Синтетический пептид hiv (варианты), иммуногенная композиция для индукции иммунного ответа против пептидов hiv, диагностический набор для определения hiv-специфичных антител

Синтетический пептид hiv (варианты), иммуногенная композиция для индукции иммунного ответа против пептидов hiv, диагностический набор для определения hiv-специфичных антител

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии и может быть использовано для получения вакцины против HIV инфекции. Синтетический пептид HIV содержит аминокислотную последовательность Т-клеточного эпитопа gag протеина вируса иммунодефицита, выбранного из P24N, P24L, P24M, P24H и P24E, связанную с аминокислотной последовательностью В-клеточного эпитопа петли V3 белка оболочки изолята HIV, содержащую последовательность GPGR, или содержащую гибридную последовательность петли V3 из двух различных изолятов HIV-1, или содержащую консенсусную последовательность петли V3 разных изолятов, или связанную с аминокислотной последовательностью В-клеточного эпитопа белка gp41 изолята HIV, содержащего, в частности ELKDWA. Тетромерная форма синтетического пептида HIV содержит индивидуальные синтетические пептиды с аминокислотной последовательностью Т-клеточного эпитопа белка gag изолята HIV, связанной с последовательностью В-клеточного эпитопа. Иммуногенная композиция, содержащая синтетический пептид, индуцирует иммунный ответ против пептидов HIV. Диагностический набор для определения HIV-специфических антител включает синтетический пептид. Изобретение позволяет разрабатывать синтетические вакцины против HIV. 8 с. и 26 з.п. ф-лы, 3 ил., 14 табл.

Рассматриваемая заявка является частичным продолжением патентной заявки США 08/073378, поданной 9 июня 1993 г.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии и, в частности, относится к синтетическим пептидам, содержащим Т- и В-клеточные эпитопы протеинов вируса иммунодефицита человека.

AIDS является заболеванием, которое является конечным результатом инфицирования вирусом иммунодефицита человека (НIV).

В настоящее время не существует эффективной вакцины, которая могла бы защитить человечество от HIV инфекции, так что разработка эффективной HIV-вакцины совершенно необходима. Ранее, HIV-l частицы, полностью инактивированные за счет химической обработки, вакцинный вектор, кодирующий полный протеин оболочки (gр160) HIV-1, и очищенный рекомбинантный gр120 рассматривались как возможные HIV вакцины. Хотя инактивированные HIV-1 вирусные препараты и вызывают осуществляемую за счет Т-клеток замедленного типа реакцию гиперчувствительности (DTH) у человека, вакцина gр160 и gр120 (варианты рекомбинантных вакцин) индуцируют нейтрализующие вирус антитела, ни один из этих иммуногенов, как было показано, не представляет собой эффективной вакцины против HIV человека (ссылка 1 - см. литературные ссылки, перечисленные в конце описания).

Авторский интерес в HIV вакцинологии состоит в разработке синтетических HIV-1 пептидов для введения в вакцины и предполагает, что вакцинная HIV-1-рекомбинантная субъединица, используемая вместе с этими HIV-1 пептидными вакцинами, может привести к выработке более эффективных иммунных реакций против HIV-1. Для создания синтетических возможных HIV вакцин, иммуногенные вирусные В-клеточные нейтрализующие эпитопы (BE), содержащие высшей степени консервативную последовательность между вирусными изолятами, связывают с функциональной Т-хелперной клеточной детерминантой (детерминантами) (ТAD) для выработки сильной и длительной перекрестно-защитной реакции антител. Кроме того, HIV-специфические Т-лимфоцитные (СТL) эпитопы могут быть включены в синтетические конструкции для создания осуществляемого за счет клеток иммунитета к HIV инфекции.

Специфическая и преимущественная пространственная связь между некоторыми Т- и В-клеточными эпитопами может оказаться необходимой для тандемных эпитопов, для их эффективного процессинга и за счет этого придания им иммуногенности. Таким образом, важно идентифицировать соответствующие Т- и В-клеточные эпитопные последовательности HIV-1 протеинов и объединить их в оптимальной конфигурации, с тем, чтобы как Т-, так и В-клеточная память могла бы эффективно вызывать продуцирование антител нужной специфичности. Как было обнаружено, THD не универсальны и функционируют иммунологически только, если представлены в ассоциации с соответствующими основного комплекса гистосовместимости (МНС) класса 11 антигенами. Существует характеристическая иерархия Т-клеточного эпитопного доминирования. Поэтому для создания эффективной синтетической AIDS вакцины важно использовать наиболее эффективную ТНD различных HIV-1 gр160, gаg, pol и других генных продуктов. Последние исследования показали, что gаg генные продукты могут играть решающую роль в выработке иммунных реакций против HIV инфекции. Таким образом, клиническое развитие AIDS связано с уменьшением циркулирующих антител до gаg р24 протеина, и антитела, вырабатываемые против иммунодоминантного gаg р17 пептида, способны ингибировать HIV-1 инфекцию ин витро (ссылки 2, 3).

