Антагонисты gnrh, модифицированные в положениях 5 и 6

Антагонисты gnrh, модифицированные в положениях 5 и 6

Реферат

 

Изобретение относится к пептидам-антагонистам GnRH, имеющим формулу: X-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser-Xaa₅-Xaa₆-Leu-Xaa₈-Pro-Xaa₁₀, и их фармацевтически приемлемым солям, где Х = ацильная группа, имеющая более 7 атомов углерода; А = 4Cl или 4F; Хаа₅ представляет собой Арh(Q₁) или Аmf(Q₁), где Q₁ представляет собой Q или где Q представляет собой и где R представляет собой Н или низший алкил; Хаа₆ представляет собой D-Aph(Q₂), D-Amf(Q₂), D-Cit или D-Pal, где Q₂ представляет собой Аc или Q₁; Xaa₈ представляет собой Lys(ipr); и Хаа₁₀ представляет собой D-Ala-NH₂, D-Ala-ol, Ala-ol, NHCH₂CH₃, Gly-NH₂ или Ala-NH₂, при условии, что, если Хаа₅ содержит Q, Хаа₆ также содержит Q; фармацевтической композиции для ингибирования секреции гонадотропинов у млекопитающих, содержащей в качестве активного ингредиента эффективное количество антагониста по GnRH; способу ингибирования секреции гонадотропинов у млекопитающих и соединению X¹-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser (X²)-Xaa₅-Xaa₆-Leu-Lys (ipr)(X⁴)-Pro-X⁵, гдe Х¹ = -аминозащитная группа; А = 4Сl или 4F; Х² = Н или гидроксизащитная группа; Хаа₅ представляет собой Aph(Q₁) или Amf(Q₁), где Q₁ = структуры I и II, или карбамоил, или метилкарбамоил; Хаа₆ = D-Aph(Q₂), D-Amf(Q₂) или D-Pal, где Q₂ = Ас; X⁴ представляет собой восприимчивую к действию кислоты аминозащитную группу; и Х⁵ представляет собой D-Ala-, Gly-, Аlа-[полимерный носитель], N(Et)-[полимерный носитель], амид D-Ala, Gly или Аlа; или этиламид, являющемуся промежуточным соединением для получения пептида-антагониста GnRH. 4 с. и 12 з.п.ф-лы.

В общих чертах, настоящее изобретение относится к пептидам, которые являются антагонистами гонадотропинрилизинг-гормона человека (GnRH) и обладают полезными физическими, химическими и биологическими свойствами. Более конкретно, настоящее изобретение относится к декапептидам, которые ингибируют функцию половых желез и способствует высвобождению стероидных гормонов прогестерона и тестостерона в течение продолжительного периода времени, и к способам введения фармацевтических композиций, содержащих указанные декапептиды и предназначенные для этих целей, а в частности к лечению состояний, возникающих в результате гиперсекреции половых стероидных гормонов.

Предпосылки создания изобретения Фолликулостимулирующий гормон (FSH) и лютеинизирующий гормон (LH), иногда называемые также гонадотропинами или гонадотропными гормонами, высвобождаются из гипофиза, который соединен с гипоталамусом гипофизарной ножкой.

Высвобождение гормона передней долей гипофиза обычно необходимо перед высвобождением гормонов, продуцируемых гипоталамусом, таких как декапептид GnRH.

Введение аналогов GnRH, которые являются антагонистами нормальной функции GnRH, было использовано для подавления секреции гонадотропинов, в основном у млекопитающих, а также для подавления или замедления овуляции.

Поиск лучших антагонистов GnRH привел к получению антида (Antide), то есть [Ac-D-2Nal¹, D-4ClPhe², D-3Pal³, Lys(Nic)⁵, D-Lys(Nic)⁶, Ilys⁸, D-Ala¹⁰] -GnRH; и цетрореликса (Cetrorelix), то есть [Ac-D-2Nal¹, D-4ClPhe², D-3Pal³, D-Cit⁶, D-Ala¹⁰]-GnRH. В патенте США N5516887 описаны антагонисты GnRH, которые, как указывается, являются более эффективными в снижении уровней тестостерона в плазме, чем антид, например [Ac-D-2Nal¹, D-4ClPhe², D-3Pal³, D-N-карбамоил Lys⁶, Ilys⁸, D-Ala¹⁰]-GnRH, которые были названы антареликсом.

