Косметические составы

Косметические составы

Реферат

 

Изобретение может быть использовано в косметологии для приготовления косметических составов. Изобретение направлено на улучшение внешнего вида морщинистой, сухой, шершавой и старой или поврежденной УФ-облучением кожи. Состав включает следующее соотношение компонентов: ресвератрол 0,5-10%, оксикислота 0,01-20%, косметически приемлемый носитель. Количество оксикислоты может также составлять от 2 до 12 мас.%, а рН состава иметь значение от 3 до 5. Способ улучшения или предотвращения появления морщин и сухой кожи заключается в нанесении на кожу состава, включающего ресвератрол в количестве от 0,5 до 10 мас.% и косметически приемлемый носитель. 2 с. и 2 з.п. ф-лы, 14 табл.

Область техники Косметические составы, содержащие ресвератрол, природный эстроген, полученный из растений, и косметические способы ухода за кожей путем нанесения таких составов на кожу.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ Кожа человека состоит из двух основных слоев, нижнего более толстого слоя, дерма (собственно кожа), и верхнего более тонкого слоя, эпидермис. Дерма представляет слой, который обеспечивает прочность, эластичность и толщину кожи. При старении толщина кожного слоя уменьшается, и это, как полагают, частично обусловливает образование морщин в стареющей коже. Верхний слой кожи человека или эпидермис, который обеспечивает упругость и бартерные свойства кожи, состоит из различных типов клеток. Кератиноциты представляют собой основной тип клеток эпидермиса (75-80% общего числа клеток в эпидермисе человека). Внутри эпидермиса кератиноциты пребывают в четырех отличных стадиях дифференциации. Эпидермальная дифференциация важна для обеспечения основной функции кожи, а именно для обеспечения защитного барьера против внешней окружающей среды и для предотвращения потери воды из тела. Образование ороговевшей оболочки является конечной стадией дифференциации кератиноцитов. Фермент, ответственный за образование ороговевших оболочек, трансглутаминаза, является маркером эпидермальной дифференциации. Средства, которые способствуют увеличению толщины кожного слоя и увеличению дифференциации кератиноцитов в эпидермальном слое, должны поэтому быть идеальными соединениями для обеспечения ухода за кожей и идеальными средствами против старения.

Эстрогены и синтетические соединения, которые действуют подобно эстрогенам, как известно, увеличивают толщину кожного слоя и уменьшают образование морщин в стареющей коже. Изменения в коже, такие как сухость кожи, потеря эластичности кожи и отечность (plumpness), возникающие после менопаузы, приписываются недостатку продуцирования эстрогенов. Лечение эстрогеном предотвращает или замедляет многие изменения, ассоциированные со старением кожи (Creidi et al., Effect of a conjugated oestrogen cream (Premarin) on aging facial skin, Maturitas, 19, p.211-23, 1994). Синтетический эстроген, диэтил стильбэстрол, имеет следующую структуру: Эта структура сильно отличается от структуры природного эстрогена, эстрадиола В последние годы фитоэстрогены (т.е. природные соединения, которые имеют эстроген-подобную активность и которые обнаружены в растениях) все более используют для терапевтических целей. Некоторые из описанных применений представляют гипохолестеринемические и противоатерогенные средства для лечения сердечно-сосудистых болезней, особенно у женщин в постклимактерическом периоде, лечения остеопороза в пожилом возрасте и как противораковое средство, особенно против рака молочной железы, внутриматочного и цервикального рака у женщин (Knight et al., Phytoestrogens - a short review, Maturitas, 22: 167-75, 1995).

В последние годы спрос потребителя на продукты на "природной" основе значительно возрос. Потребители воспринимают химический синтез как опасность для окружающей среды. Ингредиент, синтезируемый химическим путем, может содержать вредные химикаты. Природные продукты воспринимаются как чистые и умеренные, и они превосходят продукты, синтезированные химическим путем. Однако косметическая полезность источников растительного происхождения не является очевидной. Чтобы получать реальную пользу от "природного" источника, следует идентифицировать конкретное активное вещество в растении, которое, на самом деле, обладает косметической пользой.

Один известный фитоэстроген представляет собой фотоанетол Фотоанетол не описан для местного или косметического применения.

Настоящее изобретение основано, по крайней мере, частично на обнаружении того, что ресвератрол является фитоэстрагеном, что он ингибирует пролиферацию кератиноцитов, увеличивает дифференциацию кератиноцитов и смягчает раздражение или жжение, потенциально связанное с использованием альфа-оксикислот.

