Пептидные фрагменты основного белка миелина, фармацевтические композиции на их основе и применение данных композиций для лечения рассеянного склероза

Пептидные фрагменты основного белка миелина, фармацевтические композиции на их основе и применение данных композиций для лечения рассеянного склероза

Реферат

 

Описан полипептид формулы Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr, способный нейтрализовать или модулировать образование антимиелинового основного белка. Пептид может использоваться для лечения рассеянного склероза и обладает большей активностью по сравнению с миелиновым основным белком. Пептид не является токсичным и не проявляет себя в качестве иммуногенов. Описана также фармацевтическая композиция, содержащая пептид, а также способ лечения рассеянного склероза. 3 с. и 5 з.п. ф-лы, 4 табл., 35 ил.

Область, к которой относится изобретение Изобретение касается некоторых полипептидов и их использования для иммунорегуляции антител к миелиновому основному белку человека. Изобретение также относится к новым фармацевтическим композициям, содержащим указанные полипептиды, и к способу использования этих пептидов для лечения рассеянного склероза.

Уровень техники Рассеянный склероз (MS) - это многоочаговое демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы (ЦНС) человека, связанное с воспалением. Повышенный синтез IgG в пределах гематоэнцефалического барьера (intra-BBB) является признаком рассеянного склероза (Tourtelotte, W. W., J. Neurol Sci 10: 279-304, 1970; Link, H. And Tibbling, G., Scand. J. Clin. Lab Invest 37: 397-401, 1977; Tourtelotte. W. W. and Ma, В., Neurology 28: 76-83, 1978; Walsh, J. M. and Tourtelotte, W. W., In: Hallpike, J. F., Adams, C. W. M. and Tourtelotte, W. W., eds. Multiple Sclerosis. Baltimore. Williams & Wilkins, 1982: 275-358; and Warren. K. G. , and Catz, I. Ann Neurol 17: 475-480, 1985).

Выработка IgG в пределах ВВВ, в основном, повышается у пациентов с клинически определенным заболеванием рассеянным склерозом (Schumacher, G. A., Beebe G. , Kibler R. Е., et al. Ann NY Acad Sci 15:266-272, 1965), как в случае активной, так и скрытой формы заболевания. Специфичность большинства IgG ЦНС не известна. Тогда как небольшая их часть обладает антивирусной активностью или выступает во взаимодействие с антигенами мозга, нуклеиновыми кислотами, эритроцитами или антигенами гладкой мускулатуры, другие неспецифические Ig могут быть задействованы в поликлональной активации В-клеток (Tourtelotte, W. W., and Ma, В., Neurology 28:76-83, 1978). В течение последнего десятилетия наблюдается значительный интерес к изучению антител, специфичных к миелиновым белкам.

Вслед за обнаружением циркулирующих иммунных комплексов, содержащих миелиновый основный белок (МВР) в качестве антигенного компонента (Dasgupta, M. К. Catz, I, Warren, К. G., et al.. Can. J. Neurol. Sci. 10:239-243, 1983), были выявлены повышенные титры антител к МВР (anti-MBP) в спинномозговой жидкости (CSF) больных с активной формой рассеянного склероза (MS) (Warren, К. G., and Catz, I., Ann Neurol 209:20-25, 1986).

Клиническая картина рассеянного склероза характеризуется фазами активного заболевания, такими как острые рецидивы или хроническое течение, и фазами клинической ремиссии. Для активной формы рассеянного склероза характерны повышенные уровни внутриоболочечных анти-МВР (Warren, К. G., and Catz, I. , Ann Neurol 209: 20-25, 1986, and Catz, I., and Warren, K. G., Can J. Neurol Sci. 13:21-24, 1986). Эти антитела обнаруживаются преимущественно в свободной (F) форме во время острых рецидивов и преимущественно в связной (В) форме, когда болезнь незаметно прогрессирует (Warren, К. G., and Catz, I. , Ann Neurol 209:20-25, 1986). Во время острых рецидивов титры анти-МВР в спинномозговой жидкости (CSF) соответствуют активному развитию заболевания (Warren, К. G., and Catz, I., Ann Neurol 21:183-187, 1987). Уровни анти-МВР также повышаются у больных с первыми приступами оптического неврита и у большинства больных с начальными стадиями рассеянного склероза (MS) (Warren, К. G., Catz, I., and Bauer, С., AnnNeurol 23: 297-299,1988; Warren. К., G., and Catz, I., J Neurol Sci. 91:143-151, 1989).

