Способ получения 7-аминоцефалоспорановой кислоты, вектор экспрессии, рекомбинантный штамм

Способ получения 7-аминоцефалоспорановой кислоты, вектор экспрессии, рекомбинантный штамм

Реферат

 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано при промышленном получении промежуточных продуктов для синтеза цефалоспориновых антибиотиков. С помощью технологии рекомбинантных ДНК получают вектор, способный встраиваться в хромосомную ДНК штамма Penicillium chrysogenum и обеспечивать экспрессию содержащихся в нем под контролем промотора IPNS Penicillium последовательностей ДНК из Cephalosporium acremonium, кодирующих ферменты экспандазу/гидролазу и ацетилтрансферазу. В результате трансформации указанным вектором штамма Penicillium chrysogenum, способного продуцировать изопенициллин N, получают рекомбинантный штамм, в котором осуществляется биосинтез всех ферментов, необходимых для превращения адипата в адипоил-7-аминоцефалоспорановую кислоту (ад-7-АЦК). Примером такого штамма является Penicillium chrysogenum/рТS-8 (АТСС 74187). Получаемую путем культивирования рекомбинантного штамма в присутствии источника адипата ад-7-АЦК затем подвергают обработке адипоиламидазой с образованием 7-аминоцефалоспорановой кислоты (7-АЦК). Изобретение обеспечивает возможность получения 7-АЦК в промышленном масштабе эффективным и экономичным способом. 3 с. и 1 з.п.ф-лы, 1 табл.

Изобретение относится к области синтетических методов изготовления коммерческих цефалоспориновых антибиотиков в настоящее время имеется значительное количество цефалоспориновых антибиотиков, лечебные средства цефалоспориновой природы сейчас находятся в своем четвертом поколении. У коммерческих цефалоспоринов обнаруживается огромное разнообразие боковых цепей: большая экономическая важность цефалоспоринов определяет повышенную значимость разработок более экономичных и эффективных методов производства ключевых промежуточных продуктов, которые позволяют легко синтезировать различные цефалоспорины.

Одним из ключевых промежуточных продуктов цефалоспоринов является 7-аминоцефалоспорановая кислота (7-АЦК), которая может быть представлена следующей формулой: В настоящее время 7-АЦК производится из цефалоспорина С. Цефалоспорин С, сам по себе являющийся ферментационным продуктом, является исходным веществом почти для всех имеющихся в настоящее время торговых препаратов цефалоспоринов. Однако синтетические манипуляции по производству различных коммерческих цефалоспоринов в большинстве случаев начинаются, по существу, с 7-аминоцефалоспорановой кислоты, которая должна быть получена из цефалоспорина С путем отщепления 7-аминоадипоиловой боковой цепи. Обычные коммерческие цефалоспорины получают синтетически из 7-АЦК, в том числе и те, которые имеют 3-ацетилоксиметиленовую боковую цепь, включая цефотаксим, цефалоглицин, цефалотин и цефапирин.

Еще одним из ключевых промежуточных продуктов является 7-аминодеацетилцефалоспорановая кислота (7-АДАЦ), которая может быть представлена следующей формулой: В настоящее время 7-АДАЦ также производится из цефалоспорина С путем удаления 7-D--аминоадипоиловой боковой цепи вместе с превращением 3-ацетилоксиметиленовой боковой цепи в 3-гидроксиметил. 7-АДАЦ применяется в качестве промежуточного соединения в синтезе цефалоспоринов, содержащих модифицированные заместители в положении С-3.

В настоящее время в данной области техники предпочтительным способом отщепления 7-аминоадипоиловой боковой цепи является химический способ. Основной иминогалоидный процесс требует защиты амино - и карбоксильной групп 7-аминоадипоиловой боковой цепи; для достижения этого сейчас используется несколько методов. Однако процесс химического отщепления, применяемый в настоящее время, имеет серьезные недостатки. Среди этих недостатков можно отметить необходимость проведения многоэтапного и сложного процесса; чрезвычайно низкие действительные температуры; дорогостоящие реактивы; значительные количества побочных продуктов этого процесса, приводящие к проблемам обработки образующейся реакционной смеси; и очистку сильнозагрязненного сходного материала перед началом химической обработки. Поэтому ведется непрерывный поиск микробиологического или ферментативного процесса, по которому достигалось бы ферментное деацилирование цефалоспорина С с образованием 7-аминоцефалоспорановой кислоты на более экономичной основе, чем та, что имеется у используемого сейчас химического процесса.

Однако этот поиск успешного микробиологического процесса оказывается в значительной степени тщетным. Как становится ясно из литературы, это является результатом особенностей структуры и, в частности, стереохимии аминоадипоиловой боковой цепи молекулы цефалоспорина С, так как пенициллин успешно деацилируется ферментным расщеплением с использованием пенициллинацилазы, образуемой множеством микроорганизмов. С другой стороны, сообщение в литературе об успешном одноэтапном ферментом деацилировании цефалоспорина С часто являются невоспроизводимыми или обеспечивают только очень небольшие выходы конечного продукта.