Ресвератрол представляет соединение, обнаруженное в целом ряде растений. Описаны выделение и идентификация ресвератрола из целого ряда растений, таких как корни японского спорыша (Powell et al., Phytochemistry 35, р.335, 1994), из вина и винограда (Goldberg et al., J. Agric. Food Chem., 43, p. 1820, 1995 and Cellotti et al., "Resveratrol content of some wines obtained dried Valpolicella grapes: Recioto and Amarone., J chromatogr A (Netherlands) 730: 47-52, 1996), и из культур растения арахиса (Kindl and et al. , US patent 5391724). Красный виноград и красное вино содержат большое количество ресвератрола, и утверждается, что для людей, пьющих вино, это вещество является одной из причин их здоровья в отношении сердечно-сосудистых заболеваний. Кроме того, было показано, что рескератрол является сильнодействующим химическим средством, предотвращающим рак, а также противовоспалительным средством. Кроме того, сообщается, что ресвератрол индуцирует дифференциацию клеток промиелоцитарного лейкоза человека (Jang et al., Cancer chemopreventive activity of resverstrol, a natural product derived from grapes. Science 275; 218-220, 1997). Jahg et al. описывают использование ресвератрола в качестве противоракового средства на обработанных канцерогеном мышиных кожных клетках в культуре.

Описаны косметические составы, содержащие экстракт винограда. Смотри, например, реферат японской патентной заявки 06336421 ("JP '421"), раскрывающий использование 0,5% экстракта винограда в косметических составах. Scafildi et al. (Патент США 5683683) и Zabotto et al. (Патент США 5439672) раскрывают косметические составы, содержащие масло семян винограда. Griat et al. (Патент США 5171577) раскрывают косметические пены, содержащие косметические зернышки плодов. Ни в одном из этих раскрытий изобретения, кроме JP '421, не упоминается об использовании какого-либо количества винограда. В JP '421 речь идет о присутствии 0,5% экстракта винограда. Согласно Службе сельскохозяйственных исследований Департамента Сельского хозяйства Соединенных Штатов, концентрация ресвератрола в целых ягодах составляет приблизительно 15 ппм. Тогда концентрация ресвератрола в 0,5% экстракте семян винограда составляет 0,33 микромоля или 0,0000075 мас.%.

В представленном выше обсуждении предшествующего уровня техники не раскрывается использование ресвератрола для ухода за кожей или использование в косметике, не идет речи о том, что ресвератрол является фитоэстрогеном, или о том, что он ингибирует пролиферацию кератиноцитов, или что он промотирует дифференциацию кератиноцитов, или что он контролирует раздражение кожи, вызванное альфа-оксикислотами.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ Настоящее изобретение раскрывает состав для ухода за кожей, включающий ресвератрол в количестве от 0,00002 до 10 мас.% и косметически приемлемый носитель.

Кроме того, настоящее изобретение раскрывает способ улучшения или профилактики морщинистой (сморщенной), покрытой морщинами, сухой, шершавой, старой или фотоповрежденной кожи и улучшения толщины кожи, эластичности, упругости, блеска, румянца и снижения отечности, и этот способ включает нанесение на кожу предлагаемого состава. Составы данного изобретения предназначены для местного нанесения на кожу млекопитающего, которая является уже сухой, шершавой, покрытой морщинами, морщинистой, старой, фотоповрежденной, или предлагаемые составы могут применяться профилактически нормальной здоровой коже, чтобы предотвратить или уменьшить деградационные изменения.

Настоящее изобретение, кроме того, включает косметические способы доставки к коже эстрогенно-активных веществ (эстрогенной активности), ингибирования пролиферации кератиноцитов в коже человека и увеличения дифференциации кератиноцитов. Кроме того, изобретение включает косметический способ контроля раздражения кожи, жжения или воспаления, которое может быть вызвано альфа-оксикислотами. В этом отношении изобретение также включает косметический состав, содержащий ресвератрол в комбинации с альфа-оксикислотой.

ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Ресвератрол (также известный как 5-параоксистирил резорцин, или 3,4'5-стильбентриол) является существенным ингредиентом предлагаемого состава. Ресвератрол имеет следующую структуру: Ресвератрол может быть получен коммерчески от Sigma.

В общем, количество ресвератрола в предлагаемых составах находится в диапазоне от 0,00002 до 10 маc.% от массы состава. Предпочтительно, чтобы понизить стоимость и максимизировать действие, количество ресвератрола находится в диапазоне от 0,001% до 5% и наиболее предпочтительно находится в диапазоне от 0,1% до 5%.

Состав согласно изобретению также включает косметически приемлемый носитель, который действует как разбавитель, диспергирующее средство или носитель для ресвератрола в составе с тем, чтобы облегчить его распределение, когда состав наносят на кожу.

