Аналог природного фактора роста кератиноцитов (варианты), фармацевтическая композиция, рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая аналог, экспрессионный вектор, штамм e.coli, трансформированный вектором, способ получения аналога и способ стимулирования образования нефибробластных эпителиальных клеток

Аналог природного фактора роста кератиноцитов (варианты), фармацевтическая композиция, рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая аналог, экспрессионный вектор, штамм e.coli, трансформированный вектором, способ получения аналога и способ стимулирования образования нефибробластных эпителиальных клеток

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии, к генной и белковой инженерии и может быть использовано для получения аналога фактора роста кератиноцитов (KGF). Аналог KGF получают путем модификации одной или нескольких аминокислот в области 32-55 аминокислот в последовательности SEQ ID NO:2. Остаток цистеина в положениях 32 и 46 делетируют или заменяют другой аминокислотой. Экспрессионный вектор, содержащий рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую аналог KGF, трансформируют в клетки E.coli. Трансформированный штамм E.coli культивируют и получают аналог KGF. Аналог KGF используют в фармацевтической композиции для стимулирования роста эпителиальных клеток. Изобретение позволяет получать аналоги KGF, проявляющие повышенную устойчивость при хранении. 7 с. и 25 з.п. ф-лы, 50 ил., 5 табл.

Настоящее изобретение относится к технологии рекомбинантной ДНК и белковой инженерии. Конкретно, методологии рекомбинантной ДНК были применены для получения полилептидных аналогов фактора роста кератиноцитов (KGF), сильного митогена роста нефибробластных эпителиальных клеток, характеризующихся тем, что аналоги обладают повышенной устойчивостью по сравнению с таковой KGF-предшественника.

Предпосылки создания изобретения Сложный процесс образования и восстановления ткани опосредуется рядом белковых факторов, иногда называемых факторами роста мягких тканей. Эти молекулы обычно высвобождаются одним типом клеток и действуют, влияя на пролиферацию других типов клеток (Rubin et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:802-806). Некоторые факторы роста мягких тканей секретируются определенными типами клеток и влияют на пролиферацию, дифференцировку и/или созревание чувствительных клеток в процессе развития многоклеточных организмов (Finch et al. (1989), Science, 24:752-755). Помимо их роли в процессе развития организмов, некоторые из них имеют значение для продолжительного здоровья и сохранения более зрелых систем. Например, у млекопитающих есть много систем, в которых происходит быстрый "кругооборот" клеток. Такие системы включают кожу и желудочно-кишечный тракт, каждый из которых состоит из эпителиальных клеток. В эту группу факторов роста мягких тканей входит семейство белков факторов роста фибробластов (FGF).

На сегодня известно 8 членов семейства FGF, которые обладают родственными первичными структурами: основный фактор роста фибробластов, bFGF (Abraham et al. (1986), EMBO J., 5:2523-2528); кислый фактор роста фибробластов, aFGF (Jaye et al. (1986), Science, 233:541-545); int-2 генный продукт, int-2 (Dickson and Peters (1987), Nature, 326:833); hst/kFGF (Delli-Bovi et al. (1987), Cell, 50:729-737 and Yoshida et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7305-7309); FGF-5 (Zhan et al. (1987), Mol. Cell. Biol, 8: 3487-3495); FGF-6 (Marics et al. (1989), Oncogene, 4:335-340); фактор роста кератиноцитов (Finch et al. (1989), Science, 24:752-755) и гисактофилин (Habazzettl et al. (1992), Nature, 359:855-858).

Среди семейства белков FGF фактор роста кератиноцитов (KGF) является уникальным эффектором пролиферации нефибробластных эпителиальных клеток, происходящих из мезенхимных тканей. Термин "природный KGF" относится к природному человеческому (hKGF) или рекомбинантному (rKGF) полипептиду (с или без сигнальной последовательности), что отражено аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:2, или его аллельному варианту. [Если не указано иначе, нумерация аминокислот в описанных ниже молекулах соответствует таковой для зрелой формы природной молекулы (т.е. минус сигнальная последовательность), что изображено аминокислотами от 32 до 194 в SEQ ID NO: 2].

Природный KGF может быть выделен из естественных "человеческих" источников (hKGF) или получен с помощью рекомбинантной ДНК (rKGF) (Finch et al. (1989), supra; Rubin et al. (1989), supra; Ron et al. (1993), The Journal of Biological Chemistry, 268(4):2984-2988 и Yan et al. (1991), In Vitro Cell. Dev. Biol., 27A:437-438).