Поэтому настоящее изобретение главным образом относится к области изготовления ключевого цефалоспоринового промежуточного соединения 7-АЦК, а более конкретно - к области биопроцессов для производства 7-АЦК.

К настоящему времени поиск успешного биопроцесса для изготовлении 7-АЦК остается в значительной степени тщетным, конечно же, и в отношении биопроцесса промышленного масштаба. Например, в то время как возможно прямой ферментацией и/или ферментной обработкой получить 6-аминопенициллановую кислоту (6-АПК), у которой остается необходимым только расширить кольцо, чтобы получить 7-АДЦК, было обнаружено, что, к несчастью, ферменты Cephalosporium или Streptomyces, которые осуществляют расширение кольца в нормальных метаболических путях этих микроорганизмов, не воспринимают 6-АПК в качестве субстрата. Эти ферменты, которые в совокупности обозначаются как ДАОЦС или "фермент экспандаза" в данной области техники, определяются как ферменты, которые катализируют расширение структур пенамовых колец, найденных в молекулах пенициллинового типа, в цеф-3-емовые кольца, найденные у цефалоспоринов. В дальнейшем эти ферменты будут коллективно упоминаться как "фермент экспандаза".

Субстратом, на который действует фермент экспандаза, является пенициллин N, который после расширения кольца и гидроксилирования дает деацетилцефалоспорановую кислоту (ДАЦ). Теперь для получения 7-АДАЦ необходимо только отщепить (Д)--аминоадипоиловую боковую цепь, но эта боковая цепь оказалась упорно невосприимчивой к ферментному отщеплению, что приводит только к неприемлемо низким выходам конечного продукта.

В соответствии с настоящим изобретением стало возможным проводить эффективный биопроцесс, по которому пенициллиновое соединение (имеющее адипоиловую боковую цепь) образуется посредством нового ферментационного процесса в высоких титрах; названное пенициллиновое соединение является приемлемым субстратом для экспандазного фермента, который образуется "в месте нахождения" тем же самым организмом, который производит и пенициллиновое соединение, трансформированным для экспрессии названного фермента экспандазы. Фермент экспандаза затем осуществляет расширение кольца пенициллинового соединения с образованием цефалоспоринового соединения с высоким выходом последнего.

Адипоил-7-АДЦК, образуемая действием фермента экспандазы в месте нахождения, имеет 3-метильную боковую цепь (-СН₃), тогда как 7-АЦК, конечный продукт, имеет 3-ацетилоксиметильную боковую цепь [-СН₂ОС/О/CН₃]. Для того чтобы превратить 3-метильную боковую цепь в 3-ацетилоксиметильную боковую цепь, в соответствии с настоящим изобретением также "в месте нахождения" экспрессируются две другие ферментные активности в добавление к экспандазной активности. Для этого имеются гидроксилаза и ацетилтрансфераза; оба фермента являются продуктами экспрессии генов, которыми также был трансформирован микроорганизм, образующий пенициллиновое соединение. Гидроксилазный фермент превращает 3-метильную боковую цепь адипоил-7-АДЦК в 3-гидроксиметильную, а ацетилтрансферазный фермент превращает 3-гидроксиметильную боковую цепь в 3-ацетилоксиметильную боковую цепь 7-АЦК.

И на последнем решающем этапе метода настоящего изобретения важно то, что боковую цепь пенициллинового соединения, теперь уже цефалоспоринового соединения, можно удалить другой ферментной системой с неожиданно высокими выходами конечного продукта. Непредвиденным результатом этого уникального общего биопроцесса, который включает в себя настоящее изобретение, является образование 7-АЦК с удивительно высокими выходами и экономичность, достаточная для того, чтобы представлять приемлемую альтернативу используемым в настоящее время методам, связанным с химическими и биохимическими процессами.

Новый биопроцесс настоящего изобретения представляет уникальный и удивительно эффективный метод производства 7-АЦК как экономически жизнеспособную альтернативу используемому в настоящее время химическому синтезу. Непрерывные попытки изобретения такого биопроцесса в данной области техники приводят к постоянно повторяющимся неудачам. Например, ЕР-А-0422790 описывает ДНК, кодирующую изопенициллин N: ацил-КоА-ацилтрансферазную активность Aspergillus nidulans, и ее использование для получения полезных цефалоспоринов с участием образующих пенициллин грибов, которое не достигалось до этого в данной области техники. Но оно описывается как осуществляемое путем разрушения или перемещения ацетилтрансферазного гена вместе с добавлением генов, кодирующих ферменты эпимеразу и экспандазу, из образующих цефалоспорин организмов; кроме того, по-видимому, не получено действительно полезного результата трансформации и экспрессии. К тому же, если описанная трансформация была бы удачной, она все равно не была бы применима для целей настоящего изобретения, так как по прежнему оставалась бы проблема удаления D--аминоадипоиловой боковой цепи. Такая неудачная попытка получить значительные результаты по производству промежуточных продуктов в синтезе коммерческих цефалоспоринов из культур грибов, образующих пенициллин, составляет полную противоположность результатам, полученным при использовании метода настоящего изобретения.