Наполнители, другие чем вода или в дополнение к воде, могут включать жидкие или твердые смягчающие косметические средства для кожи, растворители, влагоудерживающие вещества, загустители и порошки. Особенно предпочтительным неводным носителем является полидиметил силоксан и/или полидиметилфенил силоксан. Силиконы этого изобретения могут быть силиконами с вязкостями в пределах где-нибудь от около 10 до 10000000 мм²/с (сСт) при 25^oС. Особенно желательны смеси силиконов с низкой и высокой вязкостями. Эти силиконы доступны от General Electric Company под торговыми Марками Vicasil, SE и SF и от Dow Corning Company под Сериями 200 и 500. Количества силикона, которые можно использовать в составах этого изобретения, колеблются где-нибудь от 5 до 95%, предпочтительно от 25 до 90%, от массы состава.

Косметически приемлемый носитель обычно составляет от 5 до 99,9%, предпочтительно от 25 до 80%, от массы состава и в отсутствии других косметических адъювантов составляет баланс состава. Предпочтительно носитель составляет, по крайней мере, 80 мас.% воды от массы носителя. Предпочтительно вода включает, по крайней мере, 50 мас.% заявляемого состава, наиболее предпочтительно от 60 до 80 мас.% от массы состава.

В одном варианте воплощения изобретения предлагаемые составы, кроме того, включают альфа-оксикислоту.

Оксикислоты усиливают пролиферацию и увеличивают биосинтез керамида в кератиноцитах, увеличивают эпидермальную толщину и увеличивают слущивание нормальной кожи, что приводит к более гладкой, более молодой коже.

Оксикислота может быть выбрана из альфа-оксикислот, бета-оксикислот (например, салициловая кислота), других оксикарбоновых кислот (например, диоксикарбоновая кислота, оксидикарбоновая, окситрикарбоновая) и смесей их или комбинации их стереоизомеров (DL, D или L).

Наиболее предпочтительные составы, содержащие антираздражитель-ресвератрол, включают гликолевую кислоту и/или молочную кислоту, так как эти ингредиенты, как установлено, имеют потенциал вызывать раздражение, однако, они, как установлено, являются особенно эффективными для обеспечения благоприятного косметического воздействия.

Предпочтительно оксикислоту выбирают из альфа-оксикислот, имеющих общую структуру (1) где М представляет Н или насыщенную, или ненасыщенную, прямую или разветвленную углеводородную цепь, содержащую от 1 до 27 углеродных атомов.

Еще более предпочтительно оксикислоту выбирают из молочной кислоты, 2-оксиоктановой кислоты, оксилауриновой кислоты, гликолевой кислоты и их смесей. Если существуют стереоизомеры, наиболее предпочтителен L-изомер.

Конкретное преимущество предлагаемых составов заключается в том, что можно использовать более высокие количества оксикислот без того, чтобы вызвать раздражение кожи. Предпочтительно, чтобы количество компонента - оксикислоты, присутствующее в предлагаемом составе, составляло от 0,01 до 20%, более предпочтительно от 2 до 12% и наиболее предпочтительно от 4 до 12% по массе.

Следует иметь в виду, что в зависимости от рН состава оксикислота может присутствовать в виде соли, например соли аммония, или калия, или натрия.

Хотя предлагаемые составы могут иметь любой рН в диапазоне от 2,5 до 10, предлагаемые составы особенно полезны, когда они находятся в области кислого рН (особенно, если они содержат оксикислоту), предпочтительно 3-5, и наиболее предпочтительно при рН 3-4, так как такие составы являются особенно раздражающими.

Необязательные полезные для кожи вещества и косметические адъюванты Наряду с эмульгатором, может присутствовать масло или маслянистое вещество для того, чтобы обеспечить либо эмульсию вода-в-масле, либо эмульсию масло-в-воде, в зависимости, в основном, от среднего гидрофильно-липофильного баланса (ГЛБ, HLB) используемого эмульгатора.

Предлагаемые составы предпочтительно включают солнцезащитные средства. Солнцезащитные средства включают те вещества, которые обычно используют для защиты от ультрафиолетового света. Иллюстративными соединениями являются производные РАВА, циннамат и салицилат. Например, можно использовать октил метоксициннамат и 2-гидрокси-4-метокси бензофенон (также известный как оксибензон). Октил метоксициннамат и 2-гидpoкcи-4-мeтoкcи бензофенон коммерчески доступны под торговыми марками Parsol MCX и Benzophenone-3 соответственно. Точное количество солнцезащитного средства, используемого в эмульсиях, может варьироваться в зависимости от требуемой степени защиты от УФ-облучения солнца.

