Способ получения иммуноглобулинов для внутривенного введения и другие иммуноглобулиновые продукты

Способ получения иммуноглобулинов для внутривенного введения и другие иммуноглобулиновые продукты

Реферат

 

Изобретение относится к способу очистки иммуноглобулина G из содержащей иммуноглобулин белковой фракции сырой плазмы. Указанный способ включает ряд стадий, из которых анионообменная хроматография и катионообменная хроматография предпочтительно соединены последовательно. Предпочтительно в способе очистки используется ацетатный буфер с рН примерно 5,0-6,0 и с молярностью примерно 5-25 мМ. Изобретение далее включает высокоочищенный нативный иммуноглобулиновый продукт, получаемый указанным способом. Изобретение также относится к иммуноглобулиновому продукту, который имеет чистоту более 98%, содержание мономеров и димеров IgG более 98,5%, содержание IgA менее 4 мг IgA/л и содержит менее 0,5% полимеров и агрегатов. Указанный продукт не включает детергент, ПЭГ или альбумин в качестве стабилизатора. Продукт стабилен, безопасен в отношении вирусной активности, является жидким и пригоден для непосредственного внутривенного введения. 4 с. и 21 з.п. ф-лы, 2 табл.

Область, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к способу очистки иммуноглобулинов, то есть иммуноглобулина G (IgG), из сырой плазмы или из белковой фракции сырой плазмы. Изобретение также относится к иммуноглобулиновому продукту и к использованию такого иммуноглобулинового продукта для медицинских целей.

Предпосылки к созданию изобретения Нормальный иммуноглобулин человека (НИЧ) для использования при предупреждении и лечении ряда инфекционных заболеваний был введен в практику в конце сороковых годов 20 столетия. Оказалось, что НИЧ, приготовленный методом фракционирования с использованием охлажденного этанола по Кону и Онкли (Conn E. , et al. , (1946), J.Am.Chem.Soc., 68, 459-475), (Oncley et al., (1949), J. Am. Chem.Soc., 11, 541-550) и затем также в модификации, которую осуществили Кистлер и Нитшманн (Kistler P. and Nitschmann H.S., (1952), Vox Sang, 7, 414-424), был как эффективным, так и безопасным в отношении передачи вирусной инфекции при введении подкожно или внутримышечно.

Врожденная или приобретенная полная или частичная недостаточность иммуноглобулина (первичные и вторичные синдромы иммунологической недостаточности, соответственно) проявляется через частые обычные и серьезные инфекции, особенно бактериальной природы. Предохранение от таких инфекций раньше достигалось повторными внутримышечными и подкожными инъекциями больших количеств НИЧ до нескольких раз в неделю как пожизненное лечение, что является очень болезненным, когда лекарство вводится внутримышечно.

Поэтому в начале шестидесятых годов было предпринято введение НИЧ внутривенным путем. Испытания показали, что примерно у 5% здоровых добровольцев и примерно у 95% больных с недостатком иммуноглобулина развились непосредственные побочные эффекты, варьирующиеся от одышки до циркуляторной недостаточности и имеющие такую серьезную природу, что введение НИЧ должно было быть прекращено.

Причиной побочных вышеупомянутых эффектов оказались агрегаты иммуноглобулинов, которые среди прочих эффектов сильно активировали систему комплемента. Это особенно было видно у больных с недостатком иммуноглобулинов. Особо тяжелые побочные эффекты анафилактической природы можно было наблюдать у больных, у которых вырабатывались антитела к IgA. Следовательно, были разработаны методы, позволяющие избежать образования агрегатов и/или удалить эти агрегаты в процессе получения, и около двадцати лет назад было испытано и найдено подходящим первое поколение иммуноглобулина для внутривенного введения (ИГВВ).

Первоначальной задачей ИГВВ являлось облегчение состояния инфекционных больных с врожденной или приобретенной полной или частичной недостаточностью иммуноглобулинов и ликвидация дискомфорта, связанного с введением НИЧ. Другое достоинство ИГВВ заключается в том, что в течение короткого периода времени могут быть введены большие дозы иммуноглобулина и тем самым возможно очень быстро получить достаточно высокую концентрацию в крови. Особенно важно быстро достичь высоких концентраций в местах заражений при лечении серьезных бактериальных инфекций.