Первый ферментный этап биопроцесса по методу настоящего изобретения представляет собой расширение кольца у адипоил-6-АПК, которое осуществляется ферментом экспандазой, являющимся продуктом экспрессии экспандазного гена, которым был трансформирован хозяйский нерекомбинантный штамм P. сhrysogenum. Использование такого экспандазного фермента уже применялось в данной области техники. Например, Cantwell et al. , Curr. Genet. (1990), 17: 213-221, предложили биопроцесс для получения 7-АДЦК посредством расширения кольца пенициллина V, сопровождаемого ферментным гидролизом полученного деацетоксицефалоспорина V с образованием 7-АДЦК. Это предложение основано на имеющемся в наличии гене экспандазы пенициллина N(cefE), клонированном из S. Clavuligerus, Kovacevic et al., J. Bacteriol. (1989), 171: 754-760 и Ingolia et al. U.S. 5070020. Однако поскольку экспандаза действует на пенициллин N, ее естественный субстрат, а не на пенициллин V, то сделанное предложение требует генно-инженерных работ по формированию модифицированного гена экспандазы, продукт которого может расширить кольцо у пенициллина V. Однако требуемая модификация не выполнена Cantwell et al.; им удалось трансформировать Penicillium chrysogenum геном cefE из Streptomyces clavuligerus и получить экспрессию фермента ДАОЦС (экспандазы) только на низком уровне.

Фермент экспандаза хорошо изучен в данной области техники как в отношении его активности, так и в отношении его генетической последовательности. Например, в работах Wolfe (U.S. 4510246 и 4536476) для предоставления стабильных ферментных препаратов из бесклеточных экстрактов образующих -лактамы прокариотических организмов, включая Streptomyces clavuligerus были по отдельности выделены циклаза, эпимераза и ферменты, расширяющие кольцо. Detzlaf (U. S. 5082772; EP-A-0366354) описывает выделенный и очищенный фермент экспандазу из S. clavuligerus, который охарактеризован, включая концевые остатки и аминокислотный состав; определено также, что фермент имеет молекулярный вес около 34600 Дальтон. Однако этот результат противоречит молекулярному весу в 29000 Дальтон, определенному для вещества, которое очевидно, является таким же ферментом в U.S. 4536476. ЕР-А-0233715 описывает выделение и характеристику карты, построенной при помощи рестриктирующих эндонуклеаз, гена экспандазы, полученного из S.clavuligerus и экспрессированного рекомбинантной кодирующей экспандазу ДНК (дающей активный экспандазный фермент), в штамме S.clavuligerus дефектного по способности образовывать цефалоспорин.

Ingolia et al., U.S. 5070020 (ЕР-А-0341892) описывают последовательность ДНК, кодирующую фермент экспадазу, которая была получена из P.сhrysogenum; также описывается трансформация штамма P.сhrysogenum экспрессирующим вектором, содержащим названную последовательность ДНК, и получение тем самым экспрессии фермента экспандазы. В то время как предлагается применимость этого фермента для расширения колец у субстратов, отличающихся от пенициллина N, не представлено действительной демонстрации такого расширения колец.

Описанная выше работа сосредоточена на экспандазном ферменте, происходящим из прокариотического штамма S. Clavuligerus. Фермент, по-видимому, имеющий такую же расширяющую кольцо активность, также экспрессируется у эукариотических штаммов Cephalosporium acremonium (также относимым к Acremonium chrysogenum). Однако в таких штаммах экспандазная активность экспрессируется бифункциональным геном (cefEF), который также экспрессирует активность ДАЦС (гидроксилаза), чьей естественной функцией является превращение дезацетоксицефалоспорановой кислоты (ДАОЦ), продукта экспандазного фермента, в деацетилцефалоспорин С (ДАЦ). Результатом такой экспрессии является единственный, но бифункциональный фермент экспандаза/гидроксилаза. Хотя и были приложены усилия по разделению активностей у продукта двойного гена, ни одна из попыток еще не имела успеха. Например, ЕР-А-0281391 описывает выделение и идентификацию последовательности ДНК гена ДАОЦС/ДАЦС, полученного из C.acremonium АТСС 11550, а также соответствующую аминокислотную последовательность фермента. Штамм Penicillium был трансформирован и экспрессировал ферменты, однако попытки превращения пенициллинов G и V в соответствующие цефалоспорины ни разу не были продемонстрированы. Далее, несмотря на то что методы генной инженерии предлагаются в качестве легкого способа разделение генетической информации, кодирующей ДАОЦС и ДАЦС, и их раздельной экспрессии, не представлено действительной демонстрации такого разделения.

