Способ лечения заболеваний животных, вызванных бактериями (варианты), и способ изготовления лекарственного средства

Способ лечения заболеваний животных, вызванных бактериями (варианты), и способ изготовления лекарственного средства

Реферат

 

Изобретение относится к ветеринарии. Способ лечения заболеваний животных, вызванных бактериями, выбранными из группы, включающей Serpulina pilosicoli, Lawsonia intracellularis, Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica, Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae и/или Haemophilus parasuis, заключается во введении животному эффективного количества соединения формулы I в форме свободного основания или в форме приемлемой для ветеринарии соли. 3 с. и 6 з.п. ф-лы, 11 табл.

Изобретение относится к производным плевромутилина. В частности, оно относится к применению в ветеринарии соединения формулы I т. е. 14-О-[1-[(R)-2-амино-3-метилбутириламино]-2-метилпропан-2-илтиоацетил] мутилина в форме свободного основания или в форме приемлемой для ветеринарии соли в терапии ветеринарных болезней, случаи которых учащаются при увеличении поголовья скота, что далее в настоящем описании коротко называется "применением по изобретению".

Соединение формулы I в форме свободного основания или в форме приемлемой для ветеринарии соли (Econor) далее в настоящем описании коротко называется "агент по изобретению". Предпочтительно оно представлено в форме соли, прежде всего в форме гидрохлорида. В этой форме оно известно под общим названием гидрохлорид валнемулина.

Следует отметить, что понятие "терапия" относится к обработке как в профилактических, так и в лечебных целях.

Соединение формулы I в форме свободного основания или в форме соли, приемлемой для хемотерапии или ветеринарии, известно, например, из ЕР 153277, а эквивалентные ему соединения, например, из US 4675330, в частности соединения, описанные в примере 12 указанного документа.

Из приведенных литературных источников известно также, что это соединение обладает: ингибирующим действием in vitro в отношении различных бактерий в концентрациях приблизительно 0,008-25 мкг/мл, ингибирующим действием in vitro в отношении микоплазм и хламидий обычно в концентрациях приблизительно 0,008-0,5 мкг/мл, ингибирующим действием in vivo в отношении различных бактериальных штаммов при использовании мышей в качестве хозяев и в отношении штаммов микоплазм при использовании кур в качестве хозяев в дозах приблизительно 12-50 мг/кг веса тела, антипаразитарным действием, в частности, in vivo в отношении кокцидий домашней птицы в дозах 20-150 мг/кг корма и стимулирующим рост действием в отношении кур и свиней in vivo в дозах 10-50 мг/кг корма, что делает это соединение в целом пригодным в качестве антибиотика с антибактериальной активностью и в качестве ветеринарного агента, в частности для хемотерапевтического лечения кокцидиоза у домашней птицы, а также в качестве стимулятора роста кур и свиней.

Неожиданно было обнаружено, что агент по изобретению особенно эффективен для лечения ветеринарных болезней, случаи которых учащаются при увеличении поголовья скота, таких как энзоотическая пневмония свиней, вызываемая заражением Mycoplasma hyopneumoniae, дизентерия свиней, вызываемая заражением Serpulina (прежнее название Treponema) hyodysenteriae, колит свиней (воспаление толстой кишки), связанный с заражением Serpulina pilosicoli, илеит свиней (пролиферативная энтеропатия свиней, интенстинальный аденоматоз свиней), связанный с заражением Lawsonia intracellularis, хроническое респираторное заболевание и артрит у домашней птицы, связанные с заражением Mycoplasma gallisepticum, вторичная пневмония свиней, связанная с заражением Pasteurella multocida, Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae и/или Haemophilus parasuis, пневмония ягнят, овец и крупного рогатого скота (транспортная пневмония, транзитная лихорадка, телячий респираторный комплекс, бычий пневмонический пастереллез), связанная с заражением Pasteurella haemolytica, и полиартрит свиней, связанный с заражением Mycoplasma hyosynoviae.

Кроме того, также неожиданно было обнаружено, что индукция устойчивости к лекарству является чрезвычайно низкой.

Таким образом, изобретение предназначено для применения в ветеринарии, как указано выше.

Изобретение далее относится к применению агента по изобретению для изготовления лекарственного средства, предназначенного для применения в терапии ветеринарных болезней, случаи которых учащаются при увеличении поголовья скота.

Изобретение также относится к способу лечения ветеринарных болезней, случаи которых учащаются при увеличении поголовья скота, включающему введение терапевтически эффективного количества агента по изобретению животному, нуждающемуся в таком лечении.

Изобретение также относится к ветеринарному агенту, предназначенному для применения в терапии ветеринарных болезней, случаи которых учащаются при увеличении поголовья скота, включающему соединение формулы I в форме свободного основания или в форме, приемлемой для ветеринарии соли вместе по крайней мере с одним приемлемым для ветеринарии носителем или разбавителем.