В патенте США N5296468, изданном 22 марта 1994, описаны создание и синтез ряда антагонистов GnRH, у которых боковые цепи выбранных остатков реагируют с образованием цианогуанидиновых фрагментов некоторые из которых затем спонтанно превращаются в нужный гетероцикл, например 3-амино-1,2,4-триазол(atz). Эти цианогуанидиновые фрагменты происходят от омега-аминогруппы в боковой цепи аминокислоты, такой как лизин, орнитин, 4-аминофенилаланин (4Арh) или ее удлиненный вариант, такой как 4-аминогомофенилаланин (4Aph). Антагонисты GnRH, имеющие такие значительно модифицированные или неприродные аминокислоты, а в 5- и 6-положениях обнаруживают хорошие биологические свойства, и антагонисты, которые происходят от Aph, считаются, в основном, предпочтительными. А особенно предпочтительным является азалин В, то есть [Ac-D-2Nal¹, D-4ClPhe², D-3Pal³, 4Aph(atz)⁵, D-4Aph(atz)⁶, Ilys⁸, D-Ala¹⁰] -GnRH. В патенте США N5506207 описаны биологически активные антагонисты GnRH, у которых боковые цепи аминозамещенного фенилаланина в 5- и 6-положениях ацилированы; а особенно эффективным декапептидом является ацилин, то есть, [Ac-D-2Nal¹, D-4ClPhe², D-3Pal³, 4Aph(Ac)⁵, D-4Aph(Ac)⁶, Ilys⁸, D-Ala¹⁰] -GnRH.

Несмотря на привлекательные свойства этой группы антагонистов GnRH, поиски еще более сильных антагонистов GnRH все еще продолжаются, особенно таких антагонистов, которые обладают длительным биологическим действием. В большинстве случаев оказывается важным, чтобы пептидный аналог обладал продолжительной активностью по отношению к секреции LH, то есть свойством, которое может быть усилено устойчивостью пептида к деградации протеолитическими ферментами в организме как при кратковременном, так и при длительном курсе лечения. Кроме того, для облегчения введения этих соединений млекопитающим, особенно человеку, без значительного гелеобразования, является крайне желательным, чтобы такие декапептиды-антагонисты GnRH обладали высокой степенью растворимости в воде при нормальных физиологических рН, то есть при рН примерно от 5 до 7,4.

Краткое описание изобретения Было неожиданно обнаружено, что некоторые другие модификации остатка в 5-положении или остатков в 5- и 6-положениях в антагонистах GnRH того подкласса, к которому относятся центрореликс, антареликс, ацилин, антид и другие, приводят к получению соединений, которые при их подкожном введении обладают особенно преимущественным свойством, заключающимся в продолжительности их биологической активности. Такие модификации были введены в остаток 4аминоРhе или в его эквивалент 4Aph или в 4-аминометилфенилаланин (4Amf), где первичная аминогруппа связана с метильной группой, присоединенной в 4- или параположении. В таких модификациях аминогруппа боковой цепи реагирует с изоцианатом с образованием карбамидной группы или реагирует с гетероциклической карбоновой кислотой, содержащей, по меньшей мере, 2 атома азота, расположенные таким образом, что они составляют карбамидную часть. Предпочтительными гетероциклическими реагентами являются D- или L-гидрооротовая кислота (Ноr) (С₄N₂H₅(0)₂СООН) и D- или L-2-имидазолидон-4-карбоновая кислота (Imz) (С₃N₂H₅(0) СООН).

В основном было обнаружено, что декапептиды-антагонисты GnRH, имеющие нижеследующую формулу, и их близкородственные аналоги и фармацевтически приемлемые соли обладают улучшенными фармакологическими свойствами, а в частности пролонгированной биологической активностью: X-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser-Xaa₅-Xaa₆-Leu-Xaa₈-Pro-Xaa₁₀, где Х представляет собой ацильную группу, имеющую 7 атомов углерода или Q, где Q представляет собой а R представляет собой Н или низший алкил; А представляет собой 4Сl, 4F, 4Br, 4NO₂, 4СН₃, 4OСН₃, 3,4Cl₂ или CMe4Cl; Xaa₅ представляет собой Aph (Q₁) или Amf (Q₂), где Q₁ представляет собой Хаа₆ представляет собой D-Aph (Q₂), D-Amf (Q₂), D-Lys (Nic), D-Cit, D-Hci или D-Pal, где Q₂ представляет собой For, Ac, 3-амино-1,2,4-триазол, Q или Q₁; Xaa₈ представляет собой Lys(ipr), Arg, Наr, Arg (Et₂) или Наr (Et₂); и Хаа₁₀ представляет собой D-Ala-NH₂, D-Ala-ол, Ala-ол, NHCH₂CH₃, Gly-NH₃, AzaGly-NH₂, Ala-NH₂, Agl-NH₂, D-Agl-NH₂, Agl(Me)-NH₂ или D-Agl(Me)-NH₃, при условии, однако, что -аминогруппа Xaa₅ может быть, но не обязательно, метилированной; и, кроме того, при условии, что, если Xaa₆ содержит D-, или L-Hor, или D-, или L-Imz, то Хаа₅ может иметь Ac, For или 3-амино-1,2,4-триазол, в качестве Q₁; а если Хаа₆ содержит Q, то Хаа₅ может также содержать Q.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу in vivo- или in vitro-диагностики состояний, при которых GnRH вызывает избыточную секрецию гормонов или рост опухоли, где указанный способ предусматривает введение пептида-антагониста GnRH вышеописанного типа и мониторинг секреции гормона или пролиферации опухолевых клеток.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к промежуточному соединению для получения пептида-антагониста GnRH, имеющему формулу X¹D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser (X²)-Xaa₅-Xaa₆-Leu-Lys(ipr)(X⁴)-Рrо-Х⁵, где X¹ - -аминозащитная группа; А представляет собой 4Cl или 4F; X² представляет собой Н или гидроксилзащитную группу; Хаа₅ представляет собой Aph(Q₁) или Amf(Q₁), где Q₁ представляет собой D-изомер, L-изомер или смесь D/L-изомеров любого из: Хаа₆ представляет собой D-Aph(Q₂), D-Amf(Q₂) или D-Pal, где Q₂ представляет собой Ac, Q₁, карбамоил или метилкарбамоил; X⁴ представляет восприимчивую к действию кислоты аминозащитную группу; и X⁵ представляет D-Ala-, Gly-, Ala-, Agl-, D-Agl-, Agl(Me)- или D-Agl(Me)-полимерный носитель; N(Et)-полимерный носитель; амид D-Ala, Gly или Ala; этиламид; AzaGly-NH₂, или ОН, при условии, однако, что -аминогруппа Хаа₅, может быть, но не обязательно, метилированной.

