Стабильный неводный препарат пептидного соединения, способ его получения и способ лечения гормон-зависимого заболевания у субъекта

Стабильный неводный препарат пептидного соединения, способ его получения и способ лечения гормон-зависимого заболевания у субъекта

Реферат

 

Изобретение относится к области медицины. Изобретение касается стабильных неводных протонных препаратов пептидных соединений. Данные стабильные препараты содержат пептид в неводном протонном растворителе. Они могут храниться при повышенных температурах (например, 37^oС) в течение длительного времени, и их применяют, в особенности, в имплантируемых доставляющих устройствах для длительной доставки лекарственного вещества. Изобретение обеспечивает продолжительное действие стабильного пептида с высокими концентрациями и повышенной температурой при лечении гормон-зависимых заболеваний. 3 с. и 29 з.п. ф-лы, 11 ил., 10 табл.

Область техники, к которой относится изобретение Изобретение относится к стабильным неводным протонным препаратам пептидных соединений. В частности, представлены препараты с высокими концентрациями пептидных соединений.

Уровень техники Лютеинизирующий гормон-высвобождающий гормон (LHRH), известный также как гонадотропин-высвобождающий гормон (GnRH), является декапептидом структуры: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂.

Он секретируется гипоталамусом и связывается рецепторами гипофиза, высвобождая лютеинизирующий гормон (LH) и фолликул-стимулирующий гормон (FSH). LH и FSH стимулируют синтез стероидных гормонов половыми железами. Известны многочисленные аналоги LHRH, включая пептиды, близкие LHRH, которые действуют как агонисты и пептиды, которые действуют как антагонисты (Zoladex (золадекс) (имплантат госерелина ацетата), справочник Physician's Desk Reference, 50-е изд., стр. 2858-2861 (1996); Патент США 3914412, выданный 21 октября 1975 г.; Патент США 4547370, выданный 15 октября 1985 г.; Патент США 4661472, выданный 28 апреля 1987 г.; Патент США 4689396, выданный 25 августа 1987 г. ; Патент США 4851385, выданный 25 июля 1989 г.; Патент США 5198533, выданный 30 марта 1993 г.; Патент США 5480868, выданный 02 января 1996 г.; WO92/20711, опубликованная 26 ноября 1992 г.; WO95/00168, опубликованная 05 января 1995 г. ; WO95/04540, опубликованная 16 февраля 1995 г.; Статья "Stability of Gonadorelin and Triptorelin in Aqueous Solution", V.J. Helm, B. W. Muller, Pharmaceutical Research, 7/12, стр. 1253-1256 (1990); Статья "New Degradation Product of Des-Gly¹⁰-NH₂-LH-RH-Ethilamide (Fertirelin) in Aqueous Solution", J. Okada, T. Seo, F.Kasahara, K.Takeda, S.Kondo, J. of Pharmaceutical Sciences, 80/2, стр. 167-170 (1991); Статья "Characterizaton of the Solution Degradation Product of Histrelin, a Gonadotropin Releasing Hormone (LHRH) Agonist", A.R.Oyler, R.E.Naldi, J.R.Lloyd, D.A.Graden, C.J. Shaw, M.L.Cotter, J. of Pharmaceutical Sciences, 80/3, стр. 271-275 (1991); Статья "Parenteral Peptide Formulations: Chemical and Physical Properties of Native Luteinizing Hormone-Releasing Hormone (LHRH) and Hydrophobic Analogues in Aqueous Solution", M.F. Powell, L.M.Sanders, A.Rogerson, V.Si, Pharmaceutical Research, 8/10, стр. 1258-1263 (1991)). Описание каждой публикации, патента или патентной заявки введено в заявку в виде ссылки во всей полноте в той же мере, как если бы содержание каждой отдельной публикации, патента или патентной заявки было специально и индивидуально введено посредством ссылки.

Известно, что аналоги LHRH используют для лечения гормон-зависимых заболеваний, таких как рак простаты, доброкачественная простатомегалия, эндометриоз, миома матки, фиброма матки, преждевременное половое созревание или рак молочной железы, а также в качестве противозачаточных средств (Патент США 5480868, выданный 02 января 1996 г.). Назначение лекарств с непрерывным их высвобождением является предпочтительным как для агонистов близких LHRH соединений, которые снижают число доступных рецепторов после повторного приема лекарства таким образом, что подавляется образование стероидных гормонов, так и для антагонистов близких LHRH соединений, которые должны вводиться непрерывно для постоянного ингибирования эндогенного LHRH (Патент США 5480868, выданный 02 января 1996 г.).