Продолжительные исследования кинетики уровней антител к МВР в CSF у пациентов, находящихся в стадии выздоровления после острого рецидива, показали постепенное падение титров анти-МВР в свободной (F) форме с соответствующим пропорциональным повышением (В)-фракций, т. е. анти-МВР в связанной форме (Warren, К. G., and Catz, I., J. Neurol Sci. 91: 143-151, 1989; Warren, К. G. , and Catz, I., J. Neurol Sci. 88: 185-194,1988). В стадии ремиссии анти-МВР в CSF могут не обнаруживаться, что позволяет предположить, что нейтрализация анти-МВР связана с неактивной стадией заболевания (MS) (Warren, К. G. , and Catz, I., J. Neurol Sci. 88: 185-194, 1988). Наоборот, хронически прогрессирующий рассеянный склероз (MS), характеризующийся постоянным увеличением выработки анти-МВР в течение продолжительного периода времени, связан с ингибированием нейтрализации анти-МВР (Warren, К. G., and Catz, I., J. Neurol Sci. 88: 185-194, 1988). Недавно в IgG-фракции, полученной из CSF больных MS, были идентифицированы антитела к основному миелиновому белку, в том числе анти-МВР, антитела, нейтрализующие анти-МВР, и антитела, ингибирующие нейтрализацию анти-МВР (Warren, К. G., and Catz, I., J. Neurol Sci. 96: 19-27, 1990).

Предыдущие исследования авторов изобретения с учетом сведений о В-клеточных аутоантителах показывает, что существует по крайней мере две отличающиеся друг от друга формы рассеянного склероза (MS): первая - когда у большинства больных вырабатываются аутоантитела к миелиновому основному белку (анти-МВР), и вторая, когда у меньшего числа больных вырабатываются антитела к белку протеолипидной природы (анти-PLP) (Warren, К. G., et al.,. Ann Neurol 35: 280-289, 1994). При той форме заболевания (MS), для которой характерно наличие анти-МВР, острые рецидивы сопровождаются увеличением соотношения свободных (F) и связанных (В) анти-МВР, тогда как хронически прогрессирующая фаза характеризуется более низким соотношением F/B анти-МВР, а больные на стадии ремиссии редко имеют слегка повышенные титры анти-МВР (Warren, К. G., and Catz, I, J. Neurol Sci. 88: 185-194, 1989).

Было показано, что часть пролиферирующих Т-клеток у больных рассеянным склерозом направлена к MBP (Allegretta et al.. Science, 718-721, 1990) и что Т-клетки человека могут узнавать множественные эпитопы на молекуле (Richert et al. , J. Neuroimmun 23, 55-66, 1989). MBP, по-видимому, также способом к активации некоторых Т-клеток без вовлечения антигенпрезентирующих клеток (Altman et al., Eur. J. Immunol. 17, 1635-1640, 1987). Похоже, что небольшие пептиды MBP могут распознаваться Т-клетками без внутриклеточного процессирования просто за счет их способности связывать антигены основного комплекса гистосовместимости класса П на поверхности презентирутощих клеток.

Поскольку экспериментальный аллергический энцефаломиелит (ЕАЕ), признанный моделью рассеянного склероза (MS) на животных, может быть индуцирован введением чувствительным грызунам как MBP, так и PLP в сочетании с полным адъювантом Фрейнда, процесс демиелинизации при рассеянном склерозе, возможно, имеет аутоиммунный механизм (Fritz, R. В. et al., J. Immunol., 130, 1024-1024, 1983; Trotter, J. L. et aL, J. Neurol Sci. 79, 173-188, 1987). Принимая во внимание сведения о В-клеточных аутоантителах, эпитоп МВР, на который "нацелено" заболевание, локализован вблизи от три-пролиловой последовательности (остатки -99-100-101-) на участке между 80-м и 100-м остатком (Warren, К. G., et al., Ann Neurol 35: 280-289, 1994). Этот В-клеточный эпитоп частично перекрывает иммунодоминантный эпитоп Т-клеток, активных в отношении МВР, которые обнаружены в участках мозга, пораженных рассеянным склерозом (MS) (Oksenberg, g. R. et al., Nature, 362, 68-70, 1993).

Предыдущие исследования показали, что анти-МВР нейтрализуются МВР. Однако предварительные попытки лечения рассеянного склероза (MS) внутримышечным или подкожным введением гетерологичных МВР не привели к успеху (Campbell, В. , Vogel, R. J., Fisher, E. and Lorenz, R., Arch Neurol 29: 10-15, 1973; Gonsette, R. E., Delmotte, P. and Demonty, L., J Neurol 216: 27-31, 1977; and Romine, J. S. and Salk, J.. In: Hallpike, J. F, Adams, C. W. M. and Tourtelotte, W. W., eds. Multiple sclerosis. Baltimore, Williams & Wilkins, 1982: 621-630). Проблема использования нативного МВР имеет две стороны. Белок получают из образцов мозга человека и потому существует потенциальная опасность, что в нем присутствуют латентные нейровирусы. Кроме того, несмотря на то, что, как правило, МВР не является иммуногенным, при введении лицам с нарушенной иммунной системой, МВР может проявлять себя как антиген и вызывать выработку антител к МВР.