В изобретении, кроме того, предлагается способ изготовления лекарственного средства, предназначенного для описанного выше применения, который включает смешение агента по изобретению по крайней мере с одним приемлемым для ветеринарии носителем или разбавителем.

Животное, страдающее от ветеринарных болезней, случаи которых учащаются при увеличении поголовья скота, например, возможно еще не подвергалось лечению от бактериального заражения с помощью агента по изобретению или не получало агент по изобретению для стимуляции роста.

А) Заражение Mycoplasma hyopneumoniae Заражение Mycoplasma hyopneumoniae может быть диагностировано общепринятым методом, например, как это описано в руководствах по ветеринарии, таких как Taylor D.J. в Pig Diseases, 6-е изд. (1995), Publ. Taylor D.J., Glasgow, Великобритания, стр. 164-165. Эффективность агента по изобретению в этом случае определяют следующим образом.

1. Активность in vitro В опыт включено десять природных изолятов, полученных при вспышках энзоотической пневмонии в различных стадах, и типовой штамм "J". Изоляты клонируют на фильтре, идентифицируют с помощью реакции задержки роста с использованием диска и используют 7-10 пассажей. Тест по определению минимальной ингибирующей концентрации (МИК) проводят в жидкой среде (Friis N.F. и др., Acta Vet. Scand. 32 [1991] 425-429) в пробирках объемом 1,8 мл, содержащих двукратную концентрацию валнемулина и бифумарата тиамулина. Микоплазмы вносят в 10-кратно разбавленной среде и рост культур определяют визуально, используя пробирки, засеянные 10²-10⁴ цветообразующих единиц. Первичную оценку проводят через 2-4 дня, а последнюю оценку через 10-14 дней, когда уже больше не происходит прогрессирующего изменения цвета. МИК определяют как наименьшую концентрацию тестируемого соединения, вызывающую ингибирование роста по сравнению с контролем (Friis N.F. и Szancer J., Acta Vet. Scand. 35 [1994] 389-394).

Результаты приведены в таблице 1 Все изученные штаммы М. hyopneumoniae оказались высокочувствительными к действию валнемулина, причем значения МИК оказались в 10-40 раз ниже, чем для тиамулина, как при начальной, так и при конечной оценках, что делает соединение особенно интересным с точки зрения применения для лечения клинических случаев в зараженных стадах.

2. Активность in vitro Образцы ткани получают из легких свиней из стад, пораженных различными энзоотическими пневмониями свиней (ЭПС). Для культивирования образцы перевозят на сухом льду. М. hyopneumoniae получают из свежепрепарированной ткани легкого путем прямого культивирования на агаре типа Mycoplasma Experience. Этот способ позволяет при клонировании отличить и легко отделить характерные колонии М. hyopneumoniae от других более быстро растущих видов микоплазм, таких как Mycoplasma hyorhinis, часто присутствующих в образцах ЭПС-легких. Изоляты субкультивируют и выявляют по зоне задержки роста с использованием диска, применяя специфическую кроличью антисыворотку, индуцированную штаммом М. hyopneumoniae NCTC 10110.

Культуры, предназначенные для оценки антибиотического контрольного заражения, получают из бульона типа Mycoplasma Experience, который инкубируют в аэробных условиях при 36^oС.

Для выделения М. hyopneumoniae из ткани легкого применяют имеющуюся в продаже твердую среду (фирма Mycoplasma Experience Ltd.). Для определений МИК применяют жидкую среду (фирма Mycoplasma Experience Ltd.), содержащую фенол красный и глюкозу (рН 7,6).

Маточные растворы тестируемого соединения готовят в концентрации 1 мг/мл в деионизированной воде, стерилизуют фильтрацией через мембранные фильтры с размером пор 0,2 мкм (фирма Sartorius Minisart, N) и хранят при -20^oС. Для применения в опытах по определению МИК маточные растворы разбавляют жидкой средой до концентраций, превышающих в 2 раза требуемые конечные концентрации. Опыты по определению МИК проводят согласно методу Tanner и Wu, Avian Diseases 36 (1992), 714-717. Активно растущие культуры для контрольного заражения получают либо из аликвот объемом 1 мл бульонных культур, хранившихся при -70^oС, либо из культур, хранившихся на агаре при -70^oС. Культуры для контрольного заражения разбавляют, получая нужный титр 10³-10⁵ цветоизменяющих единиц/мл. Аликвоты инокулята для контрольного заражения объемом 0,1 мл смешивают с аликвотами объемом 0,1 мл разведений антибиотика в лунках титрационного микропланшета. Каждый титрационный микропланшет содержит неинокулированную среду с рН 6,8 (Mycoplasma hyopneumoniae) (контроль для конечной точки) и инокулированные, не содержащие антибиотик контроли заражения. Все планшеты запечатывают клейкой лентой и инкубируют в аэробных условиях при 36^oС. МИК определяют, когда изменение цвета в лунках с контрольным заражением соответствует значению рН в контроле для конечной точки. МИК представляет собой наименьшую концентрацию, при которой отсутствует изменение цвета.

