Мультиспецифическая или биспецифическая молекула (варианты), способ уничтожения или уменьшения количества клеток- мишеней в организме субъекта, способ лечения субъекта, инфицированного патогеном и способ вакцинации субъекта

Мультиспецифическая или биспецифическая молекула (варианты), способ уничтожения или уменьшения количества клеток- мишеней в организме субъекта, способ лечения субъекта, инфицированного патогеном и способ вакцинации субъекта

Реферат

 

Изобретение относится к медицине. Сущность составляют мультиспецифические соединения, содержащие по меньшей мере одну связывающую детерминанту, которая связывает Fc-рецептор на эффекторной клетке. Другая связывающая детерминанта связывает один или более антигенов на клетке-мишени, например продукт протоонкогена Neu/Her-2, или рецептор эпидермального ростового фактора на раковых клетках, или антигены Candida на инфицированных клетках. Примерами являются биспецифические и триспецифические антитела. Предложено терапевтическое и профилактическое применение указанных соединений. Технический результат - множественная специфичность препарата для лечения рака и патогенных инфекций. 5 с. и 14 з.п.ф-лы, 28 ил.

Область техники, к которой относится изобретение Изобретение относится к иммунологии, в частности к терапевтическим соединениям с множественной специфичностью (мультиспецифическим соединениям), в частности, содержащим антитела к Fc-рецептору, которые могут быть использованы для лечения рака или патогенных инфекций.

Уровень техники Рецепторы Fc-фрагментов иммуноглобулинов являются важными при запуске многих защитных функций моноцитов, макрофагов и полиморфонуклеарных клеток. Были широко исследованы IgG-рецепторы (Fc-рецепторы или FcR) на данных клетках и были сконструированы биспецифические молекулы, направленные на данные рецепторы (см., например, Европейский патент No 0255249 под названием "Моноклональные антитела к Fc-рецептору иммуноглобулина G на человеческих мононуклеарных фагоцитах", совладельцами которого являются Заявители). Кроме того, клинические свойства биспецифических молекул (BsAb), которые обладают специфичностью в отношении FcR и антигена HER-2/neu, которые обнаружены на клетках рака молочной железы или яичников, указывают на то, что данные молекулы являются как безопасными, так и эффективными (см. статью Valone Frank H. и соавт., 1995, J. of Clin. Oncol., 13(9):2281-2292).

Рс-рецепторы IgA-рецепторов (FcR или CD89) способны также стимулировать функции эффекторных клеток. Связывание лиганда с Fс-рецепторами запускает фагоцитоз и обусловленную антителами цитотоксичность клеток у лейкоцитов и FcR-несущих клеточных линий. Fc-рецепторы могут также действовать совместно с IgG-рецепторами на эффекторных клетках для усиления фагоцитоза клеток-мишеней. Получены моноклональные антитела классов IgM (см. статью Shen L. и соавт., 1989, J. Immunol., 143:4117) и IgG (см. статью Monteiro R. C. и соавт.,1992, J. Immunol., 148:1764) против FcR.

