Набор для определения антител к вирусу энцефаломиелита птиц

Набор для определения антител к вирусу энцефаломиелита птиц

Реферат

 

Набор содержит очищенный и инактивированный антиген вируса энцефаломиелита птиц (ЭП), иммобилизованный на твердом носителе, сухую положительную сыворотку крови кур к вирусу (ЭП), сухую отрицательную сыворотку крови кур и сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащие карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2. Каждый из указанных компонентов и катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%: 2:98 - 15: 85. Из неспецифических компонентов набор содержит трис-буферный раствор, фосфатно-цитратный буфер, краситель ортофенилендиамин или 2,2-азино-ди[3-этил] бензтиазолинсульфоновую кислоту, раствор, останавливающий окраску реакции, детергент твин-20 и раствор для промывания. Набор обладает высокой активностью, специфичностью, низкой себестоимостью и высокой стабильностью при хранении. 11 з.п. ф-лы, 6 табл.

Изобретение относится к области диагностики, ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к получению наборов для определения антител к вирусу энцефаломиелита птиц (ЭП) в иммуноферментном анализе (ИФА), и может быть использовано при диагностике ЭП в научно-исследовательских учреждениях, региональных и областных ветеринарных лабораториях и при изготовлении указанных наборов на предприятиях биологической промышленности.

ЭП является широко распространенной вирусной болезнью цыплят, индеек, фазанов и куропаток. У молодых птиц характеризуется атаксией, параличом и обычно сопровождается тремором головы и шеи. Инфицированные взрослые птицы не проявляют признаков. Однако хорошая продуктивность часто сменяется снижением яйценоскости, которое длится не более 2 недель. Заболеваемость у птиц варьирует и может достигать 60%. У цыплят клинические признаки могут проявляться как во время вывода, так и через 7 недель. Некоторые птицы, имеющие клинические признаки, выздоравливают полностью. Реконвалесценты отстают в росте и имеют пониженную яйценоскость. У многих переболевших птиц позднее развивается катаракта и нарушается зрение.

Предварительный диагноз ставят на основании исторических данных и наличия типичных микроскопических изменений в ЦНС. Наиболее типичными микроскопическими изменениями являются: а) набухание и хромотолизис нейронов в ядрах (ядро округлое и ядро яйцевидное) среднего мозга и мозжечка, б) плотные лимфоидные агрегаты в мускулатуре мышечного и/или железистого желудка. Отмечают диффузный негнойный энцефаломиелит с выраженной периваскулярной инфильтрацией. Диагноз может быть подтвержден при наличии гистопатологических изменений или при обнаружении антигена вируса ЭП у инфицированных цыплят с помощью метода прямой флуоресценции антител (ПФА). Возможно выделение и идентификация вируса из мозговой ткани инфицированных цыплят, но эта процедура занимает много времени и весьма дорога. Кроме того, необходимы восприимчивые куриные эмбрионы, полученные от SPF-несушек. ЭП должен быть дифференцирован от других болезней, вызывающих нарушение функции ЦНС у молодых птиц. К ним относят: болезнь Ньюкасла (БН), арбовирусную инфекцию, недостаток витаминов (Е, А и рибофлавина), микотический энцефалит, абсцессы мозга, болезнь Марека, токсины (соли, некоторые пестициды и т.д.). Наличие антител в сыворотке невакцинированных несушек (часто в относительно низком титре) и в оплодотворенных яйцах дает основание предполагать присутствие ЭП. Повышение титра антител после резкого падения яичной продуктивности подтверждает наличие инфекции ЭП. Для обнаружения вирусного антигена или специфических антител, свидетельствующих о контакте птиц с вирусом, используют различные серологические тесты. Такими тестами является: реакция нейтрализации (рН), метод ПФА, иммуноферментный анализ (ИФА).