В нашей опубликованной международной патентной заявке WО 90/13564 описаны идентификация и характеризация Т-клеточного эпитопа ядерного протеина, р24Е HIV-1, и конструирование синтетических химерических пептидов, содержащих аминокислотную последовательность Т-клеточного эпитопа, связанную с аминокислотной последовательностью В-клеточного эпитопа оболочкового или ядерного протеина HIV-1. За счет связывания В-клеточных эпитопов с Т-клеточными эпитопами вызывается иммунная реакция на В-клеточные эпитопы, тогда как никакой реакции не наблюдается, если В-клеточный эпитоп не связан таким образом. Приведены данные в этой опубликованной заявке в отношении р24 Т-клеточного эпитопа, BE3 эпитопа, ENV эпитопа и V3A эпитопа, все они были получены из HIV-1/LAV изолята, с линкерной последовательностью между этими эпитопами или без нее.

Конкретные конструкции, которые тестированы в опубликованной WO заявке, являются ВЕ3 связанными с С-терминальным концом р24Е за счет прямого связывания, либо с N-терминальным концом р24Е, либо двумя пролиновыми остатками, либо за счет прямого связывания, ENV связанными с N-терминальным концом и связанными с С-терминальным концом р24Е в обоих случаях двумя пролиновыми остатками, и V3А связанными с N-терминальным концом р24 двумя пролиновыми остатками.

V3А последовательность, тестированную в публикации (остатки 308-327) вариабельной петли HIV-1 gр120 из HIV-1/А изолята, делают иммуногенной за счет связывания молекулы с N-концом р24Е без пролинового линкера.

Из патента США 4925784 (Crowl) известно получение за счет рекомбинации протеина слияния, содержащего аминокислоты 15-512 из gаg протеина и 44-140 из env протеина LAV изолята HIV-l /НTLV - 111/, то есть, полипептида или протеина, содержащего 1093 аминокислоты, значительно более длинного, нежели любой синтетический пептид, который не превышает 150 аминокислот в длину, а обычно бывает не более 50 аминокислот в длину. Такие крупные молекулы протеинов слияния описаны как пригодные для диагностических целей и материалов для вакцин.

Оболочковый гликопротеин (env) вируса иммунодефицита человека (HIV) сильно изменчив в независимых изолятах, а также в последовательных изолятах отдельного инфицированного индивидуума. Аминокислотная вариабельность в env сосредоточена в специфических вариабельных участках (в большинстве случаев в поверхностной части gр120, образующейся при протеолитическом вызревании исходного gp160 генного продукта), причем остальные участки менее вариабельны. Однако большинство вариабельных участков часто содержит нейтрализующие эпитопы, так что вирус частично ускользает от иммунной реакции хозяина и устанавливает стойкую инфекцию. Эта вариабельность составляет проблемы для диагностических методик, основанных на специфических взаимодействиях, в которых используют отдельные или смешанные реагенты, обычно используемые для тестирования образцов на наличие HIV-1. Такая вариабельность представляет также проблемы для любой возможной вакцины или иммунотерапии, так как любой подходящий агент должен вызывать реакцию на много штаммов HIV-1.

Таким образом, в выработке иммунной реакции хозяина на множество иммунологически различающихся HIV изолятов существуют две проблемы. Во-первых, любой конкретный хозяин в аутбридинговой популяции будет иметь конкретный HLA гаплотип и, таким образом, по-разному реагирует на конкретный Т-клеточный эпитоп. Во-вторых, антитела могут не распознавать или не нейтрализовать множество иммуногенически различных HIV изолятов и, в частности, тех HIV изолятов, которые были свежесобраны у пациентов как первичные полевые изоляты.

Было бы выгодным обеспечить для диагностических целей для выработки иммунологических реагентов, лечения и вакцинации против HIV, синтетические пептиды, содержащие Т-клеточные эпитопы, на которые большинство хозяев будет реагировать, и В-клеточные эпитопы протеина различных HIV изолятов, включая первичные полевые изоляты.

Настоящее изобретение относится к созданию синтетических пептидов, конкретно, синтетических HIV-1 пептидов, пригодных для создания иммунной реакции против инфицирования HIV или для определения HIV инфекции, где синтетические HIV-1 пептиды содержат Т-хелперную детерминанту (Т-клеточный эпитоп) HIV-1 ядерного протеина, в частности, р24Е аминокислотной последовательности GPKEPFRDYVDRFYK (последовательность ID 2), и аминокислотные последовательности, соответствующие В-клеточным эпитопам HIV-1 протеинов, а именно gр160, gаg и роl протеинов, вакцин против AIDS, содержащих, по крайней мере, один из таких синтетических HIV-1 пептидов, и композиций, процедур и диагностических наборов для детектирования HIV антигенов с использованием таких синтетических HIV-1 пептидов.