Недавно было доказано, что ИГВВ, кроме того, эффективен и при других тяжелых заболеваниях, лечение которых трудно провести другим путем, например, кровотечениях, вызванных исчезновением в крови тромбоцитов по иммунологической причине, идиопатической тромбоцитопенической пурпуры (ITP), при некоторых редких заболеваниях, как, например, синдром Кавасаки и ряд аутоиммунных заболеваний, как, например, полирадикулоневрит (синдром Гийена-Варре). В отношении других заболеваний, лечение которых затруднено до сих пор, в настоящее время с применением ИГВВ проходят клинические испытания. Механизм действия в случаях этих заболеваний был прояснен лишь частично. Предполагают, что эффект связан с так называемыми иммуномодулирующими свойствами IgG, например, блокада рецепторов Fe на фагоцитарных клетках, повышенный метаболизм IgG, понижающая регуляция продукции цитокинов, и с вмешательством в предполагаемую сеть идиотипов/антиидиотипов, особенно связанными с нейтрализацией аутоиммунной реактивности.

Первое поколение ИГВВ было получено при расщеплении пепсином исходного материала (фракция II по Кону), целью расщепления было удаление агрегатов иммуноглобулина. Способ не включал никаких стадий колоночной хроматографии. Продукт должен был быть подвергнут сублимационной сушке для того, чтобы оставаться стабильным какой-то разумный период времени, и его растворяли непосредственно перед использованием.

Исходным материалом для ИГВВ служил НИЧ, который оказался безопасным в отношении передачи вирусов, когда его использовали для внутримышечной инъекции. Поэтому считали, что ИГВВ является таким же безопасным. После нескольких лет клинического применения было, однако, неожиданно обнаружено, что продукты ИГВВ от некоторых производителей вызывали перенос вирусной инфекции гепатита С.

Исследования по выяснению судьбы вирусов при продуцировании НИЧ показали, что перемещение вируса в процессе фракционирования от плазмы к НИЧ ограничено. По-видимому, безопасность НИЧ для внутримышечного использования связана с тем фактом, что он содержит защитные иммуноглобулины. В комбинации с умеренным инъецируемым объемом и с внутримышечным путем введения эти защитные иммуноглобулины могут нейтрализовать и переводить обычные вирусы в плазме в неинфекционные. Вирусные инфекции могут обнаруживаться, как было продемонстрировано в начале девяностых годов, преимущественно тогда, когда внутривенно вводятся большие дозы иммуноглобулина. Поэтому было установлено, что способы получения должны включать одну или несколько явно выраженных стадий инактивации и/или удаления вируса.

Второе поколение ИГВВ, основанное на нерасщепленных и немодифицированных молекулах иммуноглобулина с низкой антикомплементарной активностью и более высокой стабильностью, было представлено в середине восьмидесятых годов, но также в виде лиофильно высушенного продукта. Этот ИГВВ очищали с помощью нескольких стадий хроматографии. Продукты такого типа в настоящее время преобладают на рынке ИГВВ. Первое и второе поколения ИГВВ существуют, таким образом, в виде лиофильно высушенных порошков, которые растворяют непосредственно перед использованием.

Растворение высушенных при лиофилизации ИГВВ происходит медленно (до 30 минут для одной ампулы). Для одного больного часто следует растворить несколько порций. Так как для потребителей имеет большое преимущество наличие ИГВВ в виде раствора, готового для применения, на рынок были представлены жидкие продукты. Более важно то, что еще существует необходимость улучшения способа производства с целью получения высокоочищенного, стабильного и полностью нативного препарата ИГВВ с высокой клинической эффективностью и с меньшим уровнем побочных реакций от препарата. Таким образом, требуется дальнейшее развитие и совершенствование способа очистки IgG из сырой плазмы или белковой фракции плазмы для безопасного в отношении вирусной активности жидкого продукта ИГВВ. Наконец, способ должен быть так спроектирован, чтобы его можно было применить для крупномасштабного производства.

Способ очистки, описанный в настоящей заявке, приводит к жидкому иммуноглобулиновому продукту для внутривенного введения, который может быть охарактеризован как высокоочищенный, полностью нативный, биологически активный, дважды инактивированный в отношении вируса и стабильный ИГВВ нового поколения, который не содержит какого-либо детергента, полиэтиленгликоля (ПЭГ) или альбумина в качестве стабилизатора.

Краткое описание изобретения Настоящее изобретение относится к усовершенствованной методике очистки и к улучшенному жидкому иммуноглобулиновому продукту, который, кроме того, может быть введен внутривенно.

