Удлиненная многослойная индикаторная тест-полоска для измерения концентрации аналита и способ измерения концентрации аналита

Удлиненная многослойная индикаторная тест-полоска для измерения концентрации аналита и способ измерения концентрации аналита

Реферат

 

Изобретение относится к области медицины, в частности к лабораторным методам исследования. Заявленные многослойная испытательная тест-полоска и способ измерения позволяют более точно определять концентрации аналита. Удлиненная многослойная индикаторная тест-полоска для измерения концентрации аналита в образце биологической жидкости, прикладываемом к полоске, содержит нижний слой со сквозным отверстием для приема образца, мембранный слой, имеющий образцовую сторону, обращенную к нижнему слою, и испытательную сторону, противоположную ей и имеющую расположенные вдоль ее длины множество дискретных впитывающих аналитических областей, разделенных невпитывающей областью, причем мембрана содержит реагент, который может вступать в реакцию с аналитом для получения изменения цвета, при этом реагент содержит первую компоненту, взаимодействующую с аналитом для получения перекиси водорода, вторую компоненту для обнаружения перекиси водорода и третью компоненту для торможения второй компоненты, промежуточный слой между нижним и мембранным слоями, и измерительное средство для распределения образца вдоль полоски от образцового отверстия к аналитическим областям, содержащее канал транспортировки жидкости, сформированный в промежуточном слое, для направления образца поверх мембранной поверхности к впитывающим аналитическим областям, причем полоска разделена на части вдоль своей длины таким образом, что соседние сегменты мембраны имеют различные концентрации ингибитора, а именно каждый последующий сегмент имеет постепенно возрастающее количество ингибитора по сравнению с предыдущим в зависимости от расстояния от первого конца полоски, тем самым одна или более аналитических областей способны изменять цвет при прикладывании образца к полоске, и изменяющая цвет область, наиболее удаленная от первого конца, указывает концентрацию аналита в образце. В способе же измерения концентрации аналита в образце биологической жидкости прикладывают образец к заявленной удлиненной многослойной индикаторной тест-полоске. 2 с. и 29 з.п. ф-лы, 11 ил., 1 табл.

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ Эта заявка является частичным продолжением одновременно рассматриваемой патентной заявки США 08/743432, поданной 1 ноября 1996 г., которая является продолжением аннулированной заявки 528511, поданной 3 августа 1995 г., являющейся частичным продолжением заявки 411238, поданной 27 марта 1995 г., и заявки 442035, поданной 15 мая 1995 г.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Область изобретения.

Это изобретение относится к сухой тест-полоске для измерения концентрации аналита в биологической жидкости, в частности тест-полоске, которая измеряет концентрацию непосредственно без необходимости использования измерительного прибора.

2. Описание известного уровня техники.

Было разработано много визуальных тест-устройств для измерения концентрации определенных аналитов в биологических жидкостях. Эти устройства измеряют, например, уровень глюкозы, холестерина, протеинов, кетонов, фенилаланина или ферментов в крови, моче или слюне.

Сухие фазовые индикаторные полоски, включающие основанные на ферментах составы экстенсивно используются в клинических лабораториях, врачебных кабинетах, госпиталях и домах для тестирования образцов биологических жидкостей на концентрацию глюкозы. В действительности индикаторные полоски стали повседневной необходимостью для многих из нескольких миллионов национальных диабетиков. Так как диабет может вызывать опасные аномалии в химии крови, он может приводить к потере зрения, повреждению почки и другим серьезным медицинским последствиям. Для минимизации риска этих последствий большинство диабетиков должно периодически контролировать себя, после чего соответственно регулировать концентрацию глюкозы в своей крови, например, через диетический контроль и/или с помощью инъекций инсулина. Некоторые пациенты должны проверять концентрацию глюкозы в своей крови по четыре раза в день или чаще.

Это особенно важно для диабетиков, которые должны соблюдать диету для регулирования потребления сахара и/или делать инъекции инсулина и которые должны руководствоваться в этом отношении частыми проверками концентрации глюкозы в крови для того, чтобы иметь быстродействующие недорогие и точные индикаторные полоски для определения глюкозы.