Под термином "синтетический пептид" в том смысле, как здесь использован, подразумевают соединение Т-клеточный эпитоп содержащей аминокислотной последовательности с В-клеточный эпитоп содержащей аминокислотной последовательностью для создания синтетической Т-В или В-Т конструкции, используя, например, процесс пептидного синтеза, такой, как описан в примере 1 далее.

Преимущественный HIV-1 штамм, обнаруженный в AIDS популяции Северной Америки и Западной Европы, принадлежит к HIV-1 (MN) изоляту. Поэтому, синтетическая HIV вакцина, способная обеспечить защиту против этого серотипа, может содержать р24Е и THD и нейтрализующие эпитопы HIV-1 (MN) протеинов в качестве В-клеточных эпитопов. Как было показано, два участка или эпитопных кластера во внеклеточной компоненте HIV-1 (МN) оболочкового протеина, gр120, вызывают нейтрализующие антитела против вируса. Один из этих участков является третьей гипервариабельной (V3) петлей, которая охватывает аминокислотные остатки 301-335 gp120 (МN) (ссылка 4). Штаммо- и группо-специфические моноклональные антитела, выделенные у индивидуумов, инфицированных МN изолятом, как было показано, распознают различные ядерные аминокислотные последовательности в "корончатом" участке V3 петли (ссылка 5).

Другой эпитопный кластер gpl20, который вызывает образование нейтрализующих антител, является СD₄ связывающим сайтом. Исследования с моноклональными антителами, выделенными из HIV-1 инфицированных индивидуумов и шимпанзе, показали, что нейтрализующие эпитопы в CD₄ связывающем сайте образованы несоприкасающимися аминокислотными остатками из множественных сайтов gр120.

Более того, результаты, полученные на этих двух типах нейтрализующих антител, показали, что ин витро нейтрализации данной дозы HIV-1 вируса можно достичь с гораздо более низкими концентрациями V3-специфических нейтрализующих моноклональных антител, нежели для реакции против СD₄ связывающего сайта.

При конструировании синтетических пептидов настоящего изобретения, авторы химически синтезировали набор линейных синтетических HIV-1 (МN) пептидов (показано в таблице 1 далее - см. таблицы в конце описательного текста), содержащих различные фланкирующие последовательности, соседние с высоко консервативной последовательностью (GPGR - послед. ID 1) в "корончатом" участке V3 (MN) петли, связанные либо с амино (N-), либо с карбокси (С-) концами ТHD, р24Е (GРКЕРFRDYVDRFYK - послед. ID 2). Кроме того, авторы синтеризовали дополнительные наборы линейных синтетических пептидов (как показано в таблицах VI, VII, IX, Х и XI далее).

Кроме того, были синтезированы и исследованы пять тетрамерных пептидов, как представлено на фиг.1, в которых В-клеточный эпитоп содержащая последовательность была связана с С-концом р24Е, а именно, p24E-V3MN (MAP), содержащая линейную р24Е-V3MN последовательность; СLТВ-34 (MAP), содержащая линейную СLТВ-34 последовательность; CLТВ-36 (MAP), содержащая линейную CLTB-36 последовательность; CLTB-91 (MAP), содержащая линейную СLТВ-91 последовательность; и VP-T-B (MAP), содержащая линейную VP последовательность (см. фиг. 1), каждая VP последовательность, содержащая гибридную V3 последовательность остатков 307-316 и 315-325 HIV-1 (MN) и HIV-1 (BRU) изолятов, соответственно, связана с С-концом р24Е.

В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения предложен синтетический пептид, который содержит, по крайней мере, одну аминокислотную последовательность, содержащую Т-клеточный эпитоп gаg протеина изолята вируса иммунодефицита человека (HIV), связанная по ее N-концу или С-концу, с, по крайней мере, одной аминокислотной последовательностью, содержащей В-клеточный эпитоп V3 петли оболочкового протеина Н изолята, где, если расположены у указанного N-терминального конца, В-клеточный эпитоп содержащая последовательность и Т-клеточный эпитоп содержащая последовательность, связаны непосредственно. Такие синтетические пептиды являются новыми и не были раскрыты в вышеуказанной WO 90/13564.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен синтетический пептид, который содержит, по крайней мере, одну аминокислотную последовательность, содержащую Т-клеточный эпитоп gаg протеина изолята вируса иммунодефицита человека (HIV), связанную по ее N-концу или С-концу, с, по крайней мере, одной аминокислотной последовательностью, содержащей В-клеточиый эпитоп gр41 протеина HIV изолята, содержащего последовательность X₁LKDWX₂, где Х₁ - Е, А, G или Q, а X₂ - А или Т, в частности, ELKDWA (см. ссылку 10), или последовательность, которая способна вызывать образование HIV-специфической антисыворотки и распознавать последовательность X₁LKDWX₂. Такие синтетические пептиды являются новыми и не раскрыты в вышеуказанной WO 90/13564.