Непрерывная (продолжительная) парентеральная доставка лекарств, особенно пептидных лекарств, имеет множество преимуществ. Применение имплантируемых устройств для непрерывной доставки широкого круга лекарств или других полезных агентов хорошо известно в уровне техники. Типичные устройства описаны, например, в Патентах США 5034229, 5057318 и 5110569. Описание каждого из данных патентов введено здесь в виде ссылки.

В общем случае биодоступность пептидов, включая близкие LHRH соединения, при пероральном введении является низкой (Статья "Degradation of the LHRH Analog Nafarelin Acetate in Aqueous Solution", D.M.Johnson, R.A.Pritchard, W. F.Taylor, D.Conley, G.Zuniga, K.G.McGreevy, Intl.J. of Pharmaceutics, 31, стр. 125-129 (1986); Статья "Percutaneous Absorption Enhancement of Leuprolide", M. Y. Fu Lu, D. Lee, G.S.Rao, Pharmaceutical Research, 9/12, стр. 1575-1576 (1992)).

Имеющиеся в настоящее время в продаже водные препараты LHRH, его аналогов и близких соединений, которые используют для парентеральных инъекций, обычно содержат относительно низкие концентрации близких LHRH соединений (0,05 до 5мг/мл) и могут также содержать наполнители, такие как маннит или лактозу (Lutrepulse (латрепалс) (гонадорелина ацетат для внутривенных инъекций), Справочник Physician's Desk Reference, 50-е изд., стр. 980-982 (1996); Factrel (фактрел) (гонадорелин HCI для подкожных и внутривенных инъекций), Справочник Physician's Desk Reference, 50-е изд., стр.2877-2878 (1996); Lupron (лапрон) (лейпролида ацетат для подкожных инъекций), Справочник Physician's Desk Reference, 50-е изд., стр. 2555-2556 (1996)). Такие препараты близких LHRH соединений должны либо храниться охлажденными, либо они могут храниться при комнатной температуре в течение коротких периодов времени.

Доступные депо-препараты близких LHRH соединений, которые назначают для непрерывного высвобождения в течение 1-3 месяцев, включают препарат, содержащий 15% близкого LHRH соединения, диспергированного в матриксе сополимера D,L-мoлoчнoй и гликолевой кислот, представляющий собой цилиндр для подкожного введения (Zoladex (золадекс) (имплантат госерелина ацетата), справочник Physician's Desk Reference, 50-е изд., стр. 2858-2861 (1996)) и препарат, состоящий из микрочастиц, содержащих ядро из близкого LHRH соединения и желатина, которые окружены оболочкой из сополимера D.L-молочной и гликолевой кислот. Данные микрочастицы суспендированы в разбавителе для подкожной или внутримышечной инъекции (Lupron depot (лапрон депо) (лейпролида ацетат для депо-суспензии), Справочник Physician's Desk Reference, 50-е изд., стр. 2556-2562 (1996); Статья "Preparation of Three-Month Depot Injectable Microspheres of Leuprorelin Acetate Using Biodegradable Polymers", Pharmaceutical Research, 11/8, стр. 1143-1147 (1994)). Эти продукты могут храниться при комнатной или более низкой температуре. Известно, что водные препараты близких LHRH соединений отличаются как химической, так и физической нестабильностью, а также разлагаются после облучения (Статья "Stability of Gonadorelin and Triptorelin in Aqueous Solution", V.J. Helm, B.W.Muller, Pharmaceutical Research, 7/12, стр. 1253-1256 (1990); Статья "New Degradation Product of Des-Gly¹⁰-NH₂-LH-RH-Ethilamide (Fertirelin) in Aqueous Solution", J. Okada, T. Seo, F.Kasahara, K.Takeda, S.Kondo, J. of Pharmaceutical Sciences, 80/2, стр. 167-170 (1991); Статья "Characterizaton of the Solution Degradation Product of Histrelin, a Gonadotropin Releasing Hormone (LHRH) Agonist", A. R. Oyler, R. E.Naldi, J.R.Lloyd, D.A.Graden, C.J.Shaw, M.L.Cotter, J. of Pharmaceutical Sciences, 80/3, стр. 271-275 (1991); Статья "Parenteral Peptide Formulations: Chemical and Physical Properties of Native Luteinizing Hormone-Releasing Hormone (LHRH) and Hydrophobic Analogues in Aqueous Solution", M. F. Powell, LM.Sanders, A.Rogerson, V.Si, Pharmaceutical Research, 8/10, стр. 1258-1263 (1991); Статья "Degradation of the LHRH Analog Nafarelin Acetate in Aqueous Solution", D.M.Johnson, R.A.Pritchard, W.F.Taylor, D. Conley, G. Zuniga, K.G.McGreevy, Intl.J. of Pharmaceutics, 31, стр. 125-129 (1986); Статья Pharmaceutical Manipulation of Leuprorelin Acetate to Improve Clinical Performance", H. Toguchi, J. of Intl. Medical Research, 18, стр. 35-41 (1990); Статья "Long-Term Stability of Aqueous Solutions of Luteinizing Hormone-Releasing Hormone Assessed by an In-Vitro Bioassay and Liquid Chromatography", Y. F. Shi, R.J. Sherins, D.Brightwell, J.F. Gallelli, D.C. Chatterji, J. of Pharmaceutical Sciences, 73/6, стр. 819-821 (1984); Статья "Peptide Liquid Crystals: Inverse Correlation of Kinetic Formation and Thermodynamic Stability in Aqueous Solution", M.F. Powell, J. FIeitman, L.M. Sanders, V. C. Si, Pharmaceutical Research, 11/9, стр. 1352-1354 (1994); Статья "Solution Behavior of Leuprolide Acetate, an LHRH Agonist, as Determined by Circular Dichroism Spectroscopy", M.E. Powers, A.Adejei, M.Y.Fu Lu, M.C. Manning, Intl.J. of Pharmaceutics, 108, стр. 49-55 (1994)).