Фермент ДАОЦС/ДАЦС/экспандаза/гидроксилаза из C.acremonium также хорошо изучен в данной области техники, как в отношении его активности и ее характеристик, так и в отношении его генетической последовательности. Например, в работах Demain (U. S. 4178210; 4248966 и 4307192) различные исходные материалы пенициллинового типа обрабатываются бесклеточным экстрактом C.acremonium, который эпимеризует и расширяет кольцо с образованием цефалоспоринового антибиотического продукта. Wu-Kuang-Yeh (U.S. 4753881) описывает C.acremonium через посредство его изоэлектрической точки, молекулярного веса, аминокислотных остатков, соотношения гидроксилазной и экспандазной активностей и пептидных фрагментов.

Ацетилтрансферазный фермент C.acremonium также описан в данной области техники в отношении его активности, различных характеристик, рестрикционного картирования и последовательностей нуклеотидов и аминокислот. Смотри, например, ЕР-А-0437378 и ЕР-А-0450758.

Предшествующий уровень техники, обсуждавшийся выше, относится только к одному аспекту настоящего изобретения, а именно к трансформации штамма P. chrysogenum генами, кодирующими ферменты экспандазу и экспандазу/гидроксилазу и обеспечивающими экспрессию этих ферментов. На предшествующем уровне, однако, используются только экспрессированные ферменты для кольца пенициллина N, но не у пенициллинов G и V. И даже в этом случае у пенициллина N остается боковая цепь в положении 7, которую нельзя отщепить при помощи фермента для получения свободной аминогруппы. Настоящее изобретение основано на неожиданном открытии того, что адипоиловая боковая цепь может быть эффективно добавлена штаммом P.chrysogenum; что экспандазный фермент, экспрессируемый "в месте нахождения", может эффективно использовать это соединение в качестве субстрата для расширения кольца с образованием 7-АДЦК; что ферменты гидроксилаза и ацетилтрансфераза, также экспрессируемые "в месте нахождения", могут использовать адипоил-7-АДЦК в качестве субстрата с образованием 3-ацетоксиметиловой боковой цепи 7-АЦК; и что адипоиловая боковая цепь затем может быть эффективно удалена еще одним ферментом с образованием 7-АЦК. Тогда как различные отдельные фрагменты настоящего изобретения могут быть найдены на предшествующем уровне техники, на нем не имеется предложения объединить их для получения неожиданных результатов, предоставляемых методом настоящего изобретения.

Например, образование 6-адипоилпенициллановой кислоты известно в данной области; смотри Ballio et al. Nature (1960), 185, 97-99. Ферментное расширение кольца 6-адипоилпенициллановой кислоты, но только на основе данных in vitro, также известно в данной области; смотри Baldwin et al., Tetrahedron (1987) 43, 3009-3014; и ЕР-А-0268343. И ферментное отщепление адипоиловых боковых цепей также известно в данной области; смотри, например, работу Matsuda et al., J.Bact. (1987) 169, 5815-5820.

Адипоиловая боковая цепь имеет следующую структуру: СООН-(СН₂)₄-СО-, тогда как две боковые цепи близкородственной структуры являются цепями глутарила, имеющего следующую формулу: СООН-(СН₂)₃-СО-, и цепями (D)--аминоадипоила, имеющего формулу: СООН-СН(NH₂)-(СН₂)₃-СО-. Ферментное отщепление глутариловых боковых цепей известно в данной области техники. Смотри, например, работы Shibuya et al. , Agric. Biol. Chem. (1981) 45, 1561-1567, и U.S. 3960662; Matsuda and Kamatsu, J.Bact. (1985) 163, 1222-1228; Matsuda et al., J.Bact. (1987) 169, 5815-5820; Jap. 53-086084 (1978 - Banyu Pharmaceutical Co., Ltd.); и Jap. 52-128293 (1977 - Banyu Pharmaceutical Co., Ltd.) ЕРА-А-0453048 описывает методы улучшения отцепляющей адипоил активности глутарилацилазы, образуемой Pseudomonas S У-77-1. При замещении различных аминокислот в определенных местах в пределах альфа-субъединицы (фермента) наблюдалась в три-пять раз более высокая скорость отщепления адипоила (от адипоилсерина). Следует отметить, что хотя ЕР-А-0453048, очевидно, демонстрирует ацилазу с улучшенной активностью в отношении адипоиловых боковых цепей, эта работа не описывает какого-либо способа (либо химического, либо при посредстве биопроцесса, каким-либо образом аналогичного тому, что описывается в настоящей спецификации), по которому адипоилцефалоспорин должен образовываться в первую очередь.