Следующий аспект изобретения предлагает синтетическую пептидную молекулу, содержащую множество индивидуальных химерических синтетических пептидов, связанных с образованием мультимерной молекулы, причем каждый из указанных индивидуальных синтетических пептидов содержит аминокислоту, содержащую Т-клеточный эпитоп gаg или оболочкового протеина изолята вируса иммунодефицита человека (HIV), связанную с аминокислотной последовательностью, содержащей В-клеточный эпитоп gаg или оболочкового протеина HIV изолята. Такие мультимерные молекулы являются новыми и не раскрыты в вышеуказанной WO 90/13564.

Далее настоящее изобретение включает антитела, специфические к любому из синтетических пептидов, предложенных здесь, и последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие синтетический пептид, как он здесь предложен, причем последовательности нуклеиновых кислот могут быть включены в вектор экспрессии.

HIV изолят, к которому относится настоящее изобретение, обычно является HIV-1 изолятом. Аминокислотные последовательности синтетических пептидов, содержащих последовательности Т-клеточные к В-клеточные эпитопы содержащих последовательностей могут быть различными HIV-1 изолятами, включая LAV, BRU, МN, SF2, RF, PR1, 1714, 2054, НХВ2, Z6, ВХ08, 111В и SС. Можно также использовать консенсусные последовательности различных изолятов.

В том варианте изобретения, где аминокислотная последовательность, содержащая В-клеточный эпитоп, получена из V3 петли протеина, эта аминокислотная последовательность, предпочтительно, содержит последовательность GX₁GX₂, где Х₁ - Р или Z, а Х₂ - R, К или Q, или последовательность, которая способна вызвать выработку HIV-специфической антисыворотки и распознавать последовательность GX₁GX₂, в частности, последовательность GPGR. Последовательность, содержащая В-клеточный эпитоп, может содержать содержащие В-клеточный эпитоп последовательности V3 петли из, по крайней мере, двух различных HIV-1 изолятов и может содержать консенсусные последовательности V3 петли из, по крайней мере, двух HIV-1 первичных изолятов.

В различных вариантах изобретения Т-клеточный эпитоп содержащая аминокислотная последовательность, предпочтительно, содержит последовательность р24 протеина, например, р24Е, P24N, Р24Z, Р24М и Р24Н, особенно Р24Е. Далее в таблицах I и IX приведены последовательности тех пептидов, которые высоко консервативны среди HIV-1 изолятов. Такие последовательности включают также часть, вариант или мутант любой из выбранных последовательностей, которая сохраняет Т-клеточные свойства выбранной последовательности.

Аминокислотная последовательность, содержащая В-клеточный эпитоп, может быть непосредственно соединена с С-терминальной аминокислотой аминокислотной последовательности, содержащей Т-клеточный эпитоп.

Последовательность, содержащую В-клеточный эпитоп, можно дополнительно связать с другой аминокислотной последовательностью, содержащей HIV Т-клеточный эпитоп, которая может быть последовательностью gаg или оболочкового протеина HIV. Последовательность, содержащую В-клеточный эпитоп, можно также связать с другой аминокислотной последовательностью, содержащей В-клеточный эпитоп HIV. В-клеточные эпитопы gp41 протеина и содержащую X₁LKDWX₂ последовательность можно соединить друг с другом или с аминокислотной последовательностью, содержащей В-клеточный эпитоп V3 петли.

Предложенные здесь миультимерные молекулы могут содержать множество идентичных индивидуальных химерических синтетических пептидов и, предпочтительно, содержат определенные ранее синтетические пептиды.

Далее в настоящем изобретении предложена иммуногенная композиция, содержащая иммуно-эффективное количество, по крайней мере, одного синтетического пептида, предложенного в соответствии с изобретением, или, по крайней мере, одну молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую любой из синтетических пептидов, и его фармацевтически приемлемый носитель. Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ иммунизации хозяина, предпочтительно, человека, который включает введение пациенту иммуногенной композиции, как указано здесь.

Иммуногенная композиция может содержать большинство из синтетических пептидов, выбранных так, чтобы обеспечить иммунную реакцию на множество иммунологически-различных HIV-1 изолятов, и, предпочтительно, выбранных далее так, чтобы обеспечить иммунную реакцию у множества хозяев, по-разному реагирующих на любой конкретный Т-клеточиый эпитоп.

Наиболее подходящий "коктейль" из пептидов, пригодный для получения иммуногенной композиции, включает пептиды, идентифицированные как CTLB-36, CTLB-91 и ВХ08 в приводимых далее таблицах. Эта композиция может далее содержать пептид, идентифицированный как MPK-2, в таблице XI далее.