IgA имеется в большом количестве в организме человека (см. статью Кеrr М.А., 1990, Biochem. J., 271:285-296). Был идентифицирован и охарактеризован единственный класс Fc-рецепторов IgA, FcRI или CD89, который связывает мономерный IgA (см. статьи Albrechtsen M. и соавт., 1988, J. Immunol., 64:201; Monteiro R. C. и соавт., 1990, J. Exp. Med., 171:597). FcRI первично конститутивно экспрессируется в цитотоксических иммунных эффекторных клетках, включая моноциты, макрофаги, нейтрофилы и эозинофилы (см. статью Morton H.C. и соавт., 1996, Critical Reviews in Immunology, 16:423). Описана экспрессия FcRI на субпопуляции лимфоцитов (см. статью Morton H.C. и соавт.,1996, Critical Reviews in Immunology, 16:423) и на гломерулярных мезангиальных клетках (см. статью Gomez-Guerrero С. и соавт., 1996, J. Immunol., 156: 4369-4376). Его экспрессия на моноцитах и PMN (полиморфонуклеарный лейкоцит) может быть усилена с помощью TNF- (фактор некроза опухоли-) (см. статьи Gesl А. и соавт. , 1994, Scad. J. Immunol., 39:151-156; Hostoffer R.W. и соавт. , 1994, The J. Infectious Diseases, 170:82-87), IL-1 (интерлейкин-1), GM-CSF (колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов), LPS (липополисахариды) или форболовых сложных эфиров (см. статью Shen L. и соавт. , J. Immunol., 152:4080-4086; Schiller С.А. и соавт., 1994, Immunology, 81: 598-604), тогда как IFN- (интерферон-) и TGF-1 (Т-клеточный ростовой фактор-1) снижают экспрессию FcRI (см. статью Reterink T.J.H. и соавт., 1996, Clin. Exp. Immunol., 103:161-166). Альфа-цепь человеческого FcRI является сильно гликозилированной трансмембранной молекулой первого типа, которая принадлежит к семейству супергена Ig, который включает также рецепторы IgG и IgE. Один ген, расположенный на хромосоме 19, кодирует несколько образованных альтернативным сплайсингом изоформ -цепи FcRI (мол. масса 55-110 кД; см. статью Morton H.C. и соавт., 1996, Critical Reviews in Immunology, 16: 423). Было показано, что FcRI миелоцитов ассоциирован с -цепью FcR, которая, как считают, участвует в сигнальной трансдукции FcRI (см. статьи Morton H.C. и соавт., 1995, J. Biol. Chem., 270:29781; Pfefferkorn L. C. и соавт., 1995, J. Immunol., 153:3228-3236; Saito К. и соавт., 1995, J. Allergy Clin. Immunol., 96:1152).

FcRI связывает IgА1 и IgA2 как в комплексе с антигеном, так и в мономерной форме (см. статьи Mazangera R.L и соавт., 1990, Biochem. J., 272:159-165), что согласуется с тем, что рецептор in vivo насыщен мономерным IgA таким же образом, как FcR и FcRI насыщены IgG и IgE соответственно. Перекрестное сшивание FcRI на миелоидных эффекторных клетках полимерным IgA, иммунными комплексами IgA или mAb (моноклональными антителами), специфическими в отношении эпитопов внутри или вне лигандсвязывающего домена, стимулирует дегрануляцию, высвобождение супероксида, секрецию воспалительных цитокинов, эндоцитоз и фагоцитоз (см. статьи Patty С., A.Herbelin, A. Lihuen, J. F. Bach и R.C.Monteiro, 1995, Immunology, 86:1-5; Stewart W.W., R.L. MazYegera, L. Shen и M.A.Kerr, 1994, J. Leucocyte Biology, 56:481-487; Stewart W.W. и М.А. Kerr, 1990, Immunology, 71:328-334; Shen L., 1992, J. Leucocyte Biology, 51: 373-378). Данные физиологические ответы, запускаемые с помощью FcRI, могут быть важными в первой линии гуморальной защиты на поверхностях слизистых оболочек (см. статью Моrton Н.С., М. van Egmond и J.G. J. van de Winkel, 1996, Critical Reviews in Immunology, 16:423).

Таким образом, FcRI является клинически приемлемым запускающим рецептором на цитотоксических иммунных эффекторных клетках, и его активность может быть использована для разработки новых иммунотерапевтических средств. Цитотоксический потенциал FcRI не был тщательно исследован, поскольку почти все способы терапии на основе моноклональных антител (mAb) разрабатываются с использованием mAb класса IgG, которые не связывают FcRI.

Сущность изобретения Данное изобретение относится к мультиспецифическим терапевтическим молекулам, содержащим детерминанты связывания для рецепторов иммуноглобулина A (IgA). IgA является антителом класса, преобладающего в жидкостях и на поверхностях слизистых оболочек, а IgA- рецепторы (Fc-рецепторы, FcR или FcRI) обнаружены на белых кровяных клетках, включая макрофаги, моноциты, нейтрофилы, эозинофилы и лимфоциты. Биспецифические и мультиспецифические молекулы, соответствующие изобретению, могут быть использованы в качестве терапевтических агентов для запуска активностей цитолиза и фагоцитоза данных белых кровяных клеток, усиления "атаки" данных клеток на раковые клетки, клетки инфекционных микроорганизмов и клетки, инфицированные патогенами.