Иммуноглобулиновый продукт, полученный по способу настоящего изобретения, мог бы быть назван ИГВВ третьего поколения. Способ характеризуется следующими условиями фракционирования: избегают расщепления пепсином, агрегаты и частицы удаляют осаждением (стадия способа, признанная выполнять функцию стадии удаления вируса), дальнейшая очистка достигается с помощью методов ионообменной хроматографии на колонках, обработка растворителем/детергентом (Р/Д) вводится как инактивирующая вирус стадия и препарат как лекарственное средство готовится в виде жидкого продукта.

Благодаря улучшенной чистоте иммуноглобулинового продукта, получаемого способом по изобретению, по сравнению с продуктами, полученными ранее описанными способами, добавление стабилизаторов, таких как неионогенный детергент, ПЭГ или альбумин, не является необходимым, для того, чтобы избежать агрегации IgG при хранении ИГВВ в виде жидкого продукта. Продукт, получаемый способом по изобретению, имеет более высокое качество, чем полученные ранее другим способом продукты, и обеспечивает улучшенные клинические эффекты, а нежелательные побочные эффекты фактически отсутствуют.

Подробное описание изобретения Настоящее изобретение относится к способу очистки иммуноглобулинов, то есть IgG, из сырой плазмы или из содержащей иммуноглобулин белковой фракции плазмы, где способ включает стадии: (a) получения водной суспензии, содержащей иммуноглобулин белковой фракции сырой плазмы; (b) добавления водорастворимого, неденатурирующего в значительной степени белок осадителя к упомянутой суспензии со стадии (а) в количестве, достаточном, чтобы вызвать осаждение большей части белков без иммуноглобулина G, агрегированных иммуноглобулинов и частиц, включая потенциально инфекционные частицы, как, например, вирусные частицы, не вызывая существенного осаждения мономерного иммуноглобулина G, образуя таким образом смесь твердого осадка и надосадочной жидкости; (с) выделения осветленной, содержащей иммуноглобулин G надосадочной жидкости из смеси со стадии (b); (d) нанесения осветленной, содержащей иммуноглобулин G надосадочной жидкости со стадии (с) на анионообменную смолу и затем на катионообменную смолу; (е) вымывания белковых загрязняющих примесей и осадителя белка с катионообменной смолы буфером, имеющим рН и ионную силу, достаточные для удаления загрязняющих примесей со смолы, не вызывая существенного элюирования иммуноглобулина G; (f) элюирования иммуноглобулина G с катионообменной смолы фактически неденатурирующим буфером со значением рН и ионной силой, достаточными для того, чтобы вызвать эффективное элюирование иммуноглобулина G, получая при этом содержащий иммуноглобулин G элюат; (g) осуществления диафильтрации/ультрафильтрации содержащего иммуноглобулин G элюата со стадии (f) для концентрирования и/или диализа элюата и, не обязательно, добавления стабилизирующего средства; (h) добавления вирулицидного количества инактивирующего вирус средства к содержащей иммуноглобулин G, подвергнутой диафильтрации/ультрафильтрации и, не обязательно, стабилизированной фракции со стадии (g), приводящего, по существу, к безопасному в отношении вирусной активности раствору, содержащему иммуноглобулин G; (i) нанесения содержащего иммуноглобулин G раствора со стадии (h) на анионообменную смолу и затем на катионообменную смолу; (j) промывания катионообменной смолы со стадии (i) буфером с рН и ионной силой, достаточными для вымывания со смолы белковых загрязняющих примесей и инактивирующего вирус средства, не вызывая существенного элюирования иммуноглобулина G; (k) элюирования иммуноглобулина G с катионообменной смолы со стадии (j) с помощью в основном неденатурирующего буфера с рН и ионной силой, достаточными, чтобы вызвать эффективное элюирование иммуноглобулина G, получая при этом содержащий иммуноглобулин G элюат, и (l) обработки содержащего иммуноглобулин G элюата со стадии (k) путем диафильтрации/ультрафильтрации для понижения ионной силы и концентрирования раствора иммуноглобулина G и регулирования осмоляльности путем добавления сахарида.