В косметические составы настоящего изобретения часто включают смягчающие средства. Уровни таких смягчающих средств могут варьироваться от 0,5 до 50%, предпочтительно от 5 до 30%, от массы суммарного состава. Смягчающие средства можно классифицировать по таким общим химическим категориям, как сложные эфиры, жирные кислоты и спирты, полиолы и углеводороды.

Сложные эфиры могут быть моно- или ди-сложными эфирами. Приемлемые примеры жирных ди-сложных эфиров включают дибутил адипат, диэтил себацат, диизопропил димерат и диоктил сукцинат. Приемлемые жирные сложные эфиры с разветвленной цепью включают 2-этил-гексил миристат, изопропил стеарат и изостеарил пальмитат. Приемлемые сложные эфиры трехосновных кислот включают тризопропил трилинолеат и трилаурил цитрат. Приемлемые жирные сложные эфиры с прямой цепью включают лаурил пальмитат, миристил лактат и стеарил олеат. Предпочтительные сложные эфиры включают кококаприлат/капрат (смесь коко-каприлата и коко-капрата), пропиленгликоль миристил эфир ацетат, диизопропил адипат и цетил октаноат.

Подходящие жирные спирты и кислоты включают соединения, имеющие от 10 до 20 углеродных атомов. Особенно предпочтительными являются соединения, такие как цетиловые, миристиловые, пальмитиновые и стеариловые спирты и кислоты.

Среди полиолов, которые могут служить в качестве смягчающих средств, находятся алкил полигидроксильные соединения с линейной и разветвленной цепью. Например, предпочтительны пропиленгликоль, сорбит и глицерин. Также полезными могут быть полимерные полиолы, такие как полипропиленгликоль и полиэтиленгликоль. Бутилен- и пропиленгликоль особенно предпочтительны в качестве усилителей проникновения.

Иллюстративными примерами углеводородов, которые могут служить в качестве смягчающих средств, являются те, которые имеют углеводородные цепи где-нибудь от 12 до 30 углеродных атомов. Конкретные примеры включают минеральное (вазелиновое) масло, вазелин, сквален и изопарафины.

Другой категорией функциональных ингредиентов, входящих в косметические составы настоящего изобретения, являются загустители. Загуститель обычно присутствует в количествах где-нибудь от 0,1 до 20% по массе, предпочтительно от около 0,5 до 10% от массы состава. Иллюстративными примерами загустителей являются сшитые полиакрилатные материалы, доступные под торговой маркой Carbopol от B.F. Goodrich Company. Могут использоваться смолы, такие как ксантан, каррагенан, желатин, карайя, пектин и смола рожкового дерева. При некоторых обстоятельствах функцию загустевания может выполнять вещество, также служащее в качестве силикона или смягчающего средства. Например, силиконовые смолы с вязкостью свыше 10 сСт и сложные эфиры, такие как стеарат глицерина, имеют двойственную функциональность.

В косметический состав настоящего изобретения могут быть включены порошки. Эти порошки включают мел, тальк, каолин, крахмал, смектические глины, химически модифицированный магний алюминий силикат, органически модифицированную монтмориллонитовую глину, гидратированный силикат алюминия, белую сажу, алюминий крахмал октенил сукцинат и смеси их.

В косметические составы могут быть также включены другие дополнительные второстепенные компоненты. Эти ингредиенты могут включать красители, вещества, делающие состав непрозрачным (замутнители) и отдушки. Количества этих других дополнительных второстепенных компонентов могут колебаться где-нибудь от 0,001 до 20% от массы состава.

Применение состава Предлагаемый состав предназначен главным образом как продукт для местного применения к коже человека, особенно в качестве средства для ухода за кожей, увлажнения и разглаживания кожи и предотвращения или уменьшения появления покрытой морщинами, морщинистой или старой кожи.

При использовании небольшое количество состава, например от 1 до 100 мл, наносят на экспонированные (подвергнутые воздействию) области кожи из подходящего контейнера или аппликатора и, при необходимости, его затем распределяют по поверхности кожи и/или втирают в кожу, используя руку или пальцы или подходящее устройство.

Форма продукта и упаковка Состав данного изобретения для местной обработки кожи может быть составлен в виде лосьона, крема или геля. Состав может быть упакован в подходящий контейнер, который соответствует его вязкости и предполагаемому использованию потребителем. Например, лосьон или крем можно упаковать в бутылку или аппликатор с валиком-шариком для нанесения; или аэрозольное устройство, управляемое пропеллентом, или контейнер, снабженный насосом, подходящим для приведения в действие с помощью пальца. Когда состав представляет крем, его можно просто хранить в недеформируемой бутылке или контейнере сжатия, таком как тюбик, или баночке с крышкой. Состав может быть также заключен в капсулы, такие как капсулы, описанные в Патенте США 5063507, на который здесь ссылаются. Таким образом, изобретение также обеспечивает закрытый контейнер, содержащий косметически приемлемый состав, как определено в нем.