В таблице 2 приведены результаты, полученные для валнемулина и двух эталонных соединений тиамулина и энрофлоксацина.

Было установлено, что все штаммы обладают высокой чувствительностью к валнемулину. Большинство штаммов обладает очень высокой чувствительностью к энрофлоксацину, но для отдельных штаммов значение МИК валнемулина оказалось по крайней мере в 5 раз ниже даже по сравнению с теми штаммами, которые чувствительны к концентрации энрофлоксацина в 0,0025 мкг/мл. Эти результаты подтверждают тот факт, что природные изоляты чрезвычайно чувствительны к валнемулину.

3. Развитие устойчивости Эталонный штамм Mycoplasma hyopneumoniae NCTC 10110 (из Национальной коллекции типовых культур, Лондон, Великобритания) и применяемый в данном исследовании природный изолят (MEVT G23) выращивают в аэробных условиях при 36^oС в глюкозном бульоне для Mycoplasma, который содержит фенол красный, до тех пор пока происходит обусловленное образованием кислоты изменение цвета. После добавления стерильного глицерина (5 об. %) культуры разделяют на аликвоты объемом 1 мл и замораживают при -70^oС. Эти культуры применяют для получения дополнительных бульонных культур, которые титруют, получая после инкубации (36^oС) большое количество цветоизменяющих единиц (ЦИЕ) в титрационных микропланшетах. Репликация позволяет осуществить контрольное заражение с заранее определенными количествами ЦИЕ разведений антибиотиков в опытах по определению минимальной ингибирующей концентрации (МИК) и в первичном пассаже в опытах по привыканию.

Применяют имеющуюся в продаже среду (фирма Mycoplasma Experience Ltd.), содержащую глюкозу и фенол красный (MEGB) с рН 7,6.

Маточные растворы тестируемого соединения готовят в концентрации 1000 мкг/мл в деионизированной воде. После встряхивания растворы стерилизуют фильтрацией через мембранные фильтры с размером пор 0,2 мкм (фирма Sartorius Minisart, N). Для применения в опытах по определению МИК маточные растворы разбавляют бульоном для микоплазм до концентраций, превышающих в 2 раза требуемые конечные концентрации. В опытах по привыканию маточные растворы разделяют на аликвоты объемом 1 мл и замораживают при -20^oС. Их подвергают оттаиванию и применяют с интервалами 5-7 дней для приготовления серий концентраций лекарства (серии с дублированием) в MEGB в виде аликвот объемом 1,9 мл, концентрации которых перекрывают значения МИК для обоих штаммов М. hyopneumoniae. В каждом опыте применяют свежеприготовленный гидрохлорид окситетрациклина. Диапазоны разведений постепенно изменяют от пассажа к пассажу, что обусловливает развитие у микоплазм устойчивости.

Методы тестирования Опыты по определению МИК согласно методу Tanner и Wu, Avian Diseases 36 (1992), 714-717, проводят до исследования привыкания (см. ниже) и после 10-го пассажа аликвоты объемом 0,1 мл разведений соединения смешивают с аликвотами объемом 0,1 мл инокулята для контрольного заражения, содержащего 10³-10⁵ цветоизменяющих единиц (ЦИЕ) на мл, в лунках титрационного микропланшета. Каждый титрационный микропланшет содержит неинокулированную среду с рН 6,8 (контроль для конечной точки) и инокулированные, не содержащие лекарства контроли заражения. Все планшеты запечатывают и инкубируют в аэробных условиях при 36^oС. МИК определяют, когда изменение цвета в зараженных лунках соответствует значению рН 6,8 в контроле (оранжево-желтый цвет). МИК представляет собой наименьшую концентрацию, при которой отсутствует изменение цвета.