Исходным материалом для настоящего способа очистки может служить сырая плазма, но преимущественно это содержащая иммуноглобулин белковая фракция сырой плазмы. Исходным материалом для очистки этим способом может быть нормальная человеческая плазма или плазма может быть от доноров с высокими титрами специфических антител, например, гипериммунная плазма. В настоящем описании термин "содержащая иммуноглобулин фракция плазмы" должна охватить все возможные исходные материалы для данного способа, например, плазму, освобожденную от выпавшего при замораживании осадка, или плазму, освобожденную от выпавшего при замораживании осадка, из которой были удалены различные плазменные белки, как, например, фактор IX и антитромбин, различные фракции по Кону и фракции, полученные по методикам осаждения с помощью ПЭГ (Polson et al., (1964), Biochem. Biophys. Acta, 82, 463-475; Polson and Ruiz-Bravo, (1972) Vox Sang, 23, 107-118) или сульфата аммония. В предпочтительном варианте осуществления изобретения белковой фракцией плазмы является фракция II и III по Кону, но также могут быть использованы фракция II по Кону или фракции I, II и III по Кону. Различные фракции по Кону предпочтительно готовят из плазмы стандартным способом фракционирования по Кону, в основном, в модификации Кистлера-Нитшманна. В дополнение к иммуноглобулинам фракции по Кону содержат, например, фибриноген, -глобулины и -глобулины, включая различные липопротеины, которые предпочтительно должны быть удалены во время последующего процесса очистки. Ускоритель фильтрации может присутствовать или нет в зависимости от способа выделения, применяемого для получения фракций по Кону (то есть центрифугирования или фильтрации).

Первая стадия способа согласно изобретению включает получение водной суспензии, содержащей иммуноглобулин белковой фракции плазмы, где концентрация IgG в суспензии настолько высока, чтобы во время последующей стадии осаждения большая часть не содержащих IgG белков, особенно с более высокой молекулярной массой, агрегированные иммуноглобулины и другие агрегированные белки, а также потенциально инфекционные частицы осаждались без существенного осаждения мономерного IgG. Это обычно достигается, если концентрация IgG в забуференной и профильтрованной суспензии составляет, как минимум, примерно 4 г/л до прибавления осадителя. Следует принять во внимание, что влияние на осаждение концентрации белка, а также рН и температуры суспензии зависит от выбранного осадителя.

Предпочтительно, чтобы белковая фракция плазмы подвергалась суспендированию в воде и/или буфере при в значительной степени неденатурирующих температуре и рН. Термин "в значительной степени неденатурирующих" подразумевает, что условие, к которому относится термин, не вызывает значительной необратимой потери функциональной активности молекул IgG, например, потери активности связывания антигенов и/или потери биологической F_c-функции (см. пример 2).

Полезно, когда белковую фракцию плазмы суспендируют в воде, подкисленной, как минимум, одной неденатурирующей буферной системой, в 6-9-кратном объеме, предпочтительно в 7-8-кратном, по отношению к объему белковой фракции плазмы. Для обеспечения максимальной растворимости иммуноглобулина и обеспечения оптимального эффекта последующей стадии осаждения с помощью ПЭГ рН содержащей иммуноглобулин суспензии предпочтительно устанавливают ниже 6, например, в диапазоне от 4,0 до 6,0, предпочтительно 5,1-5,7, наиболее предпочтительно около 5,4. Может быть использован любой подходящий кислотный буфер, но буферная система предпочтительно содержит, как минимум, один из следующих буферов и кислот: фосфат натрия, ацетат натрия, уксусная кислота, соляная кислота. Специалисты в данной области поймут, что могут быть использованы многочисленные другие буферы.

Суспензия иммуноглобулина предпочтительно находится при низкой температуре, среди прочего еще и для того, чтобы предотвратить существенную денатурацию белка и минимизировать активность протеаз. Суспензия иммуноглобулина и вода, а также добавленная буферная система имеют предпочтительно одинаковую температуру в диапазоне 0-12^oС, предпочтительно 0-8^oС, наиболее предпочтительно 1-4^oС.

Суспензия осажденной этанолом пасты содержит относительно большие количества агрегированного белкового материала. При необходимости содержащая иммуноглобулин суспензия фильтруется для удаления, например, больших агрегатов, ускорителя фильтрации, если он присутствует, и остаточной нерастворенной пасты. Фильтрацию предпочтительно проводят с помощью объемных фильтров, например, С150 AF, AF 2000 или AF 1000 (Schenk), 30LA (Cuno) или подобных фильтров. Удаление агрегатов, ускорителя фильтрации, если он присутствует, и остаточного нерастворенного белкового материала может быть также выполнено центрифугированием.

