Нуклеотидная последовательность гена leu2 yarrowia lipolytica (варианты), рекомбинантный днк-материал (варианты), штамм дрожжей yarrowia lipolytica (варианты)

Нуклеотидная последовательность гена leu2 yarrowia lipolytica (варианты), рекомбинантный днк-материал (варианты), штамм дрожжей yarrowia lipolytica (варианты)

Реферат

 

Изобретение относится к технологии выделения протеинов дрожжей и касается нуклеотидной последовательности гена LEU2 Yarrowia lipolytica, рекомбинантных ДНК-материалов, каждый из которых содержит, помимо нуклеотидной последовательности гена LEU2 Yarrowia lipolytica, ген прореннина или анафилатоксина человека, а также штаммов Yarrowia lipolytica, трансформированных рекомбинантным ДНК-материалом и способных продуцировать прореннин или анафилатоксин человека. Изобретение обеспечивает надежное получение достаточно высокого количества таких протеинов, как прореннин и анафилатоксин человека, в легко отделяемой функциональной форме. 8 с.п. ф-лы, 8 табл., 15 ил.

Заявка является частичным продолжением заявки, серийный номер 789206, поданной 18 октября 1985 г.

Данное изобретение относится к технологии выделения протеинов дрожжей. Более конкретно оно относится к рекомбинантным векторам клонирования Yarrowia lipolytica, содержащим чужеродную ДНК, кодирующую экспрессию и выделение протеинов млекопитающих (например, прохимозина) и других полипептидов; к векторам экспрессии, содержащим промотор гена Y. lipolytica (например, XРR2 или LЕU2), ДНК-последовательности, кодирующие сигнальную (или предсигнальную) последовательность щелочной протеазы, область пропептида и участок терминатора XPR2, а также их варианты и функциональные эквиваленты, возникающие при вырождении генетического кода или использовании других генных компонентов Y. lipolytica. Кроме того, изобретение относится к трансформантам дрожжей, несущим указанные векторы экспрессии и выделения, их использованию для получения чужеродных протеинов в их нативной, функциональной форме и методам осуществления вышеуказанного.

Экономическая привлекательность как надежного и обеспечивающего достаточно высокий выход разнообразного множества протеинов или полипептидов, представляющих интерес для промышленности (например, прореннина, бычьего гормона роста) или медицинских целей (например, урогастрона, тканевого активатора плазминогена, человеческого анафилатоксина С5а), и в особенности как источника, дающего высококачественный продукт в легко отделяемой функциональной форме, привели многих исследователей к приложению ДНК-рекомбинантной технологии к микроорганизмам как "фабрикам" для производства чужеродных протеинов.

Обширные исследования сконцентрированы на секреции протеинов как потенциальном разрешении трудностей, встречающихся при извлечении чужеродных (гетерологичных) или экзогенных протеинов в биологически активной форме из внутриклеточных скоплений их в рекомбинантных клетках хозяина, в особенности из Escherichia coli. В Е. coli чужеродный протеин часто производится в клетке в форме преломляющих тел включения. Эти протеины обычно имеют низкую растворимость в воде и малую биологическую активность или не имеют ее вовсе. Извлечение данных протеинов из преломляющих тел включения обычно требует жесткой химической обработки, которая может быть дорогостоящей и может иметь следствием низкий выход или невозможность получения протеина в желаемой нативной, биологически активной форме. Кроме того, возможность загрязнения протеина нежелательными веществами, производимыми Е. coli, увеличивается ввиду необходимости разрушения клеток для освобождения преломляющих тел. Другие организмы, кроме Е. coli, также производят чужеродные протеины в нерастворимой внутриклеточной форме. Например, патент Великобритании 2091271, опубликованный 28 июля 1982 г., описывает генетическую модификацию S. cerevisiae путем ДНК-рекомбинантной технологии для экспрессии телячьего реннина или химозина; эти термины используются в патенте взаимозаменяемо. Ввиду этих трудностей обратились к секреции упомянутых протеинов с целью получения протеинов в нативной, активной конфигурации.

Выделяется ли какой-либо протеин, включая чужеродные протеины, или полипептид данным организмом, предположительно зависит от вида протеина. В большинстве эукариотических клеток часть аппарата синтеза протеинов связана с эндоплазмичной сетчатой мембраной и последовательность аминокислот (называемая "сигнальной последовательностью") у аминоконца растущей полипептидной цепи служит для управления процессом преодоления протеином мембраны. Сигнальная последовательность затем отщепляется протеолитически, давая активный зрелый протеин. Для ускорения процессов выделения чужеродных протеинов было сделано несколько попыток использовать сигнальные последовательности микроорганизмов, в том числе Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae и культур клеток млекопитающих. Однако данные организмы оказались не идеальными.

Присущие В. subtilis свойства, например выделение многих протеинов, включая многочисленные протеазы, которые способны деградировать выделяемый чужеродный протеин, нестабильность трансформированных штаммов, возникающая вследствие потери чужеродной ДНК, препятствуют его использованию.