Эти антагонисты являются особенно эффективными для подавления секреции гонадотропинов и в качестве регуляторов способности к оплодотворению у человека, поскольку они обладают пролонгированной активностью, то есть активностью, продолжающейся вплоть до значительного подавления секреции LH, по меньшей мере, примерно в течение 4 дней. Они обладают улучшенной растворимостью в водных буферах при физиологических рН и допустимыми побочными эффектами в отношении стимуляции высвобождения гистамина, то есть лучшими эффектами по сравнению с суперагонистами GnRH, используемыми в современной клинической практике; и, кроме того, они обладают минимальной способностью к гелеобразованию после их подкожной (п/к) инъекции в эффективной концентрации. Эти антагонисты GnRH могут быть также с успехом использованы в анафилактоидном анализе, вызывая лишь образование относительно небольшого волдыря. В результате этого указанные пептиды являются особенно подходящими для введения млекопитающим, в частности человеку, в качестве регуляторов оплодотворяющей способности, и для лечения патологических состояний, таких как преждевременное половое созревание, гормонзависимая неоплазия, дисменорея, эндометриоз, стероидзависимые опухоли, а также при других показаниях для кратковременного и длительного курса лечения состояний, упомянутых выше. Они могут быть также использованы для диагностики.

Поскольку эти антагонисты GnRH являются легко растворимыми при физиологических значениях рН примерно в пределах от 5 до 7,4, то они могут быть изготовлены и введены в концентрированной форме, особенно при рН примерно от 5 до 7. Благодаря своей полярной природе эти антагонисты являются пригодными для использования в препаратах пролонгированного действия, изготавливаемых на основе известных сополимеров. Поскольку эти антагонисты GnRH оказывают эффективное подавляющее действие на LH и FSH в течение продолжительного периода времени, то они являются также особенно эффективными для контрацептивной обработки млекопитающих-самцов (с необязательным введением тестостерона) и для лечения стероидзависимых опухолей.

Подробное описание изобретения За последние 10-12 лет были глубоко изучены конкретные свойства каждого из 10 остатков последовательности GnRH с точки зрения создания эффективного антагониста, и в результате этих исследований было обнаружено, что имеются различные эквивалентные остатки, которые могут быть выбраны в качестве замены, и такие замены других остатков одним из этих эквивалентов не оказывают существенного неблагоприятного действия на биологическую активность антагонистов декапептида GnRH. Такие эквивалентные замены могут быть осуществлены в антагонистах GnRH настоящего изобретения.