Изучение привыкания (развитие устойчивости) В эксперименте с использованием первичного пассажа аликвоты объемом 1,9 мл растворов антибиотиков, концентрации которых перекрывают значение МИК для тестируемого штамма М. hyopneumoniae, инокулируют 0,1 мл бульонной культуры, содержащей от 10³ ЦИЕ/мл до 10⁵ ЦИЕ/мл. В качестве контроля роста применяют не содержащий лекарства бульон, инокулированный М. hyopneumoniae, и в эксперимент с использованием каждого пассажа в качестве контроля включают неинокулированную среду. После инкубации в течение 7 дней (36^oС) объединяют две самые высокие концентрации содержащего лекарство бульона, при которых наблюдается обусловленное образованием кислоты изменение цвета, и используют для инокуляции свежих серий разведений лекарства в бульон для микоплазм (0,1 мл культуры вносят в 1,9 мл содержащего лекарство бульона). Этот процесс повторяют каждые 5-7 дней, используя до 10-ти пассажей. Когда штаммы микоплазмы приобретают устойчивость к конкретным антибиотикам или после 10-го пассажа, каждый штамм еще раз пересевают в содержащий лекарство бульон и определяют значения МИК.

Результаты Значения МИК штамма "J" М. hyopneumoniae и природных изолятов до и после селекции антибиотиками приведены в таблице 3.

Было установлено, что до начала селекции оба штамма были высокочувствительными к валнемулину, а значения МИК составляли 0,0025 мкг/мл для эталонного штамма и 0,001 для природного изолята. Эти уровни активности валнемулина были в 50-100 раз выше по сравнению с активностью тилозина и окситетрациклина. Эти значения МИК использовали при выборе диапазонов разведений лекарств в эксперименте по привыканию.

После 10 циклов селекции валнемулином уровень приобретенной устойчивости оказался минимальным для обоих штаммов М. hyopneumoniae, a значения МИК возросли с 0,0025 мкг/мл до 0,005 мкг/мл и с 0,001 мкг/мл до 0,0025 мкг/мл для эталонного штамма и природного изолята соответственно. В отличие от этого у обоих штаммов М. hyopneumoniae развилась заметная устойчивость к тартрату тилозина. У эталонного штамма устойчивость появилась после 4-5 пассажей в содержащем тилозин бульоне, а к 8 пассажу значение МИК повысилось до >500 мкг/мл, что свидетельствует о более чем 2000-кратном увеличении уровня устойчивости к этому антибиотику (таблица 3). Выраженная устойчивость к тилозину развилась у природного изолята после 8 пассажей, а значение МИК повысилось в 500 раз и составило 62,5 мкг/мл. Этот уровень устойчивости сохранился после 10-11 пассажей в содержащем тилозин бульоне. У обоих штаммов М. hyopneumoniae развился 4-кратный уровень устойчивости к окситетрациклину в течение 10 циклов селекции, а значения МИК повысились с 0,25 мкг/мл до 1 мкг/мл.

Эти результаты свидетельствуют о том, что валнемулин существенно более активен в отношении М. hyopneumoniae по сравнению как с тилозином, так и с окситетрациклином, и, кроме того, он не индуцирует у штаммов М. hyopneumoniae развитие выраженной устойчивости.

4. Предупреждение экспериментально индуцированной энзоотической пневмонии in vivo Для оценки потенциальной активности валнемулина по предупреждению развития болезни применяют экспериментальную модель энзоотической пневмонии, используя пассированный материал легкого, полученный путем заражения М. hyopneumoniae гнотобиотических свиней. Проводят три серии опытов: в опытах 1 и 2 получают данные по титрованию нового соединения с использованием стандартного контрольного заражения М. hyopneumoniae, а в опыте 3 определяют эффективность соединения в концентрации 200 част./млн в корме в отношении второго контрольного заражения штаммом. Используют особей мужского пола больших белый свиней породы Landrace 6-7 недельного возраста из стада, не зараженного М. hyopneumoniae. Материал для контрольных заражений представляет собой зараженные пневмонией легкие, содержащие М. hyopneumoniae, при этом заражение гомогенатом проводят интраназально в течение трех последовательных дней. Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) валнемулина в отношении штамма, присутствующего в материале, который используют в опытах 1 и 2, составляет 0,016 мкг/мл, а для штамма, выделенного из материала, который используют в опыте 3 составляет 0,0078 мкг/мл. Материал для контрольного заражения получают путем заражения М. hyopneumoniae гнотобиотических свиней и последующего пассирования в линии свиней, свободной от особых патогенов (SPF-линии), и хранят при температуре ниже -70^oС.

Опыт 1: Медикаментозное лечение гидрохлоридом валнемулина с помощью желудочного зонда (принудительный откорм) один раз в день в концентрации 0 (контроль), 2,5, 5, 7,5 или 10 мг/кг веса тела в день. Шесть особей в группе.

Опыт 2: Медикаментозное лечение гидрохлоридом валнемулина в концентрации 0, 100, 200, 300 или 400 част./млн в корме (эквивалентно 0, 5, 10, 15 и 20 мг/кг веса тела/день). Шесть особей в группе.

