Способ идентификации лигандов, способ получения антитела, способ отбора нуклеиновой кислоты, способ получения смеси нуклеиновых кислот, смесь нуклеиновых кислот, не встречающийся в природе нуклеиново-кислотный лиганд

Способ идентификации лигандов, способ получения антитела, способ отбора нуклеиновой кислоты, способ получения смеси нуклеиновых кислот, смесь нуклеиновых кислот, не встречающийся в природе нуклеиново-кислотный лиганд

Реферат

 

Изобретение относится к новому классу нуклеиново-кислотных лигандов с высокой степенью сродства, которые специфически связываются с нужной молекулой-мишенью. Проводят взаимодействие смеси однонитевых нуклеиновых кислот с мишенью, отделение нуклеиновых кислот, имеющих повышенное сродство к данной мишени, от оставшейся смеси. После отделения нуклеиновых кислот, имеющих повышенное сродство к данной мишени, проводят их амплификацию с получением лигандобогащенной смеси нуклеиновых кислот. Обеспечивают взаимодействие однонитевых нуклеиновых кислот с мишенью. Отделяют нуклеиновые кислоты, имеющие повышенное сродство к данной мишени. Проводят амплификацию их с получением лигандобогащенной смеси нуклеиновых кислот. Повторяют перечисленные стадии с использованием лигандобогащенной смеси нуклеиновых кислот каждого последующего повтора столько раз, сколько необходимо для получения уровня обогащения, достаточного для получения лигандного раствора к указанной мишени. Молекулы нуклеиновых кислот, которые воздействуют на функции молекулы-мишени, идентифицируют вышеприведенным способом и проверяют на повышенное сродство к интересующей мишени и на способность воздействовать их на функции указанных молекул-мишеней. Получают смесь нуклеиновых кислот, содержащих консервативный сегмент и рандомизированный сегмент. Проводят взаимодействие смеси нуклеиновых кислот с мишенью в условиях, благоприятных для связывания, с образованием пар нуклеиновая кислота - мишень и несвязанных нуклеиновых кислот. Разделяют несвязанные нуклеиновые кислоты и пары нуклеиновая кислота - мишень. Проводят амплификацию отделенных нуклеиновых кислот пар нуклеиновая кислота - мишень с получением лигандобогащенной смеси нуклеиновых кислот. Смесь нуклеиновых кислот включает по меньшей мере 10⁹ однонитевых нуклеиновых кислот. Нуклеиновые кислоты включают в себя консервативный нуклеотидный сегмент и рандомизированный нуклеотидный сегмент. Рандомизированный сегмент включает в себя цепь из 8-100 следующих друг за другом нуклеотидов. Не встречающийся в природе нуклеиново-кислотный лиганд идентифицируют способом, приведенным выше. Лиганд не является нуклеиновой кислотой, обладающей известной физиологической функцией связывания молекулой-мишенью, обладает сродством специфического связывания с молекулой-мишенью. Такая молекула-мишень имеет трехмерную структуру, отличную от структуры полинуклеотида, связывающегося с указанным нуклеиново-кислотным лигандом посредством механизма, который зависит от спаривания оснований по Уотсону и Крику или связывания тройной спирали. Последовательности нуклеиновых и рибонуклеиновых кислот приведены в формуле и описании. Изобретение позволяет получать новый класс нуклеиново-кислотных соединений, так называемых нуклеиново-кислотных антител, которые обладают сродством для специфического связывания с трехмерными молекулами-мишенями. 6 с. и 77 з.п. ф-лы, 36 ил., 16 табл.

Настоящая заявка является частичным продолжением заявки на патент США рег. 07/536428, поданной 11 июня 1990 г. под названием "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment". Эта работа санкционирована правительством Соединенных Штагов Америки и финансируется через Национальный институт здоровья. Правительство Соединенных Штатов имеет определенные права на это изобретение.