Препараты, которые, как было показано, являлись стабильными (t₉₀ приблизительно пять лет) были очень низкоконцентрированными (25 мкг/мл) водными забуференными (10 мМ буфер, ионная сила 0,15) растворами, которые хранили при температурах, не превышающих комнатную температуру (25^oС) (Статья "Parenteral Peptide Formulations: Chemical and Physical Properties of Native Luteinizing Hormone-Releasing Hormone (LHRH) and Hydrophobic Analogues in Aqueous Solution", M.F. Powell, L.M. Sanders, A.Rogerson, V.Si, Pharmaceutical Research, 8/10, стр. 1258-1263 (1991)).

Существует потребность в стабильных препаратах пептидов.

Сущность изобретения Данное изобретение представляет стабильные неводные препараты, которые являются растворами пептидных соединений в неводных протонных растворителях. В частности, предложены препараты с концентрациями пептида, по меньшей мере, приблизительно 10%. Данные стабильные препараты могут храниться при повышенных температурах (например, 37^oС) в течение длительных периодов времени, и особенно пригодны для использования в имплантируемых доставляющих устройствах для продолжительной доставки (например, 1-12 месяцев или дольше) лекарственного вещества.

В одном аспекте изобретение представляет стабильные неводные препараты пептидных соединений, где указанные препараты содержат, по меньшей мере, одно пептидное соединение в, по меньшей мере, одном неводном протонном растворителе. В частности, предпочтительные препараты включают, по меньшей мере, приблизительно 10% (маc./маc.) пептидного соединения.

В другом аспекте изобретение представляет способы приготовления стабильного неводного препарата пептидного соединения, где указанные способы предусматривают растворение, по меньшей мере, одного пептидного соединения в, по меньшей мере, одном неводном протонном растворителе. Предпочтительные препараты содержат, по меньшей мере, приблизительно 10% (маc./маc.) пептидного соединения.

В еще одном аспекте изобретение представляет способы лечения субъекта, страдающего от состояния, которое может быть облегчено назначением приема пептидного соединения, где указанные способы предусматривают введение указанному субъекту эффективного количества стабильного неводного препарата, содержащего, по меньшей мере, одно пептидное соединение и, по меньшей мере, один неводный протонный растворитель.

Перечень фигур чертежей Фиг. 1 иллюстрирует стабильность раствора 40% лейпролида ацетата в пропиленгликоле (ПГ) через два месяца хранения при 80^oС при определении с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии) (RP-HPLC).

На фиг. 2 представлена RP-HPLC того же самого образца, что показан на фиг. 1, подвергнутого хроматографии с использованием молекулярных сит или гель-фильтрации (SEC), которая показывает образование 3%димеров и тримеров и отсутствие обнаружения агрегатов высшего порядка.

На фиг. 3 представлен график Аррениуса, показывающий потерю лейпролида в 40%-ных растворах лейпролида ацетата в пропиленгликоле (ПГ).

Фиг. 4 иллюстрирует потерю лейпролида в 40%-ном растворе лейпролида в ПГ спустя период от четырех до шести месяцев хранения при 37^oС, 50^oС, 65^oС или 80^oС.

Фиг. 5 иллюстрирует химическую и физическую стабильность 40% раствора лейпролида в ПГ спустя четыре месяца хранения при 80^oС.

Фиг. 6 иллюстрирует химическую стабильность 40% раствора лейпролида ацетата в ПГ через девять месяцев хранения при 37^oС.