В одном аспекте изобретение включает биспецифические связывающие молекулы, содержащие первую связывающую детерминанту, которая связывает Fc-рецептор, и вторую связывающую детерминанту, которая связывает один или более антигенов-мишеней. Предпочтительно, когда первая детерминанта связывает сайт на FcR, который отличен от сайта связывания эндогенного IgА таким образом, что связывание молекул, соответствующих изобретению, не блокируется или не блокируется в значительной мере IgА. В предпочтительном варианте осуществления антиген-мишень, связанный второй детерминантой связывания биспецифических молекул, соответствующих изобретению, является антигеном раковых клеток. В более предпочтительном варианте осуществления антиген раковых клеток представлен антигеном рака молочной железы, яичников, семенников, легкого, толстой кишки, прямой кишки, поджелудочной железы, печени, центральной нервной системы, головы и шеи, почки, кости, крови или лимфатической системы. В другом предпочтительном варианте осуществления антиген-мишень является антигеном инфекционной болезни из патогена или инфицированной патогеном клетки. В еще одном варианте осуществления изобретение касается лечения аутоиммунного заболевания с помощью композиции, которая связывает и модулирует рецептор для IgА, вызывая такую модуляцию рецептора, которая снижает дальнейшее связывание IgА с данным рецептором. В другом варианте осуществления изобретение представляет композиции, которые связывают и не модулируют рецептор для IgА таким образом, что эффекторные клетки субъекта "вооружаются" биспецифическими и мультиспецифическими молекулами и могут связывать антиген патогена или рака.

Предпочтительный вариант осуществления биспецифических молекул, соответствующих данному изобретению, представлен молекулами с детерминантами связывания для рецептора из семейства рецепторов, подобных человеческому EGF (эпидермальный фактор роста), канцероэмбрионального антигена, антигена рецептора гастрин-высвобождающего пептида и муцинового антигена, сверхэкспрессия которых происходит в ряде опухолевых клеток.

Биспецифические молекулы, соответствующие изобретению, охватывают молекулы, которые частично содержатся в связывающих детерминантах антител, и молекулы, соответствующие изобретению, включают молекулы, сконструированные таким образом, что они включают по меньшей мере одно антитело или фрагмент антитела. Биспецифические связывающие молекулы, соответствующие изобретению, предпочтительно содержат детерминанту связывания из антитела IgG или фрагмента IgG, включая Fab, Fab', F(аb')₂, Fv и Fv из одной цепи. Детерминанта связывания, включая Fab, Fab', F(ab')₂, Fv и Fv из одной цепи, может быть получена также из антитела IgA или антитела другого изотипа. Предпочтительная биспецифическая связывающая молекула, соответствующая изобретению, содержит первую детерминанту связывания, которая является по меньшей мере функциональным фрагментом антитела А77, и вторую детерминанту связывания, которая связывает антиген раковой клетки, антиген патогена или антиген инфицированной клетки. Другие предпочтительные биспецифические связывающие молекулы, соответствующие изобретению, содержат первую детерминанту связывания, которая является по меньшей мере функциональным фрагментом антител A3, А59 или А62, которые близки к А77 по аффинности к рецептору IgА, и не блокируются IgА субъекта. Изобретение включает последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие участки V_H и V_к антитела А77, а также предсказанные последовательности аминокислот данных участков. Данные последовательности предпочтительно используют для гуманизации связывающих детерминант А77 в терапевтических мультиспецифических молекулах. Предпочтительно, когда вторая детерминанта связывания молекул, соответствующих изобретению, является по меньшей мере функциональным фрагментом антитела 520С9, антитела Н425 или антитела СС49. Предпочтительный вариант осуществления представляет одну детерминанту связывания для FcR и одну для антигена HER/neu, обнаруженного, например, на опухолях молочной железы, яичников и легкого.

Изобретение охватывает ряд способов получения биспецифических связывающих молекул, включая присоединение связывающих детерминант химическими методами и с помощью рекомбинантных генетических методов. Изобретением охватываются рекомбинантные биспецифические молекулы, кодируемые последовательностями нуклеиновых кислот, которые несут гены, кодирующие детерминанты связывания, которые таким образом являются генетически присоединенными. Далее, соответствующие изобретению биспецифические связывающие молекулы получают слиянием клеток двух продуцирующих антитела клеточных линий, несущих соответствующие последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют детерминанты связывания, например, гибридомных клеточных линий с целью получения потомства клеточной линии, продуцирующего биспецифическую молекулу, соответствующую изобретению.