Опыт 3: Медикаментозное лечение гидрохлоридом валнемулина в концентрации 0 или 200 част. /млн в корме (эквивалентно 0 и 10 мг/кг веса тела/день). Восемь особей в группе. Медикаментозное лечение проводили с первого дня контрольного заражения вплоть до гибели животных, приблизительно через 3 недели после контрольного заражения. Болезнь оценивали количественно по повреждениям легких [Cambridge lung lesion scoring system (Goodwin R.F.W. и Whittlestone P., J. Hyg. [1971] 391-397), в которой балл представляет собой приблизительное значение процента повреждения легкого пневмонией], по оценке соотношения веса легкого/весу тела и путем выделения М. hyopneumoniae из легких.

Результаты приведены в таблице 4.

В опыте 1 зараженные свиньи, которых не подвергали лечению, имели средний балл повреждения легких 13,2. Лечение валнемулином в дозах 7,5 и 10 мг/кг снизило повреждения на 71% и 87% соответственно, в то время как дозы 2,5 и 5 мг/кг/день оказались несколько менее эффективными в отношении уменьшения повреждений. М. hyopneumoniae удалось повторно выделить из меньшего количества свиней, подвергавшихся лечению дозой 10 мг/кг, по сравнению с тем вариантом, когда свиней лечили, используя дозу 2,5 мг/кг (1 особь по сравнению с 4 особями).

В опыте 2 зараженные свиньи, которые не подвергались лечению, имели средний балл повреждения легких 22,1. Лечение валнемулином в концентрациях 200, 300 или 400 част. /млн снизило повреждения на 46%, 43% и 71% соответственно. На вес легких, который может отражать как микроскопические повреждения, так и крупные повреждения, воздействие оказалось более выраженным, причем заметное снижение действия происходило после применения концентрации 200 част. /млн. Не выявлено уменьшение повреждений у свиней, которых лечили концентрацией 100 част./млн. При посмертном обследовании трупов М. hyopneumoniae удалось повторно выделить из всех свиней, которых не подвергали медикаментозному лечению, но возбудитель не был повторно выделен из свиней, которых лечили валнемулином в концентрациях 400 или 300 част./млн. Возбудитель был повторно выделен из 3 и 4 свиней, которых лечили концентрациями 200 или 100 част./млн соответственно.

В опыте 3 свиньи, которые не подвергались лечению, имели средний балл повреждения 10,8, а лечение валнемулином в концентрации 200 част./млн в корме снизило балл повреждения на 79%. Не обнаружено различия в титрах М. hyopneumoniae, обнаруженных при исследовании трупов между животными, которых подвергали и не подвергали медикаментозному лечению.

Таким образом, в различных экспериментах с использованием зараженного материала, содержащего два различных штамма М. hyopneumoniae, подтверждена эффективность валнемулина для предупреждения экспериментально индуцированной энзоотической пневмонии свиней.

Следовательно, агент по изобретению пригоден для терапии энзоотической пневмонии свиней, вызываемой заражением Mycoplasma hyopneumoniae. Для такого применения эффективная доза, как очевидно, должна изменяться в зависимости от конкретно использованной соли, способа введения, размера и возраста животного и требуемого действия, при этом, например, для профилактического лечения относительно более низкие дозы должны вводиться в течение длительного периода времени. Однако в целом удовлетворительные результаты получают, когда агент по изобретению вводят в суточной дозе от приблизительно 5 мг/кг до приблизительно 15 мг/кг веса животного, при этом целесообразно использовать разделенные дозы, которые вводят 2-4 раза в день, или форму с непрерывным высвобождением. Для большинства животных общая суточная доза составляет от приблизительно 100 мг до приблизительно 1000 мг, предпочтительно от приблизительно 100 мг до приблизительно 500 мг, один или два раза в день. Предпочтительно валнемулин может использоваться в виде единственного терапевтического средства.

Предпочтительные дозы в воде для питья составляют от 0,01 до 0,05% маc. /об. , в частности от 0,01 до 0,025%, а в корме - от 100 до 400 част./млн (г/метрическую тонну), предпочтительно от 100 до 200 част./млн (г/метрическую тонну).

Б) Заражение Serpulina hyodysenteriae Заражение Serpulina hyodysenteriae может быть диагностировано общепринятым методом, например, как это описано в руководствах по ветеринарии, таких как Taylor D.J. в Pig Diseases, 6-е изд. (1995), Publ. Taylor D.J., Glasgow, Великобритания, стр. 143-144. Эффективность агента по изобретению в этом случае определяют следующим образом.