Фиг. 7 иллюстрирует химическую стабильность 40% раствора лейпролида ацетата в ПГ/ацетатном буфере (30:70) спустя один год хранения при 37^oС.

Фиг. 8 иллюстрирует физическую стабильность 40% раствора лейпролида ацетата в ПГ/ацетатном буфере (30:70) через один год хранения при 37^oС.

Фиг. 9 иллюстрирует стабильность 40% раствора лейпролида ацетата в ПГ/воде с консервантами (30:70) через шесть месяцев хранения при 60^oС после облучения.

Фиг. 10 иллюстрирует длительную стабильность 40% раствора лейпролида ацетата в ПГ/воде (30: 70) спустя шестимесячный период хранения при 37^oС после облучения.

Фиг. 11 иллюстрирует стабильность 30% раствора госерелина в ПЭГ (полиэтиленгликоль) 600/ацетатном буфере (30:70) через 14 дней хранения при 80^oС.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения Данное изобретение подводит к неожиданному открытию того, что растворение пептидных соединений в неводных протонных растворителях приводит к образованию стабильных водных препаратов. Ранее известные препараты пептидных соединений, которые представляют собой разбавленные забуференные водные растворы, содержащие наполнители, такие как EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) или аскорбиновая кислота, которые должны храниться при низких температурах (4-25^oС), образуют продукты разложения посредством таких способов разложения, как катализируемый кислотой/щелочью гидролиз, дезамидирование, рацемизация и окисление. Напротив, описанные в данной заявке препараты стабилизируют пептидные соединения при повышенных температурах (например, от 37^oС до 80^oС) и при высоких концентрациях (т.е., по меньшей мере, приблизительно 10%).

Стандартные пептидные и белковые препараты состоят из разбавленных водных растворов. Два важнейших для пептидного препарата аспекта включают солюбилизацию (растворение) и стабилизацию молекулы лекарственного вещества.

Солюбилизация пептида в водных условиях является стандартной, поскольку она имитирует природные условия. Однако солюбилизация в неводных условиях не известна. Мы обнаружили, что возможно получить пептидный препарат в неводных протонных растворителях.

Стабильность пептида обычно достигается варьированием одного или более из следующих параметров: рН, тип буфера, ионная сила, наполнители (EDTA, аскорбиновая кислота и т.п.). Для данных препаратов пути разложения, при которых требуется присутствие воды (гидролиз, дезамидирование, рацемизация), не могут быть полностью стабилизированы. Напротив, в данном изобретении показано, что препараты высококонцентрированных пептидов в неводных растворах, таких как пропиленгликолевый и полиэтиленгликолевый, являются химически и физически стабильными. Данные растворители считают неводными протонными растворителями. Действие ряда неводных протонных растворителей может заключаться в уменьшении скорости разложения, поскольку они не имеют больших дипольных моментов, необходимых для стабилизации стадий, обусловливающих скорость.

Изобретение заключается в использовании неводных протонных растворителей, таких как пропиленгликоль и полиэтиленгликоли, для стабилизации препаратов высококонцентрированных пептидов и белков в отношении как химического, так и физического разложения. Открытие состоит в осознании того, что применение пропиленгликоля или полиэтиленгликолей улучшает общую растворимость и стабильность пептидов в широких пределах условий нахождения препарата, включая высокие концентрации и повышенные температуры, и тем самым делает возможной доставку пептидов в имплантируемых доставляющих устройствах, которая иным способом была бы неосуществимой.

А. Определения.

Термины, используемые в контексте данной заявки, имеют следующие значения: Термин "химическая стабильность" означает, что процент продуктов разложения, образующихся химическими путями, такими как окисление или гидролиз, является приемлемым. В частности, препарат считают химически стабильным, если спустя два месяца хранения при 37^oС образуется не более, чем приблизительно 20% продуктов распада.

Термин "физическая стабильность" означает, что процент агрегатов (например, димеров, тримеров и более крупных форм) является приемлемым. Вчастности, препаратсчитаютфизически стабильным, если через два месяца хранения при 37^oС образуется не более, чем приблизительно 15% агрегатов.

Термин "стабильный препарат (состав)" означает, что через два месяца хранения при 37^oС (или в эквивалентных условиях при повышенной температуре) остается, по меньшей мере, приблизительно 65% химически и физически стабильного пептидного соединения. В частности, предпочтительными препаратами являются препараты, которые сохраняют, по меньшей мере, приблизительно 80% химически и физически стабильного пептида в данных условиях. Особенно предпочтительными стабильными препаратами являются препараты, которые не разлагаются после стерилизующего облучения (например, -, -лучами или электронным пучком).