Кроме биспецифических связывающих молекул, данное изобретение охватывает мультиспецифические связывающие молекулы, которые содержат по меньшей мере первую детерминанту связывания, которая связывает FC-рецептор, и вторую детерминанту связывания, которая связывает антиген-мишень, а также по меньшей мере одну третью детерминанту связывания. Связывание первой детерминанты данных мультиспецифических связывающих молекул с FcR не блокируется или не ингибируется человеческим иммуноглобулином А, вследствие чего существует незначительная или совсем не существует конкуренции за связывание эндогенными молекулами IgА. Мультиспецифические связывающие молекулы охватывают биспецифические и триспецифические композиции и композиции с четырьмя или более местами связывания. Предпочтительный вариант осуществления триспецифической связывающий молекулы несет дополнительную детерминанту связывания, которая связывает Fc-рецептор, не являющийся Fc-рецептором, включая, например, детерминанту связывания для CD2, CD3, Fc-рецептор, Fс-рецептор, Fc-рецептор и/или Fc-рецептор. При этом данные детерминанты являются дополнением к первой детерминанте связывания для Fc-рецептора. Наиболее предпочтительным вариантом осуществления дополнительной детерминанты связывания для FcR является детерминанта для Fc-рецептора. Для мультиспецифической связывающей молекулы, соответствующей изобретению, несущей детерминанту связывания для Fc-рецептора, связывание FcR не ингибируется человеческим IgG, поскольку молекула связывает Fс по другому сайту эпитопа связывания FcR из IgG. Путем инкорпорации в одну молекулу по меньшей мере связывающей детерминанты для каждого из FcR и FcR увеличивают терапевтическую активность молекулы для повышения аффинности и кинетики связывания белых кровяных клеток с опухолевыми клетками или клетками патогенных организмов, или инфицированными патогенами клетками, повышая возможность цитолиза и фагоцитоза данных мишеней.

Другой предпочтительный вариантосуществления мультиспецифических связывающих молекул с детерминантoм для Fc представлен молекулой, которая несет третью детерминанту связывания, которая связывает второй антиген-мишень или второй эпитоп-мишень на раковой клетке, патогене или инфицированной патогеном клетке. Предпочтительным способом получения данных молекул является химическое присоединение детерминант связывания, однако, изобретение охватывает также полученные рекомбинантным путем мультиспецифические связывающие молекулы или молекулы, которые получены слиянием клеток двух или более клеточных линий, каждая из которых несет последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие связывающие детерминанты. Предпочтительно, когда по меньшей мере одна детерминанта связывания является антителом или фрагментом антитела и когда для упрочения успешного результата при продолжительном лечении человека детерминанта связывания является гуманизированным антителом, которое конструируют так, чтобы свести к минимуму число чужеродных эпитопов на молекуле.

Предпочтительный вариант осуществления мультиспецифических связывающих молекул, соответствующих данному изобретению, содержит одну или более детерминант связывания для антигенов раковых клеток-мишеней, в частности антигенов клеток рака молочной железы, яичников, семенников, легкого, толстой кишки, прямой кишки, поджелудочной железы, печени, центральной нервной системы, головы и шеи, почки, кости, крови и лимфатической системы. Другой предпочтительный вариант осуществления изобретенных мультиспецифических связывающих молекул содержит в качестве антигена-мишени антигены инфекционной болезни из патогенов или инфицированных патогенами клеток. В одном варианте осуществления антигены-мишени являются антигенами инфекционной болезни и антигенами, экспрессирующимися на инфицированных клетках, например антигенами инфекций, вызываемых бактериями, грибами, простейшими и вирусами. В более предпочтительном варианте осуществления антиген-мишень является антигеном из патогенного гриба, включая антиген из патогенных дрожжей. В наиболее предпочтительном варианте осуществления антиген-мишень является антигеном из видов Candida, например Candida albicans.