Иммуногенную композицию можно приготовить в виде, пригодном как для введения через слизистую, так и парэнтерального введения. Иммуногенная композиция может содержать далее, по крайней мере, один другой иммуногенный или иммуностимулирующий материал, в частности, адъювант, такой, как фосфат алюминия или гидроксид алюминия.

Настоящее изобретение распространяется также на диагностические наборы, пригодные для детектирования HIV специфических антител в тестовом образце, причем набор содержит: (а) поверхность, (b) по крайней мере, один пептид, содержащий аминокислотную последовательность, эпитопно специфическую для HIV-специфических антител, иммобилизованную на поверхности, которая предоставлена, (с) средства для осуществления контакта антител и, по крайней мере, одного иммобилизованного пептида с образованием комплекса, и (d) средства для детектирования комплекса.

В другом аспекте изобретения предложен диагностический набор для определения HIV антигена в тестовом образце, причем набор содержит: (а) поверхность, (b) антитело, эпитопно специфическое и перекрестно не реактивное для определенных эпитопов HIV антигена, иммобилизованного на поверхности и выработанного против используемых пептидов, (c) средства для осуществления контакта антител и HIV антигена с образованием комплекса, и (d) средства для детектирования комплекса.

Фиг. 1 представляет структуру тетрамерных пептидов, которые способны вызвать реакции поликлональных антител у мышей и/или морских свинок против HIV-1.

На фиг.2 графически представлены реакции антител у морских свинок, иммунизованных неинфекционнными, нереплицируемыми HIV-1 (111В)-подобными частицами с последующим бустингом НIV-1 пептидным коктейлем, по способу изобретения.

Фиг. 3 представляет графически реакционную способность антисыворотки морских свинок, выработанной после примирования неинфекционными не-реплицируемыми HIV-1 (111B)-подобными частицами и повторной иммунизацией HIV-1 пептидным коктейлем, как представлено в одном варианте изобретения.

В одном из вариантов, настоящее изобретение включает пептиды, содержащие аминокислотную последовательность, соответствующую антигенным детерминантам V3 петли, связанную с N- или С-концами высоко консервативных Т-клеточных эпитопов, р24Е, HIV-1 ядерного протеина, Р24 (как представлено в таблице I). Эти пептиды могут содержать, например, последовательность /3МN-р24Е - последовательность ID 10/, и последовательность /р24Е-V3МN - последовательность ID 9/, соответствующие аминокислотам 311-325 V3 (MN) петли (эта часть подчеркнута, а также в дальнейшем описании подчеркнутые последовательности соответствуют аминокислотным последовательностям, содержащим В-клеточные эпитопы, если нет других указаний), связанные с Н- и С-концами р24Е/ аминокислоты 291-305, HIV-1 (МN) ядерного протеина, р24/ как аминокислотные последовательности, содержащие Т-клеточные эпитопы, соответственно. Эти пептиды могут также содержать, например, последовательности (СLТВ-32 - последовательность ID 13) и (СLТВ-28 последовательность ID 12), соответствующие аминокислотам 309-320 V3 (МN) петли, связанные с N- и С-концами р24Е, соответственно. Эти пептиды могут также содержать последовательности (CLTB-35-последовательность ID 7) и (последовательность ID 6 - СLТВ-34), соответствующие аминокислотам 309-325 V3 (МN) петли, связанные с N- и С-концами р24Е, соответственно. Эти пептиды могут также содержать последовательности (CLТВ-37 - последовательность ID 4) и (СLТВ-36 - последовательность ID 3), соответствующая аминокислотам 307-325 V3 (МN) петли, связанные с N- или С-концами р24Е, соответственно.

Эти пептиды способны вызывать реакции поликлональных HIV-специфических антител у мышей, морских свинок и обезьян (таблицы III и IV).

В другом варианте настоящее изобретение включает мультимерные молекулы, такие, как тетрамерные пептиды (как представлено на фиг. 1), способные вызывать реакции поликлональных антител против HIV-1 у мышей или морских свинок (таблица XIII). Эти мультмерные молекулы могут содержать, например, четыре линейные р24Е- V3MN последовательности (последовательность ID 9), тетрамеризованные с использованием технологии синтеза пептидов за счет лизинового разветвления, обозначенные р24Е-V3МN (МAР-мульти-антигенный пептид). Такие обработки могут также включать, например, четыре лизин-разветвленные СLТВ-34 последовательности (последовательность ID 6), обозначенные СLТВ-34 (MAP). Эти тетрамеры могут также содержать, например, четыре лизин-разветвленные СLТВ-36 последовательности (последовательность ID 3), обозначенные СLТВ-36 (MAP). Эти тетрамеры могут содержать также, например, четыре лизин-разветвленные СLТВ-91 последовательности (последовательность ID 20) и обозначен CLТВ-91 (MAP). Эти тетрамеры могут содержать также, например, четыре лизин-разветвленные VP-T-B линейные последовательности (последовательность ID 15), содержащие гибридную V3 последовательность, VР последовательность (последовательность ID 16), связанные с С-концом p24E (последовательность ID 2). Гибридная V3 последовательность, VP, сама содержит аминокислоты 307-316 (последовательность ID 17) V3 (BRU) петли, связана своим С-концом с N-концом аминокислотной последовательности 315-325 (последовательность ID 18) V3 (VN) петли, которая подчеркнута.

