Нуклеотидная последовательность вируса классической свиной лихорадки (csfv) (варианты), полипептид csfv, пестивирусная вакцина против csfv, диагностический набор и способ

Нуклеотидная последовательность вируса классической свиной лихорадки (csfv) (варианты), полипептид csfv, пестивирусная вакцина против csfv, диагностический набор и способ

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии, вирусологии и иммунологии и может быть использовано для создания вакцины против вируса классической свиной лихорадки (CSFV). Нуклеотидная последовательность, соответствующая геному вируса классической свиной лихорадки или мутанту, представляет собой нуклеотидную последовательность С-штамма вируса классической свиной лихорадки, указанной в последовательности с идентификационным 1, комплемент или РНК-эквивалент такой нуклеотидной последовательности, или содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность аминокислот 268-494 в последовательности с идентификационным 1 и/или последовательность, несущую мутацию в нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислоты 690-877, или нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислоты 690-1063 последовательности 1, и дополнительно содержащая мутацию в последовательности аминокислот 268-494. Мутацию выбирают из делеций или замещений одной или более аминокислот, изменяющих, по крайней мере, один эпитоп. Полученные полинуклеотиды входят в состав диагностического набора и пестивирусной вакцины против вируса классической свиной лихорадки. Изобретение позволяет диагностировать пестивирусы и разрабатывать вакцины против вируса классической свиной лихорадки. 5 с. и 9 з.п.ф-лы, 5 ил., 8 табл.

Область техники, к которой относится изобретение Предметом настоящего изобретения является способ создания полноразмерной ДНК-копии генома С-штамма, вакцинный штамм классической свиной лихорадки и транскрипция его РНК, которая после трансфекции в клетки вызывает синтез инфекционного вируса С-штамма. Это изобретение включает также (противопестивирусные) вакцины, полученные из С-штамма, а также субъединичные вакцины против пестивируса, средства и методы диагностики пестивирусных инфекций. Настоящее изобретение далее включает способ обнаружения иммуноактивного вещества в образце с помощью конкурентного анализа.

Известный уровень техники Классическая свиная лихорадка является очень заразным заболеванием, часто вызывает гибель свиней от сильной лихорадки и кровотечения и может протекать в острой или хронической форме (Van Dirschot, 1986, Hog cholera, стр. 289-300. В книге Diseases of Swine", Jowa State University Press, Ames ). Вспышки этой болезни периодически возникают в разных странах Европы и других регионах и могут быть причиной больших экономических убытков.

Вакцинация поросят вакцинным штаммом живого ослабленного вируса классической свиной лихорадки, так называемым "китайским" штаммом (С-штамм), защищает свиней от заражения классической свиной лихорадкой (Terpstra and Wensvoort, 1988, Vet. Microbiol, 16: 123-128). Основным недостатком вакцинации поросят обычными вакцинами, одной из которых является С-штамм, является то, что вакцинированных поросят невозможно отличить с помощью серологических методов от поросят, инфицированных диким штаммом вируса классической свиной лихорадки. Однако С-штамм считается одним из наиболее эффективных и безопасных живых вакцин. Включение (сывороточного) маркера в С-штамм дает большие преимущества и значительно улучшает эту вакцину.

Вирус классической свиной лихорадки (СSFV относится к роду Pestivirus вида Flaviviridae (Francki, R.I.B и др., 1991, Flaviviridae, стр. 223-233 в пятом отчете Международного комитета по таксономии вирусов, Archiv. Virol. Suppl. 2, Springer Verlag, Вена). Двумя другими членами рода Pestivirus, которые в структурном, антигенном и генетическом отношении близко связаны с вирусом классической свиной лихорадки, являются вирус вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV ) и вирус болезни Бордера (BDV), поражающий в основном овец (Moennig and Plagemann, 1992, Adv., Uirus Res., 41:53-98; Mооrтаnn и др. , 1990, Virology 177: 184-198; Becher и др., 1994, Virology 198: 542-551).

Геномы пестивирусов содержат молекулу РНК с положительной цепью длиной 12,5 тысяч пар нуклеотидов (Renard и др., 1985, DNА 4:429-438; Moormann and Hulst 1988, Virus. Res. , 11: 281-291; Becher и др., 1994, Virology, 198: 542-551). Однако геномы РНК с положительной цепью нескольких нецитопатогенных штаммов вируса вирусной диареи крупного рогатого скота могут быть гораздо больше ( Meyers и др., 1991, Virology, 180: 602-616; Меуеrs и др., 1992, Virology, 191: 368-386; Qi и др., 1992, Virology, 189: 285-292).