Известны индикаторные полоски, которые содержат индикатор, который изменяет оттенок цвета в зависимости от концентрации глюкозы в биологической жидкости, которая была нанесена на полоску. Хотя некоторые из этих полосок используют восстановительную химию, более обычно они включают окисляющееся красящее вещество или пару красящих веществ. Некоторые из полосок включают фермент, такой как глюкосидаза, который способен окислять глюкозу с образованием глюконовой кислоты и перекиси водорода. Они также содержат окисляемые красящее вещество и вещество, имеющее перекисную активность, которая способна осуществлять селективное катализационное окисление окисляемого красящего вещества в присутствии перекиси водорода (см., например, патент США 5306623, выданной 26 апреля 1994 г.).

В патенте США 3964871, выданном 22 июня 1976 г. Hochstrasser, описана доступная индикаторная полоска для непосредственного измерения содержания веществ, таких как глюкоза, в биологических жидкостях. Индикатор регистрирует концентрацию вещества путем включения как индикаторного реагента, который окисляется и изменяет цвет при вступлении в реакцию с веществом, так и "антагониста", который некоторым образом предотвращает накопление окисленного индикатора до его полного потребления.

В опубликованной 24 мая 1989 г. Европейской патентной заявке 0317070 (см. также патент США 5036000, опубликованный 30 июля 1991 г. на Palmer и др. ) описывается "цифровая" система количественного анализа для глюкозы и других аналитов. Эта система осуществляет измерение концентрации органического соединения в биологической жидкости путем первичного окисления соединения посредством оксидазного фермента для получения перекиси водорода. Система включает хромоген, который является восстановителем перекиси водорода, и воздушностабильный восстановитель перекиси водорода, который имеет больший восстановительный потенциал. Больший восстановительный потенциал задерживает любое обнаруживаемое изменение цвета посредством хромогена до тех пор, пока не будет потреблен воздушностабильный первый восстановитель перекиси водорода. Таким образом, не происходит результирующее изменение цвета, если количество перекиси водорода, которое должно измеряться, меньше заданного уровня, соответствующего концентрации воздушностабильного восстановителя перекиси. В результате, система измеряет концентрацию количественно, независимо от интенсивности изменения цвета.

В патенте США 4738823, выданном 19 апреля 1988 г. на имя Englemann, описана тест-полоска для определения аналита, имеющая опорный элемент, который имеет поглощающий материал, расположенный для удаления избыточного количества образца, наносимого на полоску. Полоска также может включать покрытие, в котором имеется отверстие, через которое может вводиться образец.

В патенте США 4810470, выданном 7 марта 1989 г. на имя Burkhardt и др., описано устройство для измерения концентрации аналита в жидких образцах. Устройство включает одну или более впитывающих матриц, имеющих непроницаемое для жидкости покрытие или пленку.

Образец наносится на часть впитывающей матрицы и измеряется в матрице хроматографически. За счет фитильного действия образец проходит к аналитической области, содержащей испытательный реагент для аналита.

В патенте США 4994238, выданном 19 февраля 1991 г. на имя Daffern и др., описано тест-устройство химического анализа, которое содержит поглощающий слой, водонепроницаемый барьерный слой и реагентный слой, который имеет заданный объем. Образец наносится на реагентный слой через выравненные отверстия в лежащих сверху поглощающем и барьерном слоях.

Независимо от того, проводится испытание дома, в кабинете врача, клинике или госпитале, чрезвычайно важными являются точность и воспроизводимость определения содержания глюкозы. В случае указывающей цвет индикаторной полоски желательно, чтобы изменение цвета было заметным и нечувствительным к изменениям в компонентах биологической жидкости, отличных от глюкозы. В случае визуально считываемой индикаторной полоски особенно важно, что диабетики, которые могут иметь ухудшенное зрение, имеют полоску, которая выставляет показательное изменение цвета, зависящее от концентрации глюкозы, хотя изменение цвета, выставляемое как изменение в поглощении при данной длине волны, является также важным для точности считываемых измерительным прибором полосок.