Новые иммуногенные композиции настоящего изобретения содержат пептиды, содержащие иммуногенные Т- и В-клеточные эпитопы HIV, полученные как пептиды, которые связывают специфические антигенные детерминанты из их внеклеточного оболочкового домена, gр120, gр41 и ядерного протеина р24 HIV-1. Эти композиции пригодны для иммунизации для выработки HIV-специфических гуморальных иммунных реакций при введении млекопитающим, что продемонстрировано на мышах, морских свинках и обезьянах, как видно из данных, представленных далее в примерах.

Синтез пептидов Для конструирования HIV иммуногена на основе синтетического пептида, синтезируют химически линейные пептиды, содержащие последовательности из V3 петли и gр41, связанные либо с N-, либо с С-концами пептидов, содержащих Т-клеточные эпитопы, используя автоматизированный AB1 430A твердофазный пептидный синтезатор, как описано в примере 1. Различные комбинации создают в адъюванте Фреунда (FA) или алюминийфосфате (alum) для сравнения их способности индуцировать HIV-специфические иммунные реакции у млекопитающих.

Получают также пять мультимерных молекул, обозначенных p24EV3MN (MAP), CLTB-34-(MAP), СLТВ-36 (MAP), CLTB-91 (MAP) и Т-B-VР (MAP), образованных за счет тетрамеризации с использованием технологии пептидного синтеза с лизин-разветвлением соответствующих линейных тандемных эпитопов, т.е. p24E-V3MN, CLTB-34, CLTB-36, СLТВ-91 и VР-Т-В. Исследуют их способность вызывать HIV-специфические иммунные реакции у млекопитающих при введении в alum или FA.

Иммуногенность линейных HIV пептидов у млекопитающих Способность линейных HIV пептидов вызывать реакции антител у млекопитающих исследуют, иммунизуя мышей, морских свинок или обезьян индивидуальными пептидами, эмульгированными в FA или адсорбированными на alum. После четырех инъекций по 10 мкг каждая (подкожные инъекции) реакции IgG антител определяют с помощью пептидоспецифического ЕIА и ин витро синцитин-блокирующего анализа (таблицы II, III, IV, V, XII).

Четыре различных V3 (МN) пептида, а именно, V3MN, СLТВ-29, СLТВ-55 и СLTВ-56, содержащие различные последовательности, фланкирующие "коронную" часть (GPGR) V3 (МN) петли, но не содержащие р24Е последовательности, оказываются либо вовсе неиммуногенными, либо слабо иммуногенными независимо от того, инъектируют их в FА или на алюминийфосфате (alum) (см. далее таблицу III). Функции носителя р24Е для повышения иммуногенности этих пептидов были показаны в исследованиях, проведенных с соответствующими синтетическими HIV-1 пептидами, содержащими Т-клеточный эпитоп и В-клеточный эпитоп. Так, синтетические HIV-1 пептиды в Т-В ориентации вызывают гораздо более сильные V3 (MN)-специфические реакции антител нежели соответствующие свободные V3 (МN) пептиды или В-Т двойники (см. таблицу III). Поэтому результаты этих исследований показывают, что ориентация V3 (МN) пептида по отношению к Р24Е влияет на иммуногенность синтетических HIV-1 пептидов настоящего изобретения. Сравнение соответствующих титров анти-V3 пептидных антител, определенных в мышиной и морских свинок антисыворотке, выработанной против индивидуальных синтетических HIV-1 пептидов, введенных либо в FА, либо на алюминийфосфате (alum), показывает, что CLTB-36 является наиболее иммуногенным пептидом как для мышей, так и для морских свинок (таблица III).

Иммуногенность СLТВ-36 была продемонстрирована далее по способности этого пептида (приготовленного в адъюванте ISA 51) вызывать сильную реакцию пептидо-специфических антител у приматов (таблица IV), причем эти антитела, как оказалось, нейтрализуют вирус. Замечательно, что как мышиная, так и морских свинок антисыворотка, выработанная против СLТВ-34 и СLТВ-36, оказались способны к перекрестной реакции против V3 пептидов различных HIV-1 серотипов (таблица V далее).