Как минимум, один водорастворимый осадитель, в значительной степени неденатурирующий белок, добавляется к содержащей иммуноглобулин профильтрованной суспензии в количестве, достаточном для того, чтобы вызвать осаждение большой части высокомолекулярных белков, липопротеинов, агрегированных белков, в том числе агрегированных иммуноглобулинов. Другой материал в виде частиц, например, потенциально инфекционные частицы, например, вирусные частицы, также осаждается, не вызывая значительного осаждения мономерного IgG. Термин "инфекционные частицы" в настоящем контексте включает, например, вирусные частицы (как, например, вирусы гепатита, ВИЧ1 и ВИЧ2) и бактерии.

В области очистки белка хорошо известны в значительной степени неденатурирующие водорастворимые осадители белка. Такие осадители используются для фракционирования белков, приводящего к частичной очистке белков из суспензий. Подходящие осадители белков для использования в способе по настоящему изобретению включают ПЭГ с различными молекулярными массами, каприловую кислоту и сульфат аммония. Специалисты в данной области поймут, что в качестве альтернативных средств для осаждения могут быть использованы некоторые другие неденатурирующие водорастворимые осадители. Термин "добавление осадителя белка" и варианты этого термина подразумевает добавление одного или нескольких типов средств для осаждения белка.

Предпочтительным осадителем является органическое средство в виде ПЭГ, в частности, ПЭГ с молекулярной массой в диапазоне 3000-8000 Да, как, например, ПЭГ 3350, ПЭГ 4000, ПЭГ 5000 и особенно ПЭГ 6000 (числа в этих конкретных соединениях ПЭГ представляют их среднюю молекулярную массу). Преимущество использования ПЭГ в качестве осадителя состоит в том, что ПЭГ является неионогенным и обладает стабилизирующими белок свойствами, т.е. ПЭГ в низкой концентрации хорошо известен как стабилизатор продуктов ИГВВ. Стадия осаждения также выполняет функцию стадии удаления вирусов. ПЭГ концентрирует и осаждает вирусы, независимо от их вида, размера и их поверхностной оболочки.

Определенное количество осадителя белка добавляется к профильтрованной суспензии для осаждения большей части белков с высокой молекулярной массой и агрегированных белков и частиц без существенного осаждения мономерного IgG, при этом образуется прозрачный раствор надосадочной жидкости. Осадитель белка может быть добавлен в виде твердого порошка или концентрированного раствора.

Для ПЭГ как осадителя применяется общее правило, заключающееся в том, что чем выше молекулярная масса соединения, тем ниже требуется концентрация ПЭГ, чтобы вызвать осаждение белка. Когда используется ПЭГ 3350, ПЭГ 4000 или предпочтительно ПЭГ 6000, полезно, чтобы концентрация осадителя в фильтруемой суспензии была в диапазоне 3-15% по массе, как, например, 4-10% (например, около 5, 6, 7, 8, 9, 10%), где наиболее предпочтительна 6%. На стадии осаждения процесс осаждения проводят, по меньшей мере, до достижения равновесия между твердой и жидкой фазой, например, обычно не менее двух часов, как, например, примерно от 2 до 12 часов, предпочтительно около 4 часов. В течение всего осаждения суспензию предпочтительно сохраняют при низкой температуре (например, ниже, чем примерно 12^oС, как, например, ниже, чем примерно 10^oС, предпочтительно при температуре между 2 и 8^oС). Наиболее подходящая температура зависит от особенностей осадителя белка.

После окончания осаждения белка осветленная надосадочная жидкость, содержащая IgG почти исключительно в виде мономера, выделяется из смеси твердого осадка и надосадочной жидкости, образующейся в результате осаждения. Выделение может быть осуществлено с помощью обычных методик отделения жидкости от твердой фазы, как, например, центрифугирование и/или фильтрация. Предпочтительно используют проточную центрифугу (например, фирмы Westfalia) с 1000-5000 г.

При необходимости выделенная осветленная надосадочная жидкость, содержащая IgG, фильтруется через объемный фильтр для удаления более крупных частиц и агрегатов. При необходимости осуществляется стерильная фильтрация с использованием обычного стерилизационного фильтра (как, например, фильтр 0,22 мкм от фирмы Millipore или Sartorius), при которой удаляются, например, бактерии из раствора.