Соответственно, настоящее изобретение направлено на решение вопроса: могут ли анти-МВР, выделенные из спинномозговой жидкости (CSF) больных рассеянным склерозом (MS) в стадии острого рецидива нейтрализоваться определенными пептидами МВР человека (h-МВР). Для этой цели синтетические пептиды, соответствующие полной длине h-MBP, использовали для определения возможной эпитопной области на h-MBP, которая нейтрализует анти-МВР, полученные от указанных больных. Следовательно, выбранные пептиды, которые нейтрализуют анти-МВР, могут использоваться для лечения рассеянного склероза (MS) более эффективно, чем МВР полной длины. Эти пептиды получены искусственным путем и потому не несут потенциальной угрозы, связанной с нейровирусами. Кроме того, в связи с малым размером эти пептиды не проявляют себя в качестве иммуногенов.

Следовательно, использование указанных пептидов как средства лечения рассеянного склероза поможет решить проблемы, возникающие при использовании нативного белка.

Кроме того, пептиды, полученные согласно настоящему изобретению, исследуют для определения эффективности их связывания или модуляции выработки анти-МВР рассеянного склероза (MS) in vivo.

Сущность изобретения В соответствии с изобретением синтезирован пептид, последовательность которых, в основном, гомологична части аминокислотной последовательности миелинового основного белка человека. Эти пептид способен нейтрализовать или модулировать выработку анти-МВР. В соответствии с настоящим изобретением пептид имеет формулу Asp-Glu-Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-Thr Далее, согласно настоящему изобретению, создана фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента указанный пептид в смеси с фармацевтически приемлемым носителем.

Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением создан способ лечения рассеянного склероза, предусматривающий введение эффективного количества пептида как индивидуально, так и в сочетании для эффективной нейтрализации или модулирования выработки антител к МВР человека.

Краткое описание рисунков Фиг. 1 показывает локализацию восемнадцати синтетических пептидов по отношению к интактной молекуле МВР человека. Пептиды представлены в виде вертикальных полос и размещены после соответствующего им участка на молекуле МВР. Шкала показывает аминокислотные остатки на молекуле МВР человека.

Фиг.2 показывает кривые ингибирования антител к МБР, очищенных и полученных от 10 различных больных рассеянным склерозом, при введении МБР человека и МВР-пептидов.

Фиг. 3 показывает нейтрализацию анти-МВР, полученных от одного больного рассеянным (MS) МВР человека и пептидами МВР 80-97, МВР 91-106 и МБР 75-95.

Фиг. 4 - длительный мониторинг титров анти-МВР в спинномозговой жидкости у пациента с хроническим рассеянным склерозом (MS): уровни F (свободных) и В (связанных) анти-МВР были стабильно повышенными при исследовании 26 проб в течение 11-летнего периода с 1983 по 1993 г.

срm: счет в минуту -₀- связанные (В) анти-МВР, определенные после кислотного гидролиза иммунных комплексов в спинномозговой жидкости (CSF).

-- свободные (F) анти-МВР.

Фиг.5 - контрольные больные: уровни анти-МВР CSF в 2 временных контролях (1F56, Fig. 5A и 3М66, Fig. 5B) и 2 временных контролях при использовании физиологического раствора. У всех четверых больных уровень (F)- и (В)-анти-МВР остается устойчиво повышенным по отношению к базовому уровню, когда CSF отбиралась для анализа каждые 30 мин в течение первых двух часов, так же, как и 24-мя часами позже. Обозначения такие же, как на фиг.4.

Фиг. 6 - сравнительные исследования пептидов от разных больных: уровни анти-МВР в спинномозговой жидкости в группе из четырех больных (10F38, Fig. 6а; 13F43, Fig. 6С; 5М59, Fig. 6D; и 3М66, Fig. 6G), получивших увеличенные количества (1, 2.5, 5 и 10 мг соответственно) несвязанного контрольного синтетического пептида МВР-35-58 и в группе из четырех других больных (6F53, Fig. 6В; 8М41, Fig. 6D; и 4М45, Fig. 6F; и 1F56, Fig. 6H), которые получали повышенные количества (1, 2.5, 5 и 10 мг соответственно) анти-МВР, связывающих синтетический пептид МБР 75-95. CSF (F)-анти-МВР были связаны в дозо-зависимом соотношении пептидом МБР 75-95, и они не вступали во взаимодействие с пептидом МВР 35-58. Связанные анти-МВР оставались фактически нереакционноспособным.

Фиг.7 - сравнительные исследования пептидов от разных больных: когда больные MS подвергались временному контролю (1F56, Фиг.7С и 3М66, Фиг.7D) или временному контролю при использовании физиологического раствора (5М59, Фиг. 7А и 4М45, Фиг.7В), а также, когда они получали несвязанный контрольный пептид МВР 35-58 (5М59 и ЗМ66), уровни их (F)-анти-МВР и (В)-анти-МВР оставались постоянно неизмененными. Напротив, когда те же больные 4М45, 1F56 и 3М66 позже получили 5-10 мг анти-МВР, связанных с пептидом МВР 75-95, их (F)-анти-МВР переставали обнаруживаться в течение периода до 7 дней и возвращались на уровень базовой линии между 10 и 21 днем.