В данной области техники известно, что в тех случаях, где присутствует (D)--аминоадипоиловая боковая цепь, первой удаляется аминогруппа и происходит укорачивание боковой цепи с участием фермента оксидазы (D)-аминокислот, после чего остается глутариловая (ГЛ-7) боковая цепь; глутариловая боковая цепь удаляется вторым ферментом (глутарилацилазой). Такое двухэтапное отщепление описывание в работах Matsuda, U.S. 3960662; EP-A-0275901; Jap. 61-218057 (1988 - Komatsu, Asahi Chemical Industry Co.); WO 90/12110 (1990 - Wong, Biopure Corp. ); и EP-A-0436355, Isogai et al., также Bio/Technology (1991) 9, 188-191.

В данной области техники также известно, как выполняется одноэтапное отщепление (D)--аминоадипоиловой боковой цепи, в частности, с использованием техники рекомбинантной ДНК. Смотри, например: одноэтапное отщепление (D)--аминоадипоиловой боковой цепи: - Jap. 53-94093 (Meiji Pseudomonas sp. BN-188); - Jap. 52-143289 (= U.S. 4141790, Meiji, Aspergillus sp.); - U. S. 4774179 (Asahi, 1988, Pseudomonas sp. SE-83 и SE-495), = Jap. 61-21097 и Jap. 61-152286; - Fr. Pat. 2241557 (Aries 1975, Bacillus cereus var. fluorescens); - Jap. 52-082791 (Toyo Jozo 1977, Bacillus megaterium NRRL B 5385); - EP-A-0321849 (Hoechst, Pseudomonas, Bacillus subtilis, -glutamyl transpeptidase); - EP-A-0322032, EP-A-0405846 и U.S. 5104800 (Merck, Bacillus megaterium); - EP-A-0283218 и U. S. 4981789 (Merck, Arthrobacter viscosus); одноэтапное отщепление (рекомбинантное): цеф С --> 7-АЦК; - Jap. 60-11029 (Asahi 1985, Comamonas, рекомбинантный штамм E.coli с геном из Comamonas cp. SV-77-1, одноэтапное превращение); - Jap. 61-152-286 (Asahi 1986, Pseudomonas, рекомбинантный штамм E.coli с геном из Pseudomonas cp. SЕ 83, генетическая последовательность описана и внесена в формулу изобретения; одноэтапный процесс уже сформулирован в U.S. 4774179); - Jap. 63-74499 (Asahi 1988, Trigonopsis variabibis, Comamonas, экспрессия в рекомбинантном штамме E.coli конструкции оксидазы (D)-аминокислот и ГЛ-7-АЦК-ацилазы); - ЕР-А-0475652 (Fujisawa, цефалоспорин С-ацилаза и ее продукция посредством техники рекомбинантной ДНК).

В данной области техники известны различные аспекты методов для получения 7-АДАЦ. Смотри, например, U.S. 3304236 и 3972774 (Eli Lilly & Co.) EP-A-0454478 (Shionogi Co. Ltd); и опубликованную Японскую заявку 0453499 (Shionogi Co. Ltd).

Ссылка на заявку, находящуюся в процессе одновременного рассмотрения Ссылка делается на находящуюся в процессе одновременного рассмотрения заявку с серийным номером 07/933469, выданную 28 августа 1992 года ( 185321 A в проведенном списке), которая описывает биопроцесс для получения 7-АДЦК, основанный на экспрессии активности экспандазного фермента в трансформанте P. chrysogenum тем же способом, что и в биопроцессе для получения 7-АДАЦ и 7-АЦК, описанном здесь. Однако в настоящем биопроцессе дополнительные трансформации используются для экспрессии дополнительных ферментных активностей с целью осуществить полностью отличающийся рекомбинантный метаболический путь для синтеза определенных конечных продуктов, ни один из которых не предлагается в заявке, находящейся в процессе одновременного рассмотрения.

Для того чтобы облегчить лучшее понимание метода настоящего изобретения и освоение ссылок предшествующего уровня техники, обсуждавшихся выше, далее сразу же излагается представление различных этапов метаболического пути, приводящего к адипоил-6-АПК, адипоил-7-АДЦК, адипоил-7-АЦК и 7-АЦК, промежуточных продуктов и ферментов, которые выполняют все вовлеченные в этот процесс превращения.