Известно, что природный KGF является относительно неустойчивым в водной среде и что он претерпевает химический и физический распад, приводящий к потере биологической активности вследствие процессинга и хранения (Chen et al. (1994), Pharmaceutical Research, 11:1582-1589). Природный KGF также склонен к объединению (агрегации) при повышенных температурах и становится неактивным в кислых условиях (Rubin et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 802-806). Агрегация природного KGF в водном растворе приводит к дезактивированному белку. Это является невыгодным, так как такая потеря активности делает его непрактичным для хранения водных составов белков природного KGF в течение длительного времени или для введения белка в течение длительных периодов. Более того, является особенно проблематичным приготовление фармацевтических составов, так как известно, что агрегированные белки являются иммуногенными (Cleland et al. (1993), Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems, 10:307-377; Robbins et al. (1987), Diabetes, 36:838-845 и Pinckard et al. (1967), Clin. Exp. Immunol., 2:331-340).

Природный KGF содержит пять остатков цистеина, а именно аминокислоты 1, 15, 40, 102 и 106 (Finch et al. (1989), Science, 24:752-755). Хотя сообщалось о цистеиновом составе природного KGF, не сообщалось о роли, которую играли остатки цистеина в активности (например, в особенности биологической активности) и третичной структуре (например, склонности к образованию нежелательных меж- и внутримолекулярных дисульфидных связей). Таким образом, в предыдущей технике нет сведений, даже если они известны, о том, что остатки цистеина существенны или участвуют в образовании нежелательных дисульфидных связей, что делает белок чувствительным к агрегации и/или неустойчивости.

Чтобы попытаться улучшить или другим способом изменить одну или более характеристик нативного KGF, можно применить белковую инженерию. Технология рекомбинантной ДНК была применена для модификации последовательностей природного KGF. Ron et al. (1993), J. Biol. Chem., 268(4):2984-2988 сообщил о модифицированных KGP полипептидах, у которых удалены 3, 8, 27, 38 или 49 аминокислот на N-конце. Полипептиды с удаленными 3, 8 или 27 N-концевыми остатками сохраняли способность связываться с гепарином; другие же нет. Также сообщалось, что полипептиды с отсутствующими 3 и 8 остатками являются полностью активными, тогда как форма с удаленными 27 остатками была в 10-20 раз менее активна в качестве митогена, а формы, у которых отсутствуют 38 или 49 аминокислот, не обладали митогенной активностью. Устойчивость модифицированных KGF полипептидов не обсуждалась и о ней ничего не сообщалось.

Опубликованная РСТ патентная заявка No 90/08771, supra, также сообщала о получении химерного белка, в котором примерно первые 40 N-концевых аминокислот зрелой формы природного KGF были соединены с С-концевой частью (примерно 140 аминокислот) aFGF. Сообщалось, что химера нацелена на кератиноциты, как KGF, но в ней отсутствует чувствительность (предрасположенности) к гепарину, что характерно для aFGF, но не KGF. Устойчивость химеры не обсуждалась и о ней не сообщалось.

Таким образом, в литературе не сообщалось о модифицированной молекуле KGF, имеющей значительно более высокую устойчивость по сравнению с природным KGF. Более того, в литературе не приводилось достаточных доводов или доказательств успешного получения молекул KGF с такими желательными (заданными) характеристиками.

Обычно влияние на биологическую активность любой замены аминокислот в белке меняется в зависимости от ряда факторов, включая трехразмерную структуру белка, и касается или нет модификации участка рецепторного связывания первичной последовательности белка. Так как ни трехразмерная структура, ни участок рецепторного связывания первичной структуры природного KGF не были опубликованы, знание предыдущей техники не позволяет делать обобщение о влиянии модификаций аминокислот на природный KGF на основе влияния модификаций аминокислот даже на обычные классы белков.

Целью настоящего изобретения является получение аналогов полипептидов и молекул нуклеиновых кислот, кодирующих такие аналоги, которые проявляют повышенную устойчивость (например, при типичных рН, термических и/или других условиях хранения) по сравнению с природным KGF.

Сущность изобретения Настоящее изобретение предлагает новые, биологически активные полипептидные аналоги KGF. Для целей согласно данному изобретению термин "KGF" включает природный KGF и белки, характеризующиеся пептидной последовательностью, практически такой же, что и пептидная последовательность природного KGF, которая сохраняет остатки цистеина, соответствующие Cys¹ и Cys¹⁵ природного KGF (Cys³² и Cys⁴⁶ SEQ ID NO:2), и которая сохраняет всю или часть биологической активности природного KGF, в особенности пролиферацию нефибробластных эпителиальных клеток. Когда делаются ссылки на фиг.4,7-24 и 37-50 и определенное положение аминокислоты, то первому члену последовательности присваивается номер остатка 0. Под "характеризующийся пептидной последовательностью, практически такой же, что и пептидная последовательность природного KGF" понимается пептидная последовательность, которая кодируется последовательностью ДНК, способной гибридизоваться с нуклеотидами от 201 до 684 SEQ ID NO:1, предпочтительно в жестких условиях гибридизации.