Так как изменение цвета включает ряд химических реакций, оно не происходит мгновенно. Таким образом, пользователь должен ожидать некоторый период времени, обычно минуту или меньше, для того, чтобы произошли реакции. При считывании полоски измерительным прибором схемы таймера могут выдавать сигнал, указывающий на завершение реакций. Однако при визуальном считывании полоски без использования измерительного прибора пользователь может недооценить необходимое время, считывать полоску преждевременно и получать ошибочный результат. Альтернативно, пользовать может чувствовать необходимость ожидания чрезмерное время перед считыванием полоски, чтобы быть уверенным в том, что реакция завершилась, вызывая ненужную задержку и неудовлетворенность пользователя. Таким образом, возникает необходимость использования "химического" таймера, то есть элемента на полоске, который будет изменять цвет независимо от концентрации глюкозы (или другого интересуемого аналита) в образце, но будет это делать только по истечении достаточного промежутка времени для завершения цветоформирующих реакций с образцом.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ В соответствии с настоящим изобретением удлиненная многослойная индикаторная тест-полоска для измерения концентрации аналита в образце биологической жидкости, прикладываемом к полоске, содержит: а) нижний слой со сквозным отверстием для приема образца, б) мембранный слой, имеющий образцовую сторону, обращенную к нижнему слою, и испытательную сторону, противоположную ей и имеющую расположенные вдоль ее длины множество дискретных впитывающих аналитических областей, разделенных невпитывающей областью, причем мембрана содержит реагент, который может вступать в реакцию с аналитом для получения изменения цвета, при этом реагент содержит i) первую компоненту, взаимодействующую с аналитом для получения перекиси водорода; ii) вторую компоненту, взаимодействующую с перекисью водорода для претерпевания изменения цвета, и iii) третью компоненту, которая предотвращает изменение в цвете второй компоненты; в) промежуточный слой между нижним и мембранным слоями, г) измерительное средство для распределения образца вдоль полоски, содержащее канал транспортировки жидкости, сформированный в промежуточном слое, для направления образца поверх мембранной поверхности к впитывающим аналитическим областям, причем концентрация ингибитора увеличивается заданным образом в зависимости от расстояния от первого конца полоски так, что в образце должна быть соответствующим образом увеличивающаяся концентрация аналита для осуществления изменения цвета, тем самым одна или более аналитических областей могут изменять цвет при прикладывании образца к полоске, и изменяющая цвет область, наиболее удаленная от первого конца, указывает концентрацию аналита в образце.

В процессе работы способ измерения концентрации аналита в образце биологической жидкости содержит операции: а) прикладывают образец к индикаторной тест-полоске, которая содержит: i) нижний слой со сквозным отверстием для приема образца, ii) мембранный слой, имеющий образцовую сторону, обращенную к нижнему слою, и содержащий множество впитывающих аналитических областей, каждая из которых изменяет цвет при контактировании с жидкостью, содержащей по крайней мере заданное количество аналита, превышающее количество аналита, вызывающее изменение цвета аналитических областей, расположенных ближе к первому концу полоски, и iii) измерительное средство для распределения образца от сквозного отверстия вдоль заданного невпитывающего пути к каждой из аналитических областей и б) определяют концентрацию аналита путем наблюдения аналитической области, которая изменяет цвет и которая является наиболее удаленной от первого конца полоски.

Полоска является полоской типа, которая обеспечивает видимую индикацию концентрации аналита, содержащегося в биологической жидкости, приложенной к "образцовой стороне" полоски. Видимая индикация появляется на противоположной (или "испытательной") стороне полоски. Конечно, химический состав тест-полоски зависит от комбинации аналита/биологической жидкости, которая должна измеряться. Тест-полоски могут конструироваться для обнаружения аналитов, таких как глюкоза или другие сахары, алкоголь, холестерин, протеины, кетоны, мочевая кислота, пренилаланин или ферменты в биологических жидкостях, таких как кровь, моча и слюна, а также вода. Для удобства и краткости индикаторные тест-полоски, описанные наиболее подробно в этом описании, обнаруживают содержание глюкозы в крови. Обычный специалист в данной области техники мог бы легко приспособить представленную в этом описании информацию для обнаружения других комбинаций аналита/биологической жидкости.

Предлагаемая тест-полоска обеспечивает сравнительно простое и быстрое определение концентрации глюкозы в неизмеренном образце крови. Полоска содержит нижний слой с отверстием, через которое может вводиться образец к образцовой стороне пористой матрицы, противоположная сторона которой является испытательной стороной. Матрица обычно является мембраной и в настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения попеременно используются два термина. Испытательный реагент прикладывается к матрице и в большей или меньшей степени проникает внутрь пор матрицы. Для простоты изобретатель иногда называет реагент на матрице "покрытием" в этом описании и в прилагаемой формуле изобретения, признавая, что покрытие реагента проникает в матрицу.

Между нижним слоем и матрицей находится промежуточный слой. В одном воплощении вырезы в промежуточном слое выравнены с невпитывающими областями мембраны для направления образца к ряду впитывающих аналитических областей, которые расположены вдоль полоски. (Используемый в этом описании и прилагаемой формуле изобретения термин "впитывающий" означает поглощающий.) Ряд канавок в промежуточном слое окружает пространство вокруг и выше аналитических областей для ограничения течения образца к этим областям. В другом воплощении удлиненная, практически прямоугольная прорезь в промежуточном слое направляет образец к последовательности впитывающих областей, которые разделены невпитывающей областью.

Таким образом, установленный объем образца, обычно цельная кровь, которая включает как эритроциты, так и глюкозу, направляется к образцовой стороне мембраны в каждой из ряда аналитических областей. Пористость матрицы дает возможность жидкости проходить от образцовой стороны к испытательной стороне, например, за счет капиллярного действия. Таким образом, испытательный реагент может вступать в реакцию с глюкозой в крови, вызывая изменение цвета на или около испытательной стороны. Так как сильно окрашенные эритроциты могут делать это труднее для обнаружения изменения цвета, предпочтительно, матрица является анизотропной с неодинаковыми размерами пор от больших пор на образцовой стороне к меньшим порам на испытательной стороне для улавливания эритроцитов от испытательной стороны. Может использоваться целый ряд материалов для различных компонент тест-полоски и таймера предлагаемого устройства. Некоторые из этих материалов описаны в патентах США 5306623 и 5418142, выданных 26 апреля 1994 г. и 23 мая 1995 г. соответственно на имя Kiser и введенных в описание для ссылки.

Испытательный реагент содержит компоненту для преобразования глюкозы в перекись водорода, одну или несколько компонентов для обнаружения перекиси водорода, полученной из глюкозы, присутствующей в образце, ингибитор. В качестве компонентов для обнаружения перекиси водорода может быть пероксидаза, предпочтительно хреновая пероксидаза, вместе с "индикатором", который изменяет цвет во время реакции. Индикатором может быть окисляемый краситель или красящая пара. Пероксидаза катализирует окисление индикатора в присутствии перекиси водорода. Конечным элементом реагента является ингибитор, который замедляет изменяющее цвет окисление индикатора.

Полоска разделена на части вдоль своей длины таким образом, что соседние мембранные сегменты имеют различные концентрации ингибитора. Каждый сегмент имеет впитывающую аналитическую область, которая изменяет цвет только если и когда достаточное количество глюкозы присутствует, чтобы сначала вызывать потребление всего ингибитора и затем окислять индикатор и тем самым вызывать характерное изменение цвета. Таким образом, изменение цвета в данной области служит доказательством пороговой концентрации глюкозы в первоначальном образце крови. Вдоль полоски, в данном направлении, каждый последующий сегмент имеет постепенно увеличивающуюся концентрацию ингибитора, которая соответствует постепенному увеличению пороговой концентрации глюкозы. Концентрация индикатора является одинаковой для всех сегментов. В принципе, также возможны другие изменяющиеся балансы ингибитор/индикатор.

Если сегменты имеют концентрации ингибитора в соответствующем диапазоне для данного тест-образца, соседние аналитические области вступают в реакцию с аналитом так, что одна область окрашивается, а соседняя область остается неокрашенной. Это указывает на то, что концентрация глюкозы в образце по крайней мере равна пороговой концентрации, необходимой для изменения цвета одной области, но не больше концентрации, требуемой для изменения цвета соседней области.

Для контроля глюкозы крови покрытие сегмента произвольного таймера содержит элементы индикаторной полоски - пористую матрицу, имеющую испытательный реагент, нанесенный на нее, и, кроме того, глюкозу. В сухом состоянии химия реагента не активируется глюкозой, но при прикладывании образца к полоске покрытие таймера гидратируется и глюкоза в покрытии по истечении заданного промежутка времени вызывает изменение цвета индикатора. Предпочтительно, глюкоза присутствует в таймере в количестве, превышающем количество, требуемое для преодоления ингибитора. В этом случае необходимый промежуток времени длиннее или короче, в зависимости от того, больше или меньше присутствует ингибитора. Изменение цвета в полоске и в таймере может наблюдаться или непосредственно глазом, или с помощью оптического прибора, который обнаруживает изменения в отражательной способности.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ Фиг. 1 изображает перспективный вид матрицы предлагаемой индикаторной тест-полоски с непосредственным считыванием, фиг. 2 изображает вид снизу с вырезом образцовой стороны предлагаемой индикаторной тест-полоски с непосредственным считыванием, фиг. 3 изображает в увеличенном масштабе фрагментарный перспективный вид внутренности тест-полоски, показанной на фиг.2, с частичным вырезом, фиг. 4 изображает поперечное сечение полоски, показанной на фиг.2, по линии 4-4, фиг.5 изображает вид снизу тест-полоски, показанной на фиг.2, фиг.6 изображает вид сверху, показывающий испытательную сторону тест-полоски, показанной на фиг.5, фиг.7 изображает полоску, показанную на фиг.6, после прикладывания к ней образца, фиг.8 изображает перспективный вид с вырезом другого воплощения тест-полоски, показанной на фиг.2, фиг.9 изображает вид снизу тест-полоски, показанной на фиг.8, фиг.10 изображает вид сверху тест-полоски, показанной на фиг.8, фиг.11 изображает сечение полоски, показанной на фиг.10, по линии 11-11.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Предлагается индикаторная тест-полоска с непосредственным считыванием для измерения концентрации аналита в биологической жидкости. Ключевым элементом такой тест-полоски является пористая матрица, которая включает испытательный реагент, который претерпевает изменение цвета в ответ на содержание аналита в образце биологической жидкости, который прикладывается к полоске.

Матрица может иметь однородный состав или может быть покрыта подложкой и может быть или изотропной, или анизотропной. Она имеет образцовую сторону, к которой прикладывается образец, и испытательную сторону, где наблюдается изменение цвета. Предпочтительно, матрица представляет собой анизотропную мембрану, более предпочтительно, анизотропную мембрану, имеющую широкий диапазон размеров пор. Например, мембрана может иметь размер пор от около 0,1 до около 150 мкм. На стороне больших пор размер пор, предпочтительно, находится в диапазоне около 30-40 мкм. На стороне мембраны, где поры имеют наименьший размер, объем пор является сравнительно малым и материал мембраны является обычно совершенно плотным внутри слоя, который может обычно составлять вплоть до 20% толщины мембраны. Внутри этого слоя размер пор, предпочтительно, находится в диапазоне около 0,1-0,8 мкм с номинальным размером пор, предпочтительно, около 0,3 мкм. При прикладывании к образцовой стороне биологической жидкости образец сталкивается с все более мелкими порами при ее проникновении в мембрану. В конце концов плотные частицы, такие как эритроциты, достигают положения в мембране, где они дальше не могут проникать. Остаточная часть, еще содержащая растворенную глюкозу, проходит сквозь к испытательной стороне. Анизотропная природа мембраны и/или использование отделяющей компоненты (обсужденной ниже) позволяют сравнительно высокие скорости потока через мембрану, даже в то время как имеет место фильтрация плотных частиц.

При прохождении образца через матрицу реакция с реагентом вызывает формирование или разложение в объеме пор около испытательной стороны светопоглощающего красителя, тем самым значительно влияя на отражающую способность матрицы.

Примерами подходящих матричных материалов являются полисульфоны и полиамиды (найлоны). Могут также использоваться другие полимеры, имеющие сравнимые свойства. Полимеры могут быть модифицированы для введения других функциональных групп, которые предусматривают заряженные структуры, так что поверхности матрицы могут быть нейтральными, положительно заряженными или отрицательно заряженными.

Предпочтительным способом приготовления пористого материала, образующего матрицу, является литье полимера без поддерживающего сердечника. Такой матрицей, например, является анизотропная полисульфонная мембрана, доступная от фирмы Memtec, Inc, Timonium, MD. Обычно используется матрица, имеющая толщину менее 200 мкм, предпочтительно, в пределах около 115-155 мкм. Наиболее предпочтительной является толщина в пределах около 130-140 мкм, в частности, когда матрица выполнена из найлона или анизотропного полисульфона.

Мембрана может обрабатываться с помощью испытательного реагента путем погружения ее в смесь компонентов, тем самым пропитывая мембрану. Предпочтительно, по крайней мере некоторые из компонент прикладываются к мембране последовательно. Избыточный реагент может удаляться механическим средством, таким как, например, воздушный шабер, ракель или стеклянная палочка. Затем мембрана сушится. Реагент имеет тенденцию концентрироваться около испытательной стороны мембраны с малыми порами.

Испытательный реагент содержит (i) компоненту для преобразования глюкозы в перекись водорода, (ii) компоненту для обнаружения перекиси водорода и (iii) компоненту для торможения компоненты, которая обнаруживает перекись водорода. Реагент может произвольно дополнительно содержать отделяющую компоненту, которая вызывает улавливание в матрице частиц, таких как эритроциты, эффективно удаляя плотные частицы из биологической жидкости. Могут также включаться дополнительные компоненты, описанные ниже и приведенные в примерах.

Предпочтительными компонентами для преобразования глюкозы в перекись водорода являются глюкозоксидаза, фермент, который обычно получают из аспергилла или пеницилла. Глюкозоксидаза реагирует с глюкозой и кислородом для получения глюконолактона и перекиси водорода. Оптимальная концентрация глюкозоксидазы зависит от состава индикаторной системы. Например, если индикаторной системой является система МВТН SB-ANS (которая описана ниже), тогда концентрация глюкозоксидазы в пределах около 500-10000 ед/мл является подходящей, более предпочтительной является концентрация в пределах около 700-2000 ед/мл и наиболее предпочтительной является концентрация около 1000 ед/мл. Обычно более высокие концентрации глюкозоксидазы вызывают более быстрое прохождение реакции и пониженные концентрации вызывают более медленное прохождение реакции.

Таким образом, полученная перекись водорода вступает в реакцию с компонентой для обнаружения перекиси водорода, содержащей пероксидазу, которая выборочно катализирует реакцию между перекисью водорода и индикатором. Пероксидаза использует перекись водорода в качестве окислителя, способного удалять атомы водорода из различных веществ. Подходящая пероксидаза может содержать феррипротопорфирин, красный гемин, получаемый из растений. Пероксидазы, получаемые из животных, например из щитовидных желез животных, также являются подходящими. Особенно предпочтительной является хреновая пероксидаза (HR РО) в качестве составляющей части компоненты для обнаружения перекиси водорода.

Перекись водорода, предпочтительно катализируемая пероксидазой, реагирует или непосредственно, или косвенно для формирования или разложения индикаторного красителя, который поглощает свет в заданном диапазоне длин волн. Предпочтительно индикаторный краситель сильно поглощает на длине волны, отличной от той, на которой сильно поглощает испытательный реагент. Окисленная форма индикатора может представлять собой окрашенный или бесцветный конечный продукт, который служит доказательством изменения в цвете испытательной стороны матрицы. То есть испытательный реагент может указывать присутствие аналита в образце посредством обесцвечивания окрашенной области или, альтернативно, посредством окрашивания бесцветной области.

Индикаторы, являющиеся полезными в предлагаемом устройстве, включают а) 3-метил-2-бензотиазолинонгидразонгидрохлорид (МВТН), комбинированный с 3-диметиламинобензойной кислотой (ДМАВ); б) МВТН, комбинированный с 3,5-дихлоро-2-гидроксибензол-сульфокислотой (ДСНВS); в) 4-аминоантипирин (4-ААР) и 5-оксо-1-(р-сульфофенил)-2-пиразолин-3-карбоновую кислоту (OPS P); г) 4-ААР и N-(m-толил)-диетаноламин (NДА); д) 2,2'-азино-ди(3-этилбензтиазолин)сульфокислоту (ABTS); е) 4-ААР и 4-метоксинафтол; ж) пирогаллол красный (PGR); и) бромпирогаллол красный (BPR); к) кислотный зеленый 25 (AG); или л) [3-метил-2-бензотиазолинонгидразон] N-сульфонилбензолсульфонат мононатрия (МВТН SB), комбинированный с 8-анилино-1-аммонием нафталинсульфокислоты (ANS). Предпочтительной является система MBTH SB-ANS. Дополнительная информация, касающаяся системы MBTH SB-ANS, имеется в патенте США 5563031, выданном 8 октября 1996 г. и включенном в настоящее описание для ссылки.

Задерживающая компонента замедляет реакцию между перекисью водорода и индикатором, например, путем восстановления перекиси водорода или путем восстановления окисленного индикатора. В принципе, имеется несколько различных режимов работы для ингибитора. Во-первых, ингибитор мог бы конкурировать с индикатором и тем самым снижать скорость, при которой имеет место изменение цвета в индикаторе. Во-вторых, ингибитор мог бы быть неконкурирующим, так что практически весь ингибитор потребляется перед тем, как имеет место какое-либо значительное изменение цвета в индикаторе. Возможные также другие режимы работы ингибитора. Предпочтительно, ингибиторы предлагаемого устройства являются неконкурирующими.

Подходящими ингибиторами являются 2,3,4-оксигентизиновая кислота; пропилгаллат; 3,4-диоксикоричная кислота; 3,4-диоксибензальдегид; галлиевая кислота; 5,6-диаменоурасил, аскорбиновая кислота и изоаскорбиновая кислота. Предпочитается аскорбиновая кислота, однако она окисляется в растворе и должна стабилизироваться для обеспечения возможности покрытия реагента. Предпочтительными стабилизаторами являются первичные спирты, такие как этиловый, метиловый или пропиловый спирт. Предпочтительным является этиловый спирт, в частности концентрированные растворы, то есть растворы, содержащие 50% или более этанола.

Хотя анизотропная мембрана, являющаяся предпочтительной матрицей, отфильтровывает эритроциты и удерживает их вдали от испытательной стороны, произвольно испытательный реагент может также содержать отделяющую компоненту. Отделяющая компонента должна быть способна получать сравнительно прозрачную бесцветную жидкость из жидкости, содержащей эритроциты, например цельной крови, путем изолирования эритроцитов в матрице. Отделяющие компоненты для использования в предлагаемом устройстве включают, но не ограничиваются полиэтиленгликолем, поли (метилвиниловый эфир/малеин) ангидридом, полипропиленгликолем, полистиролсульфокислотой, полиакриловой кислотой, поливиниловым спиртом и поливинилсульфокислотой при величине рН в пределах около 4,0-8,0. Такие отделяющие компоненты присутствуют в матрице в количествах, которые будут изменяться в зависимости от их заряда и молекулярного веса, других компонентов, заделанных в матрицу, величины рН матрицы и размера пор и остаточной влаги после сушки. Такие параметры легко определяются специалистом в данной области техники. Например, при использовании полипропиленгликоля в качестве отделяющей компоненты (например, PPG-410 от фирмы BASF) он, предпочтительно, присутствует с концентрацией около 2-30% веса к объему и, более предпочтительно, с концентрацией 8-10%. Другие отделяющие компоненты могут также использоваться при концентрации 2-30% веса к объему. Полимерные отделяющие компоненты могут пропитываться или заделываться в матрице или отливаться в мембране в процессе производства.

Отделение компонентов крови могут также осуществлять некоторые водорастворимые соли. Солями, подходящими для разделения компонентов крови, являются цитраты, соли муравьиной кислоты и сульфаты, а также определенные кислоты, такие как аминокислоты, лимонная кислота, фитиновая кислота и яблочная кислота (см., например, патент США 3552928, выданный 5 января 1971 г. на имя Fetter. Преимущество включения отделяющей компоненты заключается в том, что при практическом удалении из биологической жидкости плотных частиц, таких как эритроциты, становится меньше фонового цвета на испытательной стороне, затемняющего изменение в окрашивании, получаемое посредством испытательного реагента.

В матрицу могут быть заделаны другие компоненты для усиления окрашивания и улучшения считываемости индикаторных полосок и сохранения однородности и целостности матрицы. Например, испытательный реагент может включать соли и/или буферы для облегчения отделения красителя в матрице. Такие буферы могут содержать, например, цитрат, присутствующий в растворе в количестве от около 0,01 моля до около 1,0 моля и, предпочтительно, в количестве около 0,1 моля. Могут использоваться также другие буферы.

Могут также использоваться соединения, делающие матрицу гидрофильной, или соединения, которые могут действовать в качестве стабилизаторов, такие, как гидролизованные протеины. Такие соединения включают, но не ограничиваются, например, бычьим сывороточным альбумином, полипентидами и доступным протеином малого молекулярного веса, известным как Crotein SPA (от фирмы Croda, Inc.New York, N.Y.). Такие соединения используются при концентрациях, например, от около 1 мг/мл до около 100 мг/мл. В случае Crotein предпочтительна концентрация около 30 мг/мл.

В покрытие для матрицы могут также включаться другие стабилизаторы и консервирующие средства. Например, могут использоваться этилендиаминтетрауксусная кислота (ЕДТА), диэтилентриаминпентауксусная кислота (ДТРА) и родственные соединения, например, при концентрациях от около 0,01 мг/мл до около 10 мг/мл. Консервирующие средства служат для способствования стабилизации ингибитора.

Некоторые из индикаторов (например, BPR) имеют нежелательную тенденцию миграции в матрице. При использовании такого индикатора для предотвращения такой миграции включается агент спаривания ионов. Например, производные полиэтиленгликоля, коммерчески доступные под маркой Polycguart (H) (от фирмы Henkel, Inc. Ambler,PA), в частности, являются полезными за их способность облегчить спаривание ионов между индикатором и другими заместителями матрицы.

При индикации присутствия аналита путем формирования цвета (например, в индикаторной системе MBTH SB-ANS) могут добавляться поверхностно-активные вещества для повышения яркости цвета и контрастности относительно неокрашенного окружения.

При практической реализации настоящего изобретения могут также использоваться органические растворители и могут подпадать под формулировку испытательного реагента для матрицы, конечно, при условии, что они являются совместимыми с составами матрицы и испытательного реагента. Потенциально подходящие органические растворители включают хлороформ, ацетон, спирты, хлористый метилен, диэтиловый и петролейный эфиры, ацетонитрилы и их смеси. При практической реализации настоящего изобретения предпочтительной является, в частности, концентрация в 70% этанола в воде.

Испытательный реагент, который наносится на или пропитывается в матрицу, не является однородным по поверхности тест-полоски. Вместо этого, предпочтительно, реагент наносится на матрицу в виде ряда параллельных полосок или "сегментов", которые простираются поперек длины полоски. Состав в соседних сегментах имеет постепенно увеличивающуюся концентрацию ингибитора. Каждый сегмент имеет впитывающую аналитическую область. В аналитических областях испытательный реагент вступает в реакцию с любой глюкозой, содержащейся в крови, вызывая изменение цвета при условии, что концентрация глюкозы является достаточно большой для преодоления уровня ингибитора в этой аналитической области. Таким образом, каждая последующая аналитическая область требует постепенно увеличивающейся концентрации глюкозы в образце для того, чтобы вызывать изменение цвета области.

Произвольно, одна из аналитических областей приспосабливается для служения в качестве таймера для индикации того, что прошло достаточно времени для реакции реагента с глюкозой в каждой из аналитических областей. Сегмент таймера матрицы покрывается или пропитывается составом, который состоит из испытательного реагента и, кроме этого, глюкозы. Так как испытательный реагент служит для изменения цвета в ответ на глюкозу, комбинирование двух веществ, не вызывая изменения цвета, требует некоторого внимания. Количество ингибитора, превышающее количество, требуемое для выполнения функции выдержки времени, должно присутствовать для компенсации этого эффекта. Скорость сушки сегмента таймера после прикладывания раствора, содержащего глюкозу, управляется. На практике мембрана сначала покрывается раствором, содержащим буферы, стабилизаторы и ферменты, и это покрытие сушится для формирования первого слоя. Затем делается второе покрытие путем нанесения раствора, содержащего индикатор, ингибитор и глюкозу. Параметры, такие как скорость движения полотна (подложки), температура печи, воздушный поток и количество наносимых растворов покрытия, должны устанавливаться заранее, и соответствующие регулировки осуществляются для концентрации ингибитора и/или глюкозы. Вместо непосредственного нанесения второго покрытия менее предпочтительной альтернативой является изготовление второго покрытия на отдельном полотне и последующее его размещение на первом слое.

При прикладывании образца к полоске гидратация состава сегмента таймера дает возможность протекания