Отличительной особенностью вирусов с геномом РНК с положительной цепью является то, что их геномная РНК является инфекционной, то есть после трансфекции этой РНК в клетки, обеспечивающие репликацию вирусов, образуется инфекционный вирус. Как предполагалось, геномная (вирусная) РНК пестивирусов также является инфекционной (Moenning and Plagemann) 1992, Adv. Virus Res., 41: 53-98).

В настоящее время технология рекомбинантных ДНК делает возможной in vitro транскрипцию клонированной ДНК. Это позволило синтезировать инфекционную РНК in vitro из ДНК-копии генома вируса РНК с положительной цепью. В области молекулярной инженерии хорошо известно, что ДНК в отличие от РНК легко поддается сайт-направленному мутагенезу. Поэтому технология получения синтетической инфекционной РНК в значительной степени расширила исследования в области репликации, вирулентности, патогенеза, рекомбинации РНК, формирования векторов и антивирусной стратегии вирусов РНК с положительной цепью. Однако применение этой технологии может вызывать серьезные проблемы. Они были описаны в недавно опубликованном обзоре Бойера и Наунни, 1994 ( Virology, 198: 415-426). Действительно, нельзя прогнозировать с полной уверенностью успех или неудачу при создании полноразмерной ДНК-копии генома вируса, содержащего РНК с положительной цепью, и при получении синтетической инфекционной РНК из такой полноразмерной ДНК-копии.

Краткое изложение существа изобретения Настоящим изобретением предусматриваются нуклеотидные последовательности, соответствующие геному вируса классической свиной лихорадки, которые содержат, по крайней мере, часть нуклеотидной последовательности С-штамма вируса классической свиной лихорадки, представленной в виде последовательности с идентификационным 1, комплемент или эксивалент РНК такой нуклеотидной последовательности либо их мутанты. Кроме того, предусматриваются дегенеративные нуклетидные последовательности, которые имеют разные нуклеотиды, но кодируют одинаковые аминокислоты. В объем настоящего изобретения входят также полипептиды, закодированные этими нуклеотидными последовательностями, и вакцинные штаммы, геном которых содержит такую нуклеотидную последовательность, в частности штамм рекомбинантного вируса на основе транскриптов полноразмерной ДНК-копии генома С-штамма вируса классической свиной лихорадки.

Как указывалось выше, полезными также являются частичные нуклеотидные последовательности, в частности такие, которые содержат мутацию в структурной области вирусного генома, то есть в нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислоты 1-1063 последовательности с идентификационным 1. Мутация может состоять в замещении соответствующей частью генома другого пестивирусного штамма, замещении одной или нескольких аминокислот или их делеции. Мутация может также представлять собой вставленную или замещенную гетерологичную нуклеотидную последовательность, изменяющую стратегию трансляции нуклеотидной последовательности вируса классической свиной лихорадки или процессинг полипептида, закодированного нуклеотидной последовательностью вируса классической свиной лихорадки. Кроме того, мутация может представлять собой вставленную или замещенную гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, которая вызывает иммунитет против другого патогена; в этом случае последовательность вируса классической свиной лихорадки используется в качестве вектора для гетероиммуногенов.

Настоящее изобретение включает в себя как нуклеотидные последовательности пестивирусного генома в целом, так и их части или мутанты, последовательности которых содержат мутацию в субобласти белка E1, то есть в нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислоты, соответствующие аминокислотам (691-750 или 785-870 последовательности с идентификационным 1, a также полипептиды, закодированные этими нуклеотидными последовательностями. Эти полипептиды являются особенно полезными для защиты животных от пестивирусной инфекции благодаря тому, что их можно использовать в диагностических целях для отличия животных, зараженных дикими штаммами пестивируса, от вакцинированных животных.

Кроме того, в объем этого изобретения входят вакцины, содержащие нуклеотидную последовательность, полипептид или вакцинный штамм, а также диагностические композиции, содержащие нуклеотидную последовательность или полипептид, рассмотренные выше, или антитело, индуцированное против такого полипептида.

Настоящее изобретениие включает в себя также методы и средства диагностики пестивирусных инфекций, в частности такие средства и методы, которые позволяют отличить инфицированных животных от вакцинированных.

Этим изобретением предусматривается также метод определения тестируемых веществ, таких как антитело или антиген, в процессе выполнения иммуноанализа, который разработан на основе теста специфического связывания с использованием иммобилизованного эталонного вещества для специфического связывания и аналогичного меченого эталонного вещества.