Следующие далее конкретные примеры иллюстрируют изобретение, но изобретение не ограничивается ими. Во всех примерах ресвератрол получают от Sigma. Для расчета всех значений р используют критерий t стьюдента.

ПРИМЕР 1 Этот пример иллюстрирует, что ресвератрол представляет фитоэстроген.

Нижеследующий тест используют для определения, имеет ли ресвератрол эстроген-подобную активность.

ZR75 клеточная линия представляет клеточную линию дистальной карциномы молочной железы, первоначально выделенную из злокачественного эпителия молочной железы, полученного от женщины с Кавказа шестидесяти трех лет (Engel et al. , Human breast, carcinoma cells in continuous culture: A review., Cancer Res., 38: 4327-4339, 1978). Эта клеточная линия содержит рецепторы для эстрогена, прогестерона и других стероидных гормонов, но отвечает посредством увеличения пролиферации только на эстроген. Клеточная линия содержит специфические рецепторы с высоким сродством к эстрогену. Поэтому эту клеточную линию используют для определения эстроген-подобной активности (Markiewicz et al., In vitro bioassays of non-steroidal phytoestrogens, J. Steroid Biochem. Molec. Biol., 45: 399-405, 1993).

Методология, используемая для определения скорости синтеза ДНК в клетках Включение ³Н-тимидина культивируемыми клетками используют для тестирования клеточной пролиферации (как для ZR75 клеток, так и для кератиноцитов). Тимидин является одним из четырех дезоксинуклеозидов, которые являются мономерными единицами ДНК. Перед делением соматических клеток полный геном делящейся клетки реплицируется. В процессе репликации в клетке синтезируется ДНК, что позволяет обеим дочерним клеткам получить идентичные копии генетического материала. Когда ³Н-тимидин добавляют в культуральные среды клеток, которые синтезируют ДНК в подготовке к делению клеток, тогда меченый тимидин включается во вновь синтезируемую ДНК. Степень включения ³Н-тимидина в популяцию клеток пропорциональна скорости синтеза ДНК этой популяцией клеток и поэтому является показателем их клеточной пролиферации.

ZR75 клетки (от American Type Culture Collection, Rockville, Maryland) культивируют в RPMI1640 среде (от Gibco Life Technologies) с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 100 единицами пенициллина на мл и 100 единицами стрептомицина на мл. Все инкубации выполняют при 37^oС в 5% СО₂. Среды не содержат Фенол Красный (слабый миметик эстрогена). Клетки высевают при плотности один миллион на флакон 75 см². Для эксперимента клетки высевают в 24-луночные планшеты при 100000 клеток на мл в лунке.

После культивирования в течение 24 часов среду удаляют, клетки промывают РВS (0,01 М фосфат натрия, 0,136 М хлорид натрия, 0,0027 М хлорид калия, рН 7,4) и добавляют 1 мл RPMT 1640 без сыворотки (но со стрептомицином и пенициллином). Приготавливают исходные растворы ресвератрола в диметилсульфоксиде (ДМСО, DMSO) и эстрадиола в воде. Затем непосредственно в каждую лунку дозируют различные концентрации ресвератрола и эстрадиола, как указано в табл.1. После дополнительных 24 часов один мкКи [метил-3Н] тимидин добавляют в каждую лунку. Среду удаляют спустя 24 часа. Клетки промывают один раз PBS. PBS удаляют полностью и клетки оставляют на льду, чтобы инкубировать с 1 мл на лунку 10% ТХУ (ТСА) (трихлоруксусная кислота) в течение 30 минут. Планшеты промывают 3 раза 5% ТХУ, чтобы удалить все следы тимидина, который не включился в клетки. В каждую лунку добавляют 500 мкл 0,1 М гидроксида натрия и планшеты инкубируют при комнатной температуре в течение, по крайней мере, 30 минут. 250 мкл каждой пробы переносят в флаконы для сцинтилляционного счета и после добавления 5 мл сцинтилляционной жидкости просчитывают флаконы в течение 5 минут каждый на установке для трития. Данные, усредненные для четырех лунок, рассчитывают как % включения тимидина в ДНК в сравнении с данными контрольных лунок, в которые не вносили ресвератрол или эстрадиол. Значения выражают как среднее четырех лунок стандартное отклонение.

Результаты, которые были получены, суммированы в табл.1.

Контрольное значение включения ³Н тимидина для эксперимента 1 составляет 71513 имп/мин, и контроль для эксперимента 2 составляет 114958 имп/мин.