Большинство методов, позволяющих контролировать уровень антител к вирусу ЭП в сыворотках крови кур, а также присутствие вируса или его антигена в биологических материалах, основано на ИФА. Для выявления антител к вирусу ЭП и определения их концентрации в сыворотках крови получил распространение непрямой вариант ИФА, в котором исследуемый образец взаимодействует с антигеном, иммобилизованном на планшете из оптически прозрачного полимера с 96 лунками. Далее антитела в составе иммунных комплексов реагируют с конъюгатом. Результаты анализа с высокой точностью фиксируют средствами спектрофотометрии. Для обнаружения и оценки титра антигена вируса ЭП в биологических материалах широко применяют непрямой сэндвич-вариант ИФА, при осуществлении которого исследуемый антиген вначале улавливается специфическими антителами, иммобилизованными на планшете, а затем выявляется детекторными антителами, с которыми взаимодействует конъюгат. Результаты анализа фиксируют также с помощью спектрофотометра.

Достоинством ИФА являются высокая чувствительность и специфичность, возможность проведения масштабных исследований в полевых условиях, оперативность проведения анализов, небольшие объемы исследуемых проб и возможность автоматизации практически всех стадий выполнения реакции, включая регистрацию и обработку получаемых результатов (1-6).

В настоящее время фирмы, специализирующиеся на производстве средств для молекулярно-биологической диагностики, выпускают специальные наборы для проведения ИФА с целью обнаружения сывороточных антител к вирусам, вызывающим различные заболевания кур, в том числе и ЭП. Однако общим недостатком указанных наборов является то, что они импортные, что определяет высокую себестоимость соответствующих исследований (7).

Известен также карбоксилсодержащий катионит КБ-4-П2, который является органическим ионообменным веществом слабокислотного типа в натриевой форме. Известно его применение для селективного удаления небольших количеств двухвалентных катионов из смесей с большими концентрациями одновалентных катионов, для очистки катионного обмена (8).

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является набор для определения антител к вирусу ЭП птиц в ИФА, содержащий очищенный и инактивированный антиген вируса ЭП птиц, иммобилизованный на твердом носителе, сухую положительную сыворотку крови кур к вирусу ЭП, отрицательную сыворотку крови кур к вирусу ЭП, антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, буферный раствор для разведения компонентов, окрашивающий раствор 2,2-азино-ди [3-этил] бензтиазолинсульфоновой кислоты (АБТС)-субстратный буфер, останавливающий окраску реакции (5% SDS), раствор для промывания (9).

Недостатки набора-прототипа, что, во-первых, он является импортным, что определяет высокую себестоимость соответствующего исследования, а, во-вторых, его иммуноспецифические компоненты являются нестабильными и требуют соблюдения оптимальных условий хранения (4-7^oС).

В задачу создания настоящего изобретения входило расширение ассортимента наборов для определения антител к вирусу ЭП в ИФА, обладающего высокой активностью, специфичностью, низкой себестоимостью изготовления и более высокой стабильностью при хранении.

Технический результат от использования изобретения заключается в расширении ассортимента наборов для определения антител к вирусу ЭП в ИФА, обладающих высокой активностью, специфичностью, низкой себестоимостью изготовления и более высокой стабильностью при хранении.

Указанный технический результат достигнут созданием изобретения, охарактеризованного следующей совокупностью признаков: 1. Набор для определения антител к вирусу ЭП в ИФА 1.1. Очищенный и инактивированный антиген вируса ЭП кур, иммобилизованный на твердом носителе.

1.2. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ЭП, дополнительно содержащая карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.

1.2.1. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ЭП и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%: Положительная сыворотка - 2 - 15 Катионит КБ-4П-2 - До 100 1.2.2. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ЭП, полученная контактным обезвоживанием.

1.3. Сухая отрицательная сыворотка крови кур, дополнительно содержащая карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.

1.3.1. Сухая отрицательная сыворотка крови кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%: Отрицательная сыворотка - 2 - 15 Катионит КБ-4П-2 - До 100 1.3.2. Сухая отрицательная сыворотка крови кур, полученная контактным обезвоживанием.

1.4. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащий карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.

1.4.1. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%: Антивидовой иммунопероксидазный конъюгат - 2 - 15 Катионит КБ-4П-2 - До 100 1.4.2. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, полученный контактным обезвоживанием.