Подходящими мишенями среди антигенов раковых клеток предпочтительно являются члены семейства EGF-подобных рецепторов человека, более предпочтительно антиген раковых клеток представлен EGF-рецептором и наиболее предпочтительно антиген раковых клеток является HER-2/neu, HER-3, HER-4 или гетеромультимерным рецептором, содержащим по меньшей мере одну субъединицу HER. Дополнительные предпочтительные антигены раковых клеток включают канцероэмбриональный антиген, антиген рецептора гастрин-высвобождающего пептида и TAG 72.

Наиболее предпочтительная мультиспецифическая связывающая молекула содержит по меньшей мере первую детерминанту связывания, представленную по меньшей мере функциональным фрагментом антитела А77, и вторую детерминанту связывания, которая связывает антиген раковой клетки, клетки патогенного организма или инфицированной патогеном клетки. В предпочтительных вариантах осуществления мультиспецифических связывающих молекул на основе А77 с детерминантой связывания ракового антигена предпочтительной второй детерминантой связывания является по меньшей мере функциональный фрагмент антитела 520С9 или антитела СС49. Первая детерминанта связывания для Fc-рецептора предпочтительно связывает рецептор на белой кровяной клетке. Типы белых кровяных клеток, которые связывают молекулы, предпочтительно представлены макрофагами, моноцитами, нейтрофилами, эозинофилами и лимфоцитами.

Еще один аспект изобретения содержит мультиспецифические связывающие молекулы, в которых молекула содержит по меньшей мере один антиген из патогена или инфицированной патогеном клетки или антиген из раковой клетки. Молекулы данного варианта осуществления могут служить для доставки данных антигенов в качестве вакцины прямо к клеткам иммунной системы, представляющим собой антиген, для иммунизации реципиента против инфекционного заболевания или рака. Для иммунизации пациента данные антигены могут быть выделены из последовательностей антигенных белков бактерий, вирусов, грибов и простейших, а также из клеток, инфицированных данным патогеном, или из раковой клетки.

Мультиспецифические связывающие молекулы, соответствующие изобретению, содержат детерминанты связывания из молекул антител или фрагментов антител, которые предпочтительно представлены IgG или фрагментами IgG. Фрагменты антитела предпочтительно представлены Fab, Fab', F(аb')₂, F(аb')₃, Fv или Fv из одной цепи в качестве источников детерминант связывания для конструирования мультиспецифических связывающих молекул. Фрагменты антител могут быть получены из класса антител изотипа IgG, например из гибридомы, продуцирующей моноклональное антитело IgG, или из препарата поликлонального IgG. В предпочтительном варианте осуществления препарат поликлонального IgG получают из животного, которое иммунизировано антигеном из патогенного организма, более предпочтительно из патогенного гриба.

Другой признак мультиспецифических связывающих молекул, в которых первая детерминанта связывания связывает FcR, а вторая детерминанта связывания связывает антиген клетки-мишени, охватывает третью детерминанту связывания, которая связывает другой антиген на той же клетке-мишени, которую связывает вторая детерминанта связывания. Далее, варианты осуществления охватывают третье место связывания, которое связывает другой эпитоп на том же антигене, что связывает вторая детерминанта связывания. Данные детерминанты обеспечивают увеличение вдвое способности связывания мультиспецифической молекулы с мишенью при ее присоединении к иммунной эффекторной клетке для цитолиза или фагоцитоза.

Изобретение представляет также способ уничтожения клетки-мишени или уменьшения количества клеток-мишеней в организме субъекта, который предусматривает введение субъекту терапевтически эффективной дозы мультиспецифической молекулы, которая представляет собой по меньшей мере биспецифическую молекулу и содержит по меньшей мере первую детерминанту связывания, связывающую Fc-рецептор и не блокируемую IgA, и вторую детерминанту связывания, которая связывает антиген на клетке-мишени, в фармацевтически приемлемом носителе. Для человека детерминанты связывания, выделенные из антитела, могут быть гуманизированы. Далее, может проводиться мониторинг терапевтического лечения путем получения биологического образца от субъекта в течение курса лечения. Другой вариант осуществления способа уничтожения клетки-мишени у субъекта включает дополнительное лечение субъекта агентом, который повышает число или активность Fc-рецепторов, например лечение субъекта цитокином. Предпочтительные цитокины для введения при лечении соответствующей изобретению композицией включают по меньшей мере один из G-CSF, GM-CSF, IFN- и TNF, представлены также способы, предусматривающие лечение молекулами, соответствующими данному изобретению, и более чем одним дополнительным терапевтическим агентом.