Клетки млекопитающих успешно модифицировались генетически для экспрессии и выделения чужеродных протеинов, но эти системы технологически сложны и дорогостоящи для обработки и не имеют практического применения для коммерческого производства большинства протеинов.

Хотя исследования выделения протеинов были более успешны с S. cerevisiae, чем с В. subtilis, похоже, что S. cerevisiae тоже имеет некоторые внутренние ограничения, как система выделения протеинов. Европейская патентная заявка 0123544, опубликованная 31 октября 1984 г., описывает выделение -фактор-генов из S. cerevisiae и использование их промотирующих и/или сигнальных пептидных частей в сочетании с ДНК, кодирующей чужеродные для дрожжей протеины, в плазмиде для трансформации клеток дрожжей, способных производить отдельный зрелый протеин в клеточной культуре. Европейская заявка 0088632, опубликованная 14 сентября 1983 г., описывает способ экспрессии и выделения чужеродного протеина в S. cerevisiae. Однако, как представляется, размер протеинов, которые S. cerevisiae будет эффективно выделять с данной и другими системами выделения, должен быть ограничен величиной примерно 20000 дальтон. Преодоление этой неэффективности S. cerevisiae как организма выделения требует многих мутационных изменений, которые описаны Smith и др. Science 229; 1219-1224 (1985). Единственным исключением в этом отношении является наблюдение, что ферменты Aspergillus величиной более 20000, видимо, могут быть выделены S. cerevisiae, но эти ферменты сильно гликозилируются S. cerevisiae, что и может влиять на эффективность выделения.

Особый интерес представляет Yarrowia lipolytica, промышленно важный вид дрожжей, используемый для производства лимонной кислоты и клеточных протеинов. Он также может быть использован для получения эритрита, маннита и изопропиляблочной кислоты. В противоположность S. cerevisiae Y. lipolytica представляет особый интерес и ценность из-за своей способности эффективно выделять высокомолекулярные протеины (щелочную протеазу, кислую протеазу и ДНК-азу) в питательную среду, предоставляя таким образом потенциальную возможность извлечения чужеродных протеинов в нативном состоянии без необходимости разрушения продуцирующих клеток. Кроме того, Y. lipolytica количественно выделяет очень мало собственных протеинов, таким образом предоставляя возможность получения нужного чужеродного протеина в питательной среде в качестве доминирующей разновидности протеинов и облегчая извлечение указанного чужеродного протеина.

Y. lipolytica производит большое количество внеклеточной протеазы. Это доминирующий протеин, выделяемый Y. lipolytica. Вид протеазы (щелочной, кислый или нейтральный) зависит от используемого штамма Y. lipolytica (Ogrydziak и др. J. Gen. Microbiol. (1982) 128, 1225-1234). Частичный анализ N-концевой аминокислотной последовательности щелочной внеклеточной протеазы описан Ogrydziak и др. (ук. соч.).

Рассматриваемая заявка с серийным 634505, поданная 25 июля 1984 г., описывает методы трансформации Y. lipolytica и клонирования генов Y. lipolytica путем комплементации мутаций. В ней описано клонирование гена XPR2, который кодирует выделяемую щелочную протеазу, путем комплементации хрr2 мутаций Y. lipolytica. Метод включает трансформацию штамма-хозяина Y. lipolytica с частичным расщеплением ВglII из библиотеки генов Y. lipolytica в вектор pLD40, описанный в Европейской заявке 0138508, опубликованной 24 апреля 1985 г. и являющейся аналогом вышеуказанной заявки США.

Данное изобретение предусматривает: рекомбинантные векторы клонирования Y. lipolytica, содержащие чужеродную ДНК, кодирующую протеины млекопитающих и другие полипептиды, в том числе плазмиды, пригодные для трансформации клеток хозяина Y. lipolytica, и в особенности, интегративные векторы экспрессии, содержащие ген-промотор LEU2, ген-промотор XPR2, препрообласти щелочной протеазы и концевой регион XPR2; и плазмиды экспрессии, имеющие чужеродную кодирующую последовательность с сигналами выделения XPR2 далее в направлении считывания от промотора LEU2, которые способны вызывать экспрессию и выделение чужеродного протеина в трансформируемой Y. lipolytica.

Изобретение, таким образом, иллюстрирует процесс экспрессии и выделения готовых чужеродных протеинов, в особенности прореннина и человеческого анафилатоксина С5а, из генетически измененных клеточных культур Y. lipolytica. Установление точной идентичности аминокислотной последовательности, а также последовательности ДНК для внеклеточной щелочной протеазы Y. lipolytica позволило предположить, что чужеродный протеин может быть экспрессирован и выделен с помощью ДНК-рекомбинантной технологии при производстве в клеточной культуре. В случае прореннина экспрессируется и выделяется готовая форма зимогена (предшественник реннина).