Так, например, было показано, что в основном включение паразамещенного остатка D-Phe или остатка 2,4-дихлорзамещенного D-Phe или D-CMe4ClPhe или остатка D-пентаметил (Ме₅) Phe в 2-положении значительно усиливает GnRH-антагонистическую активность; однако конкретный выбор кольцевого заместителя из группы, включающей в себя хлор, фтор, бром, нитро, метил и алкокси, имеет лишь относительно небольшое значение. Поэтому такие остатки в 2-положении рассматриваются как эквиваленты D-4ClPhe, которые обычно используются в данном случае. Phe⁷ считается эквивалентным Leu⁷. N-конец является предпочтительно N-ацилированным, предпочтительно ацетилом (Ас), но он может быть ацилирован также и другими ацильными группами, имеющими до 7 атомов углерода, например формилом (For), акрилилом (Асr), н-пропионилом (Рn), бутирилом (By), валерилом (Vl), винилацетилом (Vac} и бензоилом (Bz); и альтернативно он может быть модифицирован замещенным или незамещенным карбамоилом. В качестве эквивалентов могут быть также рассмотрены и другие более длинные ацильные группы, но они являются менее предпочтительными. Для повышения водорастворимости -аминогруппа на остатке в 5-положении может быть, но необязательно, метилирована, как описано в патенте США N5110904, но такая модификация может приводить к сокращению продолжительности подавления секреции LH и к большей вероятности высвобождения гистамина. С-конец представляет собой предпочтительно D-Ala-NH₂, D-Ala-ол или Ala-ол; однако вместо них могут быть использованы Gly-NH₂, NHCH₂CH₃, AzaGly-NH₂, Ala-NH₂, Agl-NH₂, D-Agl-NH₂, Agl (Me)-NH₂, или D-Agl(Me)-NH₂, поскольку они считаются известными эквивалентами.

Как указывалось выше, настоящее изобретение относится к семейству антагонистов GnRH, имеющих следующую формулу: X-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser-Xaa₅-Xaa₆-Leu-Xaa₈-Pro-Xaa₁₀, и к их фармацевтически приемлемым солям, где Х представляет собой For, Ac, Acr, Pn, By, Vl, Vac, Bz и Q, где Q представляет собой и где R представляет собой Н или низший алкил; А представляет собой 4Сl, 4F, 4Br, 4NO₂, 4СН₃, 4OСН₃, 3,4Cl₂ или CMe4Cl; Хаа₅ представляет собой Aph(Q₁) или Amf(Q₁), где Q₁ представляет Хаа₆ представляет собой D-Aph(Q₂), D-Amf(Q₂), D-Lys (Nic), D-Cit, D-Hci или D-Pal, где Q₂ представляет собой For, Ac, 3-амино-1,2,4-триазол, Q или Q₁; Xaa₈ представляет собой Lys(ipr), Arg, Har, Arg(Et₂) или Har (Et₂); и Хаа₁₀ представляет собой D-Ala-NH₂, D-Ala-ол, Ala-ол, NHCH₂СН₃, Gly-NH₂, AzaGly-NH₂, Ala-NH₂, Agl-NH₂, D-Agl-NH₂, Аgl(Ме)-NН₂ или D-Agl(Me)-NH₂, при условии, однако, что -аминогруппа Хаа₅ может быть, но не обязательно, метилированной.

В близкородственном семействе антагонистов GnRH Xaa₅ может иметь либо Ас, либо For, либо 3-амино-1,2,4-триазол в качестве Q₁, и в этом случае Хаа₆ включает в себя Q₂ в форме D-, или L-Hor, или L-Imz.

В другом близкородственном семействе антагонистов GnRH, где Хаа₆ содержит Q, Хаа₅ может также содержать Q.

D-Nal означает D-изомер аланина, который замещен нафтилом на атоме -углерода, то есть он также означает -D-Nal или 3-D-Nal. При этом предпочтительно использовать D-2Nal, где он присоединен к нафталину в 2-положении на кольцевой структуре; однако может быть также использован D-1Nal. D-Cpa представляет собой хлор-D-Phe и D-4ClPhe, то есть предпочтительным является D-4Cpa. D-Pal представляет собой D-изомер аланина, который замещен пиридилом на атоме -углерода; при этом предпочтительно он связан в 3-положении на пиридиновом кольце, то есть D-3Pal (-3-пиридил-D-Ala), хотя вместо этого может быть использован D-2Pal (-2-пиридил-D-Ala). 4Aph означает 4NH₂Phe, где аминозаместитель на фенильном кольце находится в 4-положении; причем в этих аналогах 3NH₂Phe(3Aph) рассматривается как его эквивалент. Более того, с точки зрения биологической активности, очевидно, что 4NH₂Рhе также является эквивалентом. 4Amf означает 4NH₂CH₂Phe, где имеется метиленовая связь с аминогруппой боковой цепи; 3NH₂CH₂Phe(3Amf) считается эквивалентом. Hor или L-Hor означает L-гидрооротил, a Imz или L-Imz означает L-2-имидaзoлидoн-4-кapбoнил-, либо каждый из них может быть использован в виде D-изомера или смеси D/L-изомеров. "atz" означает 3-амино-1,2,4-триазол. Aph(atz) также известен под более точным химическим названием 4-(3'-амино-1H-1',2',4'-триазолил-5'-ил)аминофенилаланин. Lys(Nic) означает N-никотиноиллизин, то есть -аминогруппа Lys ацилирована 3-карбоксипиридином. D-Cit означает D-изомер цитруллина, a D-Hci означает D-изомер гомоцитруллина, который также представляет собой D-N-карбамоил-лизин. Ilys или Lys(ipr) означает N-изопропиллизин, где -аминогруппа Lys алкилирована. Ala-ол означает аланитол, то есть СН₃СН(NН₂)СН₂ОН, a AzaGly-NH₂ означает NHNHCONH₂. Наr означает гомоаргинин, Аgl означает -аминоглицин. Cbm означает карбамоил, а MeCbm oзначает метилкарбамоил или -СОNНСН₃. Низший алкил означает C₁-C₅, предпочтительно C₁-С₃, а более предпочтительно C₁- или С₂-группу, то есть метил (Me) или этил (Et).