В настоящей заявке описан новый класс нуклеиново-кислотных лигандов с высокой степенью сродства, которые специфически связываются с нужной молекулой-мишенью, В заявке также представлен способ отбора нуклеиново-кислотного лиганда, который специфически связывается с любой нужной молекулой-мишенью. Этот способ назван SELEX (аббревиатура полного названия: "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment" - "Систематическое извлечение лигандов путем экспоненциального обогащения"). Указанный способ настоящего изобретения (SELEX) предназначен для выделения нуклеиново-кислотного лиганда для нужной молекулы-мишени. Продукты нуклеиновых кислот настоящего изобретения могут быть использованы в любых целях, для которых требуется реакция связывания, например, в методах анализа, в диагностических методах, для сортировки клеток, в качестве секвестрантов и т.п. Кроме того, продукты нуклеиновых кислот настоящего изобретения могут обладать каталитической активностью. Целевыми молекулами являются натуральные и синтетические полимеры, включая протеины, полисахариды, гликопротеины, гормоны, рецепторы, и поверхности клеток, небольшие молекулы, такие как лекарственные вещества, метаболиты, кофакторы, аналоги переходного состояния и токсины.

Известно, что большинство белков и малых молекул не обнаруживают специфического связывания с нуклеиновыми кислотами. Исключение составляют регуляторные белки, такие как репрессоры, полимеразы, активаторы и т.п., то есть такие белки, функция которых в живой клетке заключается в переносе генетической трансформации, закодированной в нуклеиновых кислотах, в клеточные структуры, и репликации генетического материала. Кроме того, небольшие молекулы, такие как GТР, связываются с некоторыми интропными РНК.

В живой материи, нуклеиновые кислоты играют широкоинформативную роль. Основной постулат, предложенный Криком, как в исходной, так и в продвинутой форме, заключается в том, что нуклеиновые кислоты (РНК или ДНК) могут служить в качестве матриц для синтеза других нуклеиновых кислот посредством процесса репликации, при котором информация как бы "считывается" в матричной нуклеиновой кислоте, в результате чего образуются комплементарные нуклеиновые кислоты. Все экспериментальные исследования по генетике и генной экспрессии зависят от свойств нуклеиновых кислот: в основном, двухцепочечные нуклеиновые кислоты являются информативно избыточными, поскольку их химическая структура, основанная на парах оснований, и процессы репликации позволяют использовать указанное спаривание оснований относительно безошибочным способом.

Отдельные компоненты белков, то есть двадцать природных аминокислот, обладают различным химическим строением и различными активностями, достаточными для обеспечения довольно широкого спектра активностей при связывании и катализе. Нуклеиновые кислоты, однако, имеют, как известно, более узкие возможности в отношении их химических свойств, чем белки, однако их информационная роль обеспечивает переход информации от вируса к вирусу, от клетки к клетке и от организма. В связи с этим, компоненты нуклеиновых кислот, т.е. нуклеотиды, должны обладать лишь парами поверхностей, которые обеспечивают информационную избыточность в уотсон-криковской паре оснований. Компонентам нуклеиновых кислот не требуется различий в химическом строении или в активностях, достаточных для обеспечения широкого диапазона связывания или катализа.

Однако было обнаружено, что в природе существуют некоторые нуклеиновые кислоты, которые принимают участие в связывании с определенными молекулами-мишенями, а в некоторых случаях даже участвуют в катализе. Но по сравнению с белками и более специфичными антителами спектр активностей указанных нуклеиновых кислот является более узким. Например, в тех случаях, когда нуклеиновые кислоты связываются с некоторыми белками-мишенями с высокой степенью родства и специфичности, то это связывание, как известно, зависит от конкретных последовательностей нуклеотидов, которые входят в состав ДНК- или РНК-лиганда. Так, например, известно, что короткие двухцепочечные ДНК-последовательности связываются с белками-мишенями, которые подавляют или активируют транскрипцию как в прокариотах, так и в эукариотах. Другие двухцепочечные ДНК-последовательности, как известно, связываются с рестриктирующими эндонуклеазами, белковыми мишенями, которые могут быть выбраны с высокой степенью сродства и специфичности. Другие короткие ДНК-последовательности служат в качестве центромер или теломер на хромосомах, вероятно, путем создания лигандов для связывания специфических белков, которые участвуют в механике хромосом. Так, например, хорошо известно, что двухцепочечная ДНК обладает способностью связываться внутри карманов и бороздок целевых белков, функции которых направлены на связывание с ДНК. Одноцепочечные ДНК также могут связываться с некоторыми белками с высокой степенью специфичности и сродства, хотя число таких примеров значительно меньше. Известные примеры связывания двухцепочечных ДНК с белками позволяют объяснить это связывание, как взаимодействие различных структурных областей белка с ДНК, заключающееся в том, что выступающие боковые цепи аминокислот точно входят в большую бороздку В-формы двухцепочечной ДНК, и это распознавание последовательности обеспечивает специфичность связывания.