Определение положения соответствующей аминокислоты между двумя аминокислотными последовательностями может быть сделано выстраиванием (выравниванием и сравнением) двух последовательностей с целью получить максимальное число совпадений остатков, включая сдвиг амино и/или карбоксильных концов, вводя щели, если требуется, и/или удаляя остатки, присутствующие в "кандидате" в качестве инсертов. Поиски баз данных, секвенирование и манипуляции можно осуществлять, используя одну из хорошо известных и привычно употребляемых программ анализа гомологии/идентичности последовательностей (например, Pearson and Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85: 2444-2448; Altschul et al. (1990), J. Mot. Biol., 215:403-410; Lipman and Pearson (1985), Science, 222: 1435 или Devereux et al. (1984), Nuc. Acids Res., 12:387-395).

Жесткие условия в контексте гибридизации являются жесткими условиями (объединяющими), касающимися соли, температуры, органических растворителей и других параметров, обычно контролируемых в реакциях гибридизации. Примерными жесткими условиями гибридизации является гибридизация при 4SSC при 62-67^oС с последующим промыванием в 0.1SSC при 62-67^oС примерно в течение часа. Или же примером жестких условий гибридизации является гибридизация в 45-55% формамиде, 4SSC при 40-45^oС (См. Т. Maniatis et al. Molecular Cloning (A Laboratory Manual); Cold Spring Harbor Laboratory (1982), стр.387-389].

Таким образом, белки включают аллельные вариации, или делецию(и), замену(ы) или инсерцию(и) аминокислот, включая фрагменты, химерные или гибридные молекулы природного KGF. Один пример KGF включает изменение заряда полипептида, в котором один или более аминокислотных остатков 41-154 природного KGF (предпочтительно остатки Arg⁴¹, Gln⁴³, Lys⁵⁵, Lys⁹⁵, Lys¹²⁸, Asn¹³⁷, Gln¹³⁸, Lys¹³⁹, Arg¹⁴⁴, Lys¹⁴⁷, Gln¹⁵², Lys¹⁵³ или Thr¹⁵⁴) удалены или заменены нейтральным остатком или отрицательно заряженным остатком, выбранным с целью воздействовать на белок с пониженным положительным зарядом (как раскрыто в заявке, являющейся совместной собственностью U.S.S.N. 08/323,337, поданной 13 октября 1994 г.), конкретно включающий R(144)Q, KGF, имеющий замену аргинина на глутамин в положении аминокислоты 144 природного KGF. Другой пример KGF включает белки, полученные заменой, по крайней мере, на одну аминокислоту с более высоким потенциалом петлеобразования, по крайней мере, одной аминокислоты в петлеобразующем участке Asn¹¹⁵-His¹¹⁶-Tyr¹¹⁷-Asn¹¹⁸-Thr¹¹⁹ природного KGF (как раскрыто в находящейся в общей собственности заявке U.S.S. N. 08/323,473, поданной 13 октября 1994 г.), конкретно включающий H(116)G, KGF, имеющий замену гистидина на глицин в положении 116 аминокислоты природного KGF. Еще один дополнительный пример включает белки с одной или более аминокислотными заменами, делениями или присоединениями на участке 123-133 (аминокислоты 154-164 SEQ ID NO:2) природного KGF; эти белки могут проявлять агонистическую или антагонистическую активность. Удивительным является то, что, как было открыто, когда молекула KGF (т.е. молекула-предшественник) содержит остатки, соответствующие (как определено описанными выше методами) Cys¹ и Cys¹⁵ природного KGF (цистеиновым остаткам 32 и 46 SEQ ID NO:2), модифицируется заменой соответствующих цистеинов, то образующийся в результате KGF аналог обладает повышенной устойчивостью по сравнению с молекулой-предшественником. Предпочтительно, помимо повышенной устойчивости, чтобы данное изобретение было направлено на те аналоги, которые полностью проявляют биологическую активность (т.е., по меньшей мере, практически одинаковое рецепторное связывание или сродство) по сравнению с природным KGF.

В другом аспекте изобретения описаны молекулы очищенной и выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующей различные биологически активные полипептидные аналоги KGF. В одном воплощении изобретения такие нуклеиновые кислоты представляют собой молекулы ДНК, клонированные в векторы биологически функциональной плазмиды или вируса. В другом воплощении изобретения конструкции нуклеиновой кислоты могут затем применяться для того, чтобы стабильно трансформировать прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяина. Еще в одном воплощении данное изобретение включает процесс, в котором или прокариотическая (предпочтительно Е. coli) или эукариотическая клетка-хозяин, стабильно трансформированная молекулой нуклеиновой кислоты, выращивается в условиях соответствующей питательной среды так, чтобы была возможна экспрессия KGF аналога. После экспрессии образовавшийся рекомбинантный полипептид может быть выделен и очищен.

Дополнительный аспект согласно данному изобретению касается фармацевтических составов, содержащих терапевтически эффективное количество аналогового KGF и приемлемый фармацевтический носитель. Такие рецептуры будут полезны при лечении больных, страдающих заболеваниями и поражениями эпителия.