Фиг. 8 - повторяемые внутрикожные инъекции синтетического пептида: больной с хронически прогрессирующим MS получал 10 еженедельных инъекций 10 мг МВР 75-95, вводимых непосредственно в спинномозговую жидкость; титры (F) и (В)-анти-МВР измерялись до (обозначенные кружками) и спустя 30 мин после инъекции (обозначенные квадратами). Свободные (F)-анти-МВР (заштрихованные квадраты и кружки) становились неопределяемыми в течение 10 недель, несмотря на то, что уровень связанных (В)-антител оставался существенно неизмененным (незаштрихованные квадраты и кружки).

Фиг. 9. Внутривенное введение синтетического пептида: уровни анти-МВР в спинномозговой жидкости соответствуют одной внутривенной инъекции 500 мг МВР 75-95; уровни связанных (В)- и свободных (F)-анти-МВР существенно снижаются при исследованиях спустя 10, 16 и 30 дней после инъекции. Обозначения - такие же, как на фиг.4.

Фиг.10. Дальнейшее изучение МВР эпитопа для анти-МВР MS с использованием группы из 41 декапептида, которые перекрывают участки между 61 и 110 остатками.

Описание: - полосы обозначают процент ингибирования =100 - единицы радиоактивности; - МВР и пептид МВР 75-95 были использованы в качестве позитивного контроля и обеспечили 100% ингибирование как свободных (F)-, так и связанных (В)-антител; - пептиды МВР 51-60 и МВР 111-120 были использованы в качестве негативного контроля и привели к незначительному ингибированию (0-10%) связанных (В)- и свободных (F)-анти-МВР; - декапептиды МВР 84-93, МВР 85-94, МВР 86-95 и МВР 87-96, которые обеспечили максимальное ингибирование (90-100%) как свободных (F)-, так и свободных (В)-антител, тесно ассоциируются с МВР эпитопом; - пунктирная линия: 95%-ный достоверный интервал исследования по ингибированию.

На фиг.11 представлены количества свободных (F)- и связанных (В)-о анти-МВР в ЦСЖ больного с односторонним оптическим невритом, которому были проведены две внутриоболочечные инъекции (it#l и it#2) 50 мг рМВР86-95 с интервалом 4 недели; w = число недель.

На фиг.11b представлены количества свободных (F)- и связанных (В)-о анти-МВР в ЦСЖ больного с полным односторонним оптическим невритом, которому были проведены многочисленные внутриоболочечные инъекции (it#l, it#2, it#3, it#4 и it#5) 50 мг рМВР82-98 в первую неделю рецидива.

На фиг.11с представлены количества свободных (F)- и связанных (В)-о анти-МВР в ЦСЖ больного с псевдоатерозом, которому были проведены пять ежедневных внутриоболочечных инъекций (it# l, it#2, it#3, it#4 и it#5) 50 мг рМВР82-98.

На фиг. 11d представлены количества свободных (F)- и связанных (В)-о анти-МВР в ЦСЖ больного рецидивирующим-прогрессирующим рассеянным склерозом, которому были проведены четыре внутриоболочечные инъекции (it#l, it#2, it#3 и it#4) 50 мг рМВР86-95 каждые 2-3 дня в первую неделю рецидива и одна внутривенная инъекция (IV) 400 мг рМВР86-95, когда заболевание вступило в прогрессирующую фазу.

На фиг. 12 представлены количества свободных и связанных анти-МВР в ЦСЖ больного с полисимптоматичеким рецидивом, которому было проведено всего семь внутриоболочечных инъекций 50 мгрМВР86-95. Спустя 30 минут после it#2 образец ЦСЖ не брали; он был взят спустя 24 ч. Обозначения такие же, как на фиг. 11.

На Фиг. 13 представлены количества свободных и связанных анти-МВР в ЦСЖ больного рецидивирующим-прогрессирующим рассеянным склерозом, которому были проведены как внутриоболочечные (it#l, it#2 и it#3), так и внутривенные инъекции (IV# 1 и IV# 2) pMBP86-95. До или после it#2 образец ЦСЖ не брали. Обозначения такие же, как на фиг.11.

На фиг. 14 представлены количества свободных и связанных анти-МВР в ЦСЖ больного рецидивирующим-прогрессирующим рассеянным склерозом, которому были проведены как внутривенные (IV# 1, IV#2 и IV#3), так и внутриоболочечные (с it# 1 пo it#9) инъекции pMBP86-95 и рМВР82-98. Обозначения такие же, как на фиг.11.

Фиг. 15 отражает попытку предотвратить последующие рецидивы у больного рецидивирующим-прогрессирующим рассеянным склерозом, которому были проведены две внутривенные инъекции (IV#1 и IV#2) 400 мг pMBP86-95 и рМВР82-98. В ходе первого рецидива, спустя 3 месяца после IV#1, образец ЦСЖ не брали. Естественная частота рецидивов отражена наверху стрелками, соответствующими месяцам рецидива. Квадратом отмечено время эксперимента. Обозначения такие же, как на фиг.11.