Результаты в табл. 1 демонстрируют, что эстрадиол, известный эстроген, стимулирует пролиферацию ZR 75 клеток, как и ожидалось. Ресвератрол повышает пролиферацию ZR 75 клеток при концентрации от 5 до 20 мкМ.

ПРИМЕР 2 Этот пример демонстрирует, что ресвератрол ингибирует пролиферацию кератиноцитов.

1. Нормальные кератиноциты человека, изолированные из крайней плоти новорожденного обработкой трипсином, выращивают в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DME) с 5% фетальной телячьей сывороткой в присутствии 3Т3 мышиных фибробластов, обработанных митомицином С для образования колоний делящихся кератиноцитов. Кератиноциты выращивают в вышеупомянутых условиях до их третьего пассажа.

2. Для экспериментов кератиноциты третьего пассажа помещают в бессывороточную среду для выращивания кератиноцитов (СВК, KGM; полученную от Clonetics, San Diego, California), содержащую 0,09 мМ кальция. Приблизительно 30000 клеток помещают в каждую лунку 6-луночных культуральных планшетов и культивируют в течение 5 дней до тех пор, пока клетки не достигнут приблизительно 40% слияния.

3. Среду заменяют на свежую среду (КВМ; получаемую от Clonetcics) и добавляют ресвератрол в ДМСО (диметилсульфоксид) до концентрации, указанной в табл.2. Конечная концентрация ДМСО в среде составляла 0,1%. К среде контрольных культур добавляли 0,1% ДМСО без ресвератрола. Каждую концентрацию испытывают в трех отдельных лунках. После четырех часов 1 мкКи ³Н-тимидина (Amersham Corp., Sp активность 40 Ки/ммоль) добавляют к 1 мл среды в каждой лунке. Клетки инкубируют в течение 2 часов. Количество ³Н-тимидина, связанного с клеточной ДНК кератиноцитов, оценивают, как описано ниже.

4. Среду отсасывают и лунки промывают 1 мл PBS. Затем ДНК и белки клеток в планшете осаждают, добавляя 1 мл охлажденной льдом 10% ТХУ (ТСА). Планшеты оставляют на льду в течение 30 минут, чтобы завершить процесс осаждения. Затем ТХУ отсасывают и затем каждую лунку промывают 4 раза 5% ТХУ. Клетки в лунках растворяют в 0,5 мл 0,1 N гидроксида натрия. Затем 200 мкл переносят в сцинтилляционные флаконы для оценки включения тимидина и 25 мкл используют для анализа белка, используя реагент для ВСА анализа белков, как описано ниже. К остатку раствора в флаконе добавляют 5 мл сцинтилляционной жидкости (Scintiverse) и флаконы просчитывают с помощью сцинтилляционного счетчика, определяя количество радиоактивности в каждой пробирке.

ВСА (Бицинхониновая (bicinchoninic) кислота) анализ белков 25 мкл суспензии клеток помещают в 96-луночный планшет. БСА (BSA, бычий сывороточный альбумин), используемый в качестве стандарта в 0,1 N гидроксиде натрия, также вносят в 3 лунки 96-луночной планшеты. Компонент реагента для ВСА анализа белков добавляют (200 мкл/лунка) и планшету инкубируют в течение 2 часов при комнатной температуре. Определяют поглощение при длине волны 570 нм на спектрофотометре Dynatech MR7000 для планшет.

Затем скорость синтеза ДНК рассчитывают как число имп/мин ³Н-тимидина, включенного в общее количество клеточной ДНК/мкг клеточного белка для каждой индивидуальной лунки. Кроме того, рассчитывают среднее и стандартное отклонение для каждой группы. Эти числа выражают как процент по отношению к контрольным лункам. Данные для каждой точки выражают как среднее из трех лунок стандартное отклонение.

Полученные результаты суммированы в табл. 2.

Считают, что р-значения меньше чем 0,5 указывают на статистическую значимость.

Как следует из результатов табл.2, ресвератрол до концентрации 1,56 мкМ значительно снижает синтез ДКК кератиноцитов. 1,56 мкМ ресвератрола снижает пролиферацию кератиноцитов до 50%. В обоих экспериментах 50 мкМ ресвератрола ингибирует синтез ДНК полностью.

ПРИМЕР 3 Пример 2 повторяют при различных дополнительных концентрациях ресвератрола. Полученные результаты суммированы в табл.3.

Из результатов табл.3 можно видеть, что ресвератрол не эффективен в уменьшении пролиферации кератиноцитов при концентрациях ниже чем 0,8 мкМ (или 0,000018 мас. %, включая очень низкую концентрацию 0,33 мкМ, которая составляла бы максимальную концентрацию (ресвератрола), присутствующего в 0,5% экстракте винограда, раскрытом в Пат. Японии 6336421.