Было обнаружено, что Y. lipolytica может быть генетически модифицирована с помощью ДНК-рекомбинантной технологии с получением трансформантов, способных к экспрессии и выделению чужеродных протеинов в их нативной форме. Это достигается путем конструирования векторов, несущих сигнальную последовательность или сигнальную и первую (про1) или обе последовательности (npo1 + про2) гена XPR2, связанные со структурной генной последовательностью для чужеродного протеина, который необходимо выделить.

Трансформанты, получаемые интеграцией в локусе XPR2 вектора ДНК, содержащего фрагмент гена XPR2 с отсутствующими регуляторными или структурными компонентами на обоих концах гена, не выделяют более щелочной протеазы, характеристика, не только желательная для выделения чужеродного протеина, но и которая может быть использована для скрининга трансформантов.

Кроме того, векторы, несущие промотор XPR2 и последовательности для сигнальной последовательности выделения щелочной протеазы, способны в трансформированной клетке Y. lipolytica вызвать выделение готового чужеродного протеина. Некоторые ДНК-рекомбинантные векторы этого типа способны вызвать экспрессию/выделение независимо от сайта интеграции в геноме дрожжей. Вообще, векторы, содержащие подходящие 5' и 3'-фланкирующие ДНК, вызывают экспрессию продукта независимо от сайта интеграции.

Кроме того, было неожиданно обнаружено, что интеграция производной от pBR322 плазмиды в хромосомную ДНК Y. lipolytica создает область гомологии, способную благоприятствовать дальнейшей сайт-направленной интегративной трансформации. Интегрированная копия pBR322 служит таким образом "доком" для входящей трансформирующей ДНК. Интеграция резидент-копии pBR322 в хромосомную ДНК Y. lipolytica, несмотря на то, что pBR322 не является ДНК Y. lipolytica, таким образом создает известную мишень для интеграции. Трансформированные реципиенты Y. lipolytica, содержащие такой сайт, обладают двумя главными преимуществами перед реципиентами, у которых подобный сайт отсутствует, а именно, наличием региона с известной последовательностью и известной рестрикционной картой в качестве мишени для сайт-направленной интеграции, и возможность определить, используя pBR322 как мишень для интеграции, содержит ли входящая плазмида полную функциональную единицу или ген, или только часть нужного гена. Например, плазмида, содержащая только 3'-фрагмент гена XPR2, может трансформировать реципиент XPR2-1002, если она содержит кодон дикого типа и интегрирована в локусе XPR2. Однако та же плазмида не будет трансформировать клетку-хозяина XPR2-1002 к положительному фенотипу протеазы, если интегрирована в pBR322, так как в ней отсутствует целая функциональная единица.

Таким образом, в трансформантах Y. lipolytica, содержащих область гомологии к чужеродному вектору ДНК, указанная область, содержащая экзогенную ДНК, служит в качестве принимающего сайта во время интегративной трансформации Y. lipolytica. В дополнение к pBR322 и ее производным для получения трансформантов Y. lipolytica, имеющих "док", могут быть использованы космиды, бактериофаги, такие как М13 и лямбда, синтетически полученная ДНК и обычные плазмиды, такие как PUC13.

Под промотирующей последовательностью "LEU2" понимается нетранслируемый участок в направлении от ATG, который содержит большинство, если не все черты, требуемые для экспрессии.

Под промотирующей последовательностью "XPR2" понимается нетранслируемый участок, расположенный по направлению считывания перед сигнальной (или предсигнальной) последовательностью, которая необходима для экспрессии. Кроме того, сигнал с или без пропоследовательности из гена XPR2 может быть использован для выделения под контролем промоторов Y.lipolytica иных, чем гена XPR2, векторы, несущие промотор LEU2 и последовательности для сигнала выделения щелочной протеазы, способны в трансформированной клетке Y. lipolytica вызвать выделение готовых чужеродных протеинов.Человеческий анафилатоксин С5а, также известный как человеческий дополнительный протеин С5а (человеческий С5а), представляет собой биоактивный полипептидный фрагмент, генерируемый in vivo в результате комплементарной активации. Он функционирует как иммуномодулятор при регулировании определенных аспектов гуморальной и клеточной иммунореакции. Изучена первичная структура его и других анафилатоксинов. Обзор химических, физических и биологических характеристик представлен Hugli в "Complement", под редакцией Н.J. Muller-Eberhard и Р.A. Miescher, стр. 73-99, 1985, Springer-Verlag, New-York.

Специалистам в данной области понятно, что в настоящем изобретении может быть использована с соответствующими необходимыми изменениями чужеродная ДНК, кодирующая фактически любую известную аминокислотную последовательность. Методика, описанная здесь, может быть применена с соответствующими необходимыми изменениями для получения и выделения любых известных чужеродных протеинов, представители которых перечислены в патенте США 4532207, опубликованном 30 июля 1985 г. Кроме того, вместо гена XPR2 может быть использован любой другой ген Y. lipolytica для выделения протеинов, такой как гены рибонуклеазы или кислой протеазы, а также гибридные гены, сконструированные путем объединения фрагментов двух или более указанных генов, например, сигнальная последовательность гена XPR2 и промотирующая последовательность гена рибонуклеазы.