Осветленная и, при необходимости, профильтрованная надосадочная жидкость, содержащая IgG, подвергается, по меньшей мере, одной операции обработки, например, в два этапа, но при необходимости и нескольким этапам анионообменной и катионообменной хроматографии для удаления значительной доли оставшихся загрязняющих примесей, не содержащих IgG, например IgA, альбумина, а также агрегатов. В предпочтительном варианте осуществления изобретения осветленная и, при необходимости, профильтрованная надосадочная жидкость, содержащая IgG, наносится на анионообменную смолу и затем на катионообменную смолу, которой заполнены две колонки соответствующих размеров.

При проведении операций ионообменной хроматографии для очистки IgG предпочтительно, чтобы условия, например, рН и ионная сила, были выбраны так, что основная часть загрязняющих примесей (например, белки, не относящиеся к IgG, как, например, IgA, трансферрин, альбумин и агрегаты) в нанесенном растворе связывается с анионообменной смолой, так чтобы, в основном, IgG не адсорбировался на анионообменной смоле. Что касается последующей катионообменной хроматографии, предпочтительно выбранные условия приводят к связыванию, в основном, всех молекул IgG, присутствующих в растворе, нанесенном на катионообменную смолу. Белковые загрязняющие примеси, не адсорбированные на анионообменной смоле, и средство для осаждения удаляются при последующем промывании катионообменной смолы.

В предпочтительном варианте осуществления данного способа анионообменная смола и катионообменная смола соединены последовательно. В данном контексте "соединены последовательно" при использовании в связи с ионообменными смолами означает, что белки, проходящие через анионообменную смолу, непосредственно загружаются на катионообменную смолу без изменения буфера или других условий.

Несколько причин объясняют полезность того, что анионообменная и катионообменная хроматография проводятся в одну стадию с использованием двух последовательно соединенных хроматографических колонок вместо двух независимых хроматографических стадий, например, с различными буферными композициями. Использование двух последовательно соединенных хроматографических колонок делает операцию более практичной, например, нет необходимости в промежуточном этапе сбора содержащих IgG фракций между двумя ионообменными хроматографическими методами, возможно, в регулировании рН и ионной силы. В дополнение к этому, поток буфера поступает в обе колонки в одно и то же время и две колонки уравновешиваются одним и тем же буфером. Однако предполагается, что также возможно осуществлять хроматографическую стадию в две ступени, то есть анионообменная смола и катионообменная смола не соединяются последовательно. Проведение хроматографии в две ступени было бы, однако, как указывалось выше, более трудоемким по сравнению с вариантом, когда ионообменные смолы соединены последовательно.

В настоящее время предполагается, что высокая степень чистоты, высокое содержание мономеров и димеров IgG и низкое содержание IgA в продуктах ИГВВ данного изобретения отчасти имеют место благодаря использованию двух последовательно соединенных хроматографических колонок.

Как известно специалисту, ионообменники могут основываться на различных материалах в отношении матрицы, а также присоединенных заряженных групп. Например, могут быть использованы следующие матрицы, в которых указанные материалы могут быть в большей или меньшей степени соединены поперечными связями: на основе агарозы (как, например, сефароза CL-6B, сефароза Fast Flow и сефароза High Performance), на основе целлюлозы (как, например, ДЭAЭ-сефацел), на основе декстрана (как, например, сефадекс), на основе двуокиси кремния и на основе синтетических полимеров. Для анионообменной смолы заряженными группами, ковалентно присоединенными к матрице, могут быть, например, диэтиламиноэтил (ДЭАЭ), четвертичный аминоэтил (ЧАЭ) и/или четвертичный аммоний (ЧА). Для катионообменной смолы заряженными группами, которые ковалентно связаны с матрицей, могут быть, например, карбоксиметил (КМ), сульфопропил (СП) и/или метилсульфонат (МС). В предпочтительном варианте осуществления настоящего способа используемой анионообменной смолой является ДЭАЭ-сефароза Fast Flow, но могут применяться и другие анионообменники. Предпочтительной катионообменной смолой является КМ-сефароза Fast Flow, но могут применяться и другие катионообменники.

Подходящий объем используемой смолы при наполнении колонки для ионообменной хроматографии отражает размеры колонны, то есть диаметр колонны и высоту заполнения смолой, и варьируется в зависимости, например, от количества IgG в наносимом растворе и связывающей способности используемой смолы.