В другом варианте осуществления эффекторные клетки субъекта могут быть "вооружены" против антигена введением субъекту терапевтически эффективной дозы мультиспецифической связывающей молекулы, которая содержит по меньшей мере первую детерминанту связывания, которая связывает Fc-рецептор, и вторую детерминанту связывания, которая связываетантиген, в фармацевтически приемлемом носителе. Таким образом вооруженные мультиспецифической молекулой эффекторные клетки не модулируют или не регулируют по типу обратной связи Fс-рецепторы на своей поверхности и способны связывать антиген-мишень. Для человека детерминанты связывания, выделенные из антитела, могут быть гуманизированы. Далее, может проводиться мониторинг терапевтического лечения путем получения биологического образца от субъекта в течение курса лечения.

Другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения является способ удаления клетки-мишени у субъекта, предусматривающий получение аликвот образца крови или клеток крови данного субъекта, обработку данной крови или клеток крови ex vivo терапевтически эффективной дозой мультиспецифической связывающей молекулы, содержащей первую детерминанту связывания, которая связывает Fc-рецептор, и вторую детерминанту связывания, которая связывает один или более антигенов-мишеней, и введение указанных обработанных крови или клеток крови обратно субъекту. Предпочтительно, когда клетки из образца крови выделяют и размножают в культуре, и более предпочтительно, когда клетки из образца крови обрабатывают агентами, которые повышают число или активность Fc-рецепторов. Для человека детерминанты связывания, выделенные из антитела, могут быть гуманизированы. Далее, может проводиться мониторинг терапевтического лечения путем получения биологического образца от субъекта в течение курса лечения.

В одном из аспектов изобретение представляет способ лечения субъекта с инфекционным заболеванием, который предусматривает введение пациенту в фармацевтически приемлемом носителе терапевтически эффективной дозы мультиспецифической связывающей молекулы, в которой первая детерминанта связывания связывает Fс-рецептор, а вторая детерминанта связывания связывает антиген-мишень из патогена или инфицированной патогеном клетки, повышая способность иммунной системы бороться с инфекцией.

В еще одном варианте осуществления изобретение представляет способ иммунизации субъекта против ракового антигена или антигена, находящегося на патогене или клетке, инфицированной патогеном, который предусматривает введение в фармацевтически приемлемом носителе композиции мультиспецифического (с множественной специфичностью) связывающего агента, несущего один или более антигенов патогенного инфекционного организма или антиген инфицированных клеток, или раковой клетки. Предпочтительный вариант инфекционного организма представлен патогенным грибом, включая патогенные дрожжи; более предпочтительным вариантом являются виды Candida. Для человека места (детерминанты) связывания, выделенные из антитела, могут быть гуманизированы. Далее, может проводиться мониторинг терапевтического лечения путем получения биологического образца от субъекта в течение курса лечения.

Изобретение предлагает также способ идентификации агента, который модулирует Fc-рецепторы на поверхности клеток, включающий контактирование образца клеток, несущих Fc-рецепторы, с агентом. Способ идентификации агента, который модулирует Fc-рецепторы на поверхности клеток, предусматривает контактирование образца клеток, несущих Рс-рецепторы, с агентом, и определение активности Fс-рецептора в образце с агентом и в контрольном образце с антителом, которое модулирует Fc-рецепторы, таким как антитело А77, а также в еще одном контрольном образце, содержащем клетки, не контактировавшие с данным агентом или антителом; затем сравнивают активность Fc-рецептора в образцах. Таким образом, если образец клеток, который контактировал с агентом, имеет статистически значимое уменьшение активности Fc-рецептора по сравнению с контрольными, клетки, которые не контактировали с агентом, или имеет статистически значимую настолько же низкую, как у клеток в образце с антителом, активность Fc-рецептора, то это позволяет идентифицировать агент, который модулирует Fc-рецепторы на поверхности клеток.