Хотя предпочтительные D-изомеры конкретно описаны для введения в 6-положение этих антагонистов GnRH, однако следует отметить, что в результате интенсивных исследований, проводимых в этой области за последние два десятилетия, стало известно много эквивалентных D-изомеров. Такие известные замены для D-изомеров, которые получают путем специфических замен в 5-положении, описанных в настоящей заявке, могут оказаться приемлемыми и не будут оказывать неблагоприятного действия на биологическую активность, а поэтому они также, но не обязательно, могут быть использованы.

Предпочтительный подвид антагонистов GnRH имеет формулу X-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser-Xaa₅-Xaa₆-Leu-Lys(ipr)-Pro-Хаа₁₀, и их фармацевтически приемлемые соли, где: X представляет собой For, Ac, Acr, Pn, By, Vl, Vac, Bz или Q, где Q представляет собой и где R представляет собой Н или низший алкил; А представляет собой 4Сl или 4F; Хаа₅ представляет собой Aph(Q₁) или Amf(Q₁), где Q₁ представляет собой Хаа₆ представляет собой D-Aph(Q₂), D-Amf(Q₂), D-Cit, D-Lys(Nic) или D-Pal, где Q₂ представляет собой For, Ac, Q или Q₁; и Хаа₁₀ представляет собой D-Ala-NH₂, D-Ala-ол, Ala-ол, NHCH₂CH₃ или Gly-NH₂.

Другой предпочтительный подвид антагонистов GnRH имеет формулу X-D-Nal-D-4Cpa-D-Pal-Ser-Xaa₅-Xaa₆-Leu-Lys(ipr)-Pro-Хаа₁₀ и их фармацевтически приемлемые соли, где: Х представляет собой Ас или Q, где Q представляет собой и где R представляет собой Н или метил; Хаа₅ представляет собой Aph(Q₁) или Amf(Q₁), где Q₁ представляет собой Хаа₆ представляет собой D-Арh(Q₂), D-Amf(Q₂) или D-Pal, где Q₂ представляет собой Ac, Q или Q₁; и Xaa₁₀ представляет собой D-Ala-NH₂, D-Ala-ол или Ala-ол.

Другой предпочтительный подвид антагонистов GnRH имеет формулу MeCbm-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Ноr)-D-Xaa₆-Leu-ILys-Pro-Xaa₁₀ и их фармацевтически приемлемые соли, где D-Хаа₆ представляет собой D-4Amf(Q₁), D-Aph(Q₁) или D-3Раl, где Q₁ представляет собой D-Hor или и где R представляет собой Н или низший алкил, а предпочтительно Н или метил; Xaa₁₀ представляет собой D-Ala-NH₂, D-Ala-ол или Ala-ол.

Соединения настоящего изобретения могут быть синтезированы методом классического пептидного синтеза в растворе, и такой синтез является предпочтительным для больших количеств продукта. Для получения ограниченных количеств, например менее 1 кг, может оказаться предпочтительным твердофазный синтез. Защитные группы боковой цепи, хорошо известные специалистам, предпочтительно присутствуют как часть любой аминокислоты, которая имеет особенно реакционноспособную или неустойчивую боковую цепь, при присоединении ее к цепи, присутствующей на полимере. Такой синтез позволяет получить полностью защищенный промежуточный пептидополимер, такой как X¹-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser(X²)-Xaa₅-Xaa₆-Leu-Lys(ipr)(X⁴)-Pro-(X⁵). Один из примеров химического промежуточного соединения, которое может быть использовано для синтеза антагониста GnRH, имеющего нужный остаток в 5- или 6-положениях, содержащих гидрооротил или ему подобные, представлено формулой X¹-D-Nal-D-4Cpa-D-Pal-Ser-(X²)-Aph(X³)-D-Aph(X³)-Leu-Ilys(X⁴)-Pro-(X⁵) При синтезе пептидных промежуточных соединений, имеющих такую формулу, и других аналогов могут быть использованы группы Х¹-Х⁵, определенные ниже.