Перед проведением ионообменной хроматографии ионообменную смолу предпочтительно уравновешивают буфером, который позволяет смоле связать ее противоионы. Предпочтительно анионообменные и катионообменные смолы уравновешивают тем же самым буфером и это облегчает процесс, поскольку нужно готовить и использовать только один буфер.

Если, например, выбранной анионообменной смолой является ДЭАЭ-сефароза FF и катионообменной смолой является КМ-сефароза FF и колонки соединены последовательно, тогда выгодно, чтобы обе колонки уравновешивались неденатурирующим кислотным буфером, имеющим примерно такие же рН и ионную силу, как наносимый на колонку раствор IgG. Любой из различных буферов пригоден для уравновешивания ионообменных колонок, например, ацетат натрия, фосфат натрия, трис(гидроксиметил)аминометан. Специалист в данной области знает, что могут быть использованы многочисленные другие буферы для уравновешивания, пока рН и электропроводность примерно такие же, как у наносимого раствора IgG. Предпочтительным буфером для уравновешивания анионообменной колонки и катионообменной колонки, соединенных последовательно, является буферный раствор с ацетатом натрия, имеющий концентрацию ацетата натрия в диапазоне 5-25 мМ, например, в диапазоне 10-20 мМ, предпочтительно 15 мМ. Предпочтительно, чтобы рН буфера с ацетатом натрия, используемого для уравновешивания, находился в диапазоне 5,0-6,0, например, в диапазоне 5,4-5,9, предпочтительно около 5,7. Электропроводность находится в диапазоне 1,0-1,4 мСм/см, предпочтительно около 1,2 мСм/см. Подходящие ацетатные буферы могут быть получены из тригидрата ацетата натрия и ледяной уксусной кислоты.

Перед загрузкой осветленной и при необходимости профильтрованной, содержащей IgG надосадочной жидкости в ионообменные колонки концентрацию буфера и рН упомянутой надосадочной жидкости предпочтительно доводят, если необходимо, до значений, по существу, эквивалентных концентрации и рН применяемого уравновешивающего буфера.

После загрузки содержащей IgG надосадочной жидкости в последовательно соединенные колонки, их предпочтительно промывают (первоначальная промывка) буфером для промывки в объеме, равном объему колонны, чтобы обеспечить количественный перенос содержащего IgG раствора из анионообменной колонки в катионообменную колонку. Затем анионообменную и катионообменную колонки разъединяют и катионообменную колонку предпочтительно промывают для удаления белковых загрязняющих примесей со смолы буфером, имеющим рН и ионную силу, достаточные для элюирования, в основном, всех из загрязняющих примесей с катионообменной смолы, не вызывая существенного элюирования IgG.

Первоначальную промывку полезно проводить, используя уравновешивающий буфер, хотя даже другие буферы с такими же концентрацией и значением рН могут быть использованы для промывки. Предпочтительно, чтобы для вымывания загрязняющих примесей с катионообменной смолы использовался ацетатный буфер. Значение рН буфера может быть от 5,0 до 6,0, например, в диапазоне 5,2-5,8, например, около 5,4.

Элюирование IgG с катионообменной смолы предпочтительно осуществляют в значительной степени не денатурирующим буфером с рН и ионной силой, достаточными для эффективного элюирования IgG, получая таким образом содержащий IgG элюат. В этом контексте эффективное элюирование подразумевает, что, как минимум, 75%, например, как минимум, 80%, например, по меньшей мере, 85%, белков, включая IgG, нанесенных на анионообменную и катионообменную смолы последовательно, элюируются с катионообменной смолы. Элюирование полезно проводить в виде операции элюирования с градиентом. В способе по настоящему изобретению предпочтительным используемым буфером является ацетат натрия с рН в диапазоне 5,0-6,0, как, например, 5,2-5,8, предпочтительно около 5,4, и концентрацией в диапазоне 5-40 мМ, как, например, в диапазоне 10-25 мМ, предпочтительно около 15 мМ.

Предпочтительно, чтобы концентрация соли в буфере для элюирования была достаточна велика, чтобы вытеснить IgG со смолы. Однако не исключается и то, что увеличение рН и более низкая концентрация соли могут использоваться при элюировании IgG со смолы. В предпочтительном варианте осуществления настоящего способа элюирование проводят как непрерывное элюирование с градиентом по соли при концентрации хлористого натрия в диапазоне 50-500 мМ, предпочтительно при концентрации хлористого натрия примерно от 125 до 350 мМ.