1. Определение МИК В опыт включено девять природных изолятов, полученных при вспышках дизентерии свиней, и типовой штамм АТСС 31212 и штамм АТСС 29796 (Serpulina innocens, группа 3 (Fellstrom C. Res. Vet. Sci. 59 [1995] 1-4)). Идентификация основана на гемолизе в ТСА (тритиказный соевый агар) с 5% бычьей крови, на пробе на индол и на гидролизе гиппурата (диагностические таблетки типа Rosco Diagnostic Tablets, фирма Taastrup, Дания). Бактерии переносят из агаровых планшетов в 0,9%-ный физиологический раствор и значение бактериальной мути доводят до 1 по шкале Макфарланда до инокуляции агаровых планшетов, содержащих двукратные концентрации гидрохлорида валнемулина, бифумарата тиамулина, диметридазола, гидрохлорида линкомицина и тилозина, по 10 мкл каждого изолята. Рост и гемолиз определяют после культивирования в течение 4 дней в анаэробных условиях и определяют МИК как наименьшую концентрацию антибиотиков, при которой спирохеты не растут.

Результаты определения МИК для S. hyodysenteriae приведены в таблице 5.

Все изученные штаммы S. hyodysenteriae проявили высокую чувствительность к действию валнемулина, причем значения МИК оказались в 2-32 раза ниже, чем для тиамулина. Высокая чувствительность S. hyodysenteriae к валнемулину делает это соединение интересным с точки зрения применения для лечения клинических случаев в зараженных стадах.

2. Определение МИК Минимальные ингибирующие концентрации (МИК) определяют в отношении 10 штаммов S. hyodysenteriae, выделенных из экскрементов свиней, методом разведений на агаре. Во всех опытах по определению МИК в качестве контролей используют NCTC-штаммы (Национальная коллекция типовых культур) или эталонные штаммы. Агаровая среда для S. hyodysenteriae состоит из ВАВ2 (Unipath CM271), содержит 7% полной дефибринированной стерильной овечьей крови. Все противомикробные агенты тестируют в двукратных разведениях. Приготовленные разведения антибиотиков добавляют в соответствующий объем МН-агара, предварительно охлажденного до 50^oС, смешивают и разделяют на аликвоты объемом 20 мл. Все инкубации S.hyodysenteriae проводят в анаэробной рабочей станции при 37^oС (0,5^oС) (фирма Don Whitley Scientific), которая обеспечивает строгую анаэробную атмосферу, состоящую из 80% азота, 10% водорода и 10% двуокиси углерода. Все другие инкубации проводят при 37^oС. Все штаммы инкубируют в аэробной атмосфере при 37^oС в течение 24 ч. Количество организмов доводят до оптической плотности (ОП), эквивалентной 110⁸ колониеобразующих единиц (КОЕ) на мл, используя в качестве контроля МН-бульон. Содержащие антибиотик планшеты инокулируют с дублированием, используя многоточечный инокулятор (фирма Denley Instruments), который позволяет нанести на каждое пятно всех штаммов приблизительно 1 мкл взятого с планшета инокулята, содержащего 10⁴-10⁵ КОЕ (Amon, J. Antimicrob. Chemother. 21 [1988] 701-710; Ericsson и др., Acta Pathol. Microbiol. et Immunol. Sсnd. 217 [1971] (В) Suppl., 1-90). Контрольные планшеты инкубируют в тех же условиях, что и опытные планшеты. Значения МИК определяют через 24 и 48 ч, и последнее определение является окончательным. МИК определяют как наименьшую концентрацию антибиотика, при которой не наблюдается рост, не учитывая отдельную колонию или легкую муть, вызванную инокулятом, в соответствии с требованиями национального комитета по клиническим лабораторным стандартам (National Committee for Clinical Laboratory Standarts [1989] , Antimicrobial Susceptibility Testing, NCCLC Publications SCS, Villanova, PA, США).

Значения МИК (в мкг/мл) в отношении Serpulina hyodysenteriae составляют для валнемулина 0,1, для тиамулина 0,3, для линкомицина 50,0, для тилозина 200,0 и для диметридазола 30,0. Все штаммы S. hyodysenteriae обладали чувствительностью к валнемулину, который оказался самым активным из изученных агентов, превосходя остальные по активности в 3-600 раз.

3. Опыт по контрольному заражению Проведено два опыта, в которых сравнивают эффективность валнемулина и эффективность тиамулина в отношении предупреждения дизентерии свиней при включении в корм в различных концентрациях. Серьезность заболевания оценивают по клиническим симпомам болезни, которые определяют на основе клинических показателей состояния организма, консистенции и состава экскрементов. Также определяют выделение Serpulina hyodysenteriae с экскрементами, повреждения при исследовании трупов, скорость роста и конверсию корма.