1.5. Буферный раствор для разведения иммуноспецифических компонентов.

1.5.1. В качестве буферного раствора для разведения иммуноспецифических компонентов набор содержит трис-буферный раствор.

1.6. Субстратный буфер.

1.6.1. В качестве субстратного буфера набор содержит фосфатно-цитратный буфер.

1.7. Детергент.

1.7.1. Из детергентов набор содержит твин-20.

1.8. Краситель.

1.8.1. Из красителей набор содержит ортофенилендиамин (ОФД).

1.8.2. Из красителей набор содержит АБТС.

1.9. Раствор, останавливающий окраску реакции.

1.10. Раствор для промывания.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана: 1. Набор для определения антител к вирусу ЭП птиц в ИФА.

1.1. Очищенный и инактивированный антиген вируса ЭП, иммобилизованный на твердом носителе.

1.2. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ЭП, дополнительно содержащая карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.

1.3. Сухая отрицательная сыворотка крови кур, дополнительно содержащая карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.

1.4. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащий карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.

1.5. Буферный раствор для разведения.

1.6. Субстратный буфер.

1.7. Детергент.

1.8. Краситель.

1.9. Раствор, останавливающий окраску реакции.

1.10. Раствор для промывания.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы его выполнения или особые условия использования: 1. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ЭП и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%: Положительная сыворотка - 2 - 15 Катионит КБ-4П-2 - До 100 2. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ЭП, полученная контактным обезвоживанием.

3. Сухая отрицательная сыворотка крови кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%: Отрицательная сыворотка - 2 - 15 Катионит КБ-4П-2 - До 100 4. Сухая отрицательная сыворотка крови кур, полученная контактным обезвоживанием.

5. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 А содержатся в соотношении, мас.%: Конъюгат - 2 - 15 Катионит КБ-4П-2 - До 100 6. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, полученный контактным обезвоживанием.

7. В качестве буферного раствора для разведения иммуноспецифических компонентов набор содержит трис-буферный раствор.

8. В качестве субстратного буфера набор содержит фосфатно-цитратный буфер.

9. Из детергентов набор содержит твин-20.

10. Из красителей набор содержит ОФД.

11. Из красителей набор содержит АБТС.

12. Раствор для промывания.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемый набор и совпадающими и с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются: 1. Набор для определения антител к вирусу ЭП в ИФА.

2. Очищенный и инактивированный антиген ЭП, иммобилизованный на твердом носителе.

3. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ЭП.

4. Сухая отрицательная сыворотка крови кур.

5. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур.

6. Буферный раствор для разведения.

7. Субстратный буфер.

8. Детергент.

9. Краситель.

10. Раствор, останавливающий окраску реакции.

11. Раствор для промывания.

По сравнению с набором-прототипом существенными отличительными признаками предлагаемого набора являются: 1. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ЭП, дополнительно содержащая карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.

2. Сухая отрицательная сыворотка кур, дополнительно содержащая карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.

3. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащий карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы его выполнения или особые условия использования: 1. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ЭП и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%: Положительная сыворотка - 2 - 15 Катионит КБ-4П-2 - До 100 2. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ЭП, полученная контактным обезвоживанием.

3. Сухая отрицательная сыворотка крови кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%: Отрицательная сыворотка - 2 - 15 Катионит КБ-4П-2 - До 100 4. Сухая отрицательная сыворотка крови кур, полученная контактным обезвоживанием.

5. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%: Антивидовой иммунопероксидазный конъюгат - 2 - 15 Катионит КБ-4П-2 - До 100 6. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, полученный контактным обезвоживанием.

7. В качестве буферного раствора для разведения и промывки набор содержит трис-буферный раствор.

8. В качестве субстратного буфера набор содержит фосфатно-цитратный буфер.

9. Из детергентов набор содержит твин-20.

10. Из красителей набор содержит ОФД.

11. Из красителей набор содержит АБТС.