Элюция также может быть проведена в виде стадии градиентной элюции. Подразумевается, что элюция могла бы быть также проведена в виде элюции при постоянной концентрации соли, когда буфер для элюирования, используемый в катионообменной колонке, характеризуется только одной концентрацией соли в отличие от градиентной элюции. Если проводят элюирование при постоянной концентрации соли, концентрация соли может с успехом быть в интервале примерно от 350 до примерно 500 мМ хлористого натрия. Преимущество градиентного элюирования по сравнению с элюированием при постоянной концентрации соли состоит в том, что элюирование более эффективно с градиентом по соли, но другое преимущество заключается в том, что элюат имеет более низкую ионную силу, что полезно, поскольку высокая ионная сила является опасной для устойчивости IgG. Буфер для элюирования может, кроме того, включать стабилизирующее белок средство, такое, как указанное ниже. Могут быть использованы различные другие подходящие буферные системы для элюирования IgG, что понятно специалистам в этой области.

Предпочтительно, что, как минимум, одно стабилизирующее белок средство добавляется к фракции с IgG сразу после или во время элюирования. Стабилизирующие белок средства известны специалистам в данной области и включают, к примеру, различные спирты, получаемые восстановлением сахара, и сахариды (например, сорбит, манноза, глюкоза, трегалоза, мальтоза), белки (например, альбумин), аминокислоты (например, лизин, глицин) и органические средства (например, ПЭГ). Полезно, когда выбранный промежуточный стабилизатор может быть таким, который может быть удален из содержащего IgG раствора на последующих стадиях.

Подходящая концентрация стабилизирующего белок средства в содержащем IgG растворе зависит от конкретного примененного средства. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения стабилизирующим средством является сорбит, предпочтительно в конечной концентрации в диапазоне от 2 до 15% (м/о) сорбита, например, примерно 2,5%.

После элюирования с катионообменной колонки элюат предпочтительно обессоливают (то есть подвергают диализу) и преимущественно концентрируют. Замена буфера и концентрирование IgG могут быть осуществлены при объединенном процессе диафильтрации/ультрафильтрации. Термин "диафильтрация/ультрафильтрация" означает, что диализ и концентрирование путем диафильтрации и ультрафильтрации соответственно проводятся в одну стадию. Не исключается, чтобы диафильтрация и ультрафильтрация проводились в две различные стадии. Однако для предотвращения ненужной потери продукта в настоящее время предпочитают проводить диализ и концентрирование методами диафильтрации и ультрафильтрации в одну стадию.

Мембраны, применяемые для диафильтрации/ультрафильтрации, преимущественно имеют номинальный массовый порог в диапазоне 10000-100000 Да. Предпочтительным типом мембран для настоящего способа является полисульфоновая мембрана с номинальным массовым порогом 30000 Да, полученная от фирмы Millipore. Могут применяться и другие мембраны для ультрафильтрации из сравнимого материала и сравнимой пористости.

Степень концентрирования может значительно варьироваться. Раствор концентрируют от примерно 10 г/л IgG до примерно 100 г/л, предпочтительно до примерно 50 г/л. После концентрирования концентрат IgG преимущественно подвергается диализу против буфера с низкой ионной силой. Помимо удаления ионов солей на этой стадии также удаляются из раствора загрязняющие примеси с низкой молекулярной массой и предоставляются возможности для обмена буфера для следующей стадии очистки. Предпочтительным буфером для диафильтрации является 15 мМ ацетат натрия, рН 5,4, содержащий 2,5% (м/о) сорбита. Обмен буфера продолжается до тех пор, пока электропроводность подвергаемого ультрафильтрации раствора уменьшается до величины, меньшей, чем примерно 1,5 мСм/см, предпочтительно, менее чем примерно 1,3 мСм/см. При диафильтрации/ультрафильтрации рН предпочтительно поддерживают в диапазоне 4,0-6,0, предпочтительно 5,1-5,7, наиболее предпочтительно около 5,4.

После диафильтрации/ультрафильтрации концентрация стабилизирующего белок средства преимущественно доводится в растворе, если необходимо, до конечной оптимальной концентрации, характерной для конкретного примененного средства, стабилизирующего белок. Если применяется сорбит,