В первом опыте результаты, полученные с использованием гидрохлорида валнемулина, включенного в корм в концентрации 20, 30 и 40 част./млн, сравнивают с результатами, полученными для бифумарата тиамулина, включенного в корм в концентрации 30 част./млн, и с необработанными контролями. Для каждой группы, в которой проводят обработку, используют по пять групп из 9 свиней, выращенных в обычных условиях (5-6-недельного возраста). Свиней содержат на корме без лекарства в течение 14 дней, затем проводят контрольное заражение стандартным штаммом S. hyodysenteriae (Р18А). Контрольное заражение проводят оральным путем в течение двух последовательных дней. Корм с включенным в него лекарством дают через день после второго контрольного заражения. Во втором опыте проводят аналогичную процедуру, за исключением того, что используют 4 группы, состоящие приблизительно из 9 свиней каждая. Им скармливают гидрохлорид валнемулина в концентрации 5, 10 и 20 част./млн и сравнивают с необработанными контролями. В этом опыте используют свиней из стада на выгульном содержании и их заражают штаммом S. hyodysenteriae, выделенным из стада на выгульном содержании, для которого ранее показана способность вызывать дизентерию свиней. В обоих опытах клинические данные о состоянии болезни оценивают ежедневно и определяют клинические симптомы, ректальные мазки берут дважды в неделю для выделения S. hyodysenteriae и всех свиней взвешивают через определенные промежутки времени. Также оценивают поглощение корма. Посмертное обследование трупов проводят через 21 день после контрольного заражения и обследуют толстую кишку на наличие повреждений. Также берут соскобы со слизистой оболочки из 4-х областей толстой кишки и культивируют для выявления S. hyodysenteriae.

В первом опыте клинические симптомы дизентерии свиней сначала проявились в контрольной необработанной группе через 8 дней после контрольного заражения, причем было поражено 8 свиней из 9. Клинические симптомы болезни также обнаружены у 1 свиньи в группе, которую содержали на корме с концентрацией валнемулина 30 част./млн, и у 2 животных из 9 в группе, которую содержали на корме с тиамулином. Симптомы болезни не обнаружены в группах, которые обрабатывали валнемулином в концентрациях 20 и 40 част./млн. В контрольной группе обнаружен средний клинический показатель на особь, равный 36, в то время как для группы, обработанной тиамулином, этот показатель составил 6. Различия между показателями, полученными для всех обработанных и контрольных групп, оказались статистически достоверными (р<0,001). S. hyodysenteriae выделяли из ректальных мазков, взятых у всех свиней в контрольной группе, а также у 2 пораженных свиней из группы, обработанной тиамулином. S. hyodysenteriae также выделяли из 2 свиней, которые получали корм с валнемулином в концентрации 30 част. /млн, что совпадает с клиническими симптомами дизентерии свиней, которые проявились в результате случайного заражения в этой группе. S. hyodysenteriae не были выделены из групп, обработанных 20 и 40 част. /млн. Во всех группах, которые получали корм с лекарством, обнаружены незначительные различия в приросте массы или индексе конверсии корма. Посмертное обследование свиней из контрольной и обработанной тиамулином групп, у которых были обнаружены клинические симптомы болезни, показало присутствие типичных для дизентерии свиней повреждений, состоящих в наличии клейкой слизи и некрозе слизистой поверхности толстой кишки. Повреждения также обнаружены у одной свиньи из группы, обработанной тиамулином, и у свиньи из контрольной группы, причем у обеих ранее не было выявлено клинических симптомов дизентерии свиней. S. hyodysenteriae выделяли из соскобов слизистой, взятых у всех пораженных возбудителем животных. У одной свиньи из группы, содержащейся на корме с концентрацией валнемулина 30 част./млн, также обнаружены повреждения, характерные для дизентерии свиней, но S. hyodysenteriae не были выделены из соскобов слизистой. В группах, которые содержали на корме с концентрациями валнемулина 20 и 40 част./млн, при посмертном обследовании повреждения не обнаружены.