Детальное описание изобретения Настоящим изобретением предусматривается полная последовательность кДНК генома РНК "китайского" штамма (С-штамм; заявка на европейский патент 351901) вируса классической свиной лихорадки. Это позволяет создать полноразмерную ДНК-копию этой последовательности, на основании которой можно транскрибировать синтетическую РНК, которая после трансфекции соответствующих клеток, в частности клеток SК6-М ( Kasза Z. и др., 1972, Res., Vet., Sci., 13: 46-51; заявка на европейский патент 351901), вызывает синтез инфекционного вируса С-штамма. Ниже приводится описание этого открытия с целью получения вакцин на основе модифицированного С-штамма, например вакцин, содержащих (серологический) маркер. Хотя это изобретение иллюстрируется в отношении одного штамма вируса классической свиной лихорадки, оно также полезно и применимо для пестивирусных штаммов в результате обмена специфических геномных сегментов, описываемых ниже, между другим пестивирусом и С-штаммом вируса классической свиной лихорадки или путем создания "инфекционной" ДНК-копии другого пестивируса.

Нуклеотидная последовательность ДНК-копии геномной РНК С-штамма представлена в виде последовательности с идентификационным 1. Все цифры, указанные в тексте, относятся к этой последовательности и могут незначительно отличаться от последовательностей других пестивирусов. Эта нуклеотидная последовательность содержит 12311 нуклеотидов и одну большую открытую рамку считывания, состоящую из 11694 нуклеотидов, кодирующих полипротеин из 3898 аминокислот. Размер открытой рамки считывания аналогичен размеру геномов штаммов Brescia ( Moormann и др., 1990, Virology, 177: 184-198) и Alfort (Meyers и др., 1989, Virology, 171: 555-567) вируса классической свиной лихорадки.

Открытая рамка считывания начинается с ATG в положениях нуклеотидов 374-376 и заканчивается TGA-кодоном в положениях нуклеотидов 12068-12070. Длина 5'-концевой некодирующей области, предшествующей открытой рамке считывания, составляет 373 нуклеотида. Эта последовательность представляет собой весьма консервативную область в штаммах Brescia, Alfort и С (фиг. 2), а прогнозируемая вторичная структура этой области сходна с аналогичной структурой 5'-концевой некодирующей области вируса гепатита С ( Brown и др. 1992, Nucleic Acids Res., 20: 5041-5045), который является еще одним членом семейства Flaviviridae. Было установлено, что 5'-концевая некодирующая область вируса гепатита С содержит аминоацильный сайт внутренней рибосомы ( Tsukiyama-Kohara и др., 1992, J. Virol., 66:1467-1483). Такие сайты имеют важные регуляторные функции (Agоl. , 1991. Adv. Virus, Res., 40: 103-180). Аналогия с вирусом гепатита С показывает, что 5'-концевая некодирующая область вируса классической свиной лихорадки также содержит аминоацильный сайт внутренней рибосомы, который расположен между нуклеотидами 124 и 374 последовательности с идентификационным 1 и представляет собой важный регуляторный элемент. Аминоацильный сайт внутренней рибосомы можно использовать в качестве сайта для мутации с целью ослабления вируса, а также для изменения стратегии трансляции открытой рамки считывания.

Второй важной областью, регулирующей репликацию пестивирусов, является 3'-концевая некодирующая область. При сравнительном анализе последовательности С-штамма с последовательностями штаммов Bresciа и Alfort в этой области была обнаружена последовательность из 13 нуклеотидов, характерная только для С-штамма (фиг. 2В). Эта уникальная последовательность TТТТСТТТТТТТТ занимает положения нуклеотидов 12128-12140 в последовательности с идентификационным 1. Это единственная вставка из более чем двух нуклеотидов в ряду, обнаруженная в последовательности С-штамма, по сравнению с последовательностями штаммов Brescia и Alfort. В остальном последовательности в 3'-концевых некодирующих областях трех штаммов вируса классической свиной лихорадки являются достаточно гомологичными. Общая гомология последовательностей в этой области оказывается ниже при сравнении штаммов вируса классической свиной лихорадки и вируса вирусной диареи крупного рогатого скота. Тем не менее вполне очевидно, что последовательность ТТТТСТТТТТТТТ С-штамма также отсутствует в последовательностях 3'-концевых некодирующих областей штаммов вируса вирусной диареи крупного рогатого скота. Поэтому последовательность TTTTCTTTTTTTT является характерной для генома С-штамма и может служить великолепным маркером для специфической последовательности С-штамма. Эту последовательность можно использовать в качестве основы для нуклеотидных зондов и для определения последовательностей с целью идентификации специфических пестивирусов С-штамма. Поэтому можно сделать вывод о том, что все пестивирусные штаммы, имеющие эту последовательность в 3'-концевой некодирующей области (необязательно в таком же положении, как в С-штамме), относятся к С-штамму и входят в объем настоящего изобретения.