В этом направлении другой аспект относится к способам стимулирования роста эпителиальных клеток с помощью введения больному терапевтически эффективного количества аналога KGF. В одном воплощении изобретения нефибробластные эпителиальные клетки представляют собой клетки, пролиферация которых стимулируется. Такие эпителиальные клетки включают различные клетки придатков, клетки поджелудочной железы, клетки печени, эпителий слизистой оболочки дыхательных путей и желудочно-кишечного тракта.

Краткое описание фигур Фигуры 1 изображают нуклеотидную (SEQ ID NO:1) и аминокислотную (SEQ ID NO:2) последовательности природного KGF (нуклеотиды, кодирующие зрелую форму природного KGF, изображены основаниями от 201 до 684 SEQ ID NO:1, а зрелую форму KGF, изображены аминокислотными остатками от 32 до 194 SEQ ID NO:2).

Фигуры 2A, 2В и 2С изображают карты плазмиды pCFM1156, pCFM1656 и pCFM3102 соответственно.

Фигура 3 изображает нуклеотидную (SEQ ID NO:3) и аминокислотную (SEQ ID NO: 4) последовательности конструкции RSH-KGF.

Фигура 4 показывает нуклеотидную (SEQ ID NO: 5) и аминокислотную (SEQ ID NO:6) последовательности конструкции, содержащейся в плазмиде с геном KGF.

Фигура 5 показывает химически синтезированные OLIGO (олигонуклеотиды) (от OLIGO# 6 до OLIGO#11; SEQ ID NO:12-17 соответственно), применяемые для того, чтобы заменить последовательность ДНК между сайтом KpnI и сайтом EcoRI (от положения аминокислоты 46 до 85 SEQ ID NO:6) в конструкции, содержащейся в плазмиде с геном KGF, чтобы продуцировать конструкцию в плазмиде с геном KGF (dsd).

Фигура 6 изображает химически синтезированные OLIGO (олигонуклеотиды) (от OLIGO# 12 до OLIGO#24; SEQ ID NO:18-30 соответственно), применяемые для синтеза KGF (оптимизированного по кодону).

Фигура 7 изображает нуклеотидную (SEQ ID NO:31) и аминокислотную последовательности (SEQ ID NO:32) C(1,15)S, аналога KGF с заменами цистеина на серии в аминокислотных положениях 1 и 15 природного KGF.

Фигура 8 изображает нуклеотидную (SEQ ID NO:33) и аминокислотную последовательности (SEQ ID NO: 34) N3/C(15)S, аналога KGF с делецией первых трех аминокислот на N-конце и заменой цистеина на серии в аминокислотном положении 15 природного KGF.

Фигура 9 изображает нуклеотидную (SEQ ID NO:35) и аминокислотную (SEQ ID NO: 36) последовательности N3/C(15)-, аналога KGF, имеющего делению из первых 3 аминокислот на N-конце и делению цистеина в аминокислотном положении 15 природного KGF.

Фигура 10 изображает нуклеотидную (SEQ ID NO: 37) и аминокислотную (SEQ ID NO: 38) последовательности N8/C(15)S, аналога KGF, имеющего делению из первых 8 аминокислот на N-конце и замену цистеина на серин в аминокислотном положении 15 природного KGF.

Фигура 11 изображает нуклеотидную (SEQ ID NO:39) и аминокислотную (SEQ ID NO: 40) последовательности N8/C(15)-, аналога KGF, имеющего делению из первых 8 аминокислот на N-конце и делению цистеина в аминокислотном положении 15 природного KGF.

Фигура 12 изображает нуклеотидную (SEQ ID NO:41) и аминокислотную (SEQ ID NO: 42) последовательности N15, аналога KGF, имеющего делецию из первых 15 аминокислот на N-конце природного KGF.

Фигура 13 изображает нуклеотидную (SEQ ID NO:43) и аминокислотную (SEQ ID NO: 44) последовательности N16, аналога KGF, имеющего делецию первых 16 аминокислот на N-конце природного KGF.

Фигура 14 изображает нуклеотидную (SEQ ID NO:45) и аминокислотную (SEQ ID NO: 46) последовательности N17, аналога KGF, имеющего делецию первых 17 аминокислот на N-конце природного KGF.

Фигура 15 изображает нуклеотидную (SEQ ID NO:47) и аминокислотную (SEQ ID NO: 48) последовательности N18, аналога KGF, имеющего делецию первых 18 аминокислот на N-конце природного KGF.

Фигура 16 изображает нуклеотидную (SEQ ID NO:49) и аминокислотную (SEQ ID NO: 50) последовательности N19, аналога KGF, имеющего делецию первых 19 аминокислот на N-конце природного KGF.

Фигура 17 изображает нуклеотидную (SEQ ID NO:51) и аминокислотную (SEQ ID NO: 52) последовательности N20, аналога KGF, имеющего делецию первых 20 аминокислот на N-конце природного KGF.