X¹ представляет собой аминозащитную группу известного типа, которая обычно используется в ступенчатом синтезе полипептидов, и если Х в пептиде нужного состава представлят собой конкретную ацильную группу, то эта группа может быть использована в качестве защитной группы. Классами -аминозащитных групп, охватываемых X¹, являются (1) защитные группы ацильного типа, такие как формил (For), трифторацетил, фталоил, п-толуолсульфонил (Tos), бензоил (Bz), бензолсульфонил, дитиасукциноил (Dts) о-нитрофенилсульфенил (Nps), тритилсульфенил, о-нитрофеноксиацетил, акрилил (Асr), хлорацетил, ацетил (Ас) и у-хлорбутирил; (2) ароматические защитные группы типа уретана, например бензилоксикарбонил {Z}, флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc) и замещенный бензилоксикарбонил, такой как п-хлорбензилоксикарбонил (CIZ), п-нитробензилоксикарбонил, п-бромбензилоксикарбонил и п-метоксибензилоксикарбонил; (3) алифатические уретановые защитные группы, такие как трет-бутилоксикарбонил (Воc), диизопропилметоксикарбонил, изопропилоксикарбонил, этоксикарбонил и аллилоксикарбонил; (4) циклоалкильные защитные группы типа уретана, такие как циклопентилоксикарбонил, адамантилоксикарбонил и циклогексилоксикарбонил; (5) защитные группы типа тиоуретана, такие как фенилтиокарбонил; (6) защитные группы типа алкила, такие как аллил (Аlу), трифенилметил (тритил) и бензил (Bzl); (7) триалкилсилановые группы, такие как триметилсилан. Предпочтительной -аминозащитной группой является Воc.

X² представляет собой защитную группу для гидроксильной боковой цепи Ser, например Ac, Bz, тритил, 2,6-дихлорбензил (DCB) или бензиловый эфир (Bzl), а предпочтительно Bzl.

X³ представляет собой защитную группу для аминогруппы боковой цепи, которая не удаляется в том случае, если удаляется -аминозащитная группа или другая аминозащитная группа. Иллюстративными примерами являются (1), восприимчивые к действию основания группы, такие как Fmoc, или некоторые другие обладающие слабыми кислотными свойствами, стабильные защитные ароматические группы типа уретана; (2) восприимчивые к тиолу группы, такие как дитиасукциноил (Dts), которые могут быть удалены или отщеплены путем тиолиза; (3) восприимчивые к гидразину группы, такие как фталоил (Pht), который отщепляется посредством гидразинолиза; (4) нуклеофилвосприимчивые группы, такие как о-нитрофенилсульфенил (Nps) и т.п., которые отщепляются под действием тиоацетамида или слабых кислот или их солей; (5) светочувствительные группы, которые отщепляются посредством фотолиза; и (6) группы, селективно удаляемые путем восстановления, такие как Dts. Для метода твердофазного пептидного синтеза (ТФПС) с использованием Воc предпочтительной является группа Fmoc.

X⁴ представляет собой восприимчивую к действию кислоты защитную группу для первичной или вторичной аминогруппы боковой цепи, такую как Z или 2ClZ.

X⁵ может представлять собой D-Ala-, Gly-, Ala-, Agl-, D-Agl-, Agl(Me)- или D-Agl(Me)-NH-[полимерный носитель] или N(Et)-[полимерный носитель]; X⁵ также может быть амидом любой из Gly, или Ala, или D-Ala, (низший алкид)-замещенный амидом, связанный непосредственно с Pro, AzaGly-NH₂ или -ОН (свободная кислота). Если Х₅ представляет собой свободную кислоту, то промежуточное соединение представляет собой нонапептидный фрагмент, который был получен так, что он связан с D- или L-аланинолом с образованием декапептида, имеющего спиртовую группу у С-конца.

Критерием для отбора защитных групп Х²-Х⁴ боковой цепи является то, что на каждой стадии синтеза защитная группа должна быть в основном устойчивой к реагенту в реакционных условиях, выбранных для удаления -аминозащитной группы (предпочтительно, Воc). Эти защитные группы в основном не должны быть отщеплены в условиях присоединения, но должны быть удаляемыми после завершения синтеза нужной аминокислотной последовательности в реакционных условиях, не изменяющих пептидную цепь. Защитные группы, первоначально используемые для остатков в 5- и 6-положении, предпочтительно удаляют, а селективные реакции проводят перед отщеплением конечного пептида от смолы, как описано ниже. Если промежуточный декапептид синтезирован так, как описано выше, то защитные группы X³ могут быть предпочтительно удалены по отдельности.

Если группа Х⁵ представляет собой D-Ala-NH-[полимерный носитель], то амидная связь соединяет D-Ala с полимером ВНА или с полимером МВНА; причем это аналогично случаю, когда на С-конце используется Аgl или D-Agl. Если X⁵ представляет собой N(Et)-[полимерный носитель], то этиламидная связь соединяет Pro с N-алкиламинометиловым полимером (NAAM).