Благодаря созданию предлагаемого набора решена проблема расширения ассортимента наборов, обладающих высокой активностью, специфичностью, низкой себестоимостью изготовления и высокой стабильностью при хранении. Обладает более высокой активностью и специфичностью и низкой себестоимостью изготовления.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источники, характеризующиеся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа, как наиболее близкого по совокупности признаков, позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому, заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемого набора, изложенных в независимом пункте формулы изобретения.

Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности "новизна".

Для проверки соответствия предлагаемого решения условию патентоспособности "изобретательский уровень" проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения.

В результате поиска установлено следующее Известно использование карбоксилсодержащего катионита КБ-4П-2 для селективного удаления небольших количеств двухвалентных катионов из смесей с большими концентрациями одновалентных катионов, а также для очистки v стрептомицина и других реакций катионного обмена (8). Для высушивания микроколичеств иммуноспецифических компонентов предлагаемого набора авторами использован впервые карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2, при этом авторами обнаружено новое, ранее неизвестное свойство катионита КБ-4П-2 не изменять нативные характеристики иммуноспецифических компонентов при обезвоживании и одновременно повышать их специфичность и активность.

Результаты поиска показывают, что предлагаемое изобретение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены аналогичные решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата. Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "изобретательский уровень".

Сущность изобретения пояснена примерами его исполнения, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1 Набор для определения антител к вирусу ЭП в ИФА содержит следующие компоненты: очищенный антиген вируса ЭП, штамм "Calnek 1143", нанесенный на пластиковый планшет (два планшета), сухую положительную сыворотку крови кур к вирусу ЭП (одна ампула), сухую отрицательную сыворотку крови кур (одна ампула) и сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур (одна ампула), дополнительно содержащие карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2, а также набор солей для приготовления трис-буферного раствора, используемого для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов и содержащего трис(оксиметил)аминометан в количестве 0,97 г, трис(оксиметил)аминометан гидрохлорид в количестве 6,61 г, хлористый натрий в количестве 11,7 г (три флакона), набор солей для приготовления субстратного буфера, содержащего натрий фосфорнокислый двузамещенный в количестве 5,37 г и лимонную кислоту в количестве 1,57 г (фосфатно-цитратный буфер - два флакона), ОФД (одна таблетка) или АБТС (одна таблетка), раствор, останавливающий окраску (один флакон), раствор для промывания (один флакон).

Пример 2 Для изготовления антигена вируса ЭП используют производственный штамм "Calnek 1143". Вирус культивируют на 6-дневных SPF-эмбрионах кур при 37^oС и влажности 60%. Первый пассаж является матровой расплодкой, которую используют для получения необходимого количества вируссодержащего сырья. Вируссодержащий материал, включающий пенициллин - стрептомициновую смесь (200-300 Ед/см³), инокулируют в объеме 0,2 см³ в желточный мешок. Инфицированные эмбрионы содержат при стандартных условиях. Специфическое действие вируса проявляется на 8-10 сутки с момента заражения. В этот период производят овоскопию. Эмбрионы с отставанием в развитии, дистрофией конечностей и кровоизлияниями в головном мозге отбирают и охлаждают до 2-6^oС. На коллоидной мельнице или РТ-приборе из отобранных эмбрионов получают мелкодисперсный гомогенат тканей и жидкостей эмбрионов (30% суспензия на изотоническом фосфатно-буферном растворе (ФБР) со средним размером частиц 0,1-0,3 мм). Полученную суспензию замораживают при -70^oС, оттаивают и центрифугируют при 2000g в течение 15 мин для осаждения крупнодисперсных компонентов. Супернатант используют в качестве вируссодержащего материала, который хранят в замороженном (при -70^oС) или лиофилизованном состоянии. К полученному антигену добавляют 20% хлороформа и смесь шуттелируют в течение 10 мин. Полученную взвесь центрифугируют при 3000g в течение 15-20 мин и отбирают супернатант. Для осаждения антигена к супернатанту добавляют 7,5% ПЭГ и выдерживают при 4^oС в течение 16 ч. Осадок собирают центрифугированием при 17000g в течение 20 мин и ресуспендируют в ФБР из расчета 1/20 от исходного объема. Затем антиген фракционируют дополнительно в сформированном ступенчатом градиенте плотности хлористого цезия и сахарозы. Для этого в стаканах для ультрацентрифугирования образуют градиент, состоящий из равных объемов раствора CsCl раствора сахарозы. Суспензию в объеме 1/5 от общего объема наносят на градиент и центрифугируют при 70000g в течение 3 ч. Фракционирование градиента проводят на проточном спектрофотометре при длине волны 280 нм. Фракции, соответствующие пикам оптической плотности, объединяют и диализируют против ФБР при 4^oС в течение 12-18 ч. Чистоту и гомогенность антигенных препаратов контролируют электронной микроскопией.