Фигура 18 изображает нуклеотидную (SEQ ID NO:53) и аминокислотную (SEQ ID NO: 54) последовательности N21, аналога KGF, имеющего делецию первых 21 аминокислот на N-конце природного KGF.

Фигура 19 изображает нуклеотидную (SEQ ID NO:55) и аминокислотную (SEQ ID NO: 56) последовательности N22, аналога KGF, имеющего делецию первых 22 аминокислот на N-конце природного KGF.

Фигура 20 изображает нуклеотидную (SEQ ID NO:57) и аминокислотную (SEQ ID NO: 58) последовательности N23, аналога KGF, имеющего делецию первых 23 аминокислот на N-конце природного KGF.

Фигура 21 изображает нуклеотидную (SEQ ID NO:59) и аминокислотную (SEQ ID NO: 60) последовательности N24, аналога KGF, имеющего делецию первых 24 аминокислот на N-конце природного KGF.

Фигура 22 изображает нуклеотидную (SEQ ID NO:61) и аминокислотную (SEQ ID NO:62) последовательности C(1,15)S/R(144)E, аналога KGF, имеющего замены цистеина на серин в положениях аминокислот 1 и 15 и замену аргинина на глутаминовую кислоту в положении 144 аминокислоты природного KGF.

Фигура 23 изображает нуклеотидную (SEQ ID NO:63) и аминокислотную (SEQ ID NO:64) последовательности C(1,15)S/R(144)Q, аналога KGF, имеющего замены цистеина на серин в положениях 1 и 15 аминокислот и замену аргинина на глутамин в аминокислотном положении 144 природного KGF.

Фигура 24 изображает нуклеотидную (SEQ ID NO:65) и аминокислотную (SEQ ID NO: 66) последовательности N23/R(144)Q, аналога KGF, имеющего делецию первых 23 аминокислот на N-конце и замену аргинина на глутамин в положении 144 аминокислоты природного KGF.

Фигура 25 изображает количество остающегося растворимым белка при хранении природного KGF и C(1,15)S в 20 мМ фосфате натрия, 0.15 М NaCl, pH 7.0 при 37^oС в течение 27 часов.

Фигура 26 изображает количество остающегося растворимым белка при хранении природного KGF, N15 и C(1,15)S в 50 мМ NaPO₄, 0.15 M NaCl, pH 7.0 при 37^oС в течение 27 часов.

Фигура 27 показывает количество растворимого белка природного KGF, C(1,15)S, C(1,15)S/R(144)E и C(1,15)S/R(144)Q, определенного методом вытеснительной ВЭЖХ по размеру частиц, в зависимости от времени термостатирования при 37^oС.

Фигура 28 показывает расчетную температуру (Т_m) в зависимости от pH природного KGF, C(1,15)S, C(1,15)S/R(144)Q и C(1,15)S/R(144)E.

Фигура 29 представляет собой типичный график митогенной активности C(1,15)S, определенной измерением включения [³H]-тимидина в процессе синтеза ДНК и сравнением его со стандартной кривой природного KGF.

Фигура 30 представляет собой типичный график митогенной активности N15, определенной измерением включения [³H] -тимидина в процессе синтеза ДНК и сравнением его со стандартной кривой природного KGF.

Фигура 31 изображает типичный график митогенной активности N23, определенной измерением включения [³H]-тимидина в процессе синтеза ДНК и сравнением его со стандартной кривой природного KGF.

Фигура 32 представляет собой типичный график митогенной активности N23/R(144)Q, определенной измерением включения [³Н]-тимидина в процессе синтеза ДНК и сравнением его со стандартной кривой природного KGF.

Фигура 33 представляет собой типичный график митогенной активности C(1,15)S/R(144)Q, определенной измерением включения [³Н]-тимидина в процессе синтеза ДНК и сравнением его со стандартной кривой природного KGF.

Фигура 34 изображает типичный график митогенной активности C(1,15)S/R(144)E, определенной измерением включения [³Н]-тимидина в процессе синтеза ДНК и сравнением его со стандартной кривой природного KGF.

Фигура 35 изображает действие природного KGF, KGF-a, N15, C(1,15)S и N23 на химический состав сыворотки.

Фигура 36 изображает нуклеотидную (SEQ ID NO:77) и аминокислотную (SEQ ID NO: 78) последовательности C(1,15,40)S, аналога KGF, имеющего замену цистеина на серин в положениях аминокислот 1, 15 и 40 природного KGF.

Фигура 37 изображает нуклеотидную (SEQ ID NO:79) и аминокислотную (SEQ ID NO: 80) последовательности C(1,15,102)S, аналога KGF, имеющего замену цистеина на серин в положениях аминокислот 1, 15 и 102 природного KGF.

Фигура 38 изображает нуклеотидную (SEQ ID NO:81) и аминокислотную (SEQ ID NO:82) последовательности C(1,15,102,106)S, аналога KGF, имеющего замену цистеина на серин в положениях аминокислот 1, 15, 102 и 106 природного KGF.