Важным параметром инфекционности транскриптов ДНК-копии генома пестивируса является аминокислотная последовательность. В этой связи необходимо рассмотреть два аспекта, касающиеся клонирования и секвенирования РНК-содержащих вирусов вообще и пестивирусов в частности. Во-первых, частота мутации генома вирусов, содержащих РНК с положительной цепью, является достаточно высокой (около 110⁴ нуклеотидов во время репликации), поэтому ни один из вирусных препаратов или препаратов вирусной РНК не является клональным в отношении вирусной РНК, которую он содержит. Среди этих молекул РНК могут быть также молекулы, не являющиеся инфекционными. Если появление таких молекул было вызвано незрелыми стоп-кодонами в большой открытой рамке считывания, то их можно легко распознать. Кроме того, можно распознать мутации в активных сайтах вирусных ферментов или известных структурах белков. Однако, если взаимосвязь между аминокислoтной последовательностью, функцией или структурой белка неизвестна, что характерно для большинства пестивирусных белков, невозможно предсказать, какая аминокислота является правильной, а какая нет. Во-вторых, мутации могут возникнуть во время синтеза кДНК. Поэтому геном С-штамма клонировали и секвенировали дважды независимо друг от друга. Области с несходными последовательностями клонировали и секвенировали не менее трех раз (ср. фиг. 1). Последовательность, которая дважды встречалась в определенном положении, считалась правильной. Необходимость такого подхода для синтеза инфекционных транскриптов ДНК-копии генома С-штамма подтверждается следующим открытием.Полноразмерная ДНК-копия pPRKr1c-113, полученная после второй серии клонирования и секвенирования (фиг. 3), оказалась неинфекционной. После клонирования и секвенирования областей с несходными последовательностями кДНК-клонов, полученными во время первой и второй серии, было обнаружено пять аминокислот, которые отличались в полноразмерной копии второй серии клонов, поэтому последовательность С-штамма была признана правильной. После коррекции этих пяти кислот в pPRKf1c-113 был получен клон pPRKf1c-133, который синтезировал инфекционные транскрипты (фиг. 4). Пять различий находятся в положениях аминокислот 1411 (Vаl --> А1а); 2718 (G1у --> Аsp); 2877 (Val --> Met ); 3228 (Leu --> Met ); 3278 (Туr --> Glu). Аминокислоты, закодированные в этих положениях последовательностью кДНК, которая является неинфекционной, указаны до стрелки, а аминокислоты, находящиеся в тех же положениях инфекционной копии, приведены после стрелки (последовательность с идентификационным 1). Станет.ли изменение каждой аминокислоты в отдельности причиной отсутствия инфекционности ДНК-копии С-штамма, необходимо определить путем анализа инфекционности транскриптов с отдельными мутациями каждой из этих пяти аминокислот. Однако полученный результат показывает, что даже небольшие различия в аминокислотной последовательности могут иметь важное значение для инфекционности транскриптов ДНК-копии генома С-штамма. Он также свидетельствует о том, что создание инфекционных транскриптов копии последовательности пестивируса может оказаться на практике невозможным из-за небольших различий в последовательностях (даже на уровне одной аминокислоты), которые могут оказаться незамещенными.

Мутанты, полученные на основе С-штамма, которые пригодны для получения вакцины (маркера), входят в объем настоящего изобретения. Они могут включать в нуклеотидной последовательности с идентификационным 1 такие мутации, как делеции, инсерции, (несколько) мутаций нуклеотидов и вставленные и/или замененные геномные фрагменты, взятые из других пестивирусных штаммов.

Последовательность С-штаммов может быть поделена на четыре области, пригодные для мутации и/или обмена. Первой областью является 5'-концевая некодирующая последовательность, охвтывающая нуклеотиды с 1 по 373. Вторая область кодирует структурные белки N^pro-C-E2-E3-Е1 и включает в себя нуклеотиды с 374 по 3563. Третья область кодирует неструктурные белки и охватывает нуклеотиды с 3564 по 12068. Четвертая область представляет собой 3'-концевую некодирующую последовательность, которая охватывает нуклеотиды с 12069 по 12311.