Иногда, в качестве лиганда для некоторых белков могут служить двухцепочечные РНК, например эндонуклеазная РНКаза III из Е.соli. Более известны примеры связывания белков-мишеней с одноцепочечными РНК-лигандами, хотя в этих случаях одноцепочечная РНК часто образует сложную трехмерную форму, которая содержит локальные области внутримолекулярной двухцепочечности. Аминоацильные тРНК-синтетазы тесно связываются с тРНК-молекулами с высокой специфичностью. Короткие участки в геномах РНК-вирусов тесно и с высокой специфичностью связываются с оболочечным белком вируса. Короткая последовательность РНК связывается с ДНК-полимеразой фага Т4 также с высокой степенью сродства и специфичности. Таким образом, можно найти двухцепочечные или одноцепочечные РНК- и ДНК-лиганды, которые выступают в роли партнеров для связывания со специфическими белками-мишенями. Большинство из известных связывающихся с ДНК белков связываются с двухцепочечными ДНК, тогда как большинство связывающихся с РНК белков связывается с одноцепочечными РНК. Эта статистическая погрешность в литературе несомненно отражает существующую в биосфере предрасположенность к использованию ДНК в качестве двухцепочечного генома, а РНК в качестве одноцепочечной молекулы во многих случаях, где РНК играет роль, выходящую за пределы ее функции в качестве генома. С химической точки зрения нет серьезных оснований исключать из использования одноцепочечной ДНК в качестве полноценного партнера для специфических взаимодействий с белками.

Было также установлено, что РНК и ДНК связываются с более мелкими молекулами. Двухцепочечные ДНК связываются с различными антибиотиками, такими как актиномицин D. Специфические одноцепочечные РНК связываются с антибиотиком тиострептоном; специфические РНК-последовательности структуры, вероятно, связываются и с другими антибиотиками, особенно с теми, чьи функции заключаются в инактивации рибосом в целевом организме. Семейство эволюционно родственных РНК специфично и с хорошим сродством связывается с нуклеотидами и нуклеозидами (Bass, В. и Сесh Т. (1984) Nature 308:820-826), а также с одной из двадцати аминокислот (Varus, М. (1988) Science 240:1751-1758). В настоящее время известны также и каталитические РНК, и хотя эти молекулы в химическом отношении обладают узким диапазоном возможностей, однако при этом они достаточно хорошо связаны с реакциями переноса фосфодиэфира и гидролизом нуклеиновых кислот.

Несмотря на эти известные примеры, большая часть белков и других компонентов клетки, очевидно, не связывается с нуклеиновыми кислотами в физиологических условиях, и если такое связывание наблюдается, то оно является неспецифичным. Либо способность нуклеиновых кислот к связыванию с другими соединениями ограничивается относительно малым количеством случаев, перечисленных выше, либо химические особенности нуклеиновых кислот, необходимые для специфического связывания, как бы аннулируются (т.е. отклоняются при выборе) в природных структурах. Настоящее изобретение основано на той предпосылке, что нуклеиновые кислоты как химические соединения могут образовывать практически неограниченный ряд форм, размеров и конфигураций, и способы к значительно более широкому спектру связывания и каталитических функций, чем нуклеиновые кислоты, обнаруживаемые в биологических системах.