Краткое содержание изобретения Настоящее изобретение относится к новому биопроцессу производства 7-аминодеацетилцефалоспорановой кислоты (7-АДАЦ), включающему этапы: 1) выращивание штамма Penicillium chrysogenum, образующего изопенициллин N, в культуральной среде, которая способна поддерживать его рост; добавление к названной культуральной среде источников поступления адипата, включающего что-либо одно или более одного из адипиновой кислоты, ее солей и эфиров, который способен ассимилироваться и использоваться названным штаммом Penicillium chrysogenum для образования адипоил-6-аминопенициллановой кислоты (адипоил-6-АПК), посредством чего и синтезируется адипоил-АПК; 2) осуществление следующих ферментных превращений посредством экспрессии "в месте нахождения" соответствующих генов: а) кольцо адипоил-6-АПК расширяется "в месте нахождения" с образованием адипоил-7-аминодезатоксицефалоспорановой кислоты (адипоил-7-АДЦК) экспандазным ферментом; названный штамм P.chrysogenum был трансформирован ДНК, кодирующей активность экспандазного фермента, который способен воспринимать названную адипоил-6-АПК в качестве субстрата; в результате экспрессии экспандазы кольцо названной адипоил-6-АПК, образуемой названным штаммом, расширяется "в месте нахождения" с образованием адипоил-7-АДЦК; б) 3-метиловая боковая цепь адипоил-7-АДЦК гидроксилируется "в месте нахождения" ферментом гидроксилазой с образованием адипоил-7-аминодеацетилцефалоспорановой кислоты (адипоил-7-АДАЦ); названный штамм P.chrysogenum был трансформирован ДНК, кодирующей активность гидроксилазного фермента, который способен воспринимать названную 7-АДЦК в качестве субстрата; в результате экспрессии гидроксилазы названная адипоил-7-АДЦК, образуемая названным штаммом, гидроксилируется "в месте нахождения" с образованием адипоил-7-АДАЦ; и 3) соприкосновение названной адипоил-7-АДАЦ с адипоил-амидазой, посредством чего адипоиловая боковая цепь удаляется с образованием продукта 7-АДАЦ; названный продукт затем выделяется.

Кроме того, настоящее изобретение относится к новому биопроцессу для производства 7-аминоцефалоспорановой кислоты (7-АЦК), включающему этапы: 1) выращивание штамма Penicillium chrysogenum, образующего изопенициллин N, в культуральной среде, которая способна поддерживать его рост; добавление к названной культуральной среде источника поступления адипата, включающего что-то одно или более одного из адипиновой кислоты, ее солей и эфиров, который способен ассимилироваться и использоваться названным штаммом Penicillium chrysogenum для образования адипоил-6-аминопенициллановой кислоты (адипоил-6-АПК), посредством чего и синтезируется названная адипоил-6-АПК; 2) осуществление следующих ферментных превращений посредством экспрессии "в месте нахождения" соответствующих генов: а) кольцо адипоил-6-АПК расширяется "в месте нахождения" с образованием адипоил-7-аминодезатоксицефалоспорановой кислоты (адипоил-7-АДЦК) экспандазным ферментом; названный штамм P.chrysogenum был трансформирован ДНК, кодирующий активность экспандазного фермента, который способен воспринимать названную адипоил-6-АПК в качестве субстрата; в результате экспрессии экспандазы кольцо названной адипоил-6-АПК, образуемой названным штаммом, расширяется "в месте нахождения" с образованием адипоил-7-АДЦК; б) 3-метиловая боковая цепь адипоил-7-АДЦК гидроксилируется "в месте нахождения" с образованием адипоил-7-аминодеацетилцефалоспорановой кислоты (адипоил-7-АДАЦ) ферментом гидроксилазой; названных штамм P.chrysogenum был трансформирован ДНК, кодирующей активность гидроксилазного фермента, который способен воспринимать названную адипоил-7-АДЦК в качестве субстрата: в результате экспрессии гидроксилазы названная адипоил-7-АДЦК, образуемая названным штаммом, гидроксилируется также "в месте нахождения" с образованием адипоил-7-АДАЦ; и с) адипоил-7-АДАЦ ацетилируется "в месте нахождения" с образованием адипоил-7-аминоцефалоспорановой кислоты (адипоил-7-АЦК) ацетилтрансферазным ферментом; названный штамм P.chrysogenum был трансформирован ДНК, кодирующей активность ацетилтрансферазного фермента, который способен воспринимать названную адипоил-7-АДАЦ в качестве субстрата; в результате экспрессии ацетилтрансферазы названная адипоил-7-АДАЦ, образуемая названным штаммом, ацетилируется также "в месте нахождения" с образованием адипоил-7-АЦК; и 3) соприкосновение названной адипоил-7-АЦК и адипоил-амидазы, посредством чего адипоиловая боковая цепь удаляется и образуется продукт 7-АЦК; названный продукт затем выделяется.