Одна область, которая является особенно пригодной для получения вакцин-маркеров С-штамма, представляет собой геномную область, кодирующую структурные белки N^pro-С-Е2-Е3-Е1. Эта область расположена между аминокислотами 1 и 1063 в последовательности с идентификационным 1. Предпочтительные субобласти этой части генома определяются следующими аминокислотными последовательностями 1-168 (N^pro), 169-267 (С), 286-494 (Е2), 495-689 (Е3) и 690-1063 (E1) или их частями. Например, N-концевую антигенную часть области, кодирующей белок Е1 С-штамма и охватывающей аминокислоты 690-877, заменяли соответствующей областью белка Е1 штамма Brеsсiа. (фиг. 4, pPRHf1c-h6). Синтезированное производное С-штамма является инфекционным, и его можно отличить от штамма дикого типа и от штамма Brеsсiа посредством реакции со специфическими моноклональными антителами С-штамма и штамма Brеsсiа, воздействующими на белки Е1 и Е2; например, полученный С-штамм подвергали взаимодействию с моноклональными антителами, специфичными для белка Е1 штамма Brеsсiа (таблица 1). Антигенные свойства нового мутанта изменились по сравнению с родительским вирусом, и это свидетельствует о том, что замена N-концевой половины белка Е1 С-штамма аналогичной областью другого штамма вируса классической свиной лихорадки является одним из возможных способов создания вакцины-маркера С-штамма. Однако это изобретение не ограничивается заменой N-концевых половин белка Е1 в С-штамме и других штаммах вируса классической свиной лихорадки. N-концевые половины белка Е1 из любого другого пестивирусного штамма можно заменить соответствующими частями белка Е1 С-штамма. В этом отношении особенно полезными являются последовательности белка Е1 пестивирусных штаммов, которые выделены у поросят, но относятся к антигенной группе, в которую не входит С-штамм. Примерами таких штаммов, которые выбирают на основе перекрестной нейтрализации, являются штаммы "van ЕЕ, " Stam ", "SFUK 87", " Wisman" и "5250" (Wensvoort и др., 1989, Vet, Microbiol., 20: 291-306; Wensvoort 1992. В отчете о заседании национальных лабораторий по исследованию свиней в Европейском Совете. 16-17 июня 1992 г. V1/4059/92-EN(PV ET/EN/1479), 1992, стр. 59-62).

Было установлено, что N-концевая половина белка Е1 содержит три четко выраженных антигенных домена А, В и С, которые расположены в разных частях белка Е1, причем каждый из них взаимодействует с сильно нейтрализующими моноклональными антителами (Wensvoort, 1989, J. Gen. Virol., 70: 2865-2876; Van Rign и др., 1992, Vet. Microbiol., 33: 221-230; Van Rign и др., 1993. J. Gen. Virol. , 74: 2053-2060). Эпитопы, сохраняемые в 94 протестированных штаммах вируса классической свиной лихорадки, картированы в домене А, в то время как эпитопы доменов В и С не сохраняются (Wensvoort 1989, J. Gen. Virol. , 70: 2865-2876). Картирование эпитопов гибридами генов Е1 штаммов Brescia и C (Van Rign и др., 1992, Vet. Microbiol., 33:221-230) и делеционными мутантами белка Е1 штамма Brescia, позволяет предположить, что домены А и В + С образуют два различных антигенных комплекса в N-концевой половине белка El (Van Rijn и др., 1993, J. Gen. Virol., 74: 2053-2060). Это предположение было далее подтверждено открытием того, что шесть цистеинов, находящихся в положениях 693, 737, 792, 818, 828 и 856 N-концевой половины Е1, имеют важное значение для правильной укладки белка Е1. Однако, по крайней мере, Cys 792 не оказывает существенного влияния на инфекционность штамма Brescia, поскольку мутант этого вируса, устойчивый к воздействию моноклонального антитела, был выделен в случае мутации Суs --> Arg в этом положении (Van Rijn и др., 1993, выступление на 9-м Международном конгрессе по вирусологии 8-13 августа, Глазго, Шотландия).

Если небольшие изменения аминокислотной последовательности могут встать причиной утраты инфекционности РНК С-штамма (см. пример 2), то замена цистеина в положении 792 свидетельствует о том, что замена аминокислоты в положении, которое в гораздо меньшей степени подходит для модификации без утраты функции, может привести к получению жизнеспособного вирусного мутанта. Таким образом, влияние замены определенной аминокислоты на свойства вируса необходимо определять эмпирическим путем для каждой аминокислоты в последовательности штамма С. Это еще раз показывает, что на основе ранее опубликованных данных невозможно определить последовательности-мишени для модификации С-штамма, например для создания вакцины-маркера.