Термины "пептид" и/или "пептидное соединение" означают полимеры из не более, чем 50 остатков аминокислот, связанных амидными (CONH) связями. Аналоги, производные, агонисты, антагонисты и фармацевтически приемлемые соли любого из указанных материалов включают в данные термины. Термины включают также пептиды и/или пептидные соединения, которые содержат D-аминокислоты, модифицированные, дериватизированные или не существующие в естественных условиях аминокислоты в D- или L-конфигурации и/или пептомиметические единицы, являющиеся частью их структуры.

Термин "близкое LHRH соединение" означает лютеинизирующий гормон-высвобождающий гормон (LHRH) и его аналоги и фармацевтически приемлемые соли. Окта-, нона- и декапептидные агонисты и антагонисты LHRH включены в понятие близкие LHRH соединения, равно как природный LHRH. В частности, предпочтительные близкие LHRH соединения включают LHRH, лейпролид, госерелин, нафарелин и другие известные активные агонисты и антагонитсы (Zoladex (золадекс) (имплантат госерелина ацетата), справочник Physician's Desk Reference, 50-е изд., стр. 2858-2861 (1996); Патент США 3914412, выданный 21 октября 1975 г. ; Патент США 4547370, выданный 15 октября 1985 г.; Патент США 4661472, выданный 28 апреля 1987 г.; Патент США 4689396, выданный 25 августа 1987 г.; Патент США 4851385, выданный 25 июля 1989 г.; Патент США 5198533, выданный 30 марта 1993 г.; Патент США 5480868, выданный 02 января 1996 г.; W092/20711, опубликованный 26 ноября 1992 г.; WO95/00168, опубликованный 05 января 1995 г. ; WO95/04540, опубликованный 16 февраля 1995 г.; Статья "Stability of Gonadorelin and Triptorelin in Aqueous Solution", V.J. Helm, B.W. Muller, Pharmaceutical Research, 7/12, стр. 1253-1256 (1990); Статья "New Degradation Product of Des-Gly¹⁰NH₂-LH-RH-Ethilaimide (Fertirelin) in Aqueous Solution", J. Okada, T. Seo, F.Kasahara, K.Takeda, S.Kondo, J. of Pharmaceutical Sciences, 80/2, стр. 167-170 (1991); Статья "Characterizaton of the Solution Degradation Product of Histrelin, a Gonadotropin Releasing Hormone (LHRH) Agonist", A. R. Oyler, R.E. Naldi, J.R. Lloyd, D.A. Graden, C.J. Shaw, M. LCotter, J. of Pharmaceutical Sciences, 80/3, стр. 271-275 (1991); Статья "Parenteral Peptide Formulations: Chemical and Physical Properties of Native Luteinizing Hormone-Releasing Hormone (LHRH) and Hydrophobia Analogues in Aqueous Solution", M.F. Poweil, L.M. Sanders, A.Rogerson, V.Si, Pharmaceutical Research, 8/10, стр. 1258-1263 (1991); Статья "Degradation of the LHRH Analog Nafarelin Acetate in Aqueous Solution", D.M.Johnson, R.A. Pritchard, W.F.Taylor, D.Conley, G-Zuniga, K.G. McGreevy, Intl.J. of Pharmaceutics, 31, стр. 125-129 (1986); Статья "Percutaneous Absorption Enhancement of Leuprolide", M. Y. Fu Lu, D. Lee, G.S.Rao, Pharmaceutical Research, 9/12, стр. 1575-1576 (1992); Lutrepulse (латрепалс) (гонадорелина ацетат для внутривенных инъекций), Справочник Physician's Desk Reference, 50-е изд., стр. 980-982 (1996); Factrel (фактрел) (гонадорелин HCI для подкожных и внутривенных инъекций), Справочник Physician's Desk Reference, 50-е изд., стр.2877-2878 (1996); Lupron (лапрон) (лейпролида ацетат для подкожных инъекций), Справочник Physician's Desk Reference, 50-е изд., стр. 2555-2556 (1996); Lupron depot (лапрон депо) (лейпролида ацетат для депо-суспензии), Справочник Physician's Desk Reference, 50-е изд., стр. 2556-2562 (1996)).

Термин "высокая концентрация" означает, по меньшей мере, приблизительно 10% (маc./маc.) и до максимальной растворимости конкретного соединения.

Термин "наполнитель" означает более или менее инертную субстанцию в препарате, которую добавляют как разбавитель или носитель или для придания формы или консистенции. Наполнители отличаются от растворителей, таких как EtOH, который используют для растворения лекарственных веществ в препаратах, от неионных поверхностно-активных веществ, таких как Tween 20, которые используют для солюбилизации лекарственных веществ в препаратах, и от консервантов, таких как бензиловые спирты или метил- или пропилпарабены, которые используют для предупреждения или ингибирования роста микробов.