Фигура 39 изображает нуклеотидную (SEQ ID NO:83) и аминокислотную (SEQ ID NO: 84) последовательности N23/N(137)E, аналога KGF, имеющего делецию первых 23 аминокислот на N-конце и замену аспарагина на глутаминовую кислоту в положении 137 аминокислоты природного KGF.

Фигура 40 изображает нуклеотидную (SEQ ID NO:85) и аминокислотную (SEQ ID NO: 86) последовательности N23/K(139)E, аналога KGF, имеющего делецию первых 23 аминокислот на N-конце и замену лизина на глутаминовую кислоту в положении 139 аминокислоты природного KGF.

Фигура 41 изображает нуклеотидную (SEQ ID NO:87) и аминокислотную (SEQ ID NО: 88) последовательности N23/K(139)Q, аналога KGF, имеющего делецию первых 23 аминокислот на N-конце и замену лизина на глутамин в положении 139 аминокислоты природного KGF.

Фигура 42 изображает нуклеотидную (SEQ ID NO:89) и аминокислотную (SEQ ID NO: 90) последовательности N23/R(144)A, аналога KGF, имеющего делецию первых 23 аминокислот на N-конце и замену аргинина на аланин в положении 144 аминокислоты природного KGF.

Фигура 43 изображает нуклеотидную (SEQ ID NO:91) и аминокислотную (SEQ ID NO: 92) последовательности N23/R(144)E, аналога KGF, имеющего делецию первых 23 аминокислот на N-конце и замену аргинина на глутаминовую кислоту в положении 144 аминокислоты природного KGF.

Фигура 44 изображает нуклеотидную (SEQ ID NO:93) и аминокислотную (SEQ ID NO: 94) последовательности N23/R(144)L, аналога KGF, имеющего делецию первых 23 аминокислот на N-конце и замену аргинина на лейцин в положении 144 аминокислоты природного KGF.

Фигура 45 изображает нуклеотидную (SEQ ID NO:95) и аминокислотную (SEQ ID NO: 96) последовательности N23/K(147)E, аналога KGF, имеющего делецию первых 23 аминокислот на N-конце и замену лизина на глутаминовую кислоту в положении 147 аминокислоты природного KGF.

Фигура 46 изображает нуклеотидную (SEQ ID NO:97) и аминокислотную (SEQ ID NO: 98) последовательности N23/K(147)Q, аналога KGF, имеющего делецию первых 23 аминокислот на N-конце и замену лизина на глутамин в положении 147 аминокислоты природного KGF.

Фигура 47 изображает нуклеотидную (SEQ ID NO:99) и аминокислотную (SEQ ID NO: 100) последовательности N23/К(153)Е, аналога KGF, имеющего делецию первых 23 аминокислот на N-конце и замену лизина на глутаминовую кислоту в положении 153 аминокислоты природного KGF.

Фигура 48 изображает нуклеотидную (SEQ ID NO:101) и аминокислотную (SEQ ID NO: 102) последовательности N23/K(153)Q, аналога KGF, имеющего делецию первых 23 аминокислот на N-конце и замену лизина на глутамин в положении 153 аминокислоты природного KGF.

Фигура 49 изображает нуклеотидную (SEQ ID NO:103) и аминокислотную (SEQ ID NO: 104) последовательности N23/Q(152)E/K(153)E, аналога KGF, имеющего делецию первых 23 аминокислот на N-конце и замену глутамина на глутаминовую кислоту в положении 152 аминокислоты природного KGF и лизина на глутаминовую кислоту в положении 153 аминокислоты природного KGF.

Фигура 50 изображает действие N23 на вызванный стрептозотоцином диабет у крыс Sprague-Dawley.

Подробное описание изобретения В соответствии с данным изобретением получены новые аналоги KGF. В настоящее время найдено, что четыре цистеиновых остатка природного KGF (Cys¹ и Cys¹⁵, Cys¹⁰² и Cys¹⁰⁶) участвуют в образовании двух дисульфидных мостиков. Cys⁴⁰ не участвует в образовании внутримолекулярной дисульфидной связи. Следовательно, KGF содержит две малых дисульфидных петли, разделенных почти 90 аминокислотами. Ясно, что определение того, какие остатки цистеина участвуют в дисульфидных мостиках, позволяет определить, какие цистеиновые остатки свободны, чтобы образовывать нежелательные межмолекулярные сшивания или внутримолекулярные связи, которые приводят к тому, что белок приобретает нежелательную третичную структуру (например, конформацию, которая уменьшает активность белка).