Если необходимо, чтобы N-конец был ацетилирован, то это может быть, например, осуществлено с использованием ацетила в качестве защитной группы X¹ для -аминогруппы -D-Nal в 1-положении путем ее добавления к аминокислоте перед ее присоединением к пептидной цепи; однако эту реакцию предпочтительно осуществлять с использованием пептидного промежуточного соединения на полимере. После деблокирования -аминогруппы и в том случае, если желательно оставить группы боковой цепи защищенными, ацетилирование предпочтительно осуществлять посредством реакции с уксусным ангидридом; альтернативно, эта реакция может быть осуществлена с использованием уксусной кислоты в присутствии диизопропила или дициклогексилакарбодиимида (DIC или DCC), либо посредством какой-нибудь другой подходящей реакции ацилирования, известной специалистам. Аналогичную процедуру осуществляют, если необходимо, чтобы на N-конце присутствовала карбамоильная или замещенная карбамоильная группа. Если деблокированные аминогруппы боковой цепи являются модифицированными, а остаток остается частью пептидной цепи, то эта реакция может быть осуществлена с использованием соответствующего изоцианата в присутствии соответствующего основания, например, N, N-диизопропилэтиламина (DIEA), хотя использование такого основания необязательно. Если необходимо, чтобы в конечном продукте присутствовала незамещенная карбамоильная группа, то деблокированная боковая аминоцепь может взаимодействовать с бензилизоцианатом, п-тозилизоцианатом, триметилсилилизоцианатом или трет-бутилизоцианатом, при этом предпочтительным является трет-бутилизоцианат. С использованием такой стратегии, т-бутильную группу удаляют во время отщепления от полимера, что приводит к удалению карбамоильной группы.

Настоящее изобретение также относится к новому способу получения такого антагониста GnRH, имеющего, например, формулу: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Ноr)-D-4Aph(Ac)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH₂, где указанный способ предусматривает (а) образование промежуточного пептида, имеющего формулу: Boc-D-4Aph(X³)-Leu-ILys(X⁴)-Pro-X⁵, где X³ представляет собой восприимчивую к основанию и восприимчивую к гидразину или восприимчивую к другим соответствующим соединениям защитную группу для аминогруппы; X⁴ представляет собой восприимчивую к кислоте защитную группу для боковой аминоцепи; и X⁵ представляет собой D-Ala-NH-[полимерный носитель]; (b) удаление X³ из D-4Aph для деблокирования первичной аминогруппы боковой цепи этого аминокислотного остатка промежуточного пептида; (с) взаимодействие этой деблокированной первичной аминогруппы боковой цепи с уксусным ангидридом; (d) завершение удлинения цепи с получением промежуточного пептида X¹-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser(X²)-4Aph(X³)-D-4Aph(Ac)-Leu-ILys(X⁴)-Pro-X⁵, где X¹ представляет собой водород или -аминозащитную группу, а X² представляет собой водород или защитную группу для гидроксильной группы остатка Ser; (e) деблокирование -аминогруппы у N-конца и ацетилирование; (f) удаление X³ из 4Арh, и взаимодействие деблокированной первичной аминогруппы с гидрооротовой кислотой; и (g) отщепление любых остаточных защитных групп и/или отщепление от полимерного носителя, входящего в определение X⁵.

Конечную очистку пептида осуществляют с помощью хроматографии, а предпочтительно с использованием ОФ-ВЭЖХ, известной специалистам, см. J. Rivier et al. , J. Chromatography, 288, 303-328 (1984) и Miller & J. Rivier, Biopolymers (Peptide Science), 40, 265-317 (1996).

Предполагается, что антагонисты GnRH настоящего изобретения являются эффективными при концентрациях менее 100 микрограммов на килограмм массы тела при их подкожном введении примерно в полдень дня предтечки для предупреждения овуляции у самок крыс. Для длительного подавления овуляции может оказаться необходимым использовать дозы порядка от 0,1 до 2,5 миллиграммов на килограмм массы тела. Эти антагонисты являются также эффективными для прекращения образования спермы при их регулярном введении млекопитающим-самцам, а поэтому они могут быть использованы в качестве противозачаточных средств. Поскольку эти соединения способствуют снижению уровня тестостерона и, таким образом, снижению либидо (нежелательного последствия у нормальных сексуально активных самцов), то, наряду с антагонистами GnRH, может оказаться предпочтительным вводить компенсирующие дозы тестостерона для достижения азооспермии при сохранении либидо. Эти антагонисты могут быть также использованы для регуляции продуцирования гонадотропинов и половых стероидов, а также при других показаниях для кратковременного или длительного курса лечения, как указывалось выше, и, кроме того, они могут быть использованы в ветеринарии в качестве противозачаточных средств для комнатных домашних животных.