Для некоторых известных случаев связывания нуклеиновых кислот с белками, были проведены исследования химических взаимодействий. Например, размер и последовательность сайта связывания РНК с оболочечным белком бактериофага R17 были идентифицированы Uhlenbeck и сотрудниками. Минимальный сайт связывания (длиной в 21 основание) натуральной РНК с оболочечным белком R17 определяли с помощью анализа на связывание меченых и различных по размерам фрагментов мРНК с нитроцеллюлозными фильтрами, где комплексы белок-фрагмент РНК оставались связанными с фильтром (Carey и др. (1983), Biochemistry 22: 601). Для определения участия отдельных нуклеиновых кислот в связывании с белком, был создан in vitro ряд вариантов последовательностей минимального сайта связывания с оболочечным белком R17 (Uhlenbeck и др. (1983), J.Biomol. Structure Dinamics 1:539 и Romaniuk и др. (1987), Biochemistry 26:1563). Было обнаружено, что для связывания с белком необходимо поддерживать шпилечно-петлевую структуру сайта связывания, и помимо этого, было установлено, что замены нуклеотидов в большой части одноцепочечных остатков в сайте связывания, включая выступающий нуклеотид в стебле шпильки, значительно влияют на связывание. В аналогичных исследованиях была проведена оценка связывания оболочечного белка бактериофага Q с его трансляционным оператором (Witherell и Uhlenbeck (1989), Biochemistry 28: 71). При этом было установлено, что сайт связывания РНК с оболочечным белком Q по своим размерам и по предсказанной вторичной структуре аналогичен сайту связывания R17, а именно он содержит 20 оснований со шпилечной структурой из 8 пар оснований, включая выпуклый нуклеотид и петлю в 3 основания. В отличие от сайта связывания с оболочечным белком R17 в этом сайте для связывания необходим лишь один из одноцепочечных остатков петли, а наличия выпуклого нуклеотида не требуется. Взаимодействия при связывании белка с РНК, участвующие в регуляции трансляции, обнаруживают значительную специфичность.

Известно, что нуклеиновые кислоты образуют вторичную и третичную структуры в растворах. Двухцепочечные формы ДНК представляют собой так называемую В-форму двуспиральной ДНК, Z-форму ДНК и суперспиральные степени скрученности (Rich A. и др. (1984), Ann. Rev. Biochem. 53:791-846). Одноцепочечные РНК образуют локализованные области вторичной структуры, такие как шпилечные петли и псевдоузловые структуры (Schimmel, Р. (1989), Cell 58:9-12). Однако при этом очень мало что известно о влиянии неспаренных нуклеотитов петли на стабильность структуры петли, кинетику образования и денатурацию, а также термодинамику, и почти ничего не известно о третичных структурах и трехмерной форме, а также о кинетике и термодинамике третичной укладки в нуклеиновых кислотах (Tuerk С. и др. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:1364-1368).

Тип in vitro-выделения был описан при репликации РНК-бактериофага Q. Mills, D. R. и др. (1967) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 58:217-224; Levinsohn R. и Spiegleman S. (1968), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60:866-872; Levisohn R. и Spiegelman S. (1969), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 64:805-811; Saffhill R. и др. (1970), J. Mol. Вiol. 51:531-539; Kacian D.L. и др. (1972), Рroc. Natl. Acad. Sci. USA 69:3038-3042; Мills D.R. и др. (1973), Science 180: 916-927. Фаговая РНК служит в качестве полицистронной информационной РНК, направляющий трансляцию фагоспецифических белков, а также в качестве матрицы для ее собственной репликации, катализируемой Q-РНК-репликазой. Было показано, что указанная РНК репликаза является высокоспецифичной по отношению к ее собственным РНК-матрицам. В процессе циклов репликации in vitro были выделены небольшие вариантные РНК, которые также были реплицированы Q-репликазой. Было обнаружено, что небольшие изменения в условиях, при которых осуществляли циклы репликации, приводят к аккумуляции различных РНК, очевидно, потому, что изменения условий благоприятствуют их репликации. В этих экспериментах, выбранные РНК эффективно связывались посредством репликазы для инициации репликации и служили в качестве кинетически благоприятной матрицы в течение элонгации РНК. Kramer и др. (1974) (J. Mol. Biol. 89:719) описали выделение мутантной РНК-матрицы Q-репликазы, репликация которой была более резистентной к ингибированию этидий-бромида, чем натуральная матрица. Было сделано предположение, что этот мутант не присутствует в исходной РНК-популяции, а генерируется последовательной мутацией в процессе циклов in vitro-репликации с помощью Q-репликазы. Единственным источником изменения в процессе селекции была частота специфических ошибок в процессе элонгации с помощью Q-репликазы. В этих исследованиях так называемая "селекция" происходила путем предпочтительной амплификации одного или более из ограниченного числа самопроизвольных вариантов первоначально гомогенной РНК-последовательности. Эта селекция не дала желаемого результата, за исключением того результата, который присущ данному механизму действия Q-репликазы.

