Фотоотверженный гель на основе сшитой гиалуроновой кислоты и способ его получения

Фотоотверженный гель на основе сшитой гиалуроновой кислоты и способ его получения

Реферат

 

Описывается фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты, который имеет модуль накопления (G') от 50 до 1500 Па, модуль потерь (G'') от 10 до 300 Па и тангенс дельта (G''/G') от 0,1 до 0,8 в динамической вязкоупругости, измеренной реометром при следующих условиях: способ измерения - осцилляционный метод испытания, контроль нагрузки; температура измерения 37^oС; размер конуса 4 см; зазор 800 мкм и частота 10 Гц, который является гидрогелем, имеющим плотность полимерной сетки (частоту поперечных связей или узлов сетки) от 0,01 до 0,5% на 1 моль составляющего дисахаридного звена гиалуроновой кислоты и который является гидрогелем, полученным путем облучения ультрафиолетовыми лучами фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты, в котором фотореакционноспособная сшивающая группа химически связана с функциональной группой гиалуроновой кислоты и является производным коричной кислоты, содержащим спейсер, выбранный из ряда, включающего группы, полученные из аминоспирта, аминокислоты или пепетида, указанные смежные фотореакционноспособные сшивающие группы указанного фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты димеризованы путем облучения ультрафиолетовыми лучами с образованием циклобутанового кольца, с образованием таким образом сетчатой структуры, и указанный гель представляет собой гидрогель в таком состоянии, что он может быть извлечен для инъекции из контейнера при выдавливании. Описывается также способ получения фотоотвержденного геля. 4 с. и 11 з.п.ф-лы, 5 табл., 3 ил.

Область техники Изобретение относится к биосовместимому фотоотвержденному гелю на основе сшитой гиалуроновой кислоты, который имеет специфические физические свойства, способам его получения и применениям его в качестве биомедицинских материалов.

Предпосылки к созданию изобретения Гиалуроновая кислота присутствует в животных тканях и имеет биосовместимость и способность к биологическому разложению. Что касается физических свойств, то она имеет такие превосходные свойства, как высокая водопоглотительная способность, а ее водный раствор имеет высокую вязкость.

Гидрогель получают путем химического модифицирования гиалуроновой кислоты, сшивания модифицированной гиалуроновой кислоты некоторыми способами с образованием сетчатой структуры и включением водной среды, такой как вода, в сетчатую структуру. Гидрогель обнаруживает вязкоупругость, а также вязкость.

Сшитая гиалуроновая кислота, по-видимому, образует макромолекулы независимо от типа связывания. Способность к биоразложению сшитой гиалуроновой кислоты можно регулировать путем подбора степени сшивания.

Существуют различные типы сшивания. Например, как осуществление типа сшивания с использованием гидрофобного связывания или ионного связывания, известны сшивание гиалуроновой кислоты путем введения в нее нуклеофильного реагента (JP-W-3-502704 (соответствующая патенту США 4937270), термин "JP-W", как используется здесь, обозначает "не прошедшая экспертизу опубликованная международная патентная заявка"), сшивание посредством гидрофобного связывания путем этерификации гиалуроновой кислоты (патент США 4851521) и сшивание посредством ионного связывания поливалентными ионами (ЕР 0507604 А2). Так как они связываются слабой силой связывания по сравнению с силой ковалентного связывания, они подвержены влияниям внешних изменений, таких как рН, ионная сила, температура и тому подобное. В дополнение, когда они используются как биомедицинские материалы, способность оставаться в живом организме коротка, и трудно регулировать должным образом способность оставаться в организме так, чтобы обеспечить физиологические воздействия гиалуроновой кислоты на организм.

Коме того, как тип сшивания путем связывания молекул гиалуроновой кислоты ковалентным связыванием известны сшивание посредством дивинилсульфона (JP-В-4-30691 (соответствующая патенту США 4582865), термин "JP - В", как используется здесь, обозначает "прошедшая экспертизу патентная публикации Японии") и сшивание посредством эпоксида (JP-W-61-502729 (соответствующая патенту США 4886787), JP-А-5-140201, термин "JP - А", как используется здесь, обозначает "не прошедшая экспертизу опубликованная патентная заявка Японии"). Однако сшивающие агенты или сшивающие соединения, использованные в этих сшивках, являются токсичными. Кроме того, трехмерная сетчатая структура создается путем сшивания в то же самое время, когда дивинилсульфон, эпоксид или тому подобное вводятся в гиалуроновую кислоту и образованный структурированный гель на основе гиалуроновой кислоты переводится в нерастворимое состояние в растворителе, таком как вода и тому подобное. Непрореагировавшие низкомолекулярные соединения, включенные таким образом в сетчатую структуру, трудно отделять и удалять.