Во втором опыте клинические симптомы дизентерии свиней сначала проявились в контрольной необработанной группе через 5 дней после контрольного заражения, а затем все 9 свиней в группе оказались пораженными болезнью и 6 из них пришлось умертвить вследствие серьезности заболевания. В группе, которую содержали на корме с концентрацией валнемулина 5 част./млн, клинические симптомы дизентерии свиней проявились через 8 дней после контрольного заражения, а затем 5 животных из 10 оказались пораженными болезнью. Однако количество пораженных животных в группе, которую содержали на корме с концентрацией валнемулина 5 част./млн, оказалось достоверно меньшим по сравнению с контролями (р<0,05). Клинические симптомы заболевания не выявлены в группах, которые содержали на корме с концентрацией валнемулина 10 или 20 част. /млн. Средний клинический показатель, равный 11 для группы, обработанной 5 част. /млн валнемулина, оказался существенно более низким по сравнению с показателем, равным 77 для контрольных групп (р<0,005). S. hyodysenteriae выделены из ректальных мазков, взятых в процессе опыта у всех свиней в контрольной группе. Однако из 5 пораженных болезнью животных из группы, которую содержали на корме с концентрацией валнемулина 5 част./млн, S. hyodysenteriae выделены только у 2 свиней. Животные, которых содержали на корме с различными концентрациями валнемулина, в конце опыта имели достоверно больший вес (5 част. /млн, р=0,05; 10 и 20 част./млн, р<0,05 соответственно). Посмертное обследование свиней показало наличие типичных для дизентерии свиней повреждений в слизистой оболочке толстой кишки у 3 свиней, оставшихся в живых в контрольной группе. В группе, которую содержали на корме с концентрацией валнемулина 5 част./млн, из 5 свиней, которые вначале имели симптомы болезни, только у 2 обнаружены повреждения при посмертном обследовании, но S. hyodysenteriae не были выделены из этих животных. Однако S. hyodysenteriae выделены из соскобов слизистой, взятых у 2 других животных, которые к моменту обследования имели типичные повреждения, но в то же время не проявляли клинических симптомов болезни. Повреждения не обнаружены у свиней, которые получали корм с концентрациями валнемулина либо 10, либо 20 част./млн, и S. hyodysenteriae не были выделены из этих групп.

Таким образом, валнемулин при включении в концентрации до 10 част./млн эффективен в отношении предупреждения появления клинических симптомов дизентерии свиней, и он снижает количество уничтоженных спирохет в экскрементах и наличие повреждений, выявляемых при посмертном обследовании. При концентрации 30 част./млн у нескольких свиней обнаружены клинические симптомы дизентерии свиней, но это связано со случайным заражением, которое может влиять на поглощение антибиотика. Воздействия конкурентного заболевания на поглощение антибиотика и на заболеваемость дизентерией свиней ранее было описано, например, у Burch D.G.S, Vet. Rec. 110 [1982], 244-246. Анализ данных о приросте массы показал отсутствие различий между обработанными группами, свидетельствуя о том, что антибиотик не влияет на поедаемость корма. Валнемулин в концентрации 5 част./млн не полностью предотвращал клинические симптомы болезни или распространение спирохет, но выявлены достоверные уменьшения клинических показателей и распространения спирохет по сравнению с контролями. В этом опыте тимулин при концентрации в корме 30 част./млн не предупреждал дизентерию свиней, но снижал частоту заболеваемости по сравнению с контрольной группой, а также уменьшал клинические показатели. Однако в этом опыте лечение с использованием включенного в корм валнемулина в концентрации 10 част./млн безусловно оказалось более эффективным по сравнению с лечением тиамулином в концентрации 30 част./млн в отношении предупреждения дизентерии свиней.

4. Дополнительный опыт по контрольному заражению Группу из 60 свиней, выращенных в обычных условиях (3,5-4-недельного возраста), содержат на корме без лекарства в течение 14 дней, а затем оральным путем проводят контрольное заражение стандартным штаммом S. hyodysenteriae (Р18А). Когда проявляются клинические симптомы болезни, свиней разделяют на 6 групп по 8 свиней в группе, которые подвергают обработке, и содержат на корме с антибиотиком в течение 10 дней, а затем на корме без лекарства в течение еще 14 дней. Результаты, полученные с использованием гидрохлорида валнемулина, включенного в корм в концентрации 50, 75, 100 и 150 част. /млн, сравнивают с результатами, полученными для бифумарата тиамулина, включенного в корм в концентрации 100 част./млн, и с необработанными контролями. В каждую обрабатываемую группу включают свиней с широким диапазоном клинических симптомов болезни. После разделения на обрабатываемые группы клинические симптомы болезни оценивают ежедневно и определяют клинический показатель, ректальные мазки берут дважды в неделю для выделения S. hyodysenteriae и всех свиней взвешивают через определенные промежутки времени. Также оценивают поглощение корма. Посмертное обследование проводят через 24 дня после контрольного заражения и толстую кишку каждой свиньи оценивают на наличие повреждений. Также берут соскобы слизистой из 4-х областей толстой кишки и культивируют с целью выявления S. hyodysenteriae.

После контрольного заражения и до разделения на группы клинические признаки дизентерии свиней были обнаружены через 7 дней после заражения и первые 2 обрабатываемые группы (контрольная и обрабатываемая тиамулином) были сформированы через 8 дней после контрольного заражения. Через 12, 15, 20 и 28 дней после контрольного заражения сформировали следующие другие группы: группы, получающие корм с концентрацией валнемулина 75, 50, 100 и 150 част. /млн. В каждую группу входили свиньи, у которых в экскрементах обнаружена кровь и/или слизь, а также животные, которые имели только слабо выраженные клинические симптомы, например жидкий ст