Удивительным является то, что, как было показано, модификация KGF с помощью делеций или замен аминокислотными остатками остатков цистеина, соответствующих положениям 1 и 15 KGF (положения 32 и 46 SEQ ID NO:2) дает аналог KGF со значительно повышенной устойчивостью (то есть уменьшаются проблемы, вызванные неподходящим раскручиванием, образованием межмолекулярных дисульфидных связей и агрегированием белковых молекул). Например, аналоги KGF обычно при очистке дают с большим выходом растворимый, правильный складчатый белок. Более того, после очистки он более устойчив в отношении рН, температуры и т. д. по сравнению с устойчивостью молекулы-предшественника. Хотя теоретически это не объяснено, полагают, что Cys¹ и Cys¹⁵ KGF, помимо образования внутримолекулярного дисульфидного мостика и N-концевой дисульфидной петли, при определенных условиях также существуют в виде свободных цистеинов, которые способны образовывать межмолекулярные дисульфидные мостики, приводя к нестабильности белка и образованию агрегированных молекул. Более того, было обнаружено, что делеция N-концевой дисульфидной петли не является важной для рецепторного связывания или митогенной активности.

Так как это употребляется в данном изобретении "KGF-аналог" или "полипептидный аналог KGF" означают любой из описанных природных и искусственных полипептидов, отличающихся по структуре от KGF вследствие модификации пептидной последовательности, соответствующей 24 аминокислотам N-конца KGF (аминокислоты от 32 до 55 SEQ ID NO:2), в которой Cys¹ и Cys¹⁵ KGF (аминокислоты от 32 до 46 SEQ ID NO:2) заменены или удалены. Способ, каким остатки цистеина заменены или удалены, не важен и включает, например, включение полипептидных аналогов или одну или более делеций аминокислот и/или замены. Следовательно, данное изобретение представляет семейство новых белков - факторов роста кератиноцитов. Эго семейство содержит несколько групп белков.

Одна группа KGF аналогов включает молекулы, в которых остатки цистеина в положениях 1 и 15 KGF заменены на аминокислоты, включающие такие, которые не встречаются в природных белках. Стратегия получения аналогов с заменами включает применение сайт-направленного мутагенеза (Но et al. (1989), Gene, 77: 51-59; Innis et at. "PRC Protocols", Academic Press, Inc., San Diego, CA). [KGF аналоги, содержащие аминокислотные замены, обозначают остатком, обнаруженным в этом положении в зрелом белке (минус сигнальная последовательность), изображенном в SEQ ID NO:2, далее идет положение этой аминокислоты в скобках и новая аминокислота, Например, аналог, включающий замену цистеина на серин в аминокислотном положении 15 KGF (положение 46 SEQ ID NO:2), обозначает "C(15)S"]. Предпочтительно, чтобы цистеин заменялся на нейтральные аминокислоты, такие как глицин, валин, аланин, лейцин, изолейцин, тирозин, фенилаланин, гистидин, триптофан, серин, треонин и метионин, при этом серин, треонин и аланин являются предпочтительными из-за их химического сходства с цистеином. В Примере 1 подробно рассказывается о получении C(1,15)S с использованием синтеза частичного гена (в сочетании с другими рекомбинантными методами) с последующей рекомбинантной экспрессией в стабильно трансформированном бактериальном хозяине.

Другая группа аналогов KGF включает молекулы, у которых из KGF удалены цистеиновые остатки в положениях 1 и 15. Для получения таких аналогов KGF может применяться различная стратегия, такая как N-терминальное усечение и сайт-специфические делеции, или их сочетание. "N-терминальное (концевое) усечение" относится к такой модификации KGF, при которой удалены от 1 до 24 N-концевые аминокислотные остатки KGF (аминокислоты от 32 до 55 SEQ ID NO: 2), включая Cys¹ и Cys¹⁵. [Аналоги KGF с усечением аминокислот обозначаются в виде остатка, удаленного в этом положении зрелого белка (минус сигнальная последовательность), изображенного в SEQ ID NO:2, начиная с сайта делении, и количества удаленных остатков. Например, аналог KGF с N-терминальным усечением 24 остатков KGF (остатки 1-55 SEQ ID NO:2) будет обозначаться "N24" аналог] . Конкретно входят в эту группу N23 аналоги природного KGF, в которых один или более аминокислотных остатков 41-154 (аминокислоты 72-185 SEQ ID NO:2), конкретно включающие аминокислотные остатки 123-133 (аминокислоты 154-164 SEQ ID NO:2), удалены или заменены нейтральным остатком и отрицательно заряженным остатком, отобранным с целью воздействовать на белок с пониженным положительным зарядом. Предпочтительными, остатками для модификации являются Arg⁴¹, Gln⁴³, Lys⁵⁵, Lys⁹⁵, Lys¹²⁸, Asn¹³⁷, Gln¹³⁸, Lys¹³⁹, Arg¹⁴⁴, Lys¹⁴⁷, Gln¹⁵², Lys¹⁵³ или Thr¹⁵⁴, при этом более предпочтительными являются Gln¹³⁸, Lys¹³⁹, Arg¹⁴⁴, Lys¹⁴⁷, Gln¹⁵² или Lys¹⁵³, а наиболее предпочтительным является Arg¹⁴⁴. Также в эту группу входят N23 аналоги природного KGF с петлеобразующими модификациями на участке петлеобразования Asn¹¹⁵-His¹¹⁶-Tyr¹¹⁷-Asn¹¹⁸-Thr¹¹⁹ (аминокислоты 146-150 SEQ ID NO: 2), предпочтительно включающими модификацию с изменением заряда аминокислотного остатка 116, более предпочтительна замена на Gly в положении 116. Далее в эту группу N23 аналогов природного KGF входят таковые с одной или более аминокислотными заменами, делециями или присоединениями на участке 123-133 (аминокислоты 154-164 SEQ ID NO:2) природного KGF.