Важное значение для создания вакцин-маркеров С-штамма имеет возможность дифференцировать серологическими методами вакцинированных свиней и свиней, инфицированных диким штаммом вируса классической свиной лихорадки. Ранее было показано, что вектор живого ослабленного вируса псевдобешенства, экспрессирующий белок Е1, или иммуноаффинный очищенный белок Е1, экспрессированный в клетках насекомых с помощью бакуловирусного вектора, вызывает защитную иммунную реакцию у свиней против холеры (WO 91/00352; Van Rijn и др., 1991, J. Virol. , 65: 2761-2765; Hulst и др., 1993, J.Virol., 67:5435-5442). Было установлено, что мутанты белка Е1 с удаленным доменом А или удаленными доменами В + С (фиг. 5) также вызывают защитную иммунную реакцию у свиней против холеры (таблица 2). Это свидетельствует о том, что защитный иммунитет, вызванный вакцинным штаммом, не зависит от нейтрализирующих антител против доменов А и В + С. Поэтому мутанты пестивирусного штамма, у которых заменен или мутирован только домен А или только домены В + С либо их части с помощью соответствующей области другого пестивируса, предпочтительно, но необязательно пестивируса, выделенного у свиней, который относится а другой антигенной группе по сравнению с С-штаммом (примеры приведены выше), также входят в объем настоящего изобретения. Область белка Е1, включающая домен А и пригодная для обмена или мутации, расположена между аминокислотами 785 и 870. Кроме того, могут быть заменены или мутированы части этой области, например субобласти, расположенные между аминокислотами 785 и 830, а также между аминокислотами 829 и 870. Область белка Е1, включающая домены В + С и пригодные замены или мутации, расположены между аминокислотами 691 и 750. Могут быть также заменены или мутированы части этой области, например субобласти, расположенные между аминокислотами 691 и 719, а также между аминокислотами 717 и 750.

У животных, зараженных пестивирусами, вырабатываются антитела против белка Е2 (Kwang и др., 1992, Vet. Microbiol., 32: 281-292; Wensvoort, неопубликованные наблюдения). Поэтому второй областью, пригодной для создания вакцины (маркера) путем мутации (делеций, инсерций, точковых мутаций) или замены соответствующего генетического материала пестивирусом с другими антигенами или пестивирусом, относящимся к другой антигенной группе, является область, кодирующая белок Е2.

С-штамм можно также использовать в качестве вектора для инсерций или экспрессии гетерологичного генетического материала (последовательностей). В случае синтеза вектора гетерологичный генетический материал, введенный в С-штамм, служит для изменения стратегии трансляции большой открытой рамки считывания и процессинга полипротеина, закодированного этой открытой рамкой считывания. Примером последовательности, пригодной для изменения стратегии трансляции большой открытой рамки считывания является последовательность, определяющая аминоацильный сайт внутренней рибосомы (Duke и др., 1992, J.Virol. , 66: 1602-1609, и приведенные здесь противопоставленные материалы). Примером последовательности, пригодной для изменения процессинга полипротеина, является сигнальная последовательность, определяющая транслокацию белков, экспортированных из клетки или введенных в мембраны через мембрану эндоплазматического ретикулума ( Blobel, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 77: 1496-1500; Kreil, 1981, Annu. Rev. Biochem., 50: 317- 348). Сигнальные последовательности расщепляются с помощью клеточных сигнальных пептидаз. Однако последовательности, кодирующие сайты расщепления вирусных протеаз, можно также использовать для изменения процессинга полипротеина.

Последовательности, которые были введены и экспрессированы вектором С-штамма, можно использовать в качестве маркера для идентификации вакцинированных свиней или для их защиты от патогена, из которого была взята гетерологичная инсерцированная последовательность. Последовательности-маркеры предпочтительно являются антигенными и относятся к микроорганизмам, не реплицирующимся в организме свиней. Они могут кодировать известные полные генные продукты (например, белки капсида или оболочки) или их антигенные части (например, эпитопы). Последовательности-маркеры предпочтительно получают из вирусов, относящихся к следующим семействам: Adenoviridae, Arenaviridae, Arteriviridae, Bunyaviridae, Caliciviridae, Circoviridae, Coronaviridae, Flaviviridae, Hepadnaviridae, Herpesviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Papovaviridae, Rhabdoviridae, Parvoviridae, Poxviridae, Picornaviridae, Reoviridae, Retroviridae и Togaviddae.