Фиг. 16 отражает попытку предотвратить последующие рецидивы у больного рецидивирующим-прогрессирующим рассеянным склерозом, которому были проведены две внутриоболочечные (it# l и it# 2) и одна внутривенная (IV) инъекции pMBP86-95. - внутривенное введение большой дозы метилпреднизолона. Естественная частота рецидивов отражена наверху стрелками, соответствующими месяцам рецидива. Квадратом отмечено время эксперимента. Обозначения такие же, как на фиг.11.

На фиг.17 показан эффект внутриоболочечного и внутривенного введения пептида на количество МБР-специфических аутоантител в ЦСЖ больного хроническим прогрессирующим рассеянным склерозом. В эксперименте, представленном на фиг. 17а, рМВР75-95 вводили прямо в ЦСЖ (2.5 мг в 5 мл физиологического раствора) и МВР-специфические аутоантитела определяли твердофазным радиоиммунологическим тестом через различные интервалы времени (от 0.5 ч до 7 дней после инъекции). Инъекции пептида приводили к временной нейтрализации свободных анти-МВР (закрашенные кружки), но не оказывали влияния на связанные анти-МВР (незакрашенные кружки). Аутоантитела были необнаружимы через 1 и 2 ч и их количество начинало возвращаться к исходным значениям между 12 и 24 часами после инъекции. Аналогичные наблюдения были сделаны с семью другими больными хроническим прогрессирующим рассеянным склерозом. На фиг. 17b видно, что спустя 13 месяцев после внутриоболочечного введения, представленного на фиг. 17а, больному было внутривенно введено 500 мг рМВР75-95 в 50 мл физиологического раствора и МВР-специфические аутоантитела в ЦСЖ определяли на протяжении 3 месяцев (среднее стандартное отклонение).

На фиг.18 представлены уровни анти-МВР в ЦСЖ тринадцати больных хроническим прогрессирующим рассеянным склерозом, которым проводили внутривенные инъекции (IV# 1 5-6 мг/кг веса тела (256-500 мг в физиологическом растворе) рМВР75-95 (2 больных) или рМВР86-95 (11 больных); определяли как свободные, так и связанные анти-МВР (закрашенные и незакрашенные кружки соответственно). Уровень аутоантител в промежутке 1-4 месяцев после IV#1 был низким или необнаружимым, а затем возвращался к исходным значениям. В промежутке 6-10 месяцев после IV# 1 всем больным проводили вторую внутривенную инъекцию рМВР82-98 в той же дозе (IV#2).

Подробное описание изобретения Настоящее изобретение касается пептидов, аминокислотная последовательность которых практически гомологична части аминокислотной последовательности миелинового основного белка человека. Термин "практически гомологична" означает, что небольшие различия между аминокислотной последовательностью миелинового основного белка человека и пептидами могут существовать при условии, что пептиды с небольшими различиями в аминокислотной последовательности способны функционировать в соответствии с изначально присущим назначением, т.е. способны нейтрализовать или модулировать выработку антител к миелиновому основному белку человека (анти-МВР). Проведенные в настоящем изобретении разъяснения делают очевидным для специалистов в данной области тот факт, что эмпирически небольшие вариации в аминокислотной последовательности указанных пептидов могут быть произведены без ущерба для их функции.

На основе другой работы, связанной с настоящим изобретением, а также на основе тестов по конкурентному ингибированию с использованием серии из 41 декапептида, был уточнен эпитоп МБР, связывающий анти-МВР при рассеянном склерозе. Он был локализован в области между аминокислотой 86 и аминокислотой 95. Исходя из наивысшего уровня ингибирования В-анти-МВР (равного или большего 95%), эпитоп МВР, связывающий анти-МВР, можно локализовать между аминокислотой 86 и аминокислотой 95. Наименьшая общая область эффективных декапептидов находится с аминокислоты 87 по аминокислоту 93. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением, пептиды могут быть представлены следующей формулой: R₁-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-R₂ и его солей, при том, что R₁ и R₂ независимо выбраны из группы, включающей водород, гидрокси, аминокислотный остаток и полипептидный остаток; при том, что R₁ и R₂ не являются одновременно водородом или гидроксилом.

Семь аминокислот, соответствующих положениям с 87 по 93, по-видимому, недостаточно велики, чтобы эффективно связывать анти-МВР. Таким образом, R₁ и R₂ не должны быть одновременно водородом или гидроксилом.