С другой стороны, сшивание гиалуроновой кислоты путем сшивающей реакции фотоотверждения при облучении ультрафиолетовыми лучами (JP-А-6-73102 (соответствующая патенту США 5462976), ASAIO Journal, 38, М154-М157 (1992)) также известно. Этот тип сшивания имеет преимущества в том, что фотореакционноспособное производное гиалуроновой кислоты, в которое вводится фотореакционноспособная сшивающая группа, является растворимым в воде до фотоотверждаемой сшивки, и трехмерная сетчатая структура не образуется в это время, так что непрореагировавшие низкомолекулярные соединения легко могут быть удалены; фотореакция сама по себе является такой чистой реакцией, что дает фотоотвержденное производное сшитой гиалуроновой кислоты без непрореагировавших низкомолекулярных соединений, и получающаяся в результате сшитая структура образуется путем ковалентного связывания, так что контроль способности оставаться (в организме) фотоотвержденного производного сшитой гиалуроновой кислоты может быть легко осуществлен путем регулирования степени сшивания.

Кроме того, когда описанное выше фотоотвержденное производное сшитой гиалуроновой кислоты предназначено для применения в качестве биомедицинских материалов, например антиадгезивных материалов, то они в пленкообразной форме исследованы (ASAIO Journal, 38, М154-М157 (1992), но их трудно использовать для предотвращения спаек в тонких частях тканей или органов. Поэтому существует потребность в пригодном для инъекции геле фотоотвержденной сшитой гиалуроновой кислоты, который может быть инъецирован в такое тонкое место.

Однако гидрогель фотоотвержденной сшитой гиалуроновой кислоты и способы его получения, как раскрытые в данном изобретении, неизвестны.

Обычный гидрогель сшитой гиалуроновой кислоты имеет трудность в удалении примеси, такой как непрореагировавшие низкомолекулярные соединения и тому подобное, и регулировании физических свойств гидрогеля. Кроме того, затруднительно создать условия для получения гидрогеля, имеющего желательные физические свойства.

Описание изобретения Первая цель данного изобретения - обеспечить фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты, содержащий водную среду, который получают облучением ультрафиолетовыми лучами фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты, в которое вводят фотореакционноспособную сшивающую группу, и димеризацией смежных фотореакционноспособных сшивающих групп с образованием циклобутанового кольца и с образованием таким образом сетчатой структуры, и способы легкого получения вышеописанного геля.

Вторая цель данного изобретения - обеспечить пригодный для инъекции биомедицинский материал, содержащий фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты, который является превосходным по безопасности, биосовместимости и способности к биоразложению.

В результате интенсивных исследований авторы данного изобретения преуспели в достижении вышеуказанных целей путем следующего построения.

1) Фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты, который имеет модуль накопления (динамический модуль упругости) (G') от 50 до 1500 Па, модуль потерь (G") от 10 до 300 Па и тангенс дельта (G''/G') от 0,1 до 0,8 в динамической вязкоупругости, измеренной реометром при следующих условиях, способ измерения: осцилляционный метод испытания, контроль нагрузки температура измерения 37^oС геометрия измерения 4 см зазор 800 мкм частота 10 Гц, и который является гидрогелем, полученным путем облучения ультрафиолетовыми лучами фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты, в котором фотореакционноспособную сшивающую группу химически связывают с функциональной группой гиалуроновой кислоты, и сшивания смежных фотореакционноспособных сшивающих групп.

2) Фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты, который имеет плотность полимерной сетки (частоту поперечных связей или узлов сетки) от 0,01 до 0,5% на 1 моль составляющего дисахаридного звена гиалуроновой кислоты который является гидрогелем, полученным путем облучения ультрафиолетовыми лучами фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты, в котором фотореакционноспособную сшивающую группу химически связывают с функциональной группой гиалуроновой кислоты, и путем сшивания смежных фотореакционноспособных сшивающих групп.

3) Фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты, который имеет абсорбцию воды от 2000 до 15000%, как определено следующим: абсорбция воды (%) = масса абсорбированной воды/масса высушенного геля 100, и который является гидрогелем, полученным путем облучения ультрафиолетовыми лучами фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты, в котором фотореакционноспособную сшивающую группу химически связывают с функциональной группой гиалуроновой кислоты, и путем сшивания смежных фотореакционноспособных сшивающих групп.

4) Фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты согласно любому из указанных выше с 1) по 3), где указанная фотореакционноспособная сшивающая группа является производным коричной кислоты, содержащим спейсер (разделительную группу), и химически связана с функциональной группой гиалуроновой кислоты, чтобы обеспечить указанное фотореакционноспособное производное гиалуроновой кислоты; указанные смежные фотореакционноспособные сшивающие группы указанного фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты димеризуют путем облучения ультрафиолетовыми лучами с образованием циклобутанового кольца и с образованием таким образом сетчатой структуры, и указанный гель является гидрогелем, содержащим водную среду в указанной сетчатой структуре.

5) Фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты согласно указанному выше 4), где указанный спейсер является группой, полученной из аминоспирта, аминокислоты или пептида.

6) Фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты согласно указанному выше 4) или 5), где указанная фотореакционноспособная сшивающая группа представлена следующей формулой (1) или (2): -NH(CR¹R²)_nOCOCH=CH-Ph (1) где R¹ и R² каждый независимо представляют атом водорода или алкилгруппу, имеющую от 1 до 8 атомов углерода; Ph представляет фенилгруппу и n представляет целое число от 2 до 18; -A-NH-Ph-CH=CHCOOR³ (2) где R³ представляет алкилгруппу, имеющую от 1 до 8 атомов углерода или аралкилгруппу; А представляет -(NНСR⁴R⁵CO)_m- или -NH(CR⁴R⁵)_hCO-; R⁴ и R⁵ каждый независимо представляет атом водорода или алкилгруппу, имеющую от 1 до 8 атомов углерода; -Ph- обозначает группу пара-фенилена; m обозначает целое число от 1 до 6 и h обозначает целое число от 1 до 18.

7) Фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты согласно любому из указанных выше с 1) по 6), где указанную фотореакционноспособную сшивающую группу вводят в пропорции от 0,05 до 10% на 1 моль составляющего дисахаридного звена.

8) Фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты, который имеет модуль накопления (G') от 50 до 1500 Па, модуль потерь (G") от 10 до 300 Па и тангенс дельта (G"/G') от 0,1 до 0,8 в динамической вязкоупругости, измеренной реометром при следующих условиях, способ измерения: осцилляционный метод испытания, контроль нагрузки температура измерения 37^oС геометрия измерения 4 см зазор 800 мкм частота 10 Гц, и который является гидрогелем, полученным облучением ультрафиолетовыми лучами фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты, в котором фотореакционноспособную сшивающую группу химически связывают с функциональной группой гиалуроновой кислоты, и сшиванием смежных фотореакционноспособных сшивающих групп и затем термообработкой сшитого продукта.

9) Фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты, который имеет модуль накопления (G') от 50 до 1500 Па, модуль потерь (G") от 10 до 300 Па и тангенс дельта (G"/G') от 0,1 до 0,8 в динамической вязкоупругости, измеренной реометром при следующих условиях, способ измерения: осцилляционный метод испытания, контроль нагрузки температура измерения 37^oС геометрия измерения 4 см зазор 800 мкм частота 10 Гц, и который является гидрогелем, полученным путем термообработки фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты, в котором фотореакционноспособную сшивающую группу химически связывают с функциональной группой гиалуроновой кислоты, и затем путем облучения ультрафиолетовыми лучами нагретого фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты и сшивания смежных фотореакционноспособных сшивающих групп.

10) Фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты, который имеет модуль накопления (G') от 50 до 1500 Па, модуль потерь (G") от 10 до 300 Па и тангенс дельта (G"/G') от 0,1 до 0,8 в динамической вязкоупругости, измеренной реометром при следующих условиях, способ измерения: осцилляционный метод испытания, контроль нагрузки температура измерения 37^oС геометрия измерения 4 см зазор 800 мкм частота 10 Гц, и который является гидрогелем, полученным путем термообработки фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты, в котором фотореакционноспособную сшивающую группу химически связывают с функциональной группой гиалуроновой кислоты, и затем путем облучения ультрафиолетовыми лучами нагретого фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты и сшивания смежных фотореакционноспособных сшивающих групп и затем путем термообработки сшитого продукта снова.

11) Фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты согласно любому из указанных выше с 1) по 10), где содержание эндотоксина в геле составляет 0,25 единицы эндотоксина (ед.Э)/г или менее.

12) Способ получения фотоотвержденного геля сшитой гиалуроновой кислоты, содержащий облучение ультрафиолетовыми лучами раствора водной среды, содержащей от 0,5 до 10% по массе фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты, в котором фотореакционноспособную сшивающую группу химически связывают с функциональной группой гиалуроновой кислоты, и формирование межмолекулярной и внутримолекулярной сшивки путем димеризации смежных фотореакционноспособных сшивающих групп для обеспечения сетчатой структуры.

13) Способ получения фотоотвержденного геля сшитой гиалуроновой кислоты согласно вышеуказанному 12), где термообработку проводят до и/или после облучения ультрафиолетовыми лучами указанного раствора водной среды фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты.

14) Способ получения фотоотвержденного геля сшитой гиалуроновой кислоты согласно вышеуказанному 13), где указанную термообработку проводят при температуре от 100 до 125^oС в течение от 5 до 30 минут паром высокого давления.

15) Биомедицинский материал, содержащий фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты согласно любому из вышеуказанных с 1) по 11).

16) Биомедицинский материал согласно вышеуказанному 15), который имеет антиадгезионный эффект.

17) Комплект биомедицинского материала, содержащий гель сшитой гиалуроновой кислоты и контейнер, заключающий в себе указанный гель в таком состоянии, что он может быть извлечен наружу.

18) Комплект биомедицинского материала согласно вышеуказанному 17), где указанный контейнер является контейнером, который может выдавливать указанный гель для инъекции.

19) Комплект биомедицинского материала, содержащий фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты, как описано в любом из 1) до 11), и контейнер, заключающий в себе указанный гель в таком состоянии, что он может быть извлечен наружу.

20) Комплект биомедицинского материала согласно вышеуказанному 19), где указанный контейнер является контейнером, который может выдавливать указанный гель для инъекции.

Краткое описание чертежей Фиг. 1 является графическим изображением общего представления о фотоотвержденной сшивке в растворе фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты.

Фиг. 2 является графическим изображением взаимосвязи между DS (степенью замещения) и степенью абсорбции воды фотоотвержденного геля сшитой гиалуроновой кислоты.

Наилучший способ осуществления на практике изобретения Данное изобретение будет объяснено подробно ниже.

Термин "производное фотоотвержденной сшитой гиалуроновой кислоты", как используется в данном изобретении, предназначается для того, чтобы охватить производное, как общее понятие, полученное облучением ультрафиолетовыми лучами фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты, в котором фотореакционноспособная сшивающая группа является химически связанной, и димеризацией смежных фотореакционноспособных сшивающих групп для сшивки производного гиалуроновой кислоты и образования таким образом сетчатой структуры. Термин "фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты", как используется в данном изобретении, обозначает гидрогели, как общее понятие, содержащие водную среду, такую как вода, буфер, физиологический солевой раствор, забуференный физиологический раствор, водный раствор, содержащий растворимый в воде органический растворитель и тому подобное, в качестве дисперсионной среды в сетчатой структуре (трехмерной сетчатой структуре) фотоотвержденной сшитой гиалуроновой кислоты (здесь и далее иногда просто называемый как "гель данного изобретения"). Термин "функциональная группа гиалуроновой кислоты", как используется в данном изобретении, предназначается для включения функциональных групп, которые присутствуют в гиалуроновой кислоте и способны к химическому связыванию с фотореакционноспособными сшивающими группами. Типичными примерами функциональных групп являются карбоксильная группа и гидроксильная группа. Термин "низший алкил" или "низший алкоксил", как используется в данном изобретении, предназначается для того, чтобы включать алкилгруппу или алкоксилгруппу, которая имеет от 1 до 8 атомов углерода, предпочтительно от 1 до 4 атомов углерода.