Однако последовательности-маркеры могут также кодировать искусственные антигены, не встречающиеся в природе, или гистохимические маркеры, подобные -галактозидазе Escherichia coli, дегидрогеназе спирта Drosophila, щелочной фосфатазе плаценты человека, люциферазе светляков и хлорамфеникол-ацетилтрансферазе.

Гетерологичный генетический материал, кодирующий один или несколько белков, создающих защитный иммунитет против болезни, вызываемой патогеном, соответствующим гетерологичному генетическому материалу, можно получить из других пестивирусных штаммов, в том числе последовательностей указанных выше штаммов, парвовируса свиней, респираторного коронавируса свиней, вируса инфекционного гастроэнтерита, вируса респираторного синдрома свиней (вирус Лелистада, европейский патент 92200781.0), вируса болезни Ауески (вирус ложного бешенства), вируса эндемической диареи свиней и таких бактерий, как Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Actinobacillus pleuropneumoniae, Streptococcus suis, Treponema hyodysenteria, Escherichia coli, Leptospira, и микроплазматы, такая как M. hyopneumoniae и М. lyorhinis.

Сайты, пригодные для инсерции гетерологичных последовательностей в С-штамме, но не являющиеся единственно возможными, расположены между аминокислотными остатками 170 и 171, между остатками 690 и 691 и между остатками 691 и 692 и указаны в последовательности с идентификационным 1.

Настоящее изобретение включает в себя также диагностические тесты, которые можно использовать для отличия свиней, вакцинированных вакциной-маркером или субъединичной вакциной, содержащей (мутированный) белок Е1 и/или (мутированный) белок Е2, от свиней, зараженных диким штаммом пестивируса. Приемлемые формы таких диагностических тестов описываются в примерах 4 и 5. Обычный неизбирательный твердофазный иммуноферментный анализ (ELISА) вируса классической свиной лихорадки выполняли с использованием белка Е1 в качестве антигена при выполнении комплексной треппинг-блокировки в соответствии с описанием, приведенным Венсвортом и др., 1988 (Vet. Microbiol., 17: 129-140). В прототипном твердофазном иммуноферментном анализе с комплексной трэппинг-блокировкой (CTB-ELISA), который известен также как твердофазный иммуноферментный анализ с блокировкой в жидкой фазе или твердофазный иммуноферментный анализ с двухслойным иммуносэндвичем, используют два моноклональных антитела, выработанных против белка Е1 штамма Brescia вируса классической свиной лихорадки. Эпитоп для моноклонального антитела b3, который расположен в домене А, сохраняется в штаммах вируса классической свиной лихорадки, в то время как эпитоп моноклонального антитела b8, находящегося в домене С, не сохраняется (Wensvoort, 1989, J. Gen. Virol., 70: 2865-2876). Твердофазный иммуноферментный анализ с комплексной трэппинг-блокировкой является чувствительным, надежным методом и позволяет детектировать специфические антитела вируса классической свиной лихорадки, инфицированных пестивирусом. Таким образом, с помощью этого анализа можно отличить свиней, зараженных штаммом вируса классической свиной лихорадки, от свиней, инфицированных, например, штаммом вируса вирусной диареи крупного рогатого скота. Однако с помощью этого теста нельзя отличить свиней, инфицированных диким штаммом вируса классической свиной лихорадки, от свиней, вакцинированных С-штаммом. Кроме того, этот анализ не пригоден для использования с субъединичной вакциной Е1 независимо от того, является ли она живой или инактивированной.

Один тест в соответствии с настоящим изобретением представляет собой модифицированный твердофазный иммуноферментный анализ с комплексной трэппинг-блокировкой на основе одного моноклонального антитела, например b3. Такой твердофазный иммуноферментный анализ с комплексной трэппинг-блокировкой на основе одного моноклонального антитела, которое используется для связывания антигена с поверхностью планшета для выполнения твердофазного иммуноферментного анализа, а также для конкуренции с дикой сывороткой, до сих пор не описывался в научной литературе и является неотъемлемой частью настоящего изобретения. Теперь, когда известен основной принцип этого теста, его можно успешно применять для создания диагностических наборов для детектирования других антител, в том числе антител против других вирусов или других болезней, либо антител, которые являются индикаторами других состояний организма человека или животного. Поэтому это открытие является полезным для всех твердофазных иммуноферментных анализов или подобных анализов с применением комплексной трэппинг-блокировки, которые разрабатываются на основе одного моноклонального антитела и димеризованного или мультимеризованного антигена. Представленный в заявке метод тестирования применим также для определения других членов пар молекул связывающихся партнеров, таких как активаторы/рецепторы, ферменты/ингибиторы и другие, в которых один из партнеров имеет, по крайней мере, два одинаковых сайта связывания.