Joyce и Robertson (Joyce (1989) в работе RNA: Catalysic, Splicing, Evolution, Belfort и Shub (изд.), Elsevier, Амстердам, стр. 83-87; и Robertson и Joyce (1990), Nature 344:467) описали метод идентификации РНК, которые специфически расщепляют одноцепочечную ДНК. Селекция на каталитическую активность основана на способности рибозима к катализу расщепления субстратной дцРНК или ДНК в специфическом положении и к переносу 3'-конца субстрата в 3'-конец рибозима. Продукт нужной реакции отбирали путем использования олигодезоксинуклеотидного праймера, который может связываться только с полным продуктом через область присоединения, образованную каталитической реакцией, и подвергали избирательной обратной транскрипции последовательность рибозима. Отобранные каталитические последовательности амплифицировали путем присоединения промотора РНК-полимеразы Т7 к 3'-концу кДНК с последующей транскрипцией на РНК. Этот способ был использован для идентификации из небольшого числа вариантов рибозимов варианта, который является наиболее активным в расщеплении выбранного субстрата. Идентифицируемыми оказалось лишь ограниченное число вариантов, поскольку изменение зависело лишь от нуклеотидных замен, происходящих в процессе амплификации.

В предшествующих работах нет каких либо указаний или предположений, кроме указаний на ограниченный диапазон химических функций нуклеиновых кислот при их взаимодействии с другими веществами как мишеней для белковых лигандов, связывающихся с некоторыми специфическими олигонуклеотидными последовательностями; и в более поздних работах как катализаторов с ограниченным диапазоном активностей. Предшествующие эксперименты по "селекции" были ограничены узким интервалом вариантов ранее описанных функций. Теперь же, впервые, стало ясно, что нуклеиновые кислоты обладают широким диапазоном функций, и в настоящей работе раскрывается методология для реализации этих функций.

Настоящее изобретение относится к классу продуктов, которыми являются молекулы нуклеиновых кислот, каждая из которых имеет уникальную последовательность и обладает способностью специфически связываться с нужным целевым соединением или молекулой. Каждое соединение настоящего изобретения является специфическим лигандом данной целевой молекулы. Настоящее изобретение основано лишь на том убеждении, что нуклеиновые кислоты обладают достаточной способностью к образованию различных двух- и трехмерных структур и достаточной химической изменчивостью в пределах их мономеров для того, чтобы действовать в качестве лигандов (образовывать специфические связывающиеся пары) практически для любого химического соединения, независимо от того, является ли оно мономерным или полимерным. В качестве мишеней могут служить молекулы любого размера. Обычно (и предпочтительно для терапевтических целей), чтобы связывание происходило в водном растворе в солевых условиях при температуре и рН, близким к приемлемым физиологическим значениям.

Настоящее изобретение также относится к способу, который может быть применен для получения нуклеиново-кислотного лиганда для любой желаемой мишени. Этот способ заключается в том, что осуществляют выбор из смеси кандидатов и ступенчатые итерации структурного улучшения, используя при этом одну и ту же общую схему отбора, в целях достижения практически любого желаемого критерия аффинности и селективности связывания. Исходя из смеси нуклеиновых кислот, предпочтительно содержащих сегмент рандомизированной последовательности, этот способ, именуемый в настоящем описании SELEX, включает в себя стадию взаимодействия указанной смеси с мишенью в условиях, благоприятных для связывания; стадию распределения несвязанных нуклеиновых кислот из числа тех нуклеиновых кислот, которые связывались с молекулами-мишенями; стадию диссоциации пар "нуклеиновая кислота - мишень"; стадию амплификации нуклеиновых кислот, диссоциированных из пар "нуклеиновая кислота - мишень", в целях получения лигандобогащенной смеси нуклеиновых кислот; и затем стадии повторной итерации стадий связывания, распределения, диссоциации и амплификации столько циклов, сколько необходимо.

Не претендуя на какую-либо конкретную теорию, авторы настоящей заявки отмечают, что способ SЕLЕХ основан на том мнении, что в смеси нуклеиновых кислот содержится большое количество возможных последовательностей и структур с широким диапазоном сродства к связыванию с данной мишенью. Смесь нуклеиновых кислот, содержащая, например, рандомизированный сегмент из 20 нуклеотидов, может иметь 4²⁰ возможных кандидатов. Те кандидаты, которые имеют более высокое значение константы связывания по сродству для данной мишени, связываются с большей вероятностью. После распределения, диссоциации и амплификации образуется вторая смесь нуклеиновых кислот, обогащенная кандидатами с более высокой аффинностью связывания. Последующие дополнительные циклы отбора постепенно благоприятствуют тому, чтобы в смеси оставались наилучшие лиганды до тех пор, пока указанная смесь нуклеиновых кислот не будет преимущественно состоять лишь из одной или нескольких последовательностей. Эти последовательности могут быть затем клонированы, секвенированы и отдельно тестированы на сродство к связыванию в качестве чистых лигандов.