Полученный антиген подвергают морфологическому контролю путем оценки структурного состояния вирионов с помощью электронного микроскопа. Содержание разрушенных или частично поврежденных вирусных частиц не должно превышать 1/3 от числа наблюдаемых вирионов.

Активность и специфичность полученного антигена определяют в непрямом варианте ИФА. Для этого антиген иммобилизуют на планшет в различных концентрациях (разведения от 1: 50 до 1:300) и исследуют в непрямом варианте ИФА. Определяют ту концентрацию (разведение), при которой специфичная к гипериммунная сыворотка кур демонстрирует титр не менее чем 1:12800. Исключают неспецифические реакции. Исследуемый антиген не должен специфически реагировать с сыворотками, имеющими антитела к вирусам: бронхита, ньюкаслской болезни, адено-, рео-, а также к бактериальным антигенам: сальмонеллеза и пастереллеза.

Прошедший необходимые тесты препарат антигена вируса ЭП используют для иммобилизации на планшеты. Количество антигена, необходимое для изготовления партии наборов, размораживают и готовят рабочее разведение в буфере для разведения антигена. После инкубации в течение 18 ч при 4^oС или 2 ч при 37^oС раствор антигена удаляют, планшеты промывают буфером и вносят по 0,1 см³ блокирующего раствора. Инкубируют 1 ч при комнатной температуре и промывают 3 раза буфером. Планшеты высушивают на воздухе и упаковывают в полиэтиленовые пакеты поштучно.

Пример 3. Для получения положительной сыворотки в качестве доноров используют безлейкозных цыплят в возрасте 21-42 дней, которым инокулируют производственный штамм "Calnek-1143" ЭП с инфекционной активностью не ниже 100000 ЭИД₅₀/см³ в дозе 100 ЭИД₅₀/0,2 см³ орально. Через 21 сутки птицу подвергают гипериммунизации. Для гипериммунизации используют антиген вируса ЭП, полученный так, как описано в примере 1. Предварительно антиген эмульгируют 3-5 мин в тканевом гомогенизаторе с равным объемом масляного адъюванта типа неполного адъюванта Фрейнда. Препарат вводят цыплятам внутримышечно в грудную мышцу, в копчик или подкожно в область шеи в дозе 0,5 см³. Спустя 10 суток проводят пробное взятие крови для определения активности гипериммунной сыворотки. В случае высокой активности сыворотки цыплят тотально обескровливают с соблюдением правил асептики и антисептики в увлажненные физиологическим раствором пробирки. Если активность сывороток невысокого уровня, проводят дополнительную иммунизацию свежеприготовленным антигеном с адъювантом, а спустя 10 суток доноров тотально обескровливают. Индивидуальные пробы крови выдерживают сначала при +37^oС в течение 30-60 мин, а затем при +4^oС в течение суток. Отстоявшуюся сыворотку отсасывают в стерильные пробирки, не допуская попадания эритроцитов и других форменных элементов крови, инактивируют при +57^oС в течение 30 мин, консервируют хинозолом в соотношении 1: 1000. Полученную сыворотку смешивают с карбоксилсодержащим катионитом КБ-4П-2 в соотношении, мас.%: 2:98-15:85 (указанные соотношения являются оптимальными) и подвергают контактному обезвоживанию.