Что касается геля данного изобретения, во-первых, его физические свойства точно определяют с точки зрения вязкоупругости и, во-вторых, сшивающуюся структуру его устанавливают с точки зрения степени сшивания.

Фотореакционноспособная сшивающая группа в фотореакционноспособном производном гиалуроновой кислоты данного изобретения не является какой-то конкретной группой, пока указанная группа имеет виниленовую группу, которая способна димеризоваться под воздействием ультрафиолетового излучения с образованием циклобутанового кольца, и указанная группа является производной из коричной кислоты или ее замещенных производных (например, производные коричной кислоты и тому подобное, где один или два атома водорода в любых положениях бензольного кольца коричной кислоты замещены группой низшим алкилом (например, метилом, этилом, пропилом, изопропилом, бутилом, трет-бутилом и тому подобным), низшей алкоксильной группой (например, метокси, этокси, пропокси, изопропокси, бутокси и тому подобное), аминогруппой, гидроксильной группой и тому подобное), карбокси-низший алкил-тимина (например, 1-(2-карбоксиэтил)тимин и тому подобное), карбокси-низший алкил-замещенного кумарина (например, 7-кумарилоксиуксусная кислота и тому подобное) и тому подобного. Из них особенно предпочтительной является фотореакционноспособная сшивающая группа, в которую введена группа, полученная от коричной кислоты или ее производного. Кроме того, в качестве фотореакционноспособной сшивающей группы также предпочтительна группа, происходящая из соединения, в котором спейсер связан с фотореакционноспособным соединением, таким как коричная кислота и тому подобное. Предпочтительные спейсеры включают такие, которые имеют две или несколько функциональных групп, способных к связыванию как с функциональной группой фотореакционноспособного соединения, такого как коричная кислота и тому подобное, так и с функциональной группой гиалуроновой кислоты. Конкретно, предпочтительны аминокислоты или их производные, пептиды и аминоспирты и тому подобное, в частности наиболее предпочтительными являются аминоспирты. Фотореакционноспособная сшивающая группа может быть введена в какую-либо функциональную группу составляющих сахаридных частей гиалуроновой кислоты, например N-ацетил-D-глюкозамин и D-глюкуроновую кислоту, но особенно предпочтительно вводить указанную сшивающую группу в карбоксильную группу D-глюкуроновой кислоты.

При использовании коричной кислоты в качестве фотореакционноспособной сшивающей группы и аминоспирта в качестве спейсера, например, предпочтительным является фотореакционноспособное производное гиалуроновой кислоты с такой структурой, когда карбоксильная группа коричной кислоты является химически связанной с гидроксильной группой аминоспирта посредством сложноэфирной связи, а аминогруппа аминоспирта является химически связанной с карбоксильной группой гиалуроновой кислоты посредством амидной связи. При использовании аминокоричной кислоты в качестве фотореакционноспособной сшивающей группы и аминокислоты или пептида в качестве спейсера предпочтительна фотореакционноспособная гиалуроновая кислота с такой структурой, где карбоксильная группа спейсера химически связана с аминогруппой аминокоричной кислоты посредством амидной связи, и аминогруппа указанной аминокислоты или пептида химически связана с карбоксильной группой гиалуроновой кислоты посредством амидной связи.

Конкретно, из фотореакционноспособных сшивающих групп, с которыми связан спейсер, особенно предпочтительны такие, которые представлены показанной ниже следующей формулой (1) или (2).

-NH(CR¹R²)_nOCOCH=CH-Ph (1) В формуле (1) R¹ и R² каждый независимо представляют атом водорода или низшую алкилгруппу (предпочтительно имеющую от 1 до 4 атомов углерода); Ph представляет фенилгруппу, которая может быть не только группой, выраженной как -С₆Н₅-, но также группой, включающей замещенное бензольное кольцо, один или два атома которого в любых положениях замещены одним или двумя заместителями, выбранными из групп низший алкил или алкоксил, имеющий от 1 до 4 атомов углерода, аминогруппы, гидроксильной группы и тому подобного; n представляет целое число от 2 до 18, предпочтительно от 2 до 12.