Таким образом, этим изобретением предусматривается также метод определения наличия тестируемого вещества (например, антитела), способного избирательно связываться с сайтом связывания партнера (например, антиген), на основе конкуренции тестируемого вещества с измеряемым количеством эталонного вещества (антитела), способного избирательно связываться с сайтом связывания партнера, который включает в себя 1) контактирование образца с (a) эталонным веществом (антителом), связанным с твердым носителем, (b) связывающим партнером (антигеном) эталонного вещества, молекулой такого партнера, содержащей, по крайней мере, два одинаковых сайта связывания для эталонного вещества, и (c) эталонным меченым веществом (антителом); 2) измерение степени отделения меченого вещества от носителя.

Например, связывающим партнером (антигеном) для эталонного вещества (антитела), содержащим, по крайней мере, два одинаковых сайта связывания, является димер связывающего партнера (антигена) с эталонным веществом.

На основе такого же принципа создан метод определения наличия тестируемого вещества (антитела), имеющего, по крайней мере, два одинаковых сайта связывания в одной молекуле, которые предназначены для связывания со связывающим партнером (антителом), который включает в себя: 1) контактирование образца с (а) связывающим партнером (антителом), связанным с твердым носителем, и (b) связывающим меченым партнером (антителом); 2) измерение степени связывания меченого вещества с носителем.

В этих методах антитела и антигены приводятся только в качестве примера; они могут быть заменены молекулами связывающихся партнеров.

Настоящим изобретением далее предусматривется диагностический набор, содержащий: a) эталонное моноклональное антитело, связанное с твердым носителем, b) эталонное моноклональное меченое антитело и вариантно с) комплекс антигена с эталонным антителом, содержащий по крайней мере, два одинаковых сайта связывания для эталонного антитела, или комплекс компонентов (а) и/или (b) и (с), а также другие компоненты, необходимые для выполнения конкурентного иммунологического анализа.

Этот метод пригоден для дифференциального диагностического тестирования с использованием субъединичной вакцины Е1, в которой удален один или несколько эпитопов белка Е1, например домен А. Этот тест можно применять с субъединичным белком Е1, в котором домен А был подвергнут мутации, в результате которой антитела, выработанные против такого мутированного домена А, не конкурируют с моноклональным антителом b₃ в отношении эпитопа этого антитела. Кроме того, этот тест можно применять с модифицированным С-штаммом или другими вакцинными штаммами вируса классической свиной лихорадки, в которых домен А был заменен доменом пестивируса, относящимся к другой антигенной группе так же, как и вирус классической свиной лихорадки (см. выше), или был подвергнут мутации, в результате которой антитела, воздействующие на этот домен, не конкурируют с моноклональным антителом b₃ в отношении эпитопа этого антитела. Хотя этот тест описывается и рассматривается в примерах для домена А белка Е1, аналогичный тест на оcнове одного моноклонального антитела b₈ можно использовать вместе с вакциной, у которой удалены домены В + С или домен С либо домены В + С или домен С заменены аналогичными доменами пестивируса, относящегося к другой антигенной группе, как и вирус классической свиной лихорадки (см. выше), либо домены В + С или домен С были мутированы так, что антитела, выработанные против этих доменов, не конкурируют с моноклональным антителом b₈ в отношении эпитопа этого антитела. Этот тест иллюстрируется на основе моноклонального антитела b₃ или моноклонального антитела b₈ штамма Brescia. Однако этот тест можно успешно применять с другими моноклональными антителами, направленными против домена А или доменов В + С белка Е1 штамма Brescia или против домена В или доменов В + С любого другого штамма вируса классической свиной лихорадки, а также с моноклональными антителами, выработанными против аналогичных доменов в белке Е1 любого другого пестивируса. Этот тест можно также выполнять на основе эпитопов белка Е2 (см. пример 5). Антигены, используемые в (модифицированных) твердофазных иммуноферментных анализах с комплексной трэппинг-блокировкой по настоящему изобретению, предпочтительно являются димерами или мультимерами белка Е1 (плюс или минус 3'-концевая трансмембранная область) или белка Е2 (см. пример 5) штаммов вируса класс