Термин "неводный протонный растворитель" означает неводный растворитель, который содержит водород, связанный с кислородом или азотом таким образом, что он способен к образованию водородных связей или быть донором протона. Примерами неводных протонных растворителей являются полиэтиленгликоли (ПЭГи), пропиленгликоль (ПГ), поливинилпирролидон (ПВП), метоксипропиленгликоль (МПГ), глицерин и гликофурол.

Термин "полярный непротонный растворитель" означает полярный растворитель, который не содержит кислотный водород и не действует как донор водородной связи. Примерами полярных непротонных растворителей являются диметилсульфоксид (ДМСО), диметилформамид (ДМФ), гексаметилфосфотриамид (триамид гексаметилфосфорной кислоты) (ГМФТ) и н-метилпирролидон.

В. Приготовление препаратов Данное изобретение касается неводных препаратов пептидных соединений в неводном протонном растворителе, которые стабильны в течение увеличенных периодов времени при повышенных температурах. Стандартные разведенные водные препараты пептидов и белков нуждаются в манипуляциях с типом буфера, ионной силой, рН и наполнителями (например, EDTA или аскорбиновой кислотой) для того, чтобы достигнуть стабильности. Напротив, в заявленных препаратах стабильность пептидных соединений достигается путем применения неводных протонных растворителей. В частности, в препаратах, соответствующих данному изобретению была обеспечена стабильность соединения в высоких концентрациях (по меньшей мере приблизительно 10% (маc./маc.).

Примеры пептидов и пептидных соединений, препараты которых могут быть получены с использованием данного изобретения, включают такие пептиды, которые обладают биологической активностью или могут быть использованы для лечения заболевания или другого патологического состояния. Они включают, но не ограничиваются адренокортикотропным гормоном, ангиотензинами I и II, предсердным натрийуретическим пептидом, бомбезином, брадикинином, кальцитонином, церебеллином, динорфином А, - и -эндорфином, эндотелином, энкефалином, эпидермальным ростовым фактором, фертирелином, фолликулярный гонадотропин-высвобождающим пептидом, галанином, глюкагоном, гонадорелином, гонадотропином, госерелином, ростовой фактор-высвобождающим пептидом, гистрелином, инсулином, лейпролидом, LHRH, мотилином, нафарелином, нейротензином, окситоцином, соматостатином, субстанцией Р, фактором некроза опухоли, трипторелином и вазопрессином. Могут быть также использованы аналоги, производные, антагонисты, агонисты и их фармацевтически приемлемые соли.

Пептидные соединения, применяемые в препаратах и способах, соответствующих данному изобретению, могут быть использованы в форме соли, предпочтительно фармацевтически приемлемой соли. Используемые соли известны специалистам и включают соли неорганических кислот, органических кислот, неорганических оснований и органических оснований. Предпочтительными солями являются ацетаты.

Для использования в данном изобретении предпочтительными являются пептиды и пептидные соединения, которые легко растворимы в неводных протонных растворителях. Специалист может легко установить, какие соединения будут использованы, на основе их растворимости, т.е. соединение должно быть растворимым в определенном неводном протонном растворителе до, по меньшей мере, допустимого количества, которое может быть фармацевтически эффективным количеством. Предпочтительные значения растворимости составляют, по меньшей мере, приблизительно 10% (маc./маc.). В частности, предпочтительными пептидными соединениями являются близкие LHRH соединения, включая лейпролид и лейпролида ацетат.

Количественное соотношение пептида может изменяться в зависимости от соединения, состояния, которое лечат, растворимости соединения, ожидаемой дозы и длительности введения. (См., например, монографии The Pharmacological Basis of Therapeutics, Gilman и соавт., 7-ое изд. (1985) и Pharmaceutical Sciences, Remington, 18-е изд. (1990), описания которых введены здесь в виде ссылки). Концентрация пептида в высококонцентрированных препаратах может изменяться в интервале от, по меньшей мере, приблизительно 10% (маc./маc.) до максимальной растворимости соединения. Предпочтительным интервалом является от приблизительно 20 до приблизительно 60% (мас./мас.). В действительности более предпочтительным интервалом является от приблизительно 30 до приблизительно 50% (мас./мас.) и наиболее предпочтительным интервалом является от приблизительно 35 до приблизительно 45% (маc. /маc.).

В большинстве случаев стабильные препараты, соответствующие данному изобретению, могут быть приготовлены простым растворением желаемого количества желаемого пептидного соединения в выбранном неводном протонном растворителе. Мы обнаружили, что для полимерных растворителей, таких как ПЭГ, имеется тенденция к обратно пропорциональной зависимости растворимости от молекулярной массы растворителя. Предпочтительные неводные протонные растворители включают пропиленгликоль (ПГ), полиэтиленгликоль (ПЭГ), метоксипропиленгликоль (МПГ), глицерин и поливинилпирролидон (ПВП).

