Способ получения l-лизина (варианты) и рекомбинантная днк, используемая для его осуществления (варианты)

Способ получения l-лизина (варианты) и рекомбинантная днк, используемая для его осуществления (варианты)

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается производства L-лизина. Способ получения L-лизина предусматривает выращивание коринеформных бактерий, трансформированных рекомбинантной ДНК (варианты), представленной в описании в виде перечня последовательностей. Рекомбинантная ДНК содержит а) последовательность ДНК, кодирующую аспартокиназу, у которой ингибирование по типу обратной связи L-лизином и L-треонином по существу десенсибилизировано, и б) последовательность ДНК, кодирующую дигидродипиколинатредуктазу. Рекомбинантная ДНК автономно реплицируется в клетках коринеформных бактерий. Выращивание трансформированных бактерий осуществляют в среде, подходящей для продуцирования и накопления L-лизина в культуре бактерий, и L-лизин извлекают из культуры. Использование изобретения позволяет улучшить L-лизинпродуцирующую способность и скорость роста продуцента. 8 с.п. ф-лы, 14 ил., 1 табл.

Данное изобретение относится к способу получения L-лизина культивированием микроорганизма, полученного модификацией коринеформной бактерии, используемой для ферментативного получения аминокислоты или т.п., при помощи способа, основанного на генной инженерии.

Предпосылки изобретения L-лизин, который используется в качестве добавки к корму, обычно получают ферментативным способом с использованием L-лизин-продуцирующего мутантного штамма, принадлежащего к коринеформным бактериям. Различные известные в настоящее время L-лизин-продуцирующие бактерии являются бактериями, создаваемыми при помощи искусственной мутации из штаммов дикого типа, относящихся к коринеформным бактериям.

Что касается коринеформных бактерий, описаны векторная плазмида, которая автономно реплицируется в бактериальных клетках и имеет маркерный ген устойчивости к лекарственному средству (см. United States Patent No. 4514502), и способ введения гена в бактериальные клетки (например, Japanese Patent Laid-open No. 2-207791). Также описана возможность размножения L-треонин- или L-изолейцин-продуцирующей бактерии с применением описанного выше способа (см. United States Patent No. 4452890 и 4442208). Что касается размножения L-лизин-продуцирующей бактерии, известен способ, в котором ген, участвующий в биосинтезе L-лизина, вводят в векторную плазмиду для амплификации этого гена в бактериальных клетках (например, Japanese Patent Laid-open No. 56-160997).

Известные гены для биосинтеза L-лизина включают, например, ген дигидродипиколинатредуктазы (Japanese Patent Laid-open No. 7-75578) и ген диаминопимелатдегидрогеназы (Ishino, S. et al. , Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1987) (в этой работе клонирован ген, участвующий в биосинтезе L-лизина), а также ген фосфоенолпируваткарбоксилазы (Japanese Patent Laid-open No. 60-87788), ген дигидродипиколинатсинтазы (Japanese Patent Laid-open No. 6-55149) и ген диаминопимелатдекарбоксилазы (Japanese Patent Laid-open No. 60-62994, в котором амплификация гена влияла на продуктивность L-лизина).

Что касается ферментов, участвующих в биосинтезе L-лизина, известен случай для фермента, который подвергается ингибированию по типу обратной связи при использовании его в виде дикого типа. В этом случае продуктивность L-лизина улучшается введением гена фермента, имеющего такую мутацию, при которой ингибирование по типу обратной связи десенсибилизируется. К таким известным генам конкретно относится, например, ген аспартокиназы (International Publication Pamphlet of WO 94/25605).

Как описано выше, некоторые успешные результаты были получены путем амплификации генов для системы биосинтеза L-лизина или введением мутантных генов. Например, коринеформная бактерия, которая удерживает мутантный ген аспартокиназы с десенсибилизированным совместным ингибированием лизином и треонином, продуцирует значительное количество L-лизина (приблизительно 25 г/л). Однако эта бактерия страдает от снижения скорости роста по сравнению с бактерией, не удерживающей мутантного гена аспартокиназы. Также сообщалось, что продуктивность L-лизина улучшается дополнительно введением гена дигидродипиколинатсинтазы, кроме мутантного гена аспартокиназы (Applied and Environmental Microbiology. 57(6), 1746-1752 (1991)). Однако такая бактерия страдает от дополнительного снижения скорости роста.

Что касается гена дигидродипиколинатредуктазы, было показано, что активность дигидродипиколинатредуктазы увеличивается в коринеформной бактерии, в которую был введен этот ген, однако не сообщалось влияние на продуктивность L-лизина (Japanese Patent Laid-open No. 7-75578).

В настоящее время неизвестен ни один случай для коринеформных бактерий, когда кому-либо удалось значительное улучшение выхода L-лизина без ограничения роста путем комбинирования множества генов для биосинтеза L-лизина. Не сообщался ни один случай, в котором предусматривалось также улучшение роста путем усиления гена для биосинтеза L-лизина.

Описание изобретения Целью данного изобретения является улучшение L-лизин-продуцирующей способности и скорости роста коринеформной бактерии посредством использования генетических материалов последовательностей ДНК, кодирующих (каждая) аспартокиназу (далее называемую "АК", при условии, что ген, кодирующий белок АК, далее называют "lysC, если необходимо), дигидродипиколинатредуктазу (далее называемую "DDPR", при условии, что ген, кодирующий белок DDPR, далее называют "dapB", если необходимо), дигидродипиколинатсинтазу (далее называемую "DDPS", при условии, что ген, кодирующий белок DDPS, далее называют "dapA", если необходимо), диаминопимелатдекарбоксилазу (далее называемую "DDC", при условии, что ген, кодирующий белок DDC, далее называют lysA, если необходимо), и диаминопимелатдегидрогеназу (далее называемую "DDH", при условии, что ген, кодирующий белок DDH, далее называют "ddh, если необходимо), которые являются важными ферментами биосинтеза L-лизина в клетках коринеформных бактерий.

Когда целевое вещество получают ферментативно при помощи микроорганизма, скорость получения, а также выход целевого вещества относительно вводимого материала является крайне важным фактором. Целевое вещество можно получать очень дешево путем увеличения скорости продуцирования на единицу ферментативного оборудования. Поэтому в промышленном масштабе крайне важно, чтобы ферментативный выход и скорость продуцирования были совместимы друг с другом. Данное изобретение предлагает решение проблемы, описанной выше, для ферментативного получения L-лизина с использованием коринеформной бактерии.

Принцип данного изобретения основан на факте, что рост коринеформной бактерии может быть улучшен и скорость продуцирования L-лизина может быть улучшена посредством усиления при объединении dapB с мутантом lysC (далее называемым просто "мутантным lysC", если необходимо), кодирующим мутантную АК (далее называемую просто "АК мутантного типа", если необходимо), при котором совместное ингибирование лизином и треонином является десенсибилизированным по сравнению со случаем, когда lysC усиливается отдельно, и что скорость продуцирования L-лизина может быть дополнительно улучшена ступенчатым образом посредством усиления dapA, lysA и ddh.

А именно, данное изобретение основано на рекомбинантной ДНК, автономно реплицируемой в клетках коринеформных бактерий, содержащей последовательность ДНК, кодирующую аспартокиназу, для которой ингибирование по типу обратной связи по существу десенсибилизировано, и последовательность ДНК, кодирующую дигидродипиколинатредуктазу. Данное изобретение обеспечивает рекомбинантную ДНК, дополнительно содержащую последовательность ДНК, кодирующую дигидродипиколинатсинтазу, кроме каждой из описанных выше последовательностей ДНК. Данное изобретение обеспечивает рекомбинантную ДНК, дополнительно содержащую последовательность ДНК, кодирующую диаминопимелатдекарбоксилазу, кроме трех описанных выше последовательностей ДНК. Данное изобретение обеспечивает рекомбинантную ДНК, дополнительно содержащую последовательность ДНК, кодирующую диаминопимелатдегидрогеназу, кроме четырех описанных выше последовательностей ДНК.

В другом аспекте данное изобретение обеспечивает коринеформную бактерию, удерживающую аспартокиназу, в которой ингибирование по типу обратной связи L-лизином и L-треонином значительно десенсибилизировано, и содержащую усиленную ДНК, кодирующую дигидродипиколинатредуктазу. Данное изобретение обеспечивает коринеформную бактерию, дополнительно содержащую усиленную ДНК, кодирующую дигидропиколинатсинтазу в вышеупомянутой коринеформной бактерии. Данное изобретение обеспечивает коринеформную бактерию, дополнительно содержащую усиленную ДНК, кодирующую диаминопимелатдекарбоксилазу в вышеупомянутой коринеформной бактерии, кроме трех описанных выше ДНК. Данное изобретение обеспечивает коринеформную бактерию, дополнительно содержащую усиленную ДНК, кодирующую диаминопимелатдегидрогеназу в вышеупомянутой коринеформной бактерии, кроме четырех описанных выше ДНК.

Еще в одном варианте данное изобретение обеспечивает способ получения L-лизина, предусматривающий стадии культивирования любой из описанных выше коринеформных бактерий в подходящей среде, продуцирования и накопления L-лизина в культуре этой бактерии и сбор L-лизина из культуры.

Коринеформные бактерии, упоминаемые в данном изобретении, представляют собой группу микроорганизмов, описанных в Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th ed. ,p. 599 (1974), которые являются аэробными грамположительными палочками, не обладающими кислотоустойчивостью и спорообразующей способностью. Эти коринеформные бактерии включают бактерии, принадлежащие к роду Corinebacterium, бактерии, принадлежащие к роду Brevibacterium, классифицируемые до настоящего времени в род Brevibacterium, но объединенные в настоящее время в род Corinebacterium, и бактерии, принадлежащие к роду Brevibacterium, близкородственные бактериям, принадлежащим к роду Corinebacterium.

Данное изобретение будет объяснено подробно ниже.

<1> Получение генов для биосинтеза L-лизина, используемых в данном изобретении Гены для биосинтеза L-лизина, используемые в данном изобретении, получают соответственно получением хромосомной ДНК из бактерии в качестве донора ДНК, конструированием библиотеки хромосомной ДНК с применением плазмидного вектора или т.п., отбора штамма, удерживающего желаемый ген, и извлечения из выбранного штамма рекомбинантной ДНК, в которую был вставлен этот ген. Донор ДНК для гена для биосинтеза L-лизина, используемый в данном изобретении, не является специфически ограниченным, при условии, что желаемый ген для биосинтеза L-лизина экспрессирует ферментный белок, который функционирует в клетках коринеформных бактерий. Однако донор ДНК предпочтительно является коринеформной бактерией.

Все гены lysC, dapA и dapB, происходящие из коринеформных бактерий, имеют известные последовательности. Поэтому они могут быть получены путем проведения амплификации в соответствии со способом полимеразной цепной реакции (PCR; см. White, Т. J. et al.. Trends Genet.. 5, 185 (1989)).

Каждый из генов для биосинтеза L-лизина, используемый в данном изобретении, можно получить в соответствии с определенными способами, приведенными в качестве примеров ниже.

(1) Получение мутантного lysC Фрагмент ДНК, содержащий мутантный lysC, может быть получен из мутантного штамма, в котором синергическое ингибирование по типу обратной связи активности АК L-лизином и L-треонином значительно десенсибилизировано (International Publication Pamphlet of WO 94/25605). Такой мутантный штамм может быть получен, например, из группы клеток, происходящих из штамма дикого типа коринеформной бактерии, подвергнутых мутационной обработке путем приложения к ним обычной мутационной обработки, такой как облучение ультрафиолетовым светом и обработка мутирующим агентом, таким как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин. Активность АК может быть измерена при помощи способа, описанного Miyajima, R. et al. в The Journal of Biochemistry (1968), 63(2), 139-148. Наиболее предпочтительным мутантным штаммом является продуцирующая L-лизин бактерия AJ3445 (FERM Р-1944), полученная мутационной обработкой из штамма дикого типа Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 (имеющей измененное в настоящее время название Corinebacterium glutamicum).

Альтернативно, мутантный lysC можно получить также мутационной обработкой in vitro плазмидной ДНК, содержащей lysC дикого типа. В другом аспекте известна конкретная информация о мутации для десенсибилизации синергического ингибирования по типу обратной связи АК L-лизином и L-треонином ((International Publication Pamphlet of WO 94/25605). Поэтому мутантный lysC может быть также получен из lysC дикого типа на основании этой информации, например, по способу сайт-специфического мутагенеза.

Фрагмент, содержащий lysC, может быть выделен из коринеформной бактерии путем получения хромосомной ДНК в соответствии, например, со способом Saito and Miura (H. Saito and К. Miura, Biochim. Biophys. Acta,72,619 (1963) ), и амплификации lysC в соответствии со способом полимеразной цепной реакции (PCR; см. White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)).

Примерами праймеров ДНК являются одноцепочечные ДНК 23-мера и 21-мера, имеющие нуклеотидные последовательности, показанные в SEQ ID 1 и SEQ ID 2 в Списке последовательностей, для амплификации, например, района приблизительно 1643 п. н., кодирующего lysC, на основе последовательности, известной для Corinebacterium glutamicum (см. Molecular Microbiology (1991), 5 (5) 1197-1204; Mol. Gen. Genet. (1990), 224, 317-324). ДНК может быть синтезирована в соответствии с обычным способом при помощи синтезатора ДНК модели 380В Applied Biosystems и при помощи фосфоамидитного способа (см. Tetrahedron Letters (1981), 22, 1859). ПЦР может быть выполнена с применением Термоциклера ДНК модели PJ2000, производимого Takara Shuzo, и с применением ДНК-полимеразы Taq согласно способу, предписанному поставщиком.

Предпочтительно, чтобы lysC, амплифицированный при помощи ПЦР, был лигирован с вектором ДНК, автономно реплицируемым в клетках Е.coli и/или коринеформных бактериях, для получения рекомбинантной ДНК, и эту рекомбинантную ДНК вводят в клетки E.coli заранее. Это облегчает последующие операции. Вектор, автономно реплицируемый в клетках Е.coli, предпочтительно является плазмидным вектором, который предпочтительно автономно реплицируется в клетках хозяина, в том числе, например, pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, pHSG398 и RSF 1010.

Когда фрагмент ДНК, способный позволять плазмиде автономно реплицироваться в коринеформной бактерии, вводят в эти векторы, их можно использовать в качестве так называемого челночного вектора, автономно реплицируемого как в Е.coli, так и в коринеформной бактерии.

Такими челночными векторами являются следующие векторы. Микроорганизмы, удерживающие каждый из векторов, и номера депозитов в международных средствах для депонирования указаны в скобках.

рНС4: Escherichia coli AJ12617 (FERM BP-3532) pAJ655: Escherichia coii AJ11882 (FERM BP-136) Corinebacterium glutamicum SR8201 (ATCC 39135) pAJ 1844: Escherichia coli AJ 11883 (FERM BP-137) Corinebacterium glutamicum SR8202 (ATCC 39136) pAJ611: Escherichia coli AJ11884 (FERM BP-138) pAJ3148: Corinebacterium glutamicum SR8203 (FERM 39137) pAJ440: Bacillus subtilis AJ11901 (FERM BP-140) Эти векторы могут быть получены из депонированных микроорганизмов следующим образом. Клетки, собранные при логарифмической фазе роста, лизировали при помощи лизозима и ДСН с последующим отделением от лизата центрифугированием при 30000 g с получением супернатанта, к которому добавляли полиэтиленгликоль и затем фракционировали и очищали центрифугированием в равновесном градиенте плотности хлорида цезия/бромида этидия.

Е. coli может быть трансформирована введением плазмиды согласно, например, способу D.M. Morrison (Methods in Enzymology, 68, 326 (1979)) или способу, в котором реципиентные клетки обрабатывают хлоридом кальция для увеличения проницаемости для ДНК (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 ( 1970)).

LysC дикого типа получают при выделении lysC из содержащего АК штамма дикого типа, тогда как lysC выделяют из содержащего АК мутантного штамма в соответствии со способом, описанным выше.

Пример нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК, содержащего lysC, показан в SEQ ID 3 в Списке последовательностей. Аминокислотная последовательность -субъединицы белка АК дикого типа расшифрована из нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID 4 в Списке последовательностей вместе с последовательностью ДНК. Только аминокислотная последовательность показана в SEQ ID 5. Аминокислотная последовательность -субъединицы белка АК дикого типа расшифрована из нуклеотидной последовательности ДНК, показанной в SEQ ID 6 в Списке последовательностей вместе с ДНК. Только аминокислотная последовательность показана в SEQ ID 7. В каждой из этих субъединиц GTG использован как инициирующий кодон и соответствующая аминокислота представлена метионином. Однако это представление относится к метионину, валину или формилметионину.

Мутантный lysC, используемый в данном изобретении, особо не ограничивается, при условии, что он кодирует АК, для которой синергическое ингибирование по типу обратной связи L-лизином и L-треонином является десенсибилизированным. Однако мутантный lysC представлен для примера геном, имеющим мутацию, в которой 279-ый остаток аланина при отсчете от N-конца заменен на аминокислотный остаток, отличающийся от аланина и не являющийся кислой аминокислотой, в -субъединице, и 30-ый остаток аланина заменен на аминокислотный остаток, отличающийся от аланина и не являющийся кислой аминокислотой, в -субъединице в аминокислотной последовательности АК дикого типа. Аминокислотная последовательность АК дикого типа включает в себя аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID 5 в Списке последовательностей, в качестве -субъединицы и аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID 7 в Списке последовательностей, в качестве -субъединицы.

Аминокислотными остатками, иными, чем аланин, и иными, чем кислая аминокислота, предпочтительно являются остатки треонина, аргинина, цистеина, фенилаланина, пролина, серина, тирозина и валина.

Кодон, соответствующий заменяемому аминокислотному остатку, особо не лимитирован относительно его типа, при условии, что он кодирует этот аминокислотный остаток. Предполагается, что аминокислотная последовательность имеющейся АК дикого типа может слегка отличаться в зависимости от различия в бактериальных видах и бактериальных штаммах. АК, которые имеют мутацию, основанную, например, на замене, делеции или инсерции одного или нескольких аминокислотных остатков в одном или нескольких положениях, не имеющих значения для активности фермента, описанных выше, могут также использоваться для данного изобретения. Другие АК, которые имеют мутацию, основанную, например, на замене, делеции или инсерции других одного или нескольких аминокислотных остатков, могут также использоваться при условии, что они не оказывают существенного влияния на активность АК и на десенсибилизацию синергического ингибирования по типу обратной связи L-лизином и L-треонином.

Штамм AJ12691, полученный введением плазмиды р399АК 9В с мутантным lysC в штамм AJ12036 (FERM ВР-734) в качестве штамма дикого типа Brevibacterium lactofermentum, был депонирован 10 апреля 1992 года под номером доступа FERM Р-12918 в National Institute of Bioscience and Human of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (postal code: 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan), перенесен в международное депонирование на основе Budapest Treaty 10 февраля 1995 года и депонирован под номером доступа FERM ВР-4999.

(2) Получение dapB Фрагмент ДНК, содержащий dapB, может быть получен из хромосомы коринеформной бактерии при помощи ПЦР. Донор ДНК специфически не ограничивается, однако в качестве примера приводится штамм Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869.

Последовательность ДНК, кодирующая DDPR, известна для Brevibacterium lactofermentum (Journal of Bacteriology, 175 (9), 2743-2749 (1993)), на основе этой последовательности ДНК могут быть получены праймеры ДНК для ПЦР. Примерами таких праймеров ДНК являются ДНК 23-меров, соответственно имеющие нуклеотидные последовательности, изображенные в SEQ ID 8 и SEQ ID 9 в Списке последовательностей. Синтез ДНК, ПЦР и приготовление плазмиды, содержащей полученный dapB, могут быть выполнены так же, как описано выше для lysC.

Нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК, содержащего dapB, и аминокислотная последовательность, расшифрованная из этой нуклеотидной последовательности, представлены в SEQ ID 10. Только аминокислотная последовательность показана в SEQ ID 11. Кроме фрагментов ДНК, кодирующих эту аминокислотную последовательность, данное изобретение может равноценно использовать фрагменты ДНК, кодирующие аминокислотные последовательности, в основном такие же, какие показаны в SEQ ID 11, а именно аминокислотные последовательности, имеющие мутацию, основанную, например, на замене, делеции или инсерции одной или нескольких аминокислот, при условии, что при этом нет существенного влияния на активность DDPR.

Трансформированный штамм АJ13107, полученный введением плазмиды pCRDAPB, содержащей dapB, полученный в Примере, описанном ниже, в штамм Е.coli JM109, был депонирован международно с 26 мая 1995 года под депозитным номером FERM ВР-5114 в National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (postal code: 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) на основе Budapest Treaty.

(3) Получение dapA Фрагмент ДНК, содержащий dapA, может быть получен из хромосомы коринеформной бактерии при помощи ПЦР. Донор ДНК особо не ограничивается, однако в качестве примера приведен штамм Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869.

Последовательность ДНК, кодирующая DDPS, известна для Corinebacterium glutamicum (см. Nucleic Acids Research. 18 (21), 6421 (1990), EMBL accession No. X53993), на основе этой последовательности могут быть приготовлены праймеры ДНК для ПЦР. Специфическими примерами таких праймеров ДНК являются ДНК 23-меров, соответственно имеющие нуклеотидные последовательности, изображенные в SEQ ID 12 и SEQ ID 13 Списка последовательностей. Синтез ДНК, ПЦР и приготовление плазмиды, содержащей dapA, могут быть выполнены так же, как описано для lysC выше.

Нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК, содержащего dapA, и аминокислотная последовательность, расшифрованная из этой нуклеотидной последовательности, приведены в виде примеров в SEQ ID 14. Только аминокислотная последовательность показана в SEQ ID 15. Кроме фрагментов ДНК, кодирующих эту аминокислотную последовательность, данное изобретение может равноценно использовать фрагменты ДНК, кодирующие аминокислотные последовательности, в основном такие же, что и аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID 15, а именно аминокислотные последовательности, имеющие мутацию, основанную, например, на замене, делении или инсерции одной или нескольких аминокислот, при условии, что при этом нет существенного влияния на активность DDPS.

Трансформированный штамм АJ13106, полученный введением плазмиды pCRDAPA, содержащей dapA, полученный в Примере, описанном ниже, в штамм Е. coli JM 109, был депонирован с 26 мая 1995 года под депозитным номером FERM BP-5113 в National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (postal code: 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) на основе Budapest Treaty.

(4) Получение lysA Фрагмент ДНК, содержащий lysA, может быть получен из хромосомы коринеформной бактерии при помощи ПЦР. Донор ДНК особо не ограничивается, однако в качестве примера приведен штамм Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869.

В коринеформных бактериях lysA образует оперон вместе с argS (геном аргинил-тРНК-синтазы) и lysA находится по ходу транскрипции от argS. Экспрессия lysA регулируется промотором, расположенным против хода транскрипции от argS (см. Journal of Bacteriology, Nov., 7356-7362 (1993)). Последовательности ДНК этих генов известны для Corinebacterium glutamicum (см. Molecular Microbiology, 4(11), 1819-1830 (1990); Molecular and General Genetics, 212, 112-119 (1988)), на основе этих последовательностей могут быть приготовлены праймеры ДНК для ПЦР. Такие праймеры ДНК приведены в качестве специфических примеров в виде 23-меров ДНК, соответственно имеющих нуклеотидные последовательности, показанные в SEQ ID 16 в Списке последовательностей (соответствующей номерам нуклеотидов 11-33 в нуклеотидной последовательности, описанной в Molecular Microbiology, 4(11), 1819-1830 (1990)), и SEQ ID 17 (соответствующей номерам нуклеотидов 1370-1392 в нуклеотидной последовательности, описанной в Molecular and General Genetics, 212, 112-119 (1988)). Синтез ДНК, ПЦР и приготовление плазмиды, содержащей полученный lysA, могут быть выполнены так же, как описано выше для lysC.

В Примере, описанном позже, фрагмент ДНК, содержащий промотор, argS и lysA, использовали для усиления lysA. Однако argS не является существенным для данного изобретения. Можно использовать фрагмент ДНК, в котором lysA лигирован непосредственно по ходу транскрипции от промотора.

Нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК, содержащего argS и lysA, и аминокислотная последовательность, расшифрованная из этой нуклеотидной последовательности, приведены в виде примеров в SEQ ID 18. Пример аминокислотной последовательности, кодируемой argS, показан в SEQ ID 19, и пример аминокислотной последовательности, кодируемой lysA, показан в SEQ ID 20. Кроме фрагментов ДНК, кодирующих эту аминокислотную последовательность, данное изобретение может равноценно использовать фрагменты ДНК, кодирующие аминокислотные последовательности, в основном такие же, что и аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID 20, а именно аминокислотные последовательности, имеющие мутацию, основанную, например, на замене, делении или инсерции одной или нескольких аминокислот, при условии, что при этом нет существенного влияния на активность DDC.

(5) Получение ddh Фрагмент ДНК, содержащий ddh, может быть получен из хромосомы коринеформной бактерии при помощи ПЦР. Донор ДНК особо не ограничивается, однако в качестве примера приведен штамм Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869.

Ген DDH известен для Corinebacterium glutamicum (Ishino, S. et al., Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1987)), на основе его последовательности могут быть приготовлены праймеры для ПЦР. Специфические примеры таких праймеров приведены в виде ДНК 20-меров, соответственно имеющих нуклеотидные последовательности, изображенные в SEQ ID 21 и SEQ ID 22 в Списке последовательностей. Синтез ДНК, ПЦР и приготовление плазмиды, содержащей полученный ddh, могут быть выполнены так же, как описано выше для lysC.

Нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК, содержащего ddh, и аминокислотная последовательность, расшифрованная из этой нуклеотидной последовательности, приведены в виде примеров в SEQ ID 23. Только аминокислотная последовательность показана в SEQ ID 24. Кроме фрагментов ДНК, кодирующих эту аминокислотную последовательность, данное изобретение может равноценно использовать фрагменты ДНК, кодирующие аминокислотные последовательности, в основном такие же, что и аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID 24, а именно аминокислотные последовательности, имеющие мутацию, основанную, например, на замене, делении или инсерции одной или нескольких аминокислот, при условии, что при этом нет существенного влияния на активность DDH.

<2> Рекомбинантная ДНК и коринеформная бактерия данного изобретения Коринеформная бактерия данного изобретения удерживает аспартокиназу (мутантную АК), у которой ингибирование по типу обратной связи L-лизином и L-треонином по существу десенсибилизировано, причем ДНК (dapB), кодирующая дигидродипиколинатредуктазу, усилена. В предпочтительном варианте коринеформная бактерия данного изобретения представляет собой коринеформную бактерию, в которой ДНК (dapA), кодирующая дигидродипиколинтасинтазу, дополнительно усилена. В более предпочтительном варианте коринеформная бактерия данного изобретения представляет собой коринеформную бактерию, в которой ДНК (lysA), кодирующая диаминопимелатдекарбоксилазу, дополнительно усилена. В более предпочтительном варианте коринеформная бактерия данного изобретения представляет собой коринеформную бактерию, в которой ДНК (ddh), кодирующая диаминопимелатдегидрогеназу, дополнительно усилена.

Термин "усиленная" ДНК обозначает здесь тот факт, что внутриклеточная активность фермента, кодируемого этой ДНК, повышается, например, путем увеличения числа копий гена, использованием сильного промотора, использованием гена, кодирующего фермент, имеющий высокую удельную активность, или комбинированием этих средств.

Коринеформной бактерией, удерживающей мутантную АК, могут быть коринеформные бактерии, которые продуцируют мутантную аспартокиназу как результат мутации, или коринеформные бактерии, которые трансформированы введением мутантного гена lysC.

Примеры коринеформной бактерии, используемой для введения описанной выше ДНК, включают, например, следующие продуцирующие лизин штаммы дикого типа: Corinebacterium acetoacidophilum ANCC 13870; Corinebacterium acetoglutamicum ATCC 15806; Corinebacterium callunae ATCC 15991; Corinebacterium glutamicum ATCC 13032; (Brevibacterium divaricatum) ATCC 14020; (Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869; (Corinebacterium lilium) ATCC 15990; (Brevibacterium flavum) ATCC 14067; Corinebacterium melassecola ATCC 17965; Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066; Brevibacterium immariophilum ATCC 14068; Brevibacterium roseum ATCC 13825; Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240; Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354; Corinebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539).

Другими бактериальными штаммами, кроме описанных здесь, используемыми в качестве хозяина, являются, например, мутантные штаммы, способные продуцировать L-лизин, произведенные из вышеуказанных штаммов. Такие искусственные мутантные штаммы включают: S-(2-аминоэтил)-цистеин (далее сокращаемый как "АЕС")-резистентные мутантные штаммы (Brevibacterium lactofermentum AJ11082 (NRRL B-1147), Japanese Patent Publication Nos. 56-1914, 56-1915, 57-14157, 57-14158, 57-30474, 58-10075, 59-4993, 62-35840, 62-24074, 62-36673, 5-11958, 7-112437 и 7-112438); мутантные штаммы, которые требуют аминокислоты, такой как L-гомосерин, для их роста (Japanese Patent Publication Nos. 48-28078 и 56-6499), мутантные штаммы, которые проявляют устойчивость к АЕС и требуют аминокислот, таких как L-лейцин, L-гомосерин, L-пролин, L-серин, L-аргинин, L-аланин и L-валин (United States Patent Nos. 3708395 и 3825472); L-лизин-продуцирующие мутантные штаммы, которые проявляют устойчивость к DL---капролактаму, -аминолауриллактаму, аналогу аспартата, сульфа-лекарстенным средствам, хиноиду и N-лауроиллейцину; L-лизин-продуцирующие мутантные штаммы, которые проявляют устойчивость к ингибиторам оксалацетатдекарбоксилазы или ферментов дыхательной системы (Japanese Patent Laid-open Nos. 50-53588, 50-31093, 52-102498, 53-9394, 53-86089, 55-9783, 55-9759, 56-32995 и 56-39778, и Japanese Patent Publication Nos. 53-43591 и 53-1833); L-лизин-продуцирующие мутантные штаммы, которые требуют инозита или уксусной кислоты (Japanese Patent Laid-open Nos. 55-9784 и 56-8692); L-лизин-продуцирующие мутантные штаммы, которые проявляют чувствительность к фторпировиноградной кислоте или температуре не менее 34^oС (Japanese Patent Laid-open Nos. 55-9783 и 53-86090); и L-лизин-продуцирующие мутантные штаммы, принадлежащие к роду Brevibacterium или Corinebacterium, которые проявляют устойчивость к этиленгликолю и продуцируют L-лизин (United States Patent No. 4411997).

В характерном варианте для усиления генов для биосинтеза L-лизина в хозяине, описанном выше, гены вводят в хозяина с использованием плазмидного вектора, транспозона или фагового вектора или т.п. При введении ожидается получение усиления до некоторой степени даже при использовании вектора с низкой копийностью. Однако предпочтительно использовать тип вектора с высокой копийностью. Такой вектор включает, например, плазмидные векторы pAJ655, pAJ1844, pAJ611, pAJ3148 и pAJ440, описанные выше. Кроме того, транспозоны, произведенные из коринеформных бактерий, описаны в International Publication Pamphlets of WO02/02627 и WO93/18151, European Patent Publication No. 445385, Japanese Patent Laid-open No. 6-46867, Vertes, A.A. et al., Mol. Microbiol., 11, 739-746 (1994), Bonamy, С., et al., Mol. Microbiol. , 14, 571-581 (1994), Vertes, A. A. et al., Mol. Gen. Genet,, 245, 397-405 (1994), Jagar, W. et al. , FEMS Microbiology Letters, 126, 1-6 (1995), Japanese Patent Laid-open, No. 7-107976, Japanese Patent Laid-open No. 7-327680 и т. п.

В данном изобретении не является обязательным, чтобы мутантный lysC был обязательно усиленным. Можно использовать штаммы, которые имеют мутацию на lysC на хромосомной ДНК, или в которых мутантный lysC включен в хромосомную ДНК. Альтернативно, мутантный lysC может быть введен при помощи плазмидного вектора. С другой стороны, dapA, dapB, lysA и ddh предпочтительно усиливаются для эффективного продуцирования L-лизина.

Каждый из генов lysC, dapA, dapB, lysA и ddh может быть успешно введен в хозяина при помощи соответственно различных векторов. Альтернативно, два, три, четыре или пять из видов этих генов могут вводиться вместе при помощи одного вектора. При использовании различных векторов гены могут вводиться в любом порядке, однако предпочтительно использовать векторы, которые имеют стабильный механизм обмена и улавливания в хозяине и которые способны сосуществовать с каждым другим вектором.

Коринеформную бактерию, удерживающую мутантную АК и дополнительно содержащую усиленный dapB, получают, например, введением в коринеформную бактерию-хозяина рекомбинантной ДНК, содержащей мутантный lysC и dapB, автономно реплицируемые в клетках коринеформных бактерий.

Коринеформную бактерию, дополнительно содержащую dapA, кроме мутантного lysC и dapB, получают, например, введением в коринеформную бактерию-хозяина рекомбинантной ДНК, содержащей мутантный lysC, dapB и dapA, автономно реплицируемые в клетках коринеформных бактерий.

Коринеформную бактерию, дополнительно содержащую мутантный lysC, dapB и dapA, получают, например, введением в коринеформную бактерию-хозяина рекомбинантной ДНК, содержащей lysC, dapB, dapA и lysA, автономно реплицируемые в клетках коринеформных бактерий.

Коринеформную бактерию, дополнительно содержащую усиленный ddh, кроме мутантного lysC, dapB, dapA и lysA, получают, например, введением в коринеформную бактерию-хозяина рекомбинантной ДНК, содержащей lysC, dapB, dapA, lysA и ddh, автономно реплицируемые в клетках коринеформных бактерий.

Вышеупомянутые рекомбинантные ДНК могут быть получены, например, встраиванием каждого из генов, участвующих в биосинтезе L-лизина, в вектор, такой как плазмидный вектор, транспозон или фаговый вектор, как описано выше.

В случае использования в качестве вектора плазмиды рекомбинантную ДНК можно вводить в хозяина согласно электроимпульсному способу ( Sugimoto et al. , Japanese Patent Laidopen No. 2-207791). Амплификацию гена с использованием транспозона можно выполнять введением плазмиды, несущей транспозон, в клетку-хозяина и индуцированием транспозиции транспозона.

<3> Способ получения L-лизина L-лизин может продуцироваться эффективно путем культивирования в подходящей среде коринеформной бактерии, содержащей усиленные гены для биосинтеза L-лизина, как описано выше, продуцирования и накопления L-лизина в культуре этой бактерии и сбора L-лизина из культуры.

Примером используемой среды является обычная среда, содержащая источник углерода, источник азот, неорганические ионы и необязательно другие органические компоненты.

В качестве источника углерода можно использовать сахара, такие как глюкоза, фруктоза, сахароза, мелассы и гидролизат крахмала; и органические кислоты, такие как фумаровая кислота, лимонная кислота и янтарная кислота.

В качестве источника азота можно использовать неорганические соли аммония, такие как сульфат аммония, хлорид аммония и фосфат аммония; органический азот, такой как гидролизат сои; газообразный аммиак; и водный аммиак.

В качестве питательных веществ, предоставляемых в следовых количествах, желательно использовать в соответствующих количествах требующиеся вещества, такие как витамин B₁ и L-гомосерин или дрожжевой экстракт или т.п. Кроме того, добавляют, если требуется, фосфат калия, сульфат магния, ион железа, ион марганца и т.д.

Культивирование предпочтительно проводят при аэробных условиях в течение приблизительно 30-90 часов. Температура культивирования предпочтительно регулируется при 25-37^oС, и рН предпочтительно регулируется от 5 до 8 во время культивирования. Для доведения рН можно использовать неорганические или органические, кислые или щелочные вещества или газообразный аммиак или т.п. L-лизин может быть собран из культуры комбинированием обычного способа с ионообменной смолой и других известных способов.

Краткое описание чертежей.

Фиг. 1 иллюстрирует процесс конструирования плазмид p399AKYB и р399АК9В, содержащих мутантный lysC.

Фиг. 2 иллюстрирует процесс конструирования плазмиды pDPRB, содержащей dapB и Brevi.-ori. (точку начала репликации, ориджин).

Фиг. 3 иллюстрирует процесс конструирования плазмиды pDPSB, содержащей dapA и Brevi.-ori.

Фиг.4 иллюстрирует процесс конструирования плазмиды p299LYSA, содержащей lysA.

Фиг. 5 иллюстрирует процесс конструирования плазмиды pLYSAB, содержащей lysA и Brevi.-ori.

Фиг. 6 иллюстрирует процесс конструирования плазмиды рРК 4D, содержащей ddh и Brevi.-ori.

Фиг. 7 иллюстрирует процесс конструирования плазмиды pCRCAB, содержащей lysC, dapB и Brevi.-ori.

Фиг. 8 иллюстрирует процесс конструирования плазмиды рСВ, содержащей мутантный lysC, dapB и Brevi.-ori.