Когда R₁ и R₂ являются аминокислотой, то эта аминокислота может быть выбрана из природных аминокислот. R₁ и R₂ не ограничиваются аминокислотами, встречающимися "выше" или "ниже" Val87 и Ilе93 в основном белке миелина человека, как показано в последовательности SEQ ID No:l. Могут быть проведены различные модификации, включая замены, добавления или делеции, как "выше", так и "ниже" последовательностей R₁ и R₂. Кроме того, модификации, включая замены, добавления или делеции, могут быть осуществлены в последовательности -Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-, при том, что полученные таким образом пептиды способны выполнять нужную функцию, т.е. нейтрализуют или модулируют образование антител к основному белку миелина.

Термин "остаток полипептида" или "полипептидный остаток" подразумевает полипептиды различного размера, включая белки или их фрагменты. Как указано выше, когда R₁ и R₂ являются полипептидным остатком, то R₁ и R₂ не ограничиваются пептидами, встречающимися "выше" или "ниже" Val87 и Ilе93 в основном белке миелина человека. Могут быть использованы любые полипептидные остатки.

В одном из вариантов осуществления изобретения R₁ может быть пептидом, выбранным из группы пептидов, варьирующих в пределах от аминокислотного остатка 61 до аминокислотного остатка 86 последовательности SEQ ID No:1. Длина указанного пептида может варьировать от одного аминокислотного остатка до 26 аминокислотных остатков.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения R₂ может быть пептидом, выбранным из группы пептидов, варьирующих в пределах от аминокислотного остатка 94 до аминокислотного остатка 106 последовательности SEQ ID No: l. Длина указанного пептида может варьировать от одного аминокислотного остатка до 13 аминокислотных остатков.

R₁ и/или R₂ могут быть повторами последовательности -Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile или ее модификациями, включая замещения, дополнения или делении. Таким образом, пептид может содержать многочисленные повторы сайта связывания анти-МВР (эпитопа).

Соединения, заявленные согласно настоящему изобретению, могут быть получены в соответствии с общепринятыми и хорошо известными методами синтеза полипептидов. Под термином "пептид" подразумевают пептиды, полученные из природных миелиновых основных белков человека в результате контролируемого гидролиза, осуществляемого до образования пептидов, относящихся к данному изобретению. Указанное понятие также включает и пептиды, полученные с помощью технологии рекомбинантных ДНК. С учетом известной последовательности заявленных пептидов в объем настоящего изобретения включено также установление соответствующей последовательности ДНК, кодирующей заявленную аминокислотную последовательность. Соответствующая последовательность ДНК может быть получена общепринятыми хорошо известными методами синтеза ДНК последовательностей. Полученные таким образом последовательности ДНК могут быть клонированы в соответствующих клонирующих векторах и использованы для трансформации подходящей клетки-хозяина с целью получения рекомбинантного пептида. Все изложенные выше подходы являются общепринятыми и хорошо известными для специалистов в данной области.

Пептиды, заявленные согласно настоящему изобретению, в основном гомологичны по своей аминокислотной последовательности части аминокислотной последовательности миелинового основного белка человека. Понятие "часть аминокислотной последовательности" означает, что последовательность может быть любой длины при условии, что она достаточно длинна для того, чтобы нейтрализовать или модулировать выработку антител к МВР, но имеет не такую длину, которая приводит к известным ранее проблемам, когда пептиды используются in vivo для лечения рассеянного склероза. В одном примере настоящего изобретения описаны пептиды, включающие от ~10 до ~25 аминокислотных остатков. Если заявленные пептиды используются как часть белков слияния, общий размер пептида может быть гораздо больше.

В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения было установлено, что заявленные пептиды, соответствующие в значительной мере аминокислотной последовательности человеческого МВР, эффективны в отношении нейтрализации и модулирования выработки анти-МВР. Эти пептиды соответствуют аминокислотной последовательности человеческого МВР в интервале от 61 до 106 аминокислотного остатка. В одном примере эти пептиды соответствуют участку 75-106 аминокислотной последовательности человеческого МВР, когда пептиды используются для нейтрализации свободных анти-МВР. В последующем примере эти пептиды соответствуют участку 82-99 аминокислотной последовательности человеческого МВР, когда пептиды используются для нейтрализации и модулирования выработки связанных анти-МВР. Поэтому выбираются пептиды, состоящие из 10-25 аминокислотных остатков, из сплошной аминокислотной последовательности в пределах последовательности, показанной ниже (аминокислотные остатки SEQ ID NO: 1), при условии, что указанная последовательность может нейтрализовать или модулировать выработку антител к миелиновому основному белку человека.