Эти циклы отбора и амплификации повторяют вплоть до достижения желаемой цели. В самых общих чертах селекцию/амплификацию осуществляют до тех пор, пока после повторения цикла уже не наблюдается значительного улучшения эффективности связывания. Способ итеративной селекции/амплификации является достаточно чувствительным, чтобы выделить единственный вариант последовательности в смеси, содержащей, по крайней мере, 65000 вариантов последовательностей. Этот способ даже способен выделить небольшое число последовательностей с высокой степенью сродства из смеси, содержащей 10¹⁴ последовательностей. В принципе, этот способ может быть использован для испытаний примерно до 10¹⁸ различных видов нуклеиновых кислот. Нуклеиновые кислоты тестируемой смеси предпочтительно содержат часть рандомизированной последовательности, а также консервативные последовательности, необходимые для эффективной амплификации. Варианты последовательностей нуклеиновых кислот могут быть получены рядом способов, включая синтез рандомизированных последовательностей нуклеиновых кислот и отбор по размерам из произвольно гидролизованных клеточных нуклеиновых кислот. Вариабельная часть последовательности может содержать полностью или частично рандомизированную последовательность; она может также содержать подобласти консервативной последовательности, введенные с рандомизированной последовательностью. Модификации последовательностей в тестируемых нуклеиновых кислотах могут быть введены и увеличены посредством мутагенеза перед или в течение итераций селекции/амплификации.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ селекции является настолько эффективным для выделения тех нуклеиново-кислотных лигандов, которые лучше всего связываются с выбранной мишенью, что требуется всего один цикл селекции и амплификации. Такая эффективная выборка может иметь место, например, в процессах типа хроматографии, где способность нуклеиновых кислот ассоциироваться с мишенями, связанными на колонке, приводит к тому, что указанная колонка позволяет отделять и выделять нуклеиново-кислотные лиганды с наиболее высоким сродством.

Во многих случаях необязательно бывает предпочтительным осуществлять итерационные стадии SELEX до тех пор, пока не будет идентифицирован один нуклеиново-кислотный лиганд. Раствор цель-специфического нуклеиново-кислотного лиганда может содержать семейство структур или основных особенностей нуклеиновых кислот, которые имеют ряд консервативных последовательностей и ряд последовательностей, которые могут быть заменены или добавлены без значительного изменения аффинности нуклеиново-кислотных лигандов по отношению к мишени. Последовательность ряда членов семейства нуклеиново-кислотных лигандов в растворе может быть определена при прекращении способа SELEX до его завершения, что позволяет получить исчерпывающее описание раствора нуклеиново-кислотных лигандов.

После описания семейство нуклеиново-кислотных лигандов разделяют с помощью SELEX, а в некоторых случаях может быть предпочтительным осуществление дополнительных серий SЕLЕХ с учетом информации, полученной в течение SЕLEX-эксперимента. В одном из вариантов вторые серии SЕLЕХ будут фиксировать консервативные области семейства нуклеиново-кислотных лигандов при рандомизации всех остальных положений в структуре лиганда. В альтернативном варианте последовательность наиболее типичного члена семейства нуклеиново-кислотных лигандов может быть взята за основу в процессе SELEX, где первоначальный пул нуклеиново-кислотных последовательностей является не полностью рандомизированным, а имеет статистическое смещение в сторону наиболее известного лиганда. С помощью указанных методов можно оптимизировать способ SELEX для получения наиболее предпочтительных нуклеиново-кислотных лигандов.