Специалистам известно, что вода, буфер, солюбилизаторы, такие как неионные поверхностно-активные вещества, наполнители, такие как EDTA, и консерванты, такие как бензиловые спирты, метил или пропилпарабены, могут быть с успехом добавлены в фармацевтические пептидные препараты (См., например, монографию Pharmaceutical Sciences, Remington, 18-е изд. (1990)). Такие агенты могут добавляться в заявленные препараты в необязательном порядке.

С. Способы Нами было показано, что стабильные неводные препараты пептидных соединений могут быть приготовлены путем растворения пептидного соединения, из которого готовят препарат, в неводных протонных растворителях.

Мы протестировали данные препараты пептидных соединений, в частности препараты близкого LHRH соединения лейпролида, на стабильность, помещая их в условия ускоренного старения при повышенной температуре и измеряя химическую и физическую стабильность препаратов. Результаты данных исследований (представленные, например, а Таблице V и на фиг. 1, 2, 6 и 7) показывают, что эти препараты были стабильными в условиях, которые приближаются или превышают условия хранения в течение одного года при 37^oС.

Мы также протестировали препараты пептидных соединений, приготовленные, как описано в контексте заявки, на стабильность после -облучения 2,5 Мрад. Результаты, представленные в Таблице IV, показывают, что данные препараты оставались химически и физически стабильными после такого облучения. Было обнаружено, что препараты, подвергнутые облучению пучком электронов, также оставались стабильными.

Как показано в Таблице I, мы протестировали широкий круг пептидных препаратов, в частности, лейпролида, госерелина, LHRH, ангиотензина I, брадикинина, инсулина и трипсиногена на стабильность путем растворения (или попытки растворения) их в воде с последующим помещением их в условия ускоренного старения при повышенных температурах. Была определена стабильность препаратов. Результаты представлены в Таблице I, как период полураспада при 37^oС, принимая, что Е_а=22,2 ккал/моль. Многие протестированные пептиды были растворимы в исследованных неводных протонных растворителях и сохраняли стабильность в условиях тестирования. Растворимость определенного пептида в воде и стабильность полученного раствора легко определяют с помощью рутинных способов, известных специалистам.

Показан линейный характер разложения препаратов 40% лейпролида в пропиленгликоле, которые хранили в течение шести месяцев при 37^oС, что определяли по общей потере пептида в растворе. Анализ данных результатов дает значения энергии активации (Е_a) 16,6 ккал/моль и t₉₀ 9,6 месяца, показывая стабильность данных препаратов при повышенных температурах.

Мы также неожиданно обнаружили, что определенные пептидные препараты, соответствующие данному изобретению, являются бактериостатическими (т.е. ингибируют рост бактерий), бактерицидными (т.е. вызывают гибель бактерий) и спороцидными (т.е. убивают споры). В частности, препараты, содержащие 50-400 мг/мл лейпролида, проявляли бактериостатическую, бактерицидную и спороцидную активность. На стабильность образцов не влияло внесение бактерий, что указывает на то, что ферменты, выделяющиеся из убитых или лизированных бактерий, не оказывают вредного воздействия на стабильность продукта. Это служит доказательством того, что на данные препараты не влияет активность ферментов.

Известно, что некоторые пептиды, например, кальцитонин и лейпролид, являются физически нестабильными, проявляя агрегацию, образование геля и фибрилляцию, когда из них готовят раствор в неводных протонных растворителях, а также в водном растворе. Например, повышение концентрации пептида, введение солей или осторожное перемешивание могут привести к образованию геля лейпролида. Улучшение физической стабильности позволяет производить более простое парентеральное введение, включая введение с использованием имплантируемых систем для доставки лекарственных веществ.

Было неожиданно обнаружено, что добавление полярных непротонных растворителей, таких как ДМСО, к препаратам определенных пептидов, таких как лейпролид, госерелин и кальцитонин, в неводных протонных растворителях препятствует образованию геля в препарате. Это, вероятно, происходит потому, что неводные полярные непротонные растворители вызывают у пептидов формирование случайной закрученной -спиральной конформации, которая не переукладывается в структуру -листа и, вследствие этого, гель не образуется. Таким образом, данные растворители обладают антижелирующим эффектом.

Кроме того, стабильность препаратов лейпролида в форме жидкости и геля (полученного при взбалтывании) в неводном протонном растворителе ПГ (370 мг/мл) исследовали in vitro при 37^oС и in vivo на крысах, соответственно. Результаты представлены в Таблице II и показывают, что оба препарата в форме геля и жидкости оставались стабильными в течение более 12 недель.