Новое применение р24Е и V3 последовательности для конструирования иммуногенных Т-В пептидов проиллюстрирована далее в исследованиях, проведенных с тремя другими химерическими пептидами, обозначенными р24Е-SР10(А), СLТВ-91, СLТВ-84 и TI-SР10(А)-МN (см. таблицу I). Результаты таблицы III далее показывают, что будучи введенными либо в FА, либо на alum, р24Е-SР10(А) последовательность которого (последовательность ID 19), содержащая N-терминальный конец (последовательность ID 20) V3 (MN) петли, связанных с С-концом Р24Е, оказался способным вызывать хорошие титры СLТВ-56-специфичных антител у морских свинок. р24Е-SP10(A), приготовленный в alum, аналогичным образом, вызывает сильную анти-СLТВ-56 антител реакцию у мышей Ва1b/с (H-2^d). Напротив, T1-SР10(A) МN с последовательностью KQIINMWQEVEKAMYACTRPNYNKRKRIHIGPGRAFYTTK (последовательность ID 21), содержащей тот же N-терминальный конец V3 (MN) петли, связанной с С-концом Т-клеточного эпитопа, T1 (KQEVEKAMYA -последовательность 1 22), описанный в литературе (ссылка 4), как было обнаружено, слабо иммуногенен в морских свинках и мышах Balb/с (Н-2^d). Эти данные предполагают, что р24Е служит более эффективным носителем для N-терминальной последовательности V3 (MN) петли, нежели Tl. Более того, как было обнаружено, Tl способствует повышению иммуногенности CLТВ-56. Этот результат был продемонстрирован высокими титрами CLTB-56-специфичных антител, определенными в образцах сыворотки морских свинок, иммунизованных CLТВ-91 пептидом последовательности KQIINMWQEVEKAMYANKRKRIHIGPGRAFYTTKN (последовательность 1D 23), содержащим CLTB-56, связанный с Т-клеточным эпитопом Tl в FA или alum, и у мышей, которым ввели инъекцию CLTB-91 в alum. Так как CLTB-91 отличается от T1-SP10(A)-MN только в V3(MN) последовательностях, связанных с С-концом Tl, эти данные показывают, что CLTB-56 является лучшим В-клеточным эпитопом, нежели N-терминальный конец V3 (MN) петли, использованный в T1-SP10 (А)-MN. Более того, CLТВ-84, содержащий CLTB-56 последовательность, связанную с С-концом другого Т-клеточного эпитопа, Р24М, включающего последовательность GHKARVLAEMSQVT (последовательность 1D 30) из р24, будучи введенным в alum, как было также обнаружено, обладает высокой иммуногенностью в морских свинках (таблица III).

Пять других наборов HIV-1 синтетических пептидов были получены. В первом наборе пептидов, представленном в таблице IV (последовательность 1D 38-47), V3 последовательности двух различных США клинических HIV изолятов, 1714 (NTRKR1HMGPGRAFYATGD11G-последовательность ID 48), и 2054 (NTRKG1H1GPGRAFYTGE1VGD1RQ-последовательность ID 49), были связаны с С-концами р24Е и Т1 из р24Е-1714 и Т1-2054, соответственно. Кроме того, V3 консенсусная последовательность, PR1 (NTRKS1P1GPGRAFYTTG-последовательность ID 50) консенсусных изолятов из Нью-Йорка и Амстердама, была связана либо с р24Е, Т1 либо с Р24М с образованием, соответствующих Т-В пептидов CLTB-PR1, Т1-PR1 и p24M-PRl. Кроме того, три других Т-В пептида были сконструированы за счет связывания р24Е с V3 последовательностями LA1 (NTRKS1R1QRGPGRAFYTIG-последовательность ID 51), RF (NTRKS1TKGPGRV1YATGQ11G-последовательность ID 52) и гибридной V3 последовательностью МN и RF (NKRKR1H1GPGRV1YATGQ11G-последовательность ID 53) с образованием, соответственно, СLТВ-V3В, CLTB-V3RF и CLTB-HB конструкций.

Второй набор конструкций представлен в таблице VII (последовательности ID 54-68). Конкретные gр41 последовательности, использованные для их конструирования, содержат нейтрализующий эпитоп ELDKWA (последовательность ID 69), описанный в ссылке 6. Результаты, представленные в таблице VIII, показывают, что каждый из этих пептидов распознается нейтрализующим моноклональным антителом человека, 2F5 (ссылка 6).

В таблице IX представлен третий набор пептидов, который был сконструирован (последовательности ID 70-84). Эти конструкции включают использование СLТВ-56 последовательности для связывания либо N-, либо С-конца трех различных Т-клеточных эпитопов из gag, а именно Р24N (QMREPRGSD1AGTTSTL-последовательность ID 70), P24L (EEMMTACQGV GGPGHK-последовательность ID 73) и р24М (GHKARVLAEAMSQVТ-последовательность ID 30, 76) для образования В-Т или Т-В синтетических пептидов, соответственно. Кроме того, консенсусная последовательность, PRl (NTRKS1PlGPGRAFYTTG-последовательность ID 50, 80) изолятов из Нью-Йорка и Амстердама были также связаны либо с N-, либо с С-концом Т-клеточного эпитопа Р24Н (P1VQN1QGQMVHQA1- последовательность ID 79) или Т5 (VKYKVVK1EPLGVAP- последовательность ID 82) с образованием соответствующих В-Т или Т-В пептидов.