В другом варианте осуществления изобретение представляет способ конструирования агента, который модулирует Fс-рецепторы для лечения аутоиммунного заболевания, путем получения трехмерной модели сайта связывания А77 против Fc-рецептора с использованием последовательностей детерминант вариабельных участков тяжелой и легкой цепей А77. Данный способ включает сравнение остатков аминокислот вариабельного участка А77 с остатками вариабельных участков тяжелой и легкой цепей антител известной трехмерной структуры, определение положения негомологичных остатков аминокислот в основной пептидной цепи участка связывания сайтов V_Н и V_к для того, чтобы определить размер, форму и заряд сайта связывания А77 к Fc-рецептору; скрининг библиотеки молекул для получения путем компьютерного моделирования молекул подходящего размера, формы и заряда, которые имитируют сайт связывания А77, и скрининг данных кандидатов соответствующего размера, формы и заряда на активность потенциальных модуляторов Fс-рецепторов с целью создания агента, который модулирует Fc-рецепторы.

Перечень чертежей На Фигуре 1 представлен профиль элюции препарата биспецифической молекулы А77Х520С9 с помощью гель-фильтрационной ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография), в котором пик при 9,86 мин (~150 кД) представляет гетерокомплекс F(аb')₃, содержащий одну молекулу F(ab') A77 и две молекулы F(ab') 520C9, а пик при 10,43 мин представляет гетерокомплекс F(ab')₂, содержащий по одной молекуле F(ab') A77 и 520C9; гель-фильтрационную ВЭЖХ проводили с использованием колонки TSK-3000.

На Фигуре 2 представлен график, показывающий в виде функции концентрации (в мкг/мл) степень связывания А77Х520С9 (биспецифического антитела анти-FcR Х анти-НЕR-2/neu (BsAb)) с нейтрофилами (PMN, белые квадраты) и моноцитами (черные квадраты), где средняя интенсивность флуоресценции, проанализированная с помощью FACScan, является количественным значением связывания.

На Фигуре 3 представлены результаты цитометрического анализа, показывающие степень связывания А77Х520С9, BsAb анти-FсR Х анти-HER-2/neu (в конечной концентрации 10 мкг/мл) с эффекторными клетками в гепаринизированной цельной крови после инкубирования в течение одного часа при 0^oС; был добавлен фикоэритрин - противомышиный IgG, эритроциты были лизированы и образцы анализировали с помощью FACScan; данные показывают значительное связывание с моноцитами (средняя панель) и нейтрофилами (нижняя панель) при отсутствии связывания с лимфоцитами (верхняя панель).

На Фигуре 4 представлен график, показывающий в виде функции концентрации BsAb (в мкг/мл) связывание А77Х520С9, BsAb анти-FcR Х анти-HER-2/neu (ромбы) и связывания другого BsAb MDX210, также несущего детерминанту для HER-2/neu (белые квадраты), с клетками опухоли молочной железы SKBR-3-мишени, где средняя интенсивность флуоресценции, проанализированная с помощью FACScan, является количественным значением связывания.

На Фигуре 5 представлено связывание с клетками опухоли молочной железы SKBR-3-мишени препарата А77Х520С9, BsAb анти-FcR Х анти-HER-2/neu, в виде функции концентрации (в мкг/мл); клетки SKBR-3 инкубировали с различными концентрациями А77Х520С9 (кружки), F(аb')₃ А77 (треугольники) или F(аb')₂ 520С9 (квадраты) на льду, клетки промывали, окрашивали противомышиным IgG, конъюгированным с изотиоцианидом флуоресцеина (FITC), и анализировали с помощью FACScan.

На Фигуре 6 представлен график, показывающий связывание BsAb А77ХН425 с клетками-мишенями А431 со сверхэкспрессией EGF-R, где средняя интенсивность флуоресценции, проанализированная с помощью FACScan, является количественным значением связывания; клетки инкубировали с различными концентрациями А77ХН425 (кружки), F(аb')₂ A77 (треугольники) или F(аb')₂ Н425 (квадраты); клетки инкубировали, как указано, на льду; клетки промывали, окрашивали античеловеческим IgG, конъюгированным с FITC и анализировали с помощью FACScan.

На Фигуре 7 представлен график, показывающий в виде функции концентрации BsAb (в мкг/мл) обусловленную BsAb A77X520C9 антитело-зависимую цитотоксичность за счет лизиса клеток-мишеней опухоли молочной железы SKBR-3 эффекторными нейтрофилами при соотношении эффекторных клеток и клеток-мишеней 200 к 1 в двух различных препаратах BsAb.