Пептиды, полученные в соответствии с настоящим изобретением, являются хорошо растворимыми при физиологических значениях рН и могут быть получены в виде относительно концентрированных растворов для введения, особенно для подкожных инъекций. Эти пептиды хорошо переносятся организмом, и при их подкожном введении в эффективных концентрациях не имеют тенденции к образованию геля. В основном фармацевтические композиции, включающие в себя такие пептиды и подходящий фармацевтически приемлемый носитель, могут быть введены внутривенно (в/в), внутрибрюшинно (в/б), подкожно (п/к) или т.п. в концентрациях примерно от 0,001 мг до 2,5 мг на кг массы тела в день, при этом достаточной дозой является 0,5 мг/кг/день.

Соответствующим образом защищенные D- или L-гидрооротилсодержащие, карбамоилсодержащие и/или D- или L-имидазолидонкарбонилсодержащие аминокислоты могут быть синтезированы, а затем использованы в пептидном синтезе путем удлинения цепи. Однако в равной степени эффективный синтез достигается путем первоначального введения соответствующим образом защищенных остатков Aph, D-Aph, Amf или D-Amf в нужном положении в промежуточном пептиде, и этот синтез может быть осуществлен выбранным лабораторным методом, где желательно сначала проводить синтез лишь в небольших количествах. Эта последняя стратегия достигается путем деблокирования конкретного остатка (либо сразу; либо позже, во время синтеза), а затем посредством реакции деблокирования аминогруппы боковой цепи с нужным реагентом.

Настоящее изобретение, кроме того, представлено нижеследующими примерами.

Пример 1 Было обнаружено, что пептид, имеющий формулу: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-Lys(Nic)-D-Lys(Nic)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH₂ (антид) обладает очень хорошими биологическими свойствами как антагонист GnRH, поскольку он имеет пептид, который в настоящем описании назван ацилином и который отличается от антида только в 5- и 6-положениях. Авторами изобретения было установлено, что при использовании этих молекул в качестве исходного материала и при создании других заместителей в 5- и 6-положениях или в 5-положении декапептида ацилина могут быть получены антагонисты GnRH, имеющие большую продолжительность биологической активности in vivo. Что касается положений 1-4 и 7-10, то было отмечено, что антид, ацилин и азалин являются абсолютно аналогичными.

Нижеследующий декапептид [4Aph(Hor)⁵, D-4Aph(Cmb)⁶]-антид или [Ac-D-2Nal¹, D-4Cpa², D-3Pal³, 4Aph(Hor)⁵, D-4Aph(Cmb)⁶, Ilys⁸, D-Ala¹⁰]-GnRH был получен методом твердофазного синтеза. Этот пептид имеет следующую формулу: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-гидрооротил)-D-Aph(карбамоил)-Leu-Lys(изопропил)-Pro-D-Ala-NH₂.

Сначала использовали около 0,50 грамма (0,54 ммоль/г) полимера МВНА (Bachem), и Вос-защищенный D-AIB связывали с полимером приблизительно в течение 2 часов в смеси диметилформамида (ДМФ)/СН₂Сl₂ с использованием около 0,65 ммоль Вос-производного и диизопропилкарбодиимида (DIC) и безводного 1-гидроксибензотриазола (HOBt) н качестве активирующих или связывающих реагентов. Остаток D-Ala связывается с остатком МНВА посредством амидной связи.

После присоединения каждого аминокислотного остатка промывку, деблокирование, а затем присоединение следующего аминокислотного остатка осуществляли в соответствии со схемой 1 лабораторного синтеза, приведенной в конце описания, для получения примерно от 0,5 до 1 грамма исходного полимера.

Вышеуказанную схему использовали для присоединения каждой аминокислоты пептида настоящего изобретения после присоединения первой аминокислоты. NBoc-защиту использовали для каждой аминокислоты, присоединяемой в процессе синтеза. получали способом, известным специалистам, например, как подробно описано в патенте США N4234571, этот пептид также поставляется фирмой Synthe Tech, Oregon, США. Первичные аминогруппы боковой цепи 4Aph в 5-положении и D-4Aph в 6-положении защищены Fmoc. Бензиловый эфир (Bzl) предпочтительно используют в качестве защитной группы боковой цепи для гидроксильной группы Ser; однако Ser может быть присоединен без защиты боковой цепи. NBoc-Lys (ipr, Z) используют для остатка в 8-положении.

После присоединения D-4Aph для остатка в 6-положении в виде NBoc-D-4Aph(Fmoc) полученное промежуточное соединение представляло собой: Boc-D-4Aph(Fmoc)-Leu-Lys(ipr, Z)-Pro-D-Ala-NH-[полимерный носитель МВНА]. Затем аминогруппу боковой цепи на остатке в 6-положении модифицируют после первого удаления защиты боковой цепи. Защитную группу Fmoc удаляют путем проведения последовательных обработок 25% пиперидином в ДМФ (10 мл) приблизительно в течение 15 минут (каждую). После промывки пептидополимера ДМФ вновь деблокированную а