ПРИМЕР 4 Этот пример демонстрирует, что ресвератрол индуцирует дифференциацию кератиноцитов.

Методология для измерения трансглутаминазы Во время процесса терминальной дифференциации в эпидермисе слой белка толщиной 15 нм, известный как ороговевшая оболочка (00, СЕ), образуется на внутренней поверхности периферии клетки. 00 (СЕ) состоит из многочисленных различных белков, которые перекрестно сшиты вместе путем образования N'-((-глутамил) лизин изодипептидных связей, катализируемого действием, по крайней мере, двух различных трансглутаминаз, экспрессируемых в эпидермисе. Трансглутаминаза (TG-1) экспрессируется в избытке в дифференцированных слоях эпидермиса, особенно гранулярном слое, но отсутствует в недифференцированном базальном эпидермисе. Таким образом, TG-1 является полезным маркером дифференциации эпидермальных кератиноцитов с высокими уровнями TG-1, указывающими более дифференцированное состояние. Оценку состояния дифференциации культивируемых кератиноцитов в примерах, которые следуют ниже, проводят при определении уровня TG-1 методом ELISA с анти TG-1 антителами.

Уровень TG-1 измеряют следующим образом. Кератиноциты получают, как описано в Примере 2. Для эксперимента около 30000 клеток помещают в каждую лунку 6-луночного планшета и выращивают в течение пяти дней до тех пор, пока клетки не достигнут около 20-30% слияния. К каждой лунке ежедневно добавляют 2 мл свежей среды KGM с 2 мкл 2-50 мМ ресвератрола в ДМСО в течение 3 дней. В контрольные лунки также добавляют 2 мкл ДМСО. После 3 дней обработки клетки промывают дважды PBS и помещают в морозильник на 2 часа. Затем клетки оттаивают в течение 2 часов. Содержание ДНК в клетках определяют количественно, используя связывающееся с ДНК флуоресцирующее соединение, бис-бензимидазол (Hoechst 33258), и измеряя удельную флюоресценцию связанного с ДНК флуоресцирующего соединения при 450 нм (возбуждение при 360 нм).

Уровни TG-1 в клетках в лунках определяют, используя TG-1 специфическое моноклональное антитело (ВС1 (первое антитело) (полученное от Amersham Life Sciences) и используя фрагмент меченного пероксидазой кроличьего антимышиного IgG (второе антитело). Планшеты блокируют 5% обезжиренным молоком в TBS (0,01 М Трис, 0,150 М хлорид натрия, рН 8,0) в течение одного часа с последующей 2-часовой инкубацией с первым антителом (разведение 1:4000) в TBS, содержащим 1% молоко при комнатной температуре. После промывания планшетов три раза TBS, содержащим 1% молоко и 0,05% Твин 20 (Tween 20), планшеты инкубируют с вторым антителом (разведение 1:4000) при комнатной температуре в течение двух часов. Планшеты промывают три раза TBS/l% молоко/Твин и три раза TBS. При инкубации с о-фенилен диамином и перекисью водорода появляется окрашивание. Поглощение измеряют при 492 нм на Ultrospec 3000 спектрофотометре (Рharmacia Biotech) и уровни TG-1 рассчитывают как поглощение при 492 нм/флюоресценция ДНК. Среднее стандартное отклонение, по крайней мере, 3 отдельных лунок используют для расчета и статистического анализа данных. Значения выражают как поглощение для TG-1 на произвольную единицу флюоресценции ДНК трех лунок стандартное отклонение. Результаты также выражают как % контроля.

Полученные результаты суммированы в табл. 4.

Данные, полученные при 10 мкМ ресвератрола, незначительно отличаются от контроля в Эксперименте 1 вследствие обычных экспериментальных вариаций в биологических системах, но все другие концентрации значительно повышают экспрессию трансглутаминазы в кератиноцитах, тем самым подтверждая, что ресвератрол усиливает дифференциацию кератиноцитов. В Эксперименте 2 все концентрации ресвератрола от 2 мкМ и выше значительно усиливают дифференциацию кератиноцитов.

ПРИМЕР 5 Этот пример демонстрирует, что ресвератрол смягчает воспаление кожи, которое может быть вызвано альфа-оксикислотами.

Ресвератрол является известным ингибитором циклооксигеназы. Ингибирование циклооксигеназы уменьшает превращение арахидоновой кислоты в противовоспалительные вещества, такие как простагландины, включая PGE2. Хотя ингибирование циклооксигеназы, как ожидалось, должно уменьшать воспаление, не все ингибиторы циклооксигеназы уменьшают раздражение, потенциально связанное с косметическим ингредиентом, таким как альфа-оксикислоты.