Пример 4 Проведены сравнительные испытания в ИФА сухой положительной сыворотки крови кур к вирусу ЭП, дополнительно содержащей карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученной контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет, маc.%: Положительная сыворотка - 2,0 Катионит КБ-4П-2 - 98,0 Результаты испытаний представлены в табл. 1.

Представленные в табл. 1 данные свидетельствуют о том, что полученная методом контактного обезвоживания сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ЭП не уступает по активности и специфичности нативной сыворотке и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев.

Пример 5 Проведены сравнительные испытания в ИФА сухой положительной сыворотки крови кур к вирусу ЭП, дополнительно содержащей карбоксилсодержащий катионит КП-4П-2 и полученной контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет, маc.%: Положительная сыворотка - 7,0 Катионит КБ-4П-2 - 93,0 Результаты испытаний представлены в табл. 2.

Представленные в табл. 2 данные свидетельствуют о том, что полученная методом контактного обезвоживания сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ЭП не уступает по активности и специфичности нативной сыворотке и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев.

Пример 6 Проведены сравнительные испытания в ИФА сухой положительной сыворотки крови кур к вирусу, дополнительно содержащей карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученной контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет, мас.%: Положительная сыворотка - 15,0 Катионит КБ-4П-2 - 85,0 Результаты испытаний представлены в табл. 3.

Представленные в табл. 3 данные свидетельствуют о том, что полученная методом контактного обезвоживания сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу не уступает по активности и специфичности нативной сыворотке и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев.

Пример 7 Используемую в качестве компонента набора отрицательную сыворотку крови кур к вирусу ЭП получают от здоровой безлейкозной птицы. К полученной сыворотке добавляют карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 в соотношении, мас.%: 2: 98-15: 85 (указанные соотношения являются оптимальными) и подвергают контактному обезвоживанию.

Пример 8 В предлагаемом наборе используют антивидовые коммерческие конъюгаты, выпускаемые НИИЭМ имени Н.Ф.Гамалея, представляющие собой глобулиновую фракцию, выделенную из антисыворотки, полученной иммунизацией кур, и меченную пероксидазой хрена. К конъюгату добавляют карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 в соотношении, мас.%: 2:98-15:85 (указанные соотношения являются оптимальными) и подвергают контактному обезвоживанию.

Пример 9 Проведены сравнительные испытания в ИФА сухого антивидового иммунопероксидазного конъюгата против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащего карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученный контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет, мас.%: Конъюгат - 2,0 Катионит КБ-4П-2 - 98,0 Результаты испытаний представлены в табл. 4.

Представленные в табл. 4 данные свидетельствуют о том, что полученный методом контактного обезвоживания сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат не уступает по активности и специфичности нативному материалу и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев.

Пример 10 Проведены сравнительные испытания в ИФА сухого антивидового иммунопероксидазного конъюгата против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащего карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученного контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет, мас.%: Конъюгат - 7,0 Катионит КБ-4П-2 - 93,0 Результаты испытаний представлены в табл. 5.

Представленные в табл. 5 данные свидетельствуют о том, что полученный методом контактного обезвоживания сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат не уступает по активности и специфичности нативному материалу и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев.

Пример 11 Проведены сравнительные испытания в ИФА сухого антивидового иммунопероксидазного конъюгата против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащего карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученного контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет, мас.%: Конъюгат - 15,0 Катионит КБ-4П-2 - 85,0 Результаты испытаний представлены в табл. 6.

Представленные в табл. 6 данные свидетельствуют о том, что полученный методом контактного обезвоживания сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат не уступает по активности и специфичности нативному материалу и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий: - набор для определения антител к вирусу ЭП в ИФА, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в сельском хозяйстве, а именно в диагностике, ветеринарной вирусологии и биотехнологии; - для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов; - набор для определения антител к вирусу ЭП в ИФА, приготовленный в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой активностью и специфичностью, а также низкой себестоимостью изготовления.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".

Источники информации 1. Сюрин В. И. , Самуйленко А.Я. и др. Вирусные болезни животных. М. ВНИТИБП, 1998, 514-519.

2. Егоров А. М., Осипов А.П. и др. Теория и практика иммуноферментного анализа. М., Высшая школа, 1991, 77-100.

3. Сеймур П. Х. Иммуноферментный анализ антител // Иммуноферментный анализ М., Мир., 1988, 193-205.

4. Entwicklung und Erprobung eines indirekten ELISA zum Nachweis von ANTICORPERN Gegen die Aviare Encephalomyelitis. Berl. Munch Tierartl. Wschr. 107085-090(1994).

5. Heiden G., Hiinak A. et al. Entwicklung eines Zweiseitenbindung-ELISA zum Nachweis von Anticorpern gegen das Vines der Aviaren Encephalomyelitis. Mh. Vet. -Med. 43 (1988): 475-477.

6. Richter R., Koster I. und Kuhavanta-Kalkosol S. Vergleichende untersuchungen zur Anwendung eines Enzyme- linked - Immunosorbent -Assay (ELISA) zum Anticor-pernachweis gegen den Erreger der Aviaren Encephalomyelitis. Zbl. Vet. Med. В 32 116-127(1985).

7. Anen C.S. Serological Tests for diagnosis of Avian Encephalomyelitis- A Review Poultry Advisser. Vol. XXVI, ISSUE III, 1993.

8. Краткая химическая энциклопедия М., ГНИ "Сов. энциклопедия", 1963, т. 2, 299-306.

9. Avian encephalomyelitis antibody test fcit. Instruction. Catalog 54-86-01/KPL (Kirkegaard and Perry Laboratories), US, 2 Cessna Court Gaithersburg Maryland 20879, 8006383167 (прототип).

Формула изобретения

1. Набор для определения антител к вирусу энцефаломиелита птиц иммуноферментным анализом, содержащий очищенный и инактивированный антиген возбудителя инфекции, иммобилизованный на твердом носителе, сухую положительную сыворотку крови кур к вирусу энцефаломиелита, сухую отрицательную сыворотку крови кур и сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, а также буферный раствор для разведения и промывки, субстратный буфер, детергент, краситель, раствор, останавливающий окраску реакции, раствор для промывания реакции, отличающийся тем, что сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу энцефаломиелита птиц, сухая отрицательная сыворотка крови кур и сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур дополнительно содержат карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.

2. Набор по п.1, отличающийся тем, что сухая положительная сыворотка к вирусу энцефаломиелита птиц и карбоксилсодержащей катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%: Положительная сыворотка - 2-15 Катионит КБ-4П-2 - До 100 3. Набор по п.1, отличающийся тем, что он содержит сухую положительную сыворотку крови кур к вирусу энцефаломиелита птиц, полученную контактным обезвоживанием.

4. Набор по п. 1, отличающийся тем, что сухая отрицательная сыворотка крови кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%: Отрицательная сыворотка - 2-15 Катионит КБ-4П-2 - До 100 5. Набор по п.1, отличающийся тем, что он содержит сухую отрицательную сыворотку кур, полученную контактным обезвоживанием.

6. Набор по п.1, отличающийся тем, что сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%: Конъюгат - 2-15 Катионит КБ-4П-2 - До 100 7. Набор по п.1, отличающийся тем, что он содержит сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, полученный контактным обезвоживанием.

8. Набор по п.1, отличающийся тем, что в качестве буферного раствора он содержит трис-буферный раствор.

9. Набор по п.1, отличающийся тем, что в качестве субстратного буфера он содержит фосфатно-цитратный буфер.

10. Набор по п.1, отличающийся тем, что из детергентов он содержит твин-20.

11. Набор по п.1, отличающийся тем, что из красителей он содержит ортофенилендиамин.

12. Набор по п. 1, отличающийся тем, что из красителей он содержит 2,2'-азино-ди[3-этил]бензтиазолинсульфоновую кислоту.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3