В Примере 1 подробно описано получение систематических усечений N-конца, проводимых с применением синтеза частичного гена в сочетании с другими рекомбинантными методами с последующей рекомбинантной экспрессией в стабильно трансформированном бактериальном хозяине. Такие поясняющие примеры усечений N-конца включают от N15 до N24. Более того, в Примере 3 подробно описывается экспрессия в культуральных клетках млекопитающих ДНК, кодирующей природный KGF и гликозилированные изоформы с гетерогенным N-концом, очистка предпочтительной гликозилированной изоформы, имеющей N-терминальное усечение аминокислот 1-23 зрелой формы природного KGF.

Напротив, сайт-специфическая делеция относится к модификации KGF, в которой один или более аминокислотных остатков (например, Cys¹ или Cys¹⁵) удаляются. Когда конкретно удалены Cys¹ или Cys¹⁵ KGF, аналог короче KGF на одну аминокислоту. [KGF аналоги, имеющие делецию аминокислот, обозначают по остатку, находящемуся в этом положении в зрелом белке (минус сигнальная последовательность), изображенном на SEQ ID NO:2, далее следует положение этой аминокислоты в скобках и знак "минус". Например, аналог из этой группы, имеющий делению цистеина в положении 15 KGF (положение 36 SEQ ID NO:2), обозначается "С(15)-"]. Сайт-специфические делеции могут быть проведены с использованием сайт-направленного мутагенеза, как описано выше.

Также входят в эту группу аналоги, в которых Cys¹ и Cys¹⁵ KGF удалены усечением или делецией. Например, представитель KGF аналогов имеет усечение первых трех остатков на N-конце (Cys-Asn-Asp) KGF или усечение первых восьми аминокислот (Cys-Asn-Asp-Met-Thr-Pro-Glu-Gln) KGF вместе с делецией цистеина в положении 15 аминокислоты KGF (эти аналоги обозначаются N3/C(15)- и N8/C(15)- соответственно). Так как остаток метионина находится в природном KGF в четвертом и пятом положении аминокислоты, не требуется дополнительного метионинового кодона, чтобы стала возможной надлежащая инициация трансляции.

Еще одна группа включает молекулы, в которых остатки цистеина в положениях 1 и 15 KGF замещены с помощью усечения или замены. Например, представителями KGF аналогов являются N3/C(15)S и N8/C(15)S. Такие аналоги имеют усечение первых трех аминоконцевых остатков KGF или делецию первых восьми аминоконцевых остатков KGF вместе с заменой цистеина в аминокислотном положении 15 на другую аминокислоту, например серин.

Когда KGF аналоги получают биологическим путем, т.е. они являются продуктами клеточной экспрессии в противоположность продуктам синтеза в твердом состоянии, производными, полученными из природных продуктов с помощью протеолиза или энзимов и т.д., нуклеиновые кислоты, кодирующие такие полипептиды, будут иметь один или более нуклеотидов, отличных по сравнению с нуклеотидной последовательностью природного KGF. Такие полинуклеотиды могут экспрессировать и образующийся полипептид может очищаться любым из технологических методов рекомбинантной ДНК, известных специалистам.

Последовательности ДНК, кодирующей аналоги KGF, полностью или частично могут, среди прочих, иметь включение кодонов, "предпочтительных" для экспрессии в выбранных "клетках-хозяевах" (например, "колоны для экспрессии в Е. coli"); наличие сайтов расщепления рестриктазами и наличие дополнительных инициационных (начальных), терминирующей или промежуточной нуклеотидных последовательностей (например, инициационный метиониновый кодон для экспрессии в Е. coli клетках) для облегчения построения легко экспрессируемых векторов.

Настоящее изобретение также предоставляет рекомбинантные молекулы или векторы для применения в способе экспрессии полипептидов. Такие векторы могут представлять собой ДНК или РНК и могут быть по природе кольцевыми (циклическими), линейными, одноцепочечными или двухцепочечными и могут быть природными или собранными из ряда компонентов, природных или синтетических.

Известно много примеров таких экспрессирующих векторов. Компоненты векторов, например репликоны, маркерные гены, энхансеры, промоторы, и тому подобное, могут быть получены из природных источников или синтезированы известными методами. В каждом случае экспрессирующие векторы, применимые в данном изобретении, должны содержать, по крайней мере, один элемент, контро