Следующие термины при использовании здесь имеют указанные значения: "7-АЦК" означает 3-[(ацетоилокси)-метил]-7-амино-8-оксо-5-тио-1-азабицикло [4.2.0]окт-2-ен-2-карбоновая кислота; "адипоил-6-АПК" означает [2S-/2,5,6/]-3,3-диметил-7-оксо-6- [(гексан-1,6-диоил)амино]-4-тио-1-азабицикло [3.2.0] гептан-2-карбоновая кислота; "адипоил-7-АДЦК" означает 3-метил-7-[(гексан-1,6-диоил)амино]-3-метил-8-оксо-5-тио-1-азабицикло [4.2.0]окт-2-ен-2-карбоновая кислота; и "адипоил-7-АДЦК" означает 3-гидроксиметил-7-[(гексан-1,6-диоил)амино]-3-метил-8-оксо-5-тио-1-азабицикло [4.2.0]окт-2-ен-карбоновая кислота.

В частности, настоящее изобретение относится к новым биопроцессам для производства 7-аминодеацетилцефалоспорановой кислоты (7-АДАЦ) и 7-аминоцефалспорановой кислоты (7-АЦК), перечисленным выше, в которых: источником поступления адипата является динатрий-адипат; ДНК, кодирующая активность экспандазного фермента, гидроксилазного фермента и ацетилтрансферазного фермента, происходит из Cephalosporium acrеmonium, а адипоил-ацилаза происходит из Рseudomonas species.

Далее, настоящее изобретение относится к векторам экспрессии рекомбинантной ДНК, которая кодирует активность экспандазного, гидроксилазного и ацетилтрансферазного фермента, происходящих из Cephalosporium acrеmonium, и промоторы, которые управляют экспрессией генов, кодирующих названные ферменты; эти векторы включают плазмиды рРЕN/СЕРН-1, рРЕNСАСТ и рТS-8, описанные ниже.

Далее, настоящее изобретение относится к клеткам хозяйского штамма Penicillium chrysogenum, трансформированным векторами экспрессии рекомбинантной ДНК; векторы включают ДНК, кодирующую активность экспандазного, гидроксилазного и ацетилтрансферазного ферментов, которые происходят из Cephalosporium acrеmonium, и промоторы, которые управляют экспрессией, кодирующей названные ферменты ДНК, включающие промотор гена ИПNC Penicillium chrysogenum. В частности, настоящее изобретение относится к клеткам хозяйственного штамма Penicillium chrysogenum трансформированным векторами экспрессии рекомбинантной ДНК, включающими плазмиды pPEN/CEPH-1, рPENCACT и pTS-8, описанные ниже.

Далее, настоящее изобретение относится к методу культивирования рекомбинантных клеток хозяйственного штамма Penicillium chrysogenum в условиях, подходящих для экспрессии генов; рекомбинантные хозяйские клетки включают векторы экспрессии рекомбинантной ДНК, содержащие ДНК, которая кодирует активность экспандазного, гидроксилазного и ацетилтрансферазного ферментов, происходящих из Cephalosporium acremonium, и промоторы, которые управляют экспрессией, кодирующей названные ферменты ДНК, включающие промотор гена ИПNC Penicillium chrysogenum. В частности, настоящее изобретение относится к клеткам культивирования рекомбинантных клеток хозяйского штамма Penicillium chrysogenum в условиях, подходящих для экспрессии генов; названные рекомбинантные хозяйские клетки содержат векторы экспрессии рекомбинантной ДНК, включающие плазмиды pPEN/CEPH-1, рPENCACT и pTS-8, описанные ниже.

Подробное описание изобретения Главным аспектом настоящего изобретения является новый биопроцесс для производства 7-аминоцефалоспорановой кислоты (7-АЦК) и 7 аминодеацетилцефалоспорановой кислоты (7-АДАЦ), ключевых промежуточных продуктов в производстве синтетических коммерческих цефалоспоринов, которые могут быть представлены следующими структурными формулами: В добавление к цефалоспориновому ядру отличительными признаками 7-АЦК являются 7-аминогруппа и 3-ацетилоксиметильная группа (или 3-ацетоксиметильная группа, как она более часто обозначается). 7-аминогруппа является группой, которая может быть превращена в любое количество производных боковых цепей, и, таким образом, формирует основу для синтеза различных коммерческих цефалоспоринов. 3-ацетилоксиметильная группа часто может быть превращена в некоторое количество других боковых цепей для того, чтобы также синтезировать коммерческие цефалоспорины.

Конечный продукт 7-АЦК и промежуточный продукт адипоил-7-АЦК по методу настоящего изобретения могут составлять противоположность цефалоспорину С, другому ключевому цефалоспориновому промежуточному продукту, который может быть представлен следующей структурной формулой: У этого промежуточного продукта 7-(D)--аминоадипоиловая боковая цепь неприемлема для дальнейшего получения синтетических производных и должна быть отщеплена с образованием приемлемой 7-аминогруппы. К несчастью, часто оказывается, что 7-(D)--аминоадипоиловую боковую цепь трудно удалять как химическими, так и биологическими средствами.