Фотореакционноспособная сшивающая группа, представленная формулой (1), химически связана, например, с карбоксильной группой гиалуроновой кислоты посредством амидной связи с образованием фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты.

-A-NH-Ph-CH=CHCOOR³ (2) В формуле (2) R³ представляет низшую алкилгруппу, предпочтительно алкилгруппу, имеющую от 1 до 4 атомов углерода (например, метил, этил или тому подобное) или аралкилгруппу, имеющую от 7 до 20 атомов углерода, предпочтительно бензил или фенетил; А представляет -(NHCR⁴R⁵CO)_m- или -NH(CR⁴R⁵)_hCO-; R⁴ и R⁵ каждый независимо представляет атом водорода или низшую алкилгруппу (предпочтительно имеющую от 1 до 4 атомов углерода); -Ph- обозначает группу пара-фенилена, которая может быть не только группой, выраженной как -С₆Н₄-, но также группой, включающей замещенное бензольное кольцо, где атом водорода в орто- или мета-положении в бензольном кольце замещен низшей алкильной или алкоксильной группой, имеющей от 1 до 4 атомов углерода, аминогруппой, гидроксильной группой или тому подобной; m обозначает целое число от 1 до 6, предпочтительно от 1 до 3; h обозначает целое число от 1 до 18, предпочтительно от 1 до 12.

Гиалуроновая кислота для использования в данном изобретении не имеет конкретных ограничений, однако в качестве исходного материала обычно используют гиалуроновую кислоту, имеющую средневесовую молекулярную массу от 10000 до 5000000. В соответствии с целью применения могут быть выбраны различные молекулярные массы. Предпочтительны средневесовые молекулярные массы от 500000 до 3000000 и более предпочтительны от 800000 до 2500000. В следующем методе синтеза используют предпочтительно растворимую в воде соль гиалуроновой кислоты, такую как соль щелочного металла (например, соль натрия, соль калия или тому подобное), соль щелочноземельного металла (например, соль кальция или тому подобное) или тому подобное, но и другие соли или свободная кислота также могут быть использованы, пока они растворимы в используемом реакционном растворителе и не влияют на реакцию. Термин "гиалуроновая кислота", как используется здесь иногда ниже, включает ее соли.

Фотореакционноспособное производное гиалуроновой кислоты для использования в данном изобретении может быть получено растворением гиалуроновой кислоты, например, в одной воде или в водном растворе, содержащем смешивающийся с водой органический растворитель (например, диоксан, диметилформамид, N-метилпирролидон, ацетамид, спирт (например, метанол, этанол), пиридин и тому подобное) и введением фотореакционноспособной сшивающей группы, например, карбодиимидным методом в присутствии растворимого в воде карбодиимида (например, гидрохлорида 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (сокращенно называемого здесь далее как "EDCHCl"), метиодида 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида, гидрохлорида 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)карбодиимида) и способствующего конденсации агента (например, N-гидроксисукцинимида, N-гидроксибензотриазола и тому подобного).

Очистка продукта, полученного после реакции, может быть осуществлена обычным способом, например осаждением этанолом или путем диализа. После очистки и сушки степень замещения (сокращенно называемая здесь далее как "DS", которая является степенью введения фотореакционноспособных сшивающих групп на составляющее дисахаридное звено гиалуроновой кислоты) образующегося фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты может быть измерена с помощью спектрофотометра по поглощению продукта при около 269 нм.

Стерильные и, по существу, без эндотоксина (например, содержание эндотоксина 0,25 ед.Э/г или менее) фотореакционноспособные производные гиалуроновой кислоты и фотоотвержденные гели сшитой гиалуроновой кислоты могут быть получены за счет использования стерильных или, по существу, не содержащих эндотоксина реагентов, воды, контейнеров и тому подобного и повышенного внимания к стерилизации рабочей среды при получении.