Главный аспект изобретения состоит в том, что неводные растворы, содержащие пептидные соединения в неводных протонных растворителях, являются стабильными при высоких температурах в течение длительных периодов времени. Данные препараты стабильны даже при использовании высоких концентраций. Таким образом, данные препараты имеют преимущество в том, что они могут храниться в течение длительных периодов времени при комнатной или более высокой температуре. Они также пригодны для применения в имплантируемых доставляющих устройствах.

Описание примеров изобретения Для осуществления исследований, изложенных ниже в Примерах, используют следующие методы.

1. Приготовление растворов лейпролида ацетата.

Лейпролида ацетат (полученный, например, от Mallinckrodt, St. Louis, Missouri) взвешивают и растворяют, используя при необходимости нагревание (80^oС), перемешивание, взбалтывание и/или центрифугирование в растворителе (ПГ, ПЭГ, МПГ, ПГ/Н₂О, ПЭГ/Н₂O, ПЭГ/ПГ, МПГ/Н₂О или ПГ с EDTA) в соответствующей концентрации (мас. /мас. ). Если не указано иначе, термин ПЭГ означает ПЭГ 300. Термин сухой ПГ относится к препаратам ПГ, приготовленным в среде с низкой влажностью (т.е. в атмосфере сухого N₂).

Если не указано иначе, содержание лейпролида в виде свободного основания, вычисленное по сертификату анализа величины активности, равно 37% свободного основания. Это составляет 40% лейпролида ацетата за исключением указанных случаев.

2. Приготовление емкостей Емкости для имплантируемых устройств для доставки лекарственных веществ (как описано в Патентной заявке США Serial 08/595761, введенной, здесь в виде ссылки) наполняют подходящим раствором лейпролида ацетата. Наполненные устройства затем проходят тест на стабильность. Препарат вносят в титановые или полимерные емкости с полимерными пробками, закрывающими каждый конец. Наполненную емкость затем запечатывают в пакет из полимерной фольги и помещают в сушильный шкаф для тестирования на стабильность.

Следует отметить, что препараты в емкостях данных устройств полностью изолированы от внешней среды.

3. Обращенно-фазовая HPLC (ВЭЖХ. высокоэффективная жидкостная хроматография) (RP-HPLC) Все исследуемые на стабильность образцы анализируют на концентрацию лейпролида и % площади пика с использованием обращенно-фазовой ВЭЖХ в режиме градиента элюции с использованием охлаждаемого автоматического пробоотборника (4^oС) для уменьшения разложения образца. Конкретные условия хроматографии приведены в Таблице III.

Стандарты лейпролида (в воде) различных (от 4 до 6) уровней концентраций, обычно в интервале между 0,1-1,2 мг/мл, пропускают через колонку параллельно с образцами, исследуемыми на стабильность. Образцы, исследуемые на стабильность, проводят между наборами стандартов не более чем по 40 образцов между наборами стандартов. Все пики, полученные между свободным ("мертвым") объемом и 45 минутами элюированияя, объединяют. Объединенные площади пиков стандартов лейпролида наносят на график как функцию концентрации. Затем вычисляют концентрации лейпролида для образцов, исследуемых на стабильность, используя линейную регрессию. Процент площадей пика для пика лейпролида, сумму всех пиков, элюированных до лейпролида (отмеченных как "другие") и сумму всех пиков, элюируемых после лейпролида (отмеченных как "агрегаты") также записывают и наносят на график как функцию точек времени выхода образца.

4. Хроматография с использованием молекулярных сит (гель-фильтрация) (SEC) Отобранные образцы, исследуемые на стабильность, анализируют по % площади пика и молекулярным массам, используя SEC-анализ с изократным раствором и с охлаждаемым автоматическим пробоотборником (4^oС). Используемые условия хроматографирования представяют в Таблице IV.

Для вычисления молекулярных масс требуется определить свободный объем и общий объем колонки для гель-фильтрации. Для определения свободного объема и общего объема, соответственно, используют высокомолекулярный стандарт BioRad и 0,1% ацетон. Время удерживания первого пика в стандарте BioRad и пика ацетона записывают и переводят в единицы объема, используя приведенные ниже уравнения. Поскольку данные величины являются постоянными для определенной колонки, используемой для SEC и системы ВЭЖХ, то свободный и общий объемы определяют заново в случае внесения изменений в колонку для SEC или системы ВЭЖХ. Затем наносят стандартный образец, после которого проводят образцы, исследуемые на стабильность. Смесь стандартов содