Самоусиливающиеся фармакологически контролируемые экспрессионные системы

Самоусиливающиеся фармакологически контролируемые экспрессионные системы

Реферат

 

Изобретение относится к нуклеиново-кислотной конструкции, составляющей самоусиливающуюся экспрессионную систему. Сущность изобретения: система включает по крайней мере один первый структурный ген, кодирующий активное соединение, по крайней мере один второй структурный ген, кодирующий белок фактора транскрипции и по крайней мере одну активационную последовательность, состоящую из по крайней мере одной последовательности, связывающей белок фактора транскрипции, и по крайней мере одной промоторной последовательности, причем каждая активационная последовательность активирует экспрессию структурного гена и экспрессию белка фактора транскрипции. Предлагается применение нуклеиново-кислотной конструкции для получения лекарства для лечения заболеваний. Преимущество изобретения заключается в разработке подхода, обеспечивающего повышение трансъемной экспрессии. 5 с. и 29 з.п. ф-лы, 1 табл., 16 ил.

Изобретение относится к самоусиливающейся конструкции на основе нуклеиновой кислоты, которая содержит по крайней мере одну регуляторную последовательность, связанную с по крайней мере одним структурным геном и по крайней мере одним геном белка фактора транскрипции.

Несмотря на многочисленные попытки, предпринятые в области генной терапии, полученные к настоящему времени результаты предклинических и клинических исследований показывают, что остаются нерешенными две фундаментальные проблемы. Одна из этих проблем заключается в недостаточной трансгенной экспрессии в клетках-мишенях in vitro или in vivo, связанной с прекращением внутриклеточных процессов. Второй проблемой является неадекватный контроль трансгенной экспресии.

Предпринимая попытки исправления недостатков известных способов, Rivera с сотр. (Nature Med., 2, 1028 (1996)), Belshaw с сотр. (PSNA, США 93, 4604 (1996)) и Но с сотр. (Nature, 382, 822 (1996)) разработали первые методы внешнего контроля трансгенной экспрессии. Такие подходы основаны на добавлении активного соединения, представляющего собой рапамицин, который соединяет две субъединицы друг с другом. Полученный в результате продукт сшивания действует как фактор транскрипции. Первая субъединица представляет собой слитый белок, образовавшийся из ДНК-связывающего белка и FК506-связывающего белка (FKBP), причем такой белок также связывает рапамицин. Вторая субъединица представляет собой слитый белок, образовавшийся из белкового FRAP, который также связан с рапамицином, и активационной последовательности IIFkB белка фактора транскрипции NF-kB.

Функциональный белок фактора транскрипции, полученный сшиванием двух таких субъединиц с помощью рапамицина, в свою очередь активирует последовательность в трансгене, предназначенном для активации структурного гена.

Преимущество такого внешнего подхода состоит в том, что экспрессия структурного гена может включаться или выключаться путем введения или удаления соответственно активного соединения - рапамицина. Однако такой подход не решает проблемы, связанной с неадекватной экспрессией структурного гена. В соответствии с этим остается необходимость в разработке подхода, обеспечивающего повышение трансгенной экспрессии.

Настоящее изобретение удовлетворяет потребности данной области техники, обеспечивая конструкции на основе нуклеиновой кислоты, композиции, содержащие такие конструкции, и способы их применения, направленные на достижение высокой трансгенной экспрессии. В соответствии с изобретением решение такой проблемы достигается введением системы с положительной обратной связью в саму конструкцию на основе нуклеиновой кислоты. Полученная в результате система обозначается в тексте как "самоусиливающаяся экспрессионная система".

В соответствии с одним из воплощений изобретения предлагается конструкция на основе нуклеиновой кислоты, включающая по крайней мере один первый структурный ген, кодирующий активное соединение; по крайней мере один второй структурный ген, кодирующий белок фактора транскрипции, и по крайней мере одну активационную последовательность, состоящую из по крайней мере одной последовательности, которая связывается с белком фактора транскрипции, и по крайней мере одной промоторной последовательности; причем каждая активационная последовательность активирует экспрессию структурного гена и экспрессию белка фактора транскрипции.

В соответствии с другим воплощением изобретения предусматривается конструкция на основе нуклеиновой кислоты, включающая по крайней мере один первый структурный ген, кодирующий активное соединение, по крайней мере один второй структурный ген, кодирующий белок фактора транскрипции, и по крайней мере одну активационную последовательность, состоящую из по крайней мере одной последовательности, которая связывается с указанным белком фактора транскрипции, и по крайней мере одного модуля фармакологического контроля, который содержит в названном порядке по крайней мере один промотор, по крайней мере один ген слитого белка, кодирующий активационный домен белка фактора транскрипции и кодирующий белок сшивающего вещества, по крайней мере один промотор, по крайней мере один ген слитого белка, кодирующий ДНК-связывающий белок и кодирующий белок второго сшивающего вещества, а также по крайней мере одну активационную последовательность, содержащую сайт для ДНК-связывающего белка, причем каждая активационная последовательность активирует экспрессию структурного гена и экспрессию белка фактора экспрессии.

Согласно еще одному воплощению настоящего изобретения предлагается конструкция на основе нуклеиновой кислоты, которая содержит по крайней мере один первый структурный ген, который кодирует активное соединение, по крайней мере один второй структурный ген, который кодирует по крайней мере один первый слитый белок, содержащий активационный домен белка фактора транскрипции, и последовательность, связывающую сшивающее вещество, по крайней мере один третий структурный ген, кодирующий по крайней мере один второй слитый белок, содержащий белок, который связывает сшивающее вещество и ДНК-связывающий белок, по крайней мере одну активационную последовательность, состоящую из по крайней мере одной последовательности, которая связывает указанный второй слитый белок, сшитый с указанным первым слитым белком, с помощью сшивающего вещества, и по крайней мере одной промоторной последовательности, причем каждая активационная последовательность активирует экспрессию по крайней мере одного из указанных структурных генов.

Другие воплощения могут быть легко поняты специалистом в данной области из прочтения описания и прилагаемой формулы изобретения.

Самоусиливающаяся экспрессионная система В соответствии с простейшим воплощением новая самоусиливающаяся экспрессионная система содержит следующие компоненты: a) по крайней мере одну последовательность а) и/или а') для связывания белка фактора транскрипции d), b) по крайней мере одну промоторную последовательность b) и/или b') c) по крайней мере один структурный ген с), кодирующий активное соединение, и d) по крайней мере один ген, кодирующий белок фактора транскрипции а), который связывается компонентом а).

В соответствии с настоящим изобретением компоненты а) и/или а') и b) и/или b') составляют последовательность для активации транскрипции структурного гена с) и для активации экспрессии белка фактора транскрипции d).

В соответствии с предпочтительной формой изобретения компоненты могут быть расположены, как показано на фиг.1.

Связывающие последовательности а) и а') могут быть одинаковыми или различными и они связывают фактор транскрипции d).

Промоторные последовательности [компоненты b) и b')] могут быть различными или одинаковыми. Низкий уровень активации промоторных последовательностей b) и b') приводит к низкому уровню экспрессии структурного гена [компонент с)] и гена белка фактора транскрипции d) [компонент d)]. Полученный таким образом белок фактора транскрипции d) в свою очередь связывается со связывающими последовательностями [компоненты а) и а')]. В свою очередь такое связывание активирует промоторные последовательности b) и b'), вызывая усиленную экспрессию как структурного гена, так и гена белка фактора транскрипции d). Такая усиленная экспрессия дает в результате повышенное количество белка фактора транскрипции d), который функционирует по принципу обратной связи и дополнительно стимулирует такую систему.

В соответствии с настоящим изобретением расположение компонентов, показанное на фиг.1, может быть дополнено (т.е. осуществлено "добавление" на конце в направлении, обратном транскрипции) генами, кодирующими ядерный экспортный сигнал (NES) и ядерный экспортный сигнал (NEF) на 3' конце структурного гена. Экспрессия NEF находится под контролем дополнительного промотора (компонент b'''). Такая дополнительная промоторная последовательность может быть идентичной или отличной от любой части активационных последовательностей [компоненты а) и b') и/или а') и b')], показанных на фиг.2.

Ядерный экспортный сигнал (NES) представляет собой нуклеотидную последовательность, которая препятствует транспорту преинформационной РНК, связанной с ней, через ядерную мембрану. Следовательно, NES сам по себе представляет ядерный сигнал удерживания (NRS). Однако в том случае, когда NRS связывает экспортный белок, обозначенный в тексте как "ядерный фактор экспорта" или "NEF", NRS выполняет функцию NES. Поэтому ядерный фактор экспорта (NEF) опосредует транспорт NES-содержащей преинформационной или информационной РНК из ядра клетки в цитоплазму. Следовательно, NES-содержащая преинформационная или информационная РНК секретируется из ядра клетки в результате его связывания с NEF, как это описано Fisher с сотр., Cell, 82, 475 (1995).

В соответствии с настоящим изобретением компоненты с) и d) также могут быть связаны друг с другом (т.е. "взаимно связаны") с помощью сайта внутреннего входа рибосомы (IRES) вместо соединения с компонентами а') и b'). Такие IRES приводят к экспрессии двух ДНК-последовательностей, которые связаны друг с другом с помощью IRES.

Связывание с помощью IRES может осуществляться, например, так, как показано на фиг.3.

Такое расположение в той же степени гарантирует, что при слабой активации промоторной последовательности ген белка фактора транскрипции [компонент d)] также будет экспрессирован с помощью IRES последовательности. Такая экспрессия осуществляется при экспрессии структурного гена [компонент с)]. Кроме этого, белок фактора транскрипции соединяется со связующей последовательностью а), которая усиливает активацию промоторной последовательности b), усиливает экспрессию структурного гена с) и еще раз через последовательность IRES также усиливает экспрессию гена белка фактора транскрипции d).

Расположение в соответствии с изобретением индивидуальных компонентов, показанное на фиг.1-3, представляет собой самоусиливающуюся экспрессионную систему, которая действует так, как показано на фиг.4. Самоусиливающаяся экспрессионная система может быть расширена связыванием вместе нескольких идентичных или различных последовательностей для структурных генов [компоненты с), с') и с'')]. Такие структурные гены связаны друг с другом с помощью идентичных или различных IRES последовательностей или через связывающую последовательность а), промоторную последовательность b') и промоторную последовательность b''). Пример такого расположения приведен на фиг.5. Самоусиливающаяся экспрессионная система также может быть расширена совместным связыванием нескольких идентичных или различных генов белка фактора транскрипции d) [компоненты d), d') и d'')]. Один из характерных примеров показан на фиг.6, где изображено связывание с помощью IRES последовательностей. Такие IRES последовательности, необязательно, могут быть одинаковыми.

Во всех активационных последовательностях связывающая последовательность а) предпочтительно относится к одному типу последовательностей. Все белки фактора транскрипции d), d') и d'') должны связываться с такой связывающей последовательностью. В том случае когда связывающие последовательности не относятся к одному и тому же типу (например, в том случае, когда компонент а) имеет значение отличное от значения компонента а'), белки фактора транскрипции (компоненты d), d') и d'')) должны связываться со всеми связывающими последовательностями. Предпочтительно активационные последовательности конструируются или отбираются таким образом, что они распознаются всеми продуктами белков фактора транскрипции d), d') и d'').

Тем же способом, что показан на фиг.2, компоненты, изображенные на фиг. 3, могут быть дополнены генами, кодирующими ядерный экспортный сигнал (NES) и ядерный экспортный фактор. Такое расположение с NES геном на 3' конце структурного гена [компонент с)] и NEF-геном показано на фиг.7. В последнем примере NEF активируется отдельно через компонент b'''), представляющий собой дополнительную промоторную последовательность. Последовательность компонента b''' может быть идентичной или неидентичной последовательностям компонентов а) и b).

Фармакологически контролируемый промоторный модуль.

В наипростейшем виде новый фармакологически контролируемый промоторный модуль ("фармакологический контрольный модуль") включает следующие компоненты: e) по крайней мере одну промоторную последовательность, f) по крайней мере один ген, кодирующий слитый белок f), который содержит активационный домен белка фактора транскрипции и сшивающее вещество [компонент j)] связывающий белок А, g) по крайней мере одну дополнительную промоторную последовательность [идентичную или неидентичную компоненту е)] или по крайней мере одну IRES, h) по крайней мере один ген, кодирующий слитый белок h), который содержит ДНК-связывающий домен и сшивающее вещество [компонент j)] - связывающий белок В, i) по крайней мере одну активационную последовательность, имеющую сайт связывания слитого протеина h), и j) по крайней мере одно сшивающее вещество j), которое содержит как сайт А) для связывания белка А в слитом белке f) [продукт экспрессии компонента f)], так и сайт В) для связывания белка В) в слитом белке h) [продукт экспрессии компонента h)].

Компоненты e-i) могут быть расположены, например, в таком порядке, который изображен в схеме, приведенной на фиг.8. Такое расположение обеспечивает экспрессию слитых белков f) и h) [компоненты f) и h)] при активации промоторных последовательностей е) и g). В присутствии сшивающего вещества [компонент j)] два таких слитых белка связываются друг с другом ("взаимно связываются") с образованием функционального белка фактора транскрипции, предназначенного для активации активационной последовательности [компонент i)]. При таком воплощении изобретения промоторный модуль, состоящий из индивидуальных компонентов, функционирует в присутствии такого сшивающего вещества, как компонент j). Такой модуль становится функциональным при добавлении сшивающего вещества компонента j). Пример такого технического решения представлен на фиг.9.

Самоусиливающаяся, фармакологически контролируемая экспрессионная система.

Самоусиливающаяся экспрессионная система может быть объединена фармакологически контролируемым промоторным модулем. Такая комбинация может быть осуществлена, например, путем вставки фармакологически контролируемого промоторного модуля [компоненты e)-i)] в самоусиливающуюся экспрессионную систему (см. фиг.1, 2, 3 или 7) вместо промоторной последовательности [компонент b) и/или b')]. Пример конструкции такой комбинированной нуклеотидной последовательности проиллюстрирован на фиг.10. В таком примере структурный ген транскрибируется лишь в том случае, когда слитые белки f) и h) [продукты экспрессии компонентов f) и h)] связаны с помощью сшивающего вещества компонента j) с образованием белка фактора транскрипции.

С другой стороны, или кроме этого, фармакологически контролируемый промоторный модуль может быть вставлен в самоусиливающуюся экспрессионную систему вместо гена белка фактора транскрипции [компонент d)], последовательности для связывания белка фактора транскрипции а) [компонент а)] и промоторной последовательности b)[компонент b)]. В этом случае сайт связывающего компонента h) должен быть присоединен, по крайней мере, его 5' концом, к одной из промоторных последовательностей е) и g). Пример конструкции такой объединенной нуклеотидной последовательности приведен на фиг.11.

Самоусиливающаяся система может соединяться с фармакологически контролируемым промоторным модулем и другими способами. Так, например, фиг.8 показывает, что промоторная последовательность [компонент b''')] NEF (см. фиг.2 или 7) может быть заменена на фармакологически контролируемый промоторный модуль. Один из путей конструирования нуклеотидной последовательности показан на фиг.12.

Нуклеиново-кислотные конструкции изобретения преимущественно состоят из ДНК. Термин "конструкция на основе нуклеиновой кислоты" обозначает искусственную структуру, содержащую нуклеиновую кислоту, которая может транскрибироваться в клетке-мишени. Конструкцию на основе нуклеиновой кислоты преимущественно вставляют в вектор. В этом контексте особенно желательны плазмидный вектор или вирусный вектор.

В зависимости от выбора промоторной последовательности новая конструкция на основе нуклеиновой кислоты может использоваться для неспецифической экспрессии структурного гена [компонент с)]. С другой стороны, экспрессия дополнительно контролируется специфичностью клетки, специфичностью вируса, конкретными условиями или природой клеточного цикла. Структурный ген предпочтительно кодирует фармакологически активное соединение или энзим, который расщепляет неактивный предшественник лекарства с образованием активного лекарства. Дополнительно структурный ген может быть предназначен для экспрессии энзим-лигандного слитого белка. В этом случае лиганд может быть связан с поверхностью клетки. В этом контексте наиболее предпочтительным является лиганд, связанный с поверхностью пролиферирующей эндотелиальной клетки или опухолевой клетки.

Настоящее изобретение также относится к клеткам, особенно к дрожжам или клеткам млекопитающего, которые содержат новую конструкцию на основе нуклеиновой кислоты. Согласно особенно предпочтительному воплощению конструкцию на основе нуклеиновой кислоты вводят в клеточную линию, которая трансфицирована добавлением или введением сшивающего вещества [компонент j)]. Введение сшивающего вещества стимулирует экспрессию структурного гена. Клетки, содержащие такие конструкции, могут применяться для приготовления фармакологической композиции. Вместе с тем такие клетки также могут быть введены пациенту в качестве терапевтического агента или фармацевтической композиции для лечения болезни. С другой стороны, новая конструкция на основе нуклеиновой кислоты может быть встроена в вектор и непосредственно, местно или парентерально введена пациенту. При применении такая конструкция предназначается для конкретного заболевания, и при этом она экспрессирует один или более белков или нуклеиновую кислоту, которые предотвращают или улучшают один или более симптомов заболевания. Как известно специалисту в данной области, количество конструкции на основе нуклеиновой кислоты, подлежащее применению в данном контексте, определяется посредством пути введения, состоянием пациента и природой заболевания.

В случае непосредственного введения пациенту может быть дополнительно введено сшивающее вещество [компонент j)] с целью экспрессии структурного гена. Сшивающее вещество вызывает образование полного белка фактора транскрипции путем связывания слитого белка f) со слитым белком h) в трансфекцированных клетках, как это показано на фиг.9. Следовательно, трансфицированные клетки экспрессируют структурный ген лишь во время присутствия в организме сшивающего вещества. Длительность и эффективность экспрессии могут контролироваться применением сшивающего вещества.

Предпочтительное применение новой конструкции на основе нуклеиновой кислоты заключается в лечении заболевания с помощью лекарственного средства, основанного на введении конструкции на основе нуклеиновой кислоты в клетку-мишень и экспрессии такой конструкции, осуществляемой неспецифическим, вирус-специфическим или клетка-мишень специфическим, и/или клеточный цикл - специфическим способом, посредством введения сшивающего вещества.

Нуклеиново-кислотные конструкции настоящего изобретения могут использоваться для получения фармацевтической композиции путем синтеза в клетке. В этом контексте клетка трансформируется под действием ДНК-конструкции настоящего изобретения. Затем трансформированные клетки культивируют с целью получения клона клеток, в результате чего создаются множественные копии ДНК-конструкции. Предпочтительно использовать амплификацию гена для увеличения числа копий ДНК-конструкции в каждой клетке. После культивирования трансформированной клетки для получения множественных копий ДНК-конструкции такая ДНК-конструкция может быть очищена из культивируемых клеток. Предпочтительной культивируемой клеткой для получения множественных копий ДНК-конструкции является E.coli. Очищенную ДНК используют в качестве компонента фармацевтической композиции путем смешивания с такими другими веществами, как буфер, соли или другие экципиенты, известные в данной области техники.

Новые конструкции на основе нуклеиновой кислоты не существуют в природе в такой форме, т. е. структурный ген активного соединения, энзима или лиганд/энзим слитого белка, искусственно комбинируют с новыми нуклеиново-кислотными последовательностями с образованием самоусиливающейся экспрессионной системы. Такую систему также искусственно комбинируют с фармакологически контролируемым промоторным модулем.

Предпочтительно структурные гены, которые вводятся в самоусиливающуюся, фармакологически контролируемую экспрессионную систему, кодируют фармакологически активные соединения. Такие активные соединения представляют собой белки и гликопротеины, которые выбирают из группы, состоящей из цитокинов, факторов роста, рецепторных цитокинов или факторов роста, антител или их фрагментов, белков, обладающих антипролиферативным или цитостатическим действием, ингибиторов ангиогенеза, тромбозиндуцирующих белков, ингибиторов коагуляции, белков плазмы крови, комплементактивирующих белков, веществ вирусной и бактериальной оболочек, гормонов, пептидов, оказывающих влияние на кровообращение, нейропептидов, энзимов и медиаторов, а также слитых белков, содержащих по крайней мере два из таких белков или гликопротеинов.

Подробное описание компонентов самоусиливающейся, фармакологически контролируемой экспрессионной системы 1) Активационные последовательности и белки фактора транскрипции для самоусиливающихся экспрессионных систем.

В соответствии с настоящим изобретением белок фактора транскрипции d) [генный продукт компонента d)] специфически связывается с соответствующей связывающей последовательностью а) [компонент а)], которая, со своей стороны, активирует 3'-соседнюю промоторную последовательность b) (или b', либо b'').

Следовательно, компоненты а) и b) составляют активационную последовательность, которая содержит последовательность для связывания соответствующего белка фактора транскрипции d).

С другой стороны, белок фактора транскрипции d) должен содержать связывающий домен, являющийся специфичным в отношении соответствующей связывающей последовательности активаторной последовательности [компонент а)], а также трансактивационный домен. Дополнительный сигнал ядерной локализации (NLS) промотирует взаимодействие с активационной последовательностью а).

Примерами конструкций на основе нуклеиновой кислоты, удовлетворяющих такой предпосылке, являются: Воплощение А), включающее 1. активационную последовательность, содержащую компонент а), имеющий по крайней мере одну последовательность (например, нуклеотидную последовательность: 5'-CGGACAACTGTT-GACCG-3') для связывания белка Gal4 (Chasman и Kornberg, Mol. Cell. Biol., 10, 2916 (1990)) и, на ее 3'-конце, компонент b), который содержит: основной промотор SV40 (нуклеиновые кислоты 48-5191; Tooze (изд. ), DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor, New York, (1980), New-York; Colg Spring Harbor Laboratory), c-fos-промотор (Das с сотр., Nature, 374, 657 (1995)) и на его 3' конце HSVI VP16 кислый трансактивационный домен (TAD) (аминокислоты 406-488; Treizenberg с сотр., Genes Developm. 2, 718 (1988); Treizenberg, Curr. Opin. Gen. Developm. 5, 190 (1995)), U2sn РНК-промотор и (на его 3' конце) HSVI VP16 TAD или по крайней мере последовательность активационного домена Oct-2 (аминокислоты 438-479; Tanaka с сотр. , Mol. Cell Biol., 14, 6046 (1994); Das с сотр., Nature, 374, 657 (1995)) или HSV ТК промотор (Papavassiliou с сотр. , J. Biol. Chem., 265, 9402) (1990); Park с сотр., Molec. Endocrinol., 7, 319 (1993)) или другой неспецифический, клеточно-специфический, вирус-специфический или клеточный цикл - специфический либо метаболически активируемый промотор, и 2. ген релевантного белка фактора транскрипции d) [компонент d)], содержащий кДНК ДНК-связывающего домена Са14-белка (аминокислоты 1-147; Chasman & Kornberg, Mol. Cell Biol., 10, 2916 (1990)) к 3' концу которого присоединен ядерный локализационный сигнал SV40 (NLS) (SV40 большой Т; аминокислоты 126-132: например, PKKKRKV; Dingwall с сотр., TIBS, 16, 478 (1991)), к 3' концу которого присоединен HSV-1 VP16 кислый трансактивационный домен (TAD) (аминокислоты 406-488; Triezenberg с сотр., Genes Developm. , 2, 718, (1988); Triezenberg, Curr. Opin. Gen.Developm., 5, 190 (1995)).

Воплощение В), включающее 1. активационную последовательность, включающую компонент а), содержащий по крайней мере одну последовательность (например, нуклеотидную последовательность 5'-TACTGTATGTACATACAGTA-3') для связывания Lexa белка (Lexa оператор; Brent с сотр., Nature, 612, 312 (1984)) и на ее 3' конце компонент b), который содержит главный промотор SV40 (нуклеиновые кислоты 48-5191; Tooze (ред.), DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor New York, (1980) New York; Cold Spring Harbor Laboratory) или другой промотор (см. Воплощение А), и 2. ген присоединенного белка фактора транскрипции d) (компонент d)), содержащий кДНК ДНК-связывающего домена Lexa белка (аминокислоты 1-81; Kim с сотр. , Science, 255, 203 (1992)) или полный Lexa белок (аминокислоты 1-202; Brent с сотр., Cell, 43, 729 (1985)), к 3' концу которого присоединен ядерный локализационный сигнал SV40 (NLS) (большой Т SV40; аминокислоты 126-132: например, PKKKRKV; Dingwall с сотр., TIBS 16, 478 (1991)), к 3' концу которого присоединены HSV-1 VP16 кислый трансактивационный домен (TAD) (аминокислоты 406-488; Triezenberg с сотр., Genes Developm., 2, 718, (1988); Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm., 5, 190 (1995)).

Воплощение С, включающее 1. активационную последовательность, содержащую компонент а), включающий по крайней мере одну lac операторную последовательность (например, нуклеотидную последовательность 5'-GAATTGTGAGCTCACAATTC-3') для связывания lac 1 репрессорного белка (Fuerst с сотр. , PNAS США 86, 2549 (1989); Simons с сотр. , PNAS США 81, 1624 (1984) и на ее 3' конце компонент b), который содержит главный промотор SV40 (нуклеиновые кислоты 48-5191; Tooze (изд. DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor New York (1980) New York; Cold Spring Harbor Lab.) или другой промотор (см. Воплощение А), и 2. ген присоединенного белка фактора транскрипции d) (компонент d)), содержащий кДНК lac репрессорного (lac 1) белка (Brown с сотр., Cell 49, 603 (1987); Fuerst с сотр., PNAS США 86, 2549 (1989)), к 3' концу которого присоединен ядерный локализационный сигнал SV40 (NLS) (большой Т SV40; аминокислоты 126-132: например, PKKKRKV; Dingwall с сотр., TIBS, 16, 478 (1991)), к 3' концу которого присоединены HSV-1 VP16 кислый трансактивационный домен (TAD) (аминокислоты 406-488; Triezenberg с сотр., Genes Developm., 2, 718, (1988); Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm., 5, 190 (1995)).

Воплощение D, включающее 1. активационную последовательность, содержащую компонент а), включающий по крайней мере одну тетрациклиновую операторную (tet 0) последовательность (например, нуклеотидную последовательность: 5'-TCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAG-3') для связывания тетрациклинового репрессорного (tet R) белка и на ее 3' конце компонент b), который содержит главный промотор SV40 (нуклеиновые кислоты 48-5191; Tooze (ред.) DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor New York, (1980) New York, Cold Spring Harbor Lab.) или другой промотор (см. Воплощение А), и 2. ген присоединенного белка фактора транскрипции d) (компонент d)), содержащий кДНК тетрациклинового репрессорного (tet R) белка (Gossen с сотр. , PNAS США, 89, 5547 (1992); Dingermann с сотр., ЕМВО J., 11, 1487 (1992)) и на его 3'-конце сигнал ядерной локализации SV40 (NLS) (большой Т SV40; аминокислоты 126-132: например, PKKKRKV; Dingwall с сотр. , TIBS, 16, 478 (1991)) и на его 3' конце HSV-1 VP16 кислый трансактивационный домен (TAD) (аминокислоты 406-488; Triezenberg с сотр., Genes Developm., 2, 718, (1988); Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm., 5, 190 (1995)).

Воплощение Е, включающее 1. активационную последовательность, содержащую компонент а), содержащий по крайней мере одну последовательность (например, нуклеотидную последовательность 5'-TAATGAT(GGGCG-3') для связывания ZFHD-1 белка (Pomerantz с сотр. , Science, 267, 93 (1995)) и на ее 3'-конце компонент b), который содержит главный промотор SV40 (нуклеиновые кислоты 48-5191; Tooze (ред.) DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor New York, (1980) New York, Cold Spring Harbor Lab.) или другой промотор (см. Воплощение А), и 2. ген присоединенного белка фактора транскрипции d) (компонент d)), содержащий кДНК ZFHDI-белка (Pomerantz с сотр., Science, 267, 93 (1995)) и на его 3' конце ядерный локализационный сигнал SV40 (NLS) (большой Т SV40; аминокислоты 126-132: например, PKKKRKV; Dingwall с сотр., TIBS, 16, 478 (1991)) и на его 3' окончании HSV-1 VP16 кислый трансактивационный домен (TAD) (аминокислоты 406-488; Triezenberg с сотр., Genes Developm., 2, 718, (1988); Triezenberg, Curr. Opin.Gen.Developm., 5, 190 (1995)).

2) Фармакологически контролируемые промоторные модули В соответствии с настоящим изобретением следующие гены являются специфическими компонентами фармакологически контролируемых промоторных модулей (см. также фиг.8 и 9): для слитого белка f) [компонент f)] - ген активационного домена белка фактора транскрипции и - по крайней мере один ген белка А, который связывает сшивающее вещество j) при необходимости, - дополненный сигналом ядерной локализации (NLS) для слитого белка h) [компонент h)]: - по крайней мере один ген белка В, который связывает сшивающее вещество j) и - ген белка, который связывается с ДНК активационной последовательности [компонент i)] для сшивающего вещества - компонент j), имеющий по крайней мере один сайт для связывания белка А и для связывания белка В и активационную последовательность, содержащую сайт для связывания слитого белка h) [компонент h)] и промоторный элемент для компонента i).

Выбор сшивающего вещества [компонент j)] неизбежно определяет природу компонент j) - связывающих белков А и В в компонентах f) и h) соответственно. В таком контексте компонент j)-связывающие белки А и В в компонентах f) и h) могут быть одинаковыми или различными. Идентичные компонент j) - связывающие белки А и В могут использоваться, главным образом, в том случае, когда сшивающее вещество [компонент j)] обладает несколькими идентичными связывающими сайгами. Однако в соответствии с настоящим изобретением неидентичные компонент j)- связывающие белки А и В являются предпочтительными в компонентах f) и h).

Это означает, что сшивающее вещество [компонент j)] связано слитым белком f) [компонент f)] на сайте, который отличен от сайта, на котором это вещество связано слитым белком h) [компонент h)], в результате чего слитые белки f) и h) не конкурируют друг с другом за связывание со сшивающим веществом.

Могут использоваться такие сшивающие вещества, которые, как уже известно, способны связываться с конкретными клеточными белками, гены которых могут использоваться в компонентах f) и h) фармакологически контролируемого промотора.

Однако настоящее изобретение, в частности, также относится к использованию моноклональных антител, а также их производных - рекомбинантных антител или их фрагментов, которые связываются с сшивающим соединением j). Вставка моноклональных антител, особенно их рекомбинантных Fv фрагментов, в слитые белки f) и h) [компоненты f) и h)] представляет собой особый отличительный признак настоящего изобретения. В этом контексте рекомбинантные Fv фрагменты, которые распознают различные сайты связывания (эпитопы А и В-связывающих сайтов соответственно) на сшивающем веществе [компонент j)] особенно предпочтительны для использования в литых белках [компоненты f) и h)].

В соответствии с настоящим изобретением могут использоваться как мышиные, так и человеческие моноклональные антитела. Мышиные моноклональные антитела предпочтительно используются в гуманизированной форме. Гуманизация осуществляется в соответствии со способом, описанным Winter с сотр., (Nature, 349, 293 (1991)) и Hoogenbooms с сотр., (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol., 36, 19 (1993)).

Фрагменты антител получают в соответствии с уровнем техники, например с помощью способа, описанного Winter с сотр., Nature, 349, 293 (1991); Hoogenbooms с сотр., Rev. Tr. Transfus. Hemobiol., 36, 19 (1993); Girol, Mol.Immunol., 28, 1379 (1991) и Huston с сотр., Int. Rev. Immunol., 3_0, 195 (1993).

Фрагменты рекомбинантных антител получают непосредственно из существующих гибридом или выделяют из библиотек фрагментов мышиных или человеческих антител (Winter с сотр., Annu. Rev. Immunol., 12, 433 (1994)) с использованием фаг-идентификационной технологии (Smith, Science, 228, 1315 (1985)). Затем такие фрагменты антител используют непосредственно на генетическом уровне для слияния с другими белками или пептидами (с активационным доменом белка фактора транскрипции (компонент f) или с ДНК-связывающим белком (компонент h)).

Для получения фрагментов рекомбинантного антитела из гибридом генетическую информацию, которая кодирует антиген-связывающие домены (VH и VL) антител получали путем выделения мРНК, обратной транскрипции РНК в кДНК и последующей амплификации кДНК с помощью полимеразной цепной реакции (Saiki с сотр., Science, 230, 1350 (1985)) с использованием олигонуклеотидов, являющихся комплементарными к 5' и 3' концам соответственно вариабельных фрагментов (Orlandi с сотр., PNAS-США 86, 3833 (1989). VH и VL-фрагменты затем клонировали в векторы бактериальной экспрессии, например, в виде Fv-фрагментов (Skerra и , Science, 240, 1038 (1988), одно-цепочечных Fv-фрагментов (scFv) (Bird с сотр. Science, 242, 423 (1988); Huston с сотр., PNAS-США 85, 5879 (1988) или Fab-фрагментов (Better с сотр., Science, 240, 1041 (1988)).

Новые фрагменты антител могут быть также выделены непосредственно из библиотек антител (иммунные библиотеки или простые библиотеки) мышиного или человеческого происхождения с использованием фаг-индикационной технологии. В фаговой индикации фрагментов антител, антигенсвязывающие домены подвергают клонированию либо в фаговый геном (McCafferty с сотр., Nature, 348, 522 (1990)), или в фагмидные векторы (Breitling с сотр., Gene, 104, 147 (1991)), в виде scFv фрагментов (McCafferty с сотр., Nature, 348, 522 (1990)), или Fab-фрагментов (Hoogenboom с сотр., Nucl. Acid Res., 19, 4133 (1991); Barbas с сотр., PNAS США 88, 7978 (1991)) как слитые белки совместно с g3P оболочечным белком нитчатых бактериофагов. Антигенсвязывающие фаги подвергали селекции на пластиковых подложках с загруженным антигеном (отмывка) (Marks с сотр. , J. Mol. Biol., 22, 581 (1991)), на парамагнитных гранулах с конъюгированным антигеном (Hawkins с сотр., J. Мо1. Biol., 226, 889 (1992)) или путем связывания с поверхностью клеток (Marks с сотр., Bio/Technol., 11, 1145 (1993)).

Иммунные библиотеки готовили PCR-амплификацией вариабельных фрагментов антител из В лимфоцитов иммунизированных животных (Sastry с сотр., PNAS-США 86, 5728 (1989); Ward с сотр., Nature, 341, 544 (1989); Clackson с сотр., Nature, 352, 624 (1991)) или пациентов (Mullinax с сотр., PNAS-США 87, 8095 (1990); Barbas с сотр., PNAS-США 88, 7978 (1991). Для этой цели использовали комбинации олигонуклеотидов, специфичных к мышиным (Orlandi с сотр., PNAS-США 86, 3833 (1989); Sastry с сотр., PNAS-США 86, 5728 (1989)) или человеческим иммуноглобулиновым генам (Larrick с сотр., BBRC, 160, 1250 (1989)), или специфичным к семействам человеческих иммуноглобулиновых генов (Marks с сотр., Eur. J. Immunol., 21, 985 (1991)).

Простые библиотеки могут быть приготовлены с использованием неиммунизированных доноров в качестве источника иммуноглобулиновых генов (Marks с сотр. , J. Мо1. Biol., 222, 581 (1991)). С другой стороны, гены иммуноглобулиновой зародышевой линии могут использоваться для получения полусинтетических спектров антител, причем гипервариабельный участок 3 вариабельных фрагментов амплифицируют с помощью PCR с использованием вырожденных праймеров (Hoogenboom и Winter, J. Mol. Biol., 227, 381 (1992); Barbas с сотр., PNAS-США 89, 4457 (1992); Nissim с сотр., ЕМВО J., 13, 692 (1994); Griffiths с сотр. , ЕМВО J., 13, 3245 (1994)). По сравнению с иммунными библиотеками так называемые "однососудные" (single-pot) библиотеки обладают тем преимуществом, что фрагменты антител против большого числа антигенов могут быть выделены из одной единственной библиотеки Nissim с сотр., ЕМВО J., 13, 692 (1994).

Аффинность фрагментов антител может быть дополнительно повышена с использованием фаг-индикационной технологии, с помощью новых библиотек, полученных из фрагментов предсуществующих антител с помощью неспецифического (Hawkins с сотр., J. Mol. Biol., 226, 889 (1992); Gr