Конкретные соединения, использованные для введения фотореакционноспособной сшивающей группы в гиалуроновую кислоту, включают те, что представлены следующей формулой (1-1) или (2-1): -N₂H(CR¹R²)_nOCOCH=CH-Ph (1-1) где R¹, R², Ph и n - те же, как определено выше; H-A-NH-Ph-CH=CHCOOR³ (2-1) где A, -Ph- и R³ - те же, как определено выше.

Соединения (1-1) и (2-1) предпочтительно используют в форме соли, например соли с присоединенной кислотой, такой как гидрохлорид, гидробромид и тому подобное, гидрохлорид является особенно предпочтительным.

Конкретно, гидрохлорид (1-2) соединения (1-1) может быть синтезирован согласно следующей схеме реакции.

Первая реакция R⁶HN(CR¹R²)_nOH (3)+XCOCH=CH-Ph (4) --> R⁶HN(CR¹R²)_nOCOСH=CH-Ph (5) Вторая реакция (5) + HCl --> HClH₂N(CR¹R²)_nOCOСH=CH-Ph (1-2) где R⁶ представляет аминозащитную группу, которая может быть отщеплена кислотой, например трет-бутоксикарбонильную группу и тому подобное; Х представляет атом галогена, например атом хлора и тому подобное.

Здесь конкретно соединение (1-2) синтезируют следующим образом.

Органический растворитель (например, хлороформ и тому подобное) добавляют к соединению (3) и органическое основание (например, триэтиламин и тому подобное) добавляют туда же при охлаждении льдом. Последовательно добавляют соединение (4) и катализатор основного характера (например, 4-диметиламинопиридин и тому подобное). После перемешивания смеси при комнатной температуре органический растворитель (например, этилацетат и тому подобное) добавляют к реакционной смеси и смесь промывают последовательно несколькими порциями слабокислого водного раствора, водой, несколькими порциями слабощелочного водного раствора, водой, насыщенным водным раствором хлорида натрия и тому подобное. Отделенный слой органического растворителя сушат над безводным сульфатом натрия или тому подобного. Дессикант (осушитель) и тому подобное удаляют фильтрованием и фильтрат сушат при пониженном давлении, чтобы получить соединение (5).

1-5 М раствор хлористого водорода в органическом растворителе (например, диоксан и тому подобное) добавляют к соединению (5) при охлаждении льдом с последующим перемешиванием. Туда же добавляют органический растворитель (например, простой диэтиловый эфир и тому подобное) и осажденные кристаллы собирают путем фильтрования. Кристаллы промывают органическим растворителем и сушат при пониженном давлении, чтобы получить соединение (1-2).

Конкретно, гидрохлорид (2-2) соединения (2-1) может быть синтезирован согласно следующей схеме реакции.

Первая реакция R⁶-A-OH (6) H₂N-Ph-CH=CHCOOR³ (7) --> R⁶-A-NH-Ph-CH=CHCOOR³ (8) Вторая реакция (8) + HCl --> HClH-A-HN-Ph-CH=CHCOOR³ (2-2) где R³ и R⁶ - как определено выше.

Кроме того, соединение (2-2) конкретно синтезируют следующим образом.

Органический растворитель (например, хлороформ или тому подобное) добавляют к соединению (6), туда же добавляют активатор (например, диметилфосфинотиоилхлорид и тому подобное) в присутствии органического основания (например, триэтиламин и тому подобное) при охлаждении льдом, активируя тем самым карбоксильную группу соединения (6). После активации соединения (6) добавляют соединение (7) в присутствии органического основания (например, триэтиламин и тому подобное) при охлаждении льдом с последующим перемешиванием при комнатной температуре. Органический растворитель (например, этилацетат и тому подобное) добавляют к реакционной смеси и смесь промывают последовательно несколькими порциями слабокислого водного раствора, водой, несколькими порциями слабощелочного водного раствора, водой, насыщенным водным раствором хлорида натрия и тому подобное. Слой органического растворителя отделяют и сушат над безводным сульфатом натрия или тому подобного. Дессикант и тому подобное удаляют фильтрованием и фильтрат сушат при пониженном давлении, чтобы получить соединение (8).

1-5 М раствор хлористого водорода в органическом растворителе (например, диоксан и тому подобное) добавляют к соединению (8) при охлаждении льдом с последующим перемешиванием. Туда же добавляют органический растворитель (например, простой диэтиловый эфир и тому подобное) и осажденные кристаллы собирают путем фильтрования, промывают органическим растворителем и сушат при пониженном давлении, чтобы получить соединение (2-2).