На Фигуре 8 представлен график, показывающий в виде функции концентрации BsAb (в мкг/мл) обусловленную BsAb A77X520C9 антитело-зависимую цитотоксичность за счет лизиса клеток-мишеней опухоли молочной железы SKBR-3 эффекторными клетками в цельной крови, при использовании независимых дубликатов препаратов BsAb.

На Фигуре 9 представлен график в виде столбиков, показывающий ингибирование с помощью F(аb')₂ A77 против FcR обусловленного BsAb A77X520C9 киллинга (цитолиза) клеток опухоли молочной железы моноцитами в сравнении с отсутствием ингибирования при добавлении F(ab')₂ M22 против FcR.

На Фигуре 10 представлен график, показывающий обусловленную BsAb А77Х520С9 цитотоксичность за счет лизиса клеток-мишеней SKBR-3 эффекторными клетками PMN, очищенными из цельной крови; в клетки-мишени SKBR-3 вводили метку 100 мкКи ⁵¹Сr за 1 час до смешивания с PMN и другим препаратом BsAb, обозначенным здесь как BSM (кружки); и данную смесь клеток-мишеней, PMN и BsAb в присутствии 50 мкг/мл F(ab')₂ А77 (квадраты); и данную смесь в присутствии F(аb')₂ M22 (треугольники), каждая из которых находится в планшете для микротитрования с U-образным дном; смеси клеток и антител инкубировали в течение 16 час при 37^oС, супернатанты собирали и анализировали на радиоактивность и вычисляли цитотоксичность по формуле: % лизиса = (экспериментальное СРМ (число импульсов/мин) - СРМ-утечки мишени/СРМ лизиса детергентами - СРМ утечки мишени) х 100%. BsAb-зависимый лизис = % лизиса с помощью BsAb - % лизиса без BsAb при соотношении эффектор : мишень 200:1; границы ошибки представляют стандартное отклонение от среднего, полученного из значений трех повторов эксперимента.

На Фигуре 11 представлен график, показывающий обусловленную BsAb А77Х520С9 цитотоксичность за счет лизиса клеток-мишеней SKBR-3 моноцитами, очищенными из Leukopaks, которые используют в качестве эффекторных клеток, при соотношении эффектор : мишень 100 : 1; другие условия и обозначения те же, что в описании Фигуры 10.

На Фигуре 12 представлен график, показывающий обусловленную BsAb А77Х520С9 цитотоксичность за счет лизиса клеток-мишеней SKBR-3 эффекторными клетками в цельной крови, другие условия и обозначения те же, что в описании Фигуры 10.

На Фигуре 13 представлен график, показывающий цитотоксичность для клеток-мишеней А431 со сверхэкспрессией EGF-R, обусловленную BsAb А77ХН425 (обозначенными как BSM, кружки) и эффекторными клетками PMN, очищенными из цельной крови; клетки инкубировали также с BsAb в присутствии 50 мкг/мл F(ab')₂ A77 (квадраты) или F(ab')₂ M22 (треугольники); в клетки-мишени вводили метку 100 мкКи ⁵¹Сr в течение 1 час и определяли цитотоксичность согласно краткому описанию Фигуры 10.

На Фигуре 14 представлен график, показывающий обусловленный BsAb А77ХН425 лизис клеток-мишеней А431 моноцитами, очищенными из цельной крови с помощью Leukopaks (соотношение Е : Т 100:1); другие условия и обозначения те же, что в кратком описании Фигуры 13.

На Фигуре 15 представлен график, показывающий обусловленный BsAb А77ХН425 лизис клеток-мишеней А431 эффекторными клетками в цельной крови; другие условия и обозначения те же, что в кратком описании Фигуры 13.

На Фигуре 16 представлен график, показывающий обусловленную BsAb анти-TAG 72XА77 антитело-зависимую цитотоксичность нейтрофилов в отношении TAG 72-несущих опухолевых клеток в виде функции концентрации антител BsAb (в мкг/мл).

На Фигуре 17 представлен график, показывающий стимуляцию с помощью композиции BsAb A77XTT роста специфических в отношении токсоида столбняка (ТТ) Т-клеток, определенную спектрофотометрическим анализом клеточной лактатдегидрогеназы и по присутствию данного антигена на моноцитах при дейст