В объем данного изобретения также включены функциональные эквиваленты вышеописанных ДНК или нуклеотидных последовательностей. Вырожденность генетического кода дает возможность замещения определенных кодонов другими, которые кодируют ту же самую аминокислоту и, следовательно, приводят к тому же протеину. ДНК или нуклеотидная последовательность могут значительно изменяться, так как за исключением метионина и триптофана известные аминокислоты могут кодироваться более чем одним кодоном. Так, часть или весь ген XPR2 могут быть синтезированы для получения последовательности ДНК, существенно отличающейся от показанной на фиг.3. Кодируемая аминокислотная последовательность для него будет однако сохранена. Подобные функциональные изменения данной ДНК или нуклеотидной последовательности дают возможность промотировать выделение и/или обработку чужеродных протеинов, кодируемых чужеродными ДНК-последовательностями, пришитыми к ним. Все изменения нуклеотидной последовательности гена XPR2 и его фрагментов, разрешенные генетическим кодом, следовательно, включены в данное изобретение. Кроме того, возможно ликвидировать кодоны или заменить один или более кодонов иными, чем вырожденные кодоны, для получения структурно модифицированного полипептида, но по существу имеющего ту же полезность или активность, что и полипептид, полученный с помощью немодифицированной молекулы ДНК. Данные два полипептида функционально эквивалентны, как две молекулы ДНК, вызывающие их появление, даже если разница между этими молекулами ДНК не относится к вырождению генетического кода. Наиболее простой пример этого относится к прореннину А и прореннину В, двум аллельным формам прореннина, которые различаются только присутствием остатка аспарагиновой кислоты в положении 286 прореннина А и остатка глицина в этом положении у прореннина В.

При использовании данной методики достигнута экспрессия и экскреция в Y. lipolytica чужеродных протеинов млекопитающих прореннина и человеческого анафилатоксина С5а при применении сигналов экспрессии и выделения из генов Y. lipolytica XPR2 и/или LEU2. ДНК-последовательности для прореннина и человеческого анафилатоксина С5а были пришиты с помощью синтетических олигонуклеотидов к генной последовательности XPR2 в сайтах, предполагаемых для кодирования сигнального пептида щелочной протеазы, или в сайтах преобразования предшественника протеазы, обозначенных здесь как про1 и про2, и использованы для получения генных конструктов, которые были затем введены в Y. lipolytica путем интегративной трансформации. Рекомбинантные культуры экспрессировали и выделяли в питательную среду чужеродные протеины, имеющие молекулярный вес и иммунореактивность прореннина и человеческого анафилатоксина С5а. Можно полагать, что прореннин, полученный таким образом, имеет нативную конфигурацию, так как после удаления пропептида он обнаруживает полную ферментативную активность.

Термин "рекомбинантный ДНК материал", используемый здесь, включает любой материал, который содержит по крайней мере один из следующих элементов: ген XPR2 Y. lipolytica, сигнал (или предсигнал), про1- и про2- (которые вместе составляют прорегион) промотор или его концевую последовательность; промотор LEU2 или функциональные эквиваленты вышеуказанных последовательностей, допускаемые вырожденностью генетического кода.

Представителями указанного рекомбинантного ДНК материала являются фрагменты ДНК, плазмиды или векторы или трансформанты, содержащие любую или все из вышеуказанных последовательностей.

Материалы. Рестрикционные эндонуклеазы и Т4 лигаза были получены из New England Biolabs, бактериальная щелочная фосфатаза из Bethesda Research Laboratories, T4 полинуклеотидкиназа из PL-Biochemicals и [гамма-³²p]АТФ из New England Nuclear. Все ферменты использовались при условиях, рекомендованных поставщиком.

Среды Среда ГПП (среда глицерин-протеаза-пептон) содержала (на литр): 6,7 г глицерина, 1,6 г Difco протеазы-пептона, 1,7 г Difco азотистого основания дрожжей без аминокислот и сульфата аммония, 30 мг урацила и 0,5 мл/л полипропиленгликоля с мол. в. 2000 (Polysciences) в 40 мМ-фосфатном буфере (рН 6,8). (Полипропиленгликоль не был включен, когда среда использовалась для выращивания культур для анализа ферментной активности реннина). Протеаза-пептон был отдельно обработан в автоклаве в фосфатном буфере.

Среда ДЭПД (дрожжевой экстракт-пептон-декстроза) содержала (на литр): 5 г экстракта дрожжей, 10 г пептона и 20 г декстрозы.

Е. coli выращивали в среде LB при 37^oС. Среда LB содержала (на литр): 10 г бактотриптона, 10 г бактодрожжевого экстракта, 10 г хлорида натрия, доводилась до рН 7,5 гидроксидом натрия.

Анализ последовательности ДНК. Фрагменты ДНК из различных описанных здесь плазмид изолировали на геле полиакриламида и секвенировали по методу Маxam и др. Methods in Enzymology, 65, 499 (1980).

Процедуры связывания. Фрагменты ДНК, включая расщепленные векторные плазмиды, связывали путем смешения нужных компонентов (фрагменты ДНК с концевыми участками, специально сконструированными для обеспечения правильного спаривания) с Т4 ДНК-лигазой. Добавляли примерно 10 единиц лигазы на мкг количества вектора и вводимых фрагментов. Полученную реакционную смесь трансформировали в компетентные клетки штаммов ММ294 (АТСС-33625) или НВ101 (АТСС-33694) Е. coli K12.

Получение химически синтезированной ДНК. Для конструирования гибридных генов для экспрессии и выделения прореннина было синтезировано восемь олигонуклеотидов по модифицированной фосфорамидатной методике (Sinha и др., Tetrahedron Letters 24, 5843 (1983) на Genetic Design 6500 (Watertown, MA) автоматическом ДНК-синтезаторе и очищены на 6М мочевина-20% полиакриламидном геле. Аликвоты комплементарных олигонуклеотидов смешивали и сшивали друг с другом при 4^oС в течение ночи в ТЭ (10 мМ трис-HCl, рН 8,0; 1 мМ NaEDTA). Аликвоты (около 2 мкг) двухцепочечных олигонуклеотидов фосфорилировали в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 70 мМ трис (рН 7,6), 10 мМ MgCl₂, 5 мМ дитиотрейтола, 5 мМ АТФ, при 37^oС с использованием Т4 полинуклеотидкиназы.

Получение плазмидной ДНК. Плазмидную ДНК в больших количествах получали по методике Holmes и др.. Anal. Biochem., 114, 195-197 (1981), с последующим центрифугированием в градиенте плотности этидиум бромид-CsCl. Миниколичества плазмидной ДНК получали по щелочной SDS методике Birnboim и др., NAR 1, 1513 (1979).

Конструирование векторов экспрессии/выделения для прореннина. Была приготовлена серия различных конструкций для получения конечных векторов экспрессии. Все стадии представлены в виде схемы на прилагаемых фигурах. В общем, фрагменты ДНК изолировали путем гель-электрофореза и сшивали с другими фрагментами или расщепленной плазмидной ДНК в 20 мкл 50 мМ трис-НСl (рН 7,5), 10 мМ MgCl₂, 20 мМ дитиотрейтола, 1 мМ АТФ, в присутствии 200 единиц Т4 лигазы при 4^oС. Если требовалось частичное расщепление ДНК рестрикционной эндонуклеазой, оптимальное время расщепления устанавливалось экспериментально.

Идентификация прореннина в культуральной жидкости. Трансформанты дрожжей, содержащие векторы экспрессии, выращивали в течение ночи в среде ГПП (см. выше). После центрифугирования для удаления клеток дрожжей добавляли 1 мл 50% трихлоруксусной кислоты в каждой 5 мл аликвоте культуральной жидкости и выдерживали при 4^oС 60 минут. Центрифугированием получали шарики, которые дважды промывали 2 мл холодного ацетона. Осажденный протеин растворяли в 100 мкл стандартного SDS-буфера и аликвоты подвергали электрофорезу на 10% SDS-полиакриламидных гелях (Laemmli, U.K. (1970), Nature 227, 680). Освобожденные из геля протеины электрофоретически переносили на нитроцеллюлозу (Schleicher и Schuell, 0,22 мкм) и прореннин определяли иммуноточечным анализом на пластинке геля (Hawkes, R. и др. (1982) Anal. Biochem. 119, 142). Фильтр покрывали антипрореннин-антителом кролика с последующей инкубацией с конъюгированным пероксидазой антителом козел-кролик (IgG) Cappel, Malvern, Pa). Связанные антитела определяли окрашиванием смесью 4-хлор-1-нафтола и перекиси водорода.

Активность прореннина по свертыванию молока в культуральной жидкости. Культуральную жидкость различных трансформантов Y. lipolytica исследовали на активность по свертыванию молока по модифицированному методу Ernstrom, J. Dairy Sci. 41, 1664 (1958). Коротко говоря, исследование включало измерение времени, требуемого для свертывания буферного снятого молока реннином в активированных супернатантах культуры и соотнесения значений со стандартными для очищенного реннина. Культуры дрожжей (25 мл) выращивали в течение ночи в среде ГПП. После удаления клеток центрифугированием 5 мл аликвоты супернатантов культуры высушивали замораживанием под вакуумом. Каждый лиофилизированный супернатант был ресуспендирован в 300 мкл дистиллированной воды. В качестве контрольного стандарта была приготовлена серия разведений очищенного прореннина теленка. Концентраты прореннина в среде и контрольные образцы активировали добавлением примерно 5-10 мкл конц. НСl до получения рН приблизительно 2 и инкубировали один час при 22^oС. Снятое молоко готовили добавлением 60 г сухого порошка снятого молока (Difco) к 500 мл 41,5 мМ ацетата натрия (рН 6,3) и 13,6 мМ CaCl₂ и перемешиванием в течение 20 минут при 4^oС. Субстрат был использован для анализа немедленно после приготовления. Аликвоту 60 мкл (эквивалент 1 мл супернатанта культуры) каждого препарата фермента добавляли к 1 мл аликвоты снятого молока при 37^oС и регистрировали время свертывания.

Получение синтетических олигонуклеотидов для гена С5а. Олигодезоксинуклеотиды, используемые в синтезе структурного гена С5а, получали по модифицированной фосфорамидатной методике (Sinha и др., ук. соч.) с использованием контролируемой подложки из пористого стекла на Genetic Design 6500 (Watertown, MA) автоматическом ДНК-синтезаторе. При получении использовали 3% (вес/объем) дихлоруксусную кислоту в дихлорметане для удаления тритильной группы, активирование фосфорамидатов насыщенным тетразолом в ацетонитриле, обработку диэтоксифосфинтетразолидом и окисление водным раствором йод/ТГФ (Matteucci и др., 1981, J. Amer. Chem. Soc. 105, 3183). Полное время на цикл добавления составляло 14 минут. Десять 47-мер сегментов A-J (фиг.7) получали с 98,8% средним выходом на стадию (по тритильному анализу), деблокировали по методике Matteucci и др., ук. соч., осаждали этанолом из 0,3 М ацетата натрия и выделяли препаративным гель-электрофорезом на 10% денатурированном геле полиакриламид-мочевина перед сшиванием.

Сборка, клонирование и секвенирование человеческого гена С5а. На фиг.7 показана аминокислотная последовательность нужного протеина и расположение синтетических олигонуклеотидов, необходимых для изготовления гена, кодирующего человеческий протеин С5а. Все олигомеры, кроме А и F, фосфорилировали по их 5'-концам Т4 полинуклеотидкиназой. Сборка гена включала две первичные реакции расщепления/сшивания, включающие: олигомеры А, В, I и J и олигомеры С, D, Е, F, G и Н. Образующиеся двухцепочечные фрагменты ДНК размером 94 п.ос. и 141 п. ос. изолировали после электрофореза на 10% полиакриламидном геле, сшивали вместе, и их продукт размером 235 п.ос. изолировали гель-электрофорезом. Этот фрагмент ДНК, содержащий структурный ген, кодирующий С5а, вводили между EcoRI и HindIII-сайтами ДНК вектора pBR322 и использовали для трансформации клеток штамма НВ101 Е. coli К-12. Рестрикционный анализ плазмидной ДНК, изолированной из 6 трансформантов, показал, что 5 из 6 клонов содержали EcoRI/HindIII-фрагмент правильного размера. Нуклеотидную последовательность участка гена С5а каждой из этих плазмид определяли по методу Махаm и др. Method Enzymol. 65, 499 (1980).

Конструирование и характеристика плазмиды экспрессии С5а для Е. coli. Методика изолирования фрагментов ДНК и условия реакции сшивания были такими же, как описано Maniatis и др. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor. E. coli trp промотор-оператор был первоначально получен из ptrpL1 (Edman и др. (1981) Nature 291, 503). Фрагмент EcoRI 360 п. ос. , содержащий промотор-операторную последовательность, используемый в плазмиде экспрессии С5а (рС5а-48), изолировали из плазмиды экспрессии прореннина pPFZ-R2, описанной в Европейской заявке 0147178, опубликованной 3 июля 1985 г.

Идентификация С5а в культуральной жидкости Y. lipolytica. Методика была такой же, как описано выше для прореннина, за исключением того, что в иммуноанализе были использованы козел- анти-С5а- и кролик анти-козел IgG (Cappel). Антитело козел-анти-человеческий С5а получали методом Manderino и др., J. Immunol. Methods 53, 41-50 (1982).

Векторы pLD40 - описанный в Европейской заявке 0138508, опубликованной 24 апреля 1985 г.

Микроорганизмы: АТСС 20774 - Yarrowia lipolytica PC 30869; АТСС 20781 - Yarrowia lipolytica DL112-PC-30869, трансформант с XPR2; АТСС 20776 - Yarrowia lipolytica DL-148. Трансформант Y. Lipolytica ATCC-20688 с SnaBI, расщепленной pLS-3; АТСС 20775 - Yarrowia lipolytica DL-144. Трансформант Y. Lipolytica АТСС 20688 с нерасщепленной pLS-3; АТСС 20777 - Трансформант Y. lipolytica PC-30869 с SnaBI, расщепленной рС5аХ-3; АТСС 20780 - Трансформант Y. lipolytica PC-30869 с SnaBI, расщепленной рХХ-33; АТСС 20794 - Трансформант Y. lipolytica PC-30869 с pLD56; АТСС 20795 - Трансформант Y. lipolytica АТСС 20794 с NruI, расщепленной pLX-34.

Они были депонированы в соответствии с Будапештским договором в Американской Коллекции типовых культур, Rockville, Maryland, признанной коллекции, гарантирующей неизменность депозитов и быстрый доступ к ним заинтересованных лиц, если будет выдан патент по данной заявке. В период рассмотрения данной заявки депозиты доступны лицам, которые определяются Комиссионером Ведомства по патентам и товарным знакам США в соответствии с 37 CFR 1.14 и 35 USC 122 и в соответствии с иностранными патентными законодательствами в странах, куда поданы дубликаты данной заявки или основанных на ней последующих заявок. Все ограничения на доступ к депонированным микроорганизмам будут окончательно сняты после выдачи патента.

Таксономическое исследование Y. lipolytica АТСС 20774 (идентифицированного в коллекции культур Pfizer Inc. как PC 30869) проведено д-ром J. R. DeZeeuw, который подготовил следующее описание. Использовались методики, рекомендованные J.L. Lodder в "The Yeasts", второе издание, N. Holland Publishing Co., Амстердам, 1970.

CBS 599, типовая культура для вида Candida lipolytica ("The Yeasts", второе издание, N. Holland Publishing Co., Амстердам, 1970) и CBS 6124, типовая культура для Saccharomycopsis lipolytica в "The Yeasts", третье издание, были взяты для сравнения. Ранее вид был также сопоставлен с Endomycopsis lipolytica. Его промежуточное обозначение - Candida lipolytica. Таксономическое положение вида было установлено van der Walt и von Arx, Antonie van Leeuwenhoek, 46, 517-521 (1980). Предпочитаемым названием в настоящее время является Yarrowia lipolytica.

Культуральные, морфологические и физиологические характеристики штамма PC-30869 согласуются со стандартным описанием вида, указанного как Saccharomycopsis lipolytica в "The Yeasts", третье издание, под редакцией Kreger-van Rij, стр. 406-408, Elsevier Science Publishers B.V., Амстердам, 1984. Сравнение штаммов Y.lipolytica приведено в таблице 1.

PC-30869 был сконструирован с помощью генетически рекомбинированных подходящих мутантов Y. lipolytica PC-22208, Pfizer почвенный изолят и Y. lipolytica PC-30026, субкультура NRRL Y-1094. PC-30869 фенотипически отличается от своих родителей дикого типа следующим: (1) не производит активной внеклеточной щелочной протеазы, (2) требует биотина для роста и (3) требует источник L-лейцина.

В течение лог-фазы роста PC-30869 в бульоне дрожжевой экстракт-пептон-глюкоза (ДЭПГ) почкующиеся клетки имеют яйцевидную форму и средний размер 2,6 х 5,5 микрон. На ДЭПГ-агаре доминируют псевдо- и истинные мицелии. Бластоспоры присутствуют в большинстве как одиночки в плевральных положениях. Не обнаруживаются каротиноидные пигменты. Культура ведет себя как "В" спаривающийся гаплоид в скрещивании с аутентичными для вида тестовыми штаммами (Таблица 5). Типичная аскоспоруляция наблюдается на агаре V8. Особенности ассимиляции углерода указаны в Таблице 2. Ферментация отсутствует. Ион аммония и мочевина, но не нитрат, утилизируются как единственные источники азота (Таблица 3). Штамм PC-30869 требует витаминов тиамина и D-биотина (Таблица 4). Только тиамин требуется для родителей культуры дикого типа. Никакого роста не наблюдается при 37^oС. В таблице 6 приведены также и другие характеристики штаммов.

PC-30869 отличается от других штаммов Y. lipolytica, описанных в патентной литературе, как это следует из сравнения их фенотипов (таблицы 7 и 8).

АТСС 20228 (Nubel и др. Патент США 4155811) обнаруживает вид питания дикого типа подобно типовым штаммам для вида CBS 599 и CBS 6124. Конкретно, он не нуждается для роста в урациле, лейцине или биотине и он разжижает желатин.

АТСС 20268 (DeZeeuw и др., патент США 4407953) в отличие от АТСС 20228 требует дополнительного лейцина для роста. Подобно АТСС 20228 он не нуждается в урациле или биотине. Он также разжижает желатин.

АТСС 20688 (европейская заявка 0138508) растет, только если в среду добавлены как урацил, так и лейцин. Эта необходимость в урациле отличает АТСС 20688 как от АТСС 20228, так и от АТСС 20628. АТСС 20688 не требует биотина и разжижает желатин.

Культура PC-30869 отличается от всех вышеуказанных. Она нуждается для роста в биотине и лейцине, но не в урациле. Она не разжижает желатин.

Полная среда содержала 16,7 г/л бактодрожжевого основания, свободного от витаминов, плюс 100 мг/л урацила, 100 мг/л L-лейцина, 10 мкг/л D-биотина и 200 мкг/л тиаминаНСl.

Среда содержала 120 г/л желатина и 16,7 г/л бактодрожжевого основания, свободного от витаминов, плюс 100 мг/л урацила, 100 мг/л L-лейцина, 10 мкг/л D-биотина и 200 мкг/л тиаминаНСl.

Краткое описание чертежей Фиг. 1 - Частичная линейная рестрикционная карта перекрывающихся плазмид pLD 57, pLD 58 и pLD 62, изолированных из штамма Y. lipolytica DL 112.

Фиг.2 - Пробы синтетических олигонуклеотидов для гена XPR2. Из описанной последовательности для большинства первых 25 аминокислотных остатков активной протеазы (Ogrydziak и др., ук. соч.) два участка, отмеченные I и II, дают возможность конструирования 14-мер-олигонуклеотидных проб с 32-кратным или меньшим вырождением. Эти два участка начинаются соответственно у аминокислот 7 и 18. Четыре различные восьмикратно вырожденные смешанные пробы были приготовлены для каждого участка, они получили номера от 170 до 186, как показано. В изображенной предсказанной последовательности нуклеиновой кислоты "X" означает все 4 основания, "U" означает оба пурина и "Y" означает оба пиримидина.

Фиг.3 - Нуклеотидная последовательность гена XPR2 с указанием промотора, пре (от -157 до -136), про1 (от -135 до -98), про2 (от -97 до -1), щелочной внеклеточной протеазы и концевых последовательностей.

Фиг. 4 - Сконструированная последовательность для вектора-терминатора pterm 4.

Фиг.5 - Сконструированная последовательность и рестрикционная карта плазмиды pLS-3.

Фиг.6 - Сконструированная последовательность и рестрикционная карта плазмиды рХХ-33.

Фиг. 7 - Аминокислотная последовательность человеческого анафилатоксина С5а.

Фиг.8 - Рестрикционная карта плазмиды рС5а-48.

Фиг.9 - Сконструированная последовательность и рестрикционная карта плазмиды рС5аХ-3.

Фиг.10 - Нуклеотидная последовательность гена LEU2.

Фиг. 11 - Сконструированная последовательность и рестрикционная карта плазмиды pLX-34.

Анализ последовательности гена XPR2. Анализ ДНК-последовательности клонированного гена XPR2 проводится методом химической деградации (Махаm и др., 1980, Methods Enzymol. 65, 499) на перекрывающихся фрагментах рестрикции, полученных из плазмид pLD 57, pLD 58, pLD 62 (Фиг.1), pLD 84 и pLD 86 (см. ниже). Результаты показали, что клонированные геномные ДНК дрожжей действительно содержат ген для внеклеточной щелочной протеазы. Нуклеотидная последовательность гена XPR2 и аминокислотная последовательность предшественника щелочной протеазы с ее сигнальной последовательностью, выведенная из нуклеотидной последовательности, показаны на фиг.3. Значительная часть аминокислотной последовательности внеклеточной протеазы была неизвестна (Ogrydziak и др., ук. соч.) и представлена здесь впервые. Более того, последовательности, требуемые для экспрессии и выделения внеклеточной протеазы, также описаны здесь в первый раз. Последовательность ДНК, кодирующая щелочную протеазу, ее предшествующие и сигнальные последовательности, состоит из 1362 пар оснований (Фиг.3). Первичная структура этой полипептидной цепи, выводимая из нуклеотидной последовательности, должна содержать 454 аминокислотных остатка. Щелочная протеаза синтезируется в клетке в форме предшественника, который протеолитически переводится в выделяемую или готовую форму. Анализ N-концевой аминокислотной последовательности, выведенной из нуклеотидной последовательности, показал наличие сигнального пептида в молекуле предшественника. Этот сигнальный пептид содержит 22 аминокислотных остатка, и его структурные особенности подобны особенностям сигнальных пептидов высших эукариотов и прокариотов (Perlman и др., 1983, J. Mol. Biol. 167, 391). Области предсказанной аминокислотной последовательности, в целом совпадающей с известными 25 N-концевыми аминокислотами зрелой щелочной протеазы (Ogrydziak и др., 1982, J. Gen. Microbiol. 128, 1225) предшествуют 157 аминокислотных остатков, содержащих сигнальный пептид и два сайта расщепления трипсинового типа (Lys-Arg). Эти сайты расщепления использовались для разделения прорегиона на про1 (от -135 до -98) и про2 (от -97 до -1). См. Фиг.3. Как следует из нуклеотидной последовательности, активная щелочная протеаза имеет 297 аминокислот. Аминокислотные последовательности для различных форм протеазы, выведенные из нуклеотидной последовательности, находятся в соответствии с размерами очищенных форм фермента. В дополнение к структурной последовательности предшественника щелочной протеазы были определены примерно 700 п. ос. 5'-фланкирующей последовательности и 600 п.ос. 3'-фланкирующей последовательности. Анализ этих учас