Пример 5А Метод испытания на раздражение Испытание пятном с четырьмя экспозициями. Цель состояла в том, чтобы сравнить уровень раздражения, получаемого под воздействием различных испытываемых веществ после повторных нанесений пятна. Испытываемые вещества выдерживают в контакте с кожей при occlusive обтурирующих условиях. Наружная часть плеча участника испытания была выбрана в качестве области для нанесения. Перевязку бандажного типа (Scanpor липкая лента) используют для того, чтобы удержать пятна (25 мм повязка Hill Top Chamber, снабженная диском диаметром 18 мм с подложкой Webril) на месте. Используют оба плеча участника испытания. Пятна наносились в сбалансированном случайном порядке.

Пятна наносят в 9:00 ч в понедельник утром и удаляют в 9:00 ч во вторник утром (экспозиция 24 ч). Новую серию пятен наносят в 3:00 ч во вторник в полдень и удаляют в среду утром в 9:00 ч (экспозиция 18 ч). Третью серию пятен наносят в 3: 00 ч в среду в полдень и удаляют в четверг утром в 9:00 ч (экспозиция 18 ч). Конечную серию пятен наносят в 3:00 ч в четверг в полдень и удаляют в пятницу утром в 9:00 ч (экспозиция 18 ч).

Каждый раз пятна удаляют, указанные места промывают теплой водой и сушат похлопывающим движением. Затем места испытаний маркируют хирургической ручкой для метки кожи, чтобы гарантировать местоположение для сортировки и последующих нанесений пятен. Места испытаний оценивают в 3:00 пополудни во вторник, среду, четверг и пятницу, в дни испытания, до повторного нанесения пятна.

Ожидается раздражение кожи, такое как умеренная краснота, сухость и/или зудящее ощущение места испытания. Возможна припухлость мест испытаний. Если какое-либо место испытания имеет умеренную красноту или какую-либо припухлость при любой оценке, то такое конкретное место испытания не подвергают повторному нанесению пятна.

Места испытаний на каждом плече оцениваются визуально двумя специально подготовленными экспертами при соответствующем освещении. Места испытаний оценивают в порядке серьезности. Эксперт, оценивающий ответные реакции в первом периоде оценки, продолжал оценивать эти места каждый день на протяжении периода исследования.

При оценке ответных реакций месту с наиболее серьезным ответом дают наименьший счет. Месту со вторым наиболее серьезным ответом дают второй наименьший счет и т.д. Никакой принудительной оценки не было. Если два или несколько мест не имели никакой ответной реакции или имели ту же самую ответную реакцию (никакого различия между местами), приписывали среднее из оценок. Если место испытания отбрасывалось из-за степени раздражения, это место сохраняло оценку, которая присваивалась на время прекращения дозирования.

Статистический анализ Результаты оценки обработок пятном статистически сравнивают с помощью непараметрических статистических методов. Испытываемые вещества, содержащие антираздражители, сравнивает с соответствующим контролем, содержащим только оксикислоту, используя сумму оценок по Фридману в каждой точке оценки с участником испытания, действующим как группа (т.е. каждый участник испытания испытывается обработкой каждого теста). Считают, что р-значение меньше чем 0,10 указывает на статистическую значимость.

Составы, содержащие ингредиенты, указанные в табл. 5А, испытывают, используя метод испытания на раздражение. Двадцать субъектов (20) были подвергнуты испытанию. Полученные результаты суммированы в табл.5А. Чем выше сумма оценок, тем меньше раздражение.

Из результатов табл.5А можно видеть, что ресвератрол (Состав 3) значительно снижает раздражение, индуцированное составом 2 (содержащий 8% гликолевой кислоты) на день 1, после начальной экспозиции состава 2.

Сравнительный Пример 5В Составы, содержащие ингредиенты, указанные в табл.5В, испытывают, используя метод испытания на раздражение, описанный в Примере 5А. Двадцать два (22) субъекта были подвергнуты испытанию. Результаты, которые были получены, суммированы в табл.5В. Чем выше сумма оценок, тем меньше раздражение.

Из результатов табл.5В можно видеть, что ибупрофен, известный противовоспалительный ингредиент (состав 4), не уменьшает раздражение рецептуры, которая содержит 8% кликолевой кислоты (состав 2).

Сравнительный Пример 5С Составы, содержащие ингредиенты, указанные в табл.5С, испытывают, используя метод испытания на раздражение, как описано в Примере 5А. Девятнадцать (19) субъектов были подвергнуты испытанию. Результаты, которые были получены, суммированы в табл.5С. Чем выше сумма оценок, тем меньше раздражение.

Из результатов табл.5С можно видеть, что индометацин, известный ингибитор cyclo-оксигеназы и прот