Аминокислотные остатки 61-106 SEQ ID NO: 1 61 His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser His Gly Arg Thr Gln Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Hle Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gln Gly Lys Gly 106 Ниже приведены примеры пептидов, выбранных из группы, включающей: МВР61-75 (аминокислотные остатки 61-75 SEQ ID NO:1) His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Lys MBP64-78 (аминокислотные остатки 64-78 SEQ ID NO:1) Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser His Gly MBP69-83 (аминокислотные остатки 69-83 SEQ ID NO:1) Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser His Gly Arg Thr Gln Asp Glu MBP75-95 (аминокислотные остатки 75-95 SEQ ID NO:1) Lys Ser His Gly Arg Thr Glin Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr MBP80-97 (аминокислотные остатки 80-97 SEQ ID NO:1) Thr Gln Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn He Val Thr Pro Arg MBP91-106 (аминокислотные остатки 91-106 SEQ ID NO: 1) Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gln Gly Lys Gly Один аспект настоящего изобретения касается пептидов, представленных формулой R₁-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-R₂ и их солей, где R₁ и R₂ независимо друг от друга выбраны из группы, включающей водород, гидрокиси, остаток аминокислоты и остаток полипептида, при условии, что R₁ и R₂ не являются одновременно водородом или гидроксилом. Пептид может содержать замещения, добавления или делении при условии сохранения пептидом своего свойства нейтрализовать или модулировать выработку антител к МВР человека.

Ниже приведены примеры пептидов, выбранные из группы, включающей МВР84-93 Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile МВР85-94 Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val МВР86-95 Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr МВР87-96 Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-VaI-Thr-Pro MBP82-98 Asp-Glu-Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-Thr B силу наличия пяти дополнительных гидрофильных остатков пептид MBP82-98 имеет повышенную растворимость в сравнении с другими пептидами, заявленными в настоящем изобретении. Таким образом, использование данного пептида является предпочтительным по сравнению с другими пептидами, заявленными в настоящем изобретении.

Возможная роль анти-МВР в патогенезе рассеянного склероза продолжает исследоваться. О повышенных титрах анти-МВР у больных активной формой рассеянного склероза впервые сообщили Panich et al. (Panitch, H. S., Hooper, С. S., and Johnson, K. P., Arch Neurol 37: 206-209, 1980), которые использовали твердофазный радиоиммунологический анализ с МВР морской свинки. Пациенты с острым рецидивом заболевания, как правило, имели повышенное содержание анти-МВР, в основном, в свободной форме, тогда как некоторые больные в стадии клинической ремиссии могли иметь необнаруживаемые уровни анти-МВР. Во время переходного периода от острой дозы к ремиссии титры свободных анти-МВР прогрессивно снижались за период от нескольких недель до нескольких месяцев, в то время как уровень связанных антител был сравним с первоначальным. У других больных на стадии ремиссии можно было наблюдать низкие титры свободных и связанных анти-МВР, обычно с соотношением F/B меньше 1.

Это позволяет предположить, что антитела (антитело), нейтрализующие анти-МВР, связываются с анти-МВР. Иногда больные, которые точно соответствовали критериям клинически определяемого рассеянного склероза или больные с нейропатологически выявленным рассеянным склерозом, имели неопределяемый уровень анти-МВР в период активной стадии заболевания. Возможно, такие пациенты имеют антитела к другим миелиновым белкам. Отсутствие схемы выработки специфических антител не уменьшает потенциальной возможной роли анти-МВР в механизме демиелинизации у большинства больных рассеянным склерозом.

Недавно различные антитела к МВР были обнаружены во фракции IqG, выделенной из спинномозговой жидкости больных рассеянньм склерозом (Warren, К.G. and Catz, I., J. Neurol Sci 96: 19-27, 1990). Первичные антитела к МВР как в свободной, так и в связанной форме оказались связанными с активной фазой заболевания: F/B>1 у пациентов с острой формой и <1 - у пациентов с хронически прогрессирующей формой рассеянного склероза (Warren, К. G. and Catz, I., Ann Neurol 209: 20-25, 1986; Catz, I., and Warren, K. G. Can J Neurol Sci 13: 21 -24,1986; and Warren, K. G. and Catz, I., Ann Neurol 21: 183-187,1987). Вторичные антитела, которые нейтрализуют анти-МВР, появляются, когда заболевание переходит в неактивную форму. Третичные антитела, которые ингибируют нейтрализацию анти-МВР, обнаруживаются, когда заболевание становится хронически прогрессирующим и переходит в неактивную форму. Тот факт, что каскад антител к МБР ассоциирован с фазами (MS), позволяет предположить, что образование таких антител, возможно, играет важную роль в развитии данного заболевания.

Несмотря на то, что анти-МВР могут быть определены в CSF больных с активной формой рассеянного склероза (MS), их главная роль в патогенезе демиелинизации остается неподтвержденной. Участие анти-МВР в механизме развития рассеянного склероза (MS) лучше всего может быть установлено их нейтрализацией in vivo, возможно, при введении заявленных пептидов и мониторингом клинического течения заболевания. Если анти-МВР являются только первичными антителами, связанными с демиелинизацией при рассеянном склерозе (MS), вероятно, возможно блокировать димиелинизацию внутриоболочечным и/или внутривенным и/или оральным введением заявленных МВР пептидов, которые нейтрализовали бы анти-МВР и обеспечивали бы толерантность к МВР in situ. Другие миелиновые белки человека, возможно, также участвуют в димиелинизации при рассеянном склерозе (MS) и, в соответствии с этим, в объем настоящего изобретения включено использование пептидов, в значительной мере гомологичных по аминокислотной последовательности части аминокислотной последовательности указанных других миелиновых белков, для того, чтобы нейтрализовать соответствующие антитела. Несмотря на то, что предыдущие попытки лечения рассеянного склероза (MS) внутримышечным или подкожным введением гетерологичного МВР не оказались в полной мере успешными (Campbel, В.,Vogel, R. J., Fisher, E. and Lorenz, R., Arch. Neuro l29: 10-15, 1973; Gousette, R. E., Delmotte. P. and Demonty, L. J .Neurol 216: 27-31,1977; and Romine, J. S. and Salk; J., In: Halpike, J. F., Adams, C. W. M. and Tourtelotte, W. W., eds. Multiple Sclerosis. Baltimore, Williams & Wilkins, 1982: 621-630), внутриоболочечное и/или внутривенное введение МВР пептидов, которые нейтрализуют или модулируют выработку анти-МВР, в соответствии с изобретением продемонстрировало более успешные результаты.

Моделью MS на животных служит экспериментальный аллергический энцефаломиелит (ЕАЕ), представляющий собой опосредованное Т-клетками демиелинизирующее заболевание. Симптомы ЕАЕ могут быть скорригированы введением мышам синтетических пептидов МВР (Gaur, A. et al., Science, 258, 1491-1494, 1992). Более того, введение высоких доз МВР делегировало аутореактивные Т-клетки и аннулировало клинические и патологические симптомы ЕАЕ у мышей (Gritchfield, J. M. et al., Science, 263, 1139-1143, 1994). Даже оральное введение МВР модулировало течение ЕАЕ за счет индукции периферической толерантности (Chen, W. et al., Science, 265, 1237-1240, 1394).

Недавно на основании сдвоенных пробных экспериментов было высказано предположение, что толерантность может быть индуцирована у больных MS оральным введением миелиновых антигенов (Weiner, H, L. et al. Science 259, 1321-1324, 1993). Комбинация миелиновых антигенов и синтетических пептидов указанных антигенов, введенная оральным, и/или внутривенным, и/или внутриоболочечным путем, возможно, необходима для модулирования Т-клеток, В-клеток и макрофагов, участвующих в деструкции миелина у больных рассеянным склерозом (MS).

Соответственно изобретение также касается фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента пептид, описанный выше, отдельно или в композиции, в смеси с фармацевтически приемлемым носителем. Примеры фармацевтически пригодных носителей хорошо известны и включают, например, физиологический раствор.

Пептиды, заявленные в настоящем изобретении, могут назначаться людям для лечения или модулирования MS. Терапевтическая доза для внутривенного и/или орального введения при лечении MS может составлять от примерно 1.0 мг на 1 кг веса тела до примерно 10.0 мг на 1 кг веса тела. Если введение осуществляется внутриоболочечно, доза может составлять от около 1 до около 10 мг. В одном из примеров изобретения пептид применяется либо внутривенно, либо внутриоболочечно или сочетанием данных методов. Если требуется, пептиды могут назначаться как однократной дозой, так и последовательно в виде нескольких доз.

В соответствии с настоящим изобретением, внутривенное введение пептида снижает количество как свобоных, так и связанных анти-МВР антител; внутриоболочечное введение пептида оказалось эффективным только для нейтрализации или модулирования свободных анти-МВР антител.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения было показано, что последовательное внутриоболочечное введение пептидов МВР может снижать количество свободных анти-МВР антител и поддерживать их количество на низком уровне в течение месяцев после инъекции пептидов больным, страдающим от моносимптоматических рецидивов. В одном из примеров, согласно данному варианту осуществления изобретения, 50 мг пептида МВР вводили больному ежедневно в течение четырех - пяти дней. Согласно другому примеру, может быть введена дополнительная доза спустя одну или две недели после первоначальных инъекций.

В то время, как в описании изобретения детально и подробно изложены предпочтительные варианты его осуществления, нижеследующие примеры иллюстрируют, но не ограничивают изобретение.

ПРИМЕР 1 Нейтрализация антител к МВР человека in vitro.

Фиг.1 показывает локализацию 18 пептидов человеческого МВР, используемых в этом опыте, по отношению к молекуле интактного МВР. Нативный МВР был выделен из ткани мозга, не пораженного рассеянным склерозом (MS) (Diebler, G. E., Martenson, R. Е-, Kies, W. W. Prep Biochem 2: 139-165, 1972) и далее очищен гель-фильтрацией. Конечные антигенные препараты были проверены на чистоту SDS-электрофорезом в полиакриламидном геле. В дальнейших исследованиях использовались только те препараты, которые перемещались соответственно молекулярному весу 18.5 кД. Очищенный МВР был использован в антиген-специфичной аффинной хроматографии, в опытах по нейтрализации и в твердофазном радиоиммуноисследовании при и