Определения Следующие термины, используемые в настоящем описании и, особенно, в разделе, озаглавленном "Описание предпочтительных осуществлений изобретения", имеют указанные ниже значения: 7-АЦК 7-аминоцефалоспорановая кислота 7-АДАЦ 7-аминодеацетилцефалоспорановая кислота 7-АДЦК 7-аминодезацетоксицефалоспорановая кислота 6-АПК 6-аминопенициллановая кислота ДАОЦ дезацетоксицефалоспорановая кислота ДАОЦС ДАОЦ-синтетаза ДАЦ деацетилцефалоспорин С ДАЦС ДАЦ-синтаза ИПNС изопенициллин N-синтетаза Трис трис[гидроксиметил]аминометан ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота ДЭПК диэтилпирокарбонат ТЕ буфер Трис/ЭДТА SS С буфер, содержащий соль (хлористый натрий) и цитрат натрия SDS додецилсульфат натрия ПЭГ полиэтиленгликоль.

Культура Penicillium chrysogenum.

Первый этап метода настоящего изобретения включает этап выращивания штамма Penicillium chrysogenum, образующего изопенициллин N, в культуральной среде, которая способна поддерживать его рост, и добавления к названной культуральной среде источника поступления адипата, включающего что-то одно или более одного из адипиновой кислоты, ее солей и эфиров; эти вещества должны ассимилироваться и использоваться названным штаммом Penicillium chrysogenum для образования адипоил-6-АПК. Источник поступления адипата можно добавлять к культуральной среде после посева P.сhrysogenum, но предпочтительно, чтобы он уже присутствовал в культуральной среде в то время, когда производится посев.

Другие роды, отличные от рода Penicillium, например, aspergillus nigulaus, а также другие виды из рода Penicillium, кроме вида chrysogenum, также образуют изопенициллин N. Однако исторически сложилось так, что все штаммы с самым высоким уровнем образования изопенициллина N были разработаны из штаммов вида chrysogenum при помощи хорошо известных методов улучшения штаммов. С практической стороны настоящее изобретение ограничено штаммами Penicillium chrysogenum, хотя очевидна его применимость и к другим видам. Любые заложенные в коллекции штаммы Penicillium chrysogenum или такие штаммы из других источников с открытым доступом являются подходящим исходным материалом для осуществления метода настоящего изобретения.

Культуральная среда, способная поддерживать рост штамма Penicillium chrysogenum, который образует изопенициллин N, относится к типу сред, с которым квалифицированный специалист в данной области мог бы легко познакомиться. Например, культивирование могло бы быть выбрана из ряда подходящих сред, имеющихся в наличии. В обычных средах используются источники углерода, такие как сахароза, глюкоза и крахмал; источники азота, такие как соевые бобы (в виде муки грубого помола или в дробленом виде), масло из семян хлопка, мука грубого помола из земляничных орехов и различные аминокислоты, их смеси и пептоны. Обеспечение потребностей продукции (антибиотика) увеличивает выход и облегчает выделение (антибиотика); предпочтительными средами в таких ситуациях могут быть среды с мелассой в качестве источника углерода и с соевой мукой и аминокислотами в качестве источника азота.

К культуральной среде обычно добавляют пищевые неорганические соли, которые включают соли, способные поставлять следующие ионные компоненты: натрий, калий, аммоний, кальций, фосфат, сульфат, хлорид, бромид, нитрат, карбонат, двухвалентное железо, трехвалентное железо, магний, марганец и другие. Микроэлементы обычно также необходимы для роста, развития и метаболизма Penicillium chrysogenum; их можно добавлять прямо в культуральную среду в том случае, если они уже не доставлены в качестве загрязнений других ингредиентов культуральной среды.

Штаммы Penicillium chrysogenum могут культивироваться в емкостях с малым объемом, такие как качалочные колбы на 1 л, в тех случаях, когда желательно получить только небольшие количества адипоил-7-АЦК и, в конечном счете, 7-АЦК. Когда желательно получить большие количества адипоил-7-АЦК, однако, будут использоваться резервуары для крупномасштабной ферментации в погруженных аэробных условиях.

При осуществлении крупномасштабного производства адипоил-7-АЦК споровую культуру штамма Penicillium chrysogenum выращивают на скошенном агаре. Споры с косяка используются для засева небольшого объема среды для вегетативного роста мицелия. Культивирование на этом этапе проводится для получения обильной, свежей, активно растущей культуры микроорганизма. Этот вегетативный мицелий затем используется в качестве посевного материала на среду для крупномасштабной ферментации. В определенных случаях может быть желательно в качестве посевного материала вносить дополнительный вегетативный мицелий в ферментационную среду. Такое двухэтапное внесение вегетативного мицелия обычно используется, когда объем ферментационной среды значительно больше, чем объем среды для начального вегетативного роста. По этому способу споры микроорганизма культивируют сначала в малом объеме среды для вегетативного роста для получения посевного материала,