Присутствие спейсера, включенного в фотореакционноспособную сшивающую группу в значительной мере способствует фотореакционноспособности фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты, а то же время это усовершенствование зависит от степени свободы спейсера и его способностей к гидрофобному связыванию. Усовершенствованная чувствительность в фотореакционноспособности, привнесенная спейсером, делает возможным достигнуть фотоотвержденной сшивки при такой малой степени введения фотореакционноспособной сшивающей группы, при которой фотоотвержденная сшивка прежде была затруднена при таких условиях.

Согласно обычной технологии, когда описанное выше фотореакционноспособное производное гиалуроновой кислоты сшивают облучением светом, водный раствор фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты вначале высушивают поверх контейнера или тому подобного в пленку или тому подобное и затем облучают ультрафиолетовыми лучами, чтобы получить фотоотвержденную пленку сшитой гиалуроновой кислоты. Это делают не только из-за того, что пленка легко пропускает ультрафиолетовые лучи, но также и потому, что фотореакционноспособные сшивающие группы ориентируются до более тесного прилегания друг к другу благодаря их гидрофобному характеру, в то время как пленка дегидратируется или вода испаряется во время пленкообразования. Считается, что созданная таким образом ситуация служит на благо фотореакции. Например, в случае, когда фотореакционноспособная сшивающая группа является остатком коричной кислоты, когда расстояние между смежными остатками коричной кислоты составляет 4 ангстрема, молекулы могут быть димеризованы, например сшиты, путем облучения ультрафиолетовыми лучами конкретной длины волны, но не при другом межмолекулярном расстоянии. Поэтому пленкообразование, которое делает фотореакционноспособные сшивающие группы более тесно расположенными друг к другу, считается важным шагом для достижения фотореакции. Более того, транс-коричная кислота может быть димеризована облучением ультрафиолетовыми лучами при вышеописанных условиях, в то время как ее геометрический изомер (т.е. цис-коричная кислота) является неактивной для димеризации. Когда водный раствор обычного фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты облучают ультрафиолетовыми лучами, предполагается, что сшивание может быть затруднено, потому что молекулы воды, по-видимому, препятствуют более тесному прилеганию фотореакционноспособных сшивающих групп, и преимущественно перед димеризацией имеет место транс- в цис- изомеризация.

Авторы данного изобретения обнаружили, что фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты может быть сформирован путем приготовления водного раствора фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты высокой концентрации, чтобы сделать более тесно расположенные смежные фотореакционноспособные сшивающие группы более частыми, путем придания слою раствора формы, позволяющей ультрафиолетовым лучам проходить через этот слой с легкостью, и последующим облучением его ультрафиолетовыми лучами.

Согласно данному изобретению, когда фотореакционноспособную гиалуроновую кислоту облучают ультрафиолетовыми лучами, фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты, имеющий желательные физические свойства, такие как вязкоупругость и тому подобное, может быть получен путем соответствующего выбора условий фотореакции, таких как концентрация раствора фотореакции, время облучения ультрафиолетовыми лучами и тому подобное, или DS.

Предпочтительная концентрация раствора фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты в водной среде, которая должна быть облучена светом (на которую здесь и далее иногда ссылаются как на "концентрацию фотореакции") составляет от 0,5 до 10% по массе. При использовании фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты, имеющего молекулярную массу около 1000000, более предпочтительна концентрация от 1 до 4% по массе. При более низких концентрациях изомеризация превалирует над димеризацией, как упомянуто здесь выше. Напротив, при более высоких концентрациях трудно получить однородный гель.

Когда более разбавленный водный раствор по концентрации, чем указанная определенная концентрация, облучают ультрафиолетовыми лучами, имеется тенденция к преимущественному образованию изомеров, как описано выше. При продолжающемся облучении ультрафиолетовыми лучами сама сахаридная цепь гиалуроновой кислоты будет расщепляться под влиянием ультрафиолетовых лучей, результатом чего является уменьшение молекулярной массы. С этих точек зрения, важно создать си