Известно, что существуют нуклеиновые кислоты с первичной, вторичной и третичной структурами. В литературе чаще всего описываются структуры или их характерные фрагменты, которые участвуют во взаимодействиях не-уотсон-криковского типа, например, такие как шпилечные петли, симметричные или асимметричные выступы, псевдоузлы и их бесчисленные комбинации. Почти во всех случаях указанных характерных особенностей предполагается, что они могут быть образованы в нуклеиново-кислотной последовательности, состоящей не более чем из 30 нуклеотидов. По этой причине предпочтительно, чтобы процедуры SELEX с использованием смежных рандомизированных сегментов начинались с нуклеиново-кислотных последовательностей, содержащих рандомизированный сегмент примерно с 20-50 нуклеотидами, а наиболее предпочтительно с 25-40 нуклеотидами. Настоящее изобретение также включает в себя растворы, содержащие смесь примерно из 10⁹-10¹⁸ нуклеиново-кислотных последовательностей, имеющих смежную рандомизированную последовательность, состоящую, по крайней мере, примерно из 15 нуклеотидов. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения рандомизированная часть последовательностей фланкируется фиксированными последовательностями, что облегчает амплификацию лигандов.

В случае полимерной мишени, например, такой как белок, аффинность лиганда может быть увеличена посредством использования в SELEX-процедуре смеси кандидатов, содержащей первую выбранную последовательность и вторую рандомизированную последовательность. Последовательность первого выбранного лиганда, ассоциированного со связыванием, или ее подобласти может быть введена в рандомизированную часть нуклеиновых кислот второй тестируемой смеси. Затем SЕLЕХ-процедуру повторяют со второй тестируемой смесью для выделения второго нуклеиново-кислотного лиганда, имеющего две последовательности, выбранные для связывания с мишенью, и обладающего более высокой эффективностью связывания или более высокой специфичностью связывания по сравнению с первым выделенным нуклеиново-кислотным лигандом. Последовательность второго нуклеиново-кислотного лиганда, ассоциированного со связыванием с мишенью, может быть затем введена в вариабельную часть нуклеиновых кислот третьей тестируемой смеси, которая после SELEX-циклов дает третий нуклеиново-кислотный лиганд. Эти процедуры можно повторять до тех пор, пока не будет получен лиганд с нужной эффективностью связывания или с нужной специфичностью связывания с молекулой-мишенью. Способ итерационной селекции и комбинации элементов нуклеиново-кислотной последовательности в данном описании именуется "прогулкой", где указанный термин подразумевает оптимизированное связывание с другими доступными областями поверхности или углубления макромолекулярной мишени, начиная с первой области связывания. Увеличение площади контакта при связывании между лигандом и мишенью и лигандом может способствовать повышению константы реакции связывания по сродству. Указанные процедуры "прогулки" могут быть, в частности, использованы для нуклеиново-кислотных антител, которые являются высокоспецифичными при связывании с конкретной целевой молекулой.

В одном из вариантов "прогулки" используют лиганд, не являющийся нуклеиновой кислотой и в настоящем описании обозначаемый термином "якорь", который связывается с целевой молекулой в качестве первой области связывания (см. фиг.9). Эта молекула-"якорь" может быть, в принципе, любой не являющейся нуклеиновой кислотой молекулой, которая связывается с молекулой-мишенью и которая может быть прямо или опосредованно ковалентно связана с нуклеиновой кислотой. Если целевой молекулой является фермент, то молекула-якорь может быть ингибитором или субстратом этого фермента. Указанный "якорь" может быть также антителом или фрагментом антитела, специфичным для данной мишени. Указанную молекулу-якорь ковалентно связывают с нуклеиновокислотным олигомером известной последовательности для получения молекулы, образующей мостик. Этот олигомер предпочтительно состоит приблизительно минимум из 3-10 оснований. Затем получают тестируемую смесь из нуклеиновых кислот-кандидатов, которая включает в себя рандомизированную часть и последовательность, комплементарную известной последовательности мостиковой молекулы. Мостиковая молекула образует комплекс с молекулой-мишенью. После этого SELEX используют для отбора нуклеиновых кислот, которые связываются с комплексом мостиковой молекулы и молекулы-мишени. Нуклеиново-кислотные лиганды, которые связываются с комплексом, выделяют. Описанные выше процедуры "прогулки" могут быть затем использованы для получения нуклеиново-кислотных лигандов, обладающих повышенной эффективностью связывания или повышенной специфичностью связывания с комплексом. Процедуры "прогулки" позволяют проводить селекции на связывание с комплексом или с самой мишенью. Этот способ может быть, в частности, использован для выделения нуклеиново-кислотных лигандов, которые связываются с конкретным сайтом внутри молекулы-мишени. Комплементарная последовательность в тестируемой смеси действует для обеспечения выделения нуклеиново-кислотных последовательностей, которые связываются с молекулой-мишенью в сайте связывания мостиковой молекулы или близ него. Если мостиковая молекула происходит от ингибитора молекулы-мишени, то этот метод позволит в результате получить нуклеиново-кислотный лиганд, который ингибирует функцию молекулы-мишени. В частности, этот способ может быть использован, например, для выделения нуклеиновых кислот, которые будут активировать или ингибировать функцию белка. Комбинация лиганда и мишени может иметь новую или усиленную функцию.