Четвертый набор пептидов представлен в таблице Х (последовательности ID 85-92). Были сконструированы пептиды СLТВ-102 и СLТВ-105, которые содержат гибридную последовательность gр41 (ELLELDKWASLWNWF-последовательность ID 93) и СLТВ-56, связанные с С- и N-концом Т-хелперного эпитопа, р24Е, соответственно. CLTB-103 и СLТВ-107 являются пептидами, содержащими СLТВ-56, и ту же gp41 последовательность, связанную с С- и N-концом Р24Е, соответственно. Для конструирования СLТВ-160 и СLТВ-161 были использованы V3 последовательности из консенсуса (LIP) изолятов Лондона, Индии и Парижа, V3 последовательность (THAI) Таиланда. Вирус HIV-1 и консенсус первичных изолятов, обнаруженных в Нью-Йорке и Амстердаме, были использованы для связывания с С-концом Т-клеточного эпитопа, Р24Е и Т1, соответственно.

Пятый набор сконструированных пептидов представлен в таблице XI (последовательности 94-97). Пептид МРК-1 содержит копию gр41 нейтрализующего эпитопа (ЕLDKWA-последовательность ID 98), связанную GPG-линкерной последовательностью по ее N- и С-концам с Т1 и р24Е Т-клеточными эпитопами, соответственно. Конструкция пептида, МРК-2, была такой же, как и у МРК-1, за исключением того, что ориентации Т1 и Р24Е были обратными. Конструкции МРК-3 и MРК-4 включают использование двух копий gр41 последовательности ЕLDКWAS для того, чтобы связать МРК-1 зa счет его N- или С-конца либо с Т-1 и р24Е, либо р24Е и Т1, соответственно.

Иммуногенность HIV-1 пептидного коктейля Иммуногенность коктейля, содержащего пять пептидов настоящего изобретения, оценивают на морских свинках (таблица II). Эти тандемные пептиды состоят из: CLTB-70, содержащего V3 последовательность HIV-1 (SF₂) изолята, связанную с С-концом р24Е, CLTB-72, содержащего 3 последовательность HIV-1 (111В), связанный с С-концом р24Е, СLТВ-74, содержащего V3 последовательность HIV-1 (RF), связанный с С-концом р24Е; CLТВ-76, содержащего V3 последовательность HIV-1 (6), связанную с С-концом р24 и р24Е-GP41C, содержащим gр41 последовательность HIV-1 (BRU), связанную с С-концом р24Е. Результаты, представленные в таблице II, показывают, что животные, иммунизованные коктейлем, приготовленным в FA или alum, демонстрируют сильные реакции антител против каждого из пяти тандемных пептидов.

Поэтому вышеуказанные результаты демонстрируют способность пептидного коктейля (если он адсорбирован на alum) вызывать сильные реакции антител против V3 петель четырех различных HIV-1 изолятов (SF2, 111В, RF и Z6) и gр41 последовательности HIV-1 (BRU).

Исследовали также схему иммунизации с использованием другого коктейля HIV-1 пептидов, состоящего из СLТВ-36, СLТВ-91, СLТВ-84 (представлены в таблице I) и СLТВ-70 (представлен в таблице II) и HIV-1 само-собранной, не реплицируемой, не инфекционной HIV-1 подобной частицы (как указано в WO 91/058564, опубликованной 2 мая 1991). Результаты, представленные на фиг.2, показывают, что морские свинки, предварительно иммунизованные HIV-подобными частицами, эмульгированными в неполном адъюванте Фреунда, и бустер-иммунизованные коктейлем, адсорбированным на alum, вызывают сильные реакции антител против СLТB-56 пептидов. Титр нейтрализующей вирус антисыворотки против МN изолята с последующей второй бустерной инъекцией коклейлем составляет 1,091. Весьма значительно, что результаты, представленные на фиг.3, демонстрируют далее, что антисыворотка, собранная у животных после второй бустерной инъекции пептидным коктейлем, демонстрирует сильную перекрестную реактивность против пептидов, содержащих V3 последовательности нескольких выращенных в лаборатории вирусов и первичных клинических изолятов.

Другие пептидные коктейли могут содержать иммуноэффективное количество любого из раскрытых пептидов, включая синтетический пептид, который содержит, по крайней мере, одну аминокислотную последовательность, содержащую Т-клеточный эпитоп gаg протеина изолята вируса иммунодефицита (HIV) человека, связанный по своему N-концу или С-концу с, по крайней мере, одной аминокислотной последовательностью, содержащей В-кл