Нуклеиново-кислотные лиганды настоящего изобретения могут содержать множество лигандных компонентов. Как указывалось выше, нуклеиново-кислотные лиганды, полученные с помощью процедур "прогулки", могут рассматриваться как лиганды, имеющие более одного лигандного компонента. Настоящее изобретение также относится к нуклеиново-кислотным антителам, которые конструируют на основании результатов, полученных SELEX-способом, однако при этом они не являются идентичными нуклеиново-кислотному лиганду, идентифицированному способом SELEX. Например, нуклеиново-кислотное антитело может быть сконструировано таким образом, чтобы в нем множество идентичных лигандных структур составляло часть одной нуклеиновой кислоты. В другом варианте осуществления изобретения с помощью SELEX может быть идентифицировано более одного семейства нуклеиново-кислотных лигандов к данной мишени. В этом случае может быть сконструировано антитело из одной нуклеиновой кислоты, которое содержит множество различных лигандных структур. Могут быть также осуществлены SELEX-эксперименты, где фиксированные идентичные или различные лигандные структуры соединены рандомизированными нуклеотидными областями и/или областями с различным расстоянием между фиксированными лигандными структурами в целях идентификации наилучших нуклеиново-кислотных антител.

Указанные способы SELEX могут быть легко объединены с методами скрининга, отбора или анализами для оценки влияния связывания нуклеиново-кислотного лиганда на функцию молекулы-мишени. В частности, скрининг на ингибирование или активацию ферментной активности может быть объединен с методами SELEX.

В более специфических вариантах осуществления настоящего изобретения SELEX представляет собой быстрое средство для выделения и идентификации нуклеиново-кислотных лигандов, которые связываются с белками, включая белки, связывающиеся с нуклеиновыми кислотами, и белки, о которых не известно, является ли их связывание с нуклеиновыми кислотами частью их биологической функции. Среди прочих, белками, связывающимися с нуклеиновыми кислотами, являются полимеразы и обратные транскриптазы. Эти способы могут быть также легко применены к белкам, которые связываются с нуклеотидами, нуклеозидами, нуклеотидными кофакторами и структурно родственными молекулами.

В другом своем варианте настоящее изобретение относится к способу обнаружения наличия или отсутствия и/или измерения количества молекулы-мишени в образце; причем в указанном способе используется нуклеиново-кислотный лиганд, который может быть выделен способами, описанными выше. Обнаружение молекулы-мишени опосредуется ее связыванием с нуклеиново-кислотным лигандом, специфичным для данной молекулы-мишени. Нуклеиново-кислотный лиганд может быть меченым, например радиоактивно меченным, что позволяет осуществлять количественное или качественное детектирование. В частности, этот метод обнаружения может быть использован для обнаружения белков, о которых неизвестно, является ли их связывание с нуклеиновыми кислотами частью их биологической функции. Так, например, нуклеиново-кислотные лиганды настоящего изобретения могут быть использованы в диагностике аналогично стандартным методам диагностики, основанным на использовании обычного антитела. Одно из преимуществ использования нуклеиново-кислотных лигандов в указанном методе обнаружения и диагностики по сравнению с использованием стандартных антител заключается в том, что указанные нуклеиновые кислоты могут быть легко амплифицированы in vitro, например, путем РСR-амплификации или аналогичными методами. Другое преимущество заключается в том, что весь процесс SELEX проводят in vitro и его осуществление не требует иммунизации испытуемых животных. Кроме того, аффинность связывания нуклеиново-кислотных лигандов может быть адаптирована к требованиям пользователя.

Нуклеиново-кислотные лиганды для небольших молекул-мишеней могут быть использованы в качестве реагентов диагностического анализа, а также в терапевтических целях, например, в качестве секвестрантов, носителей в лекарственных препаратах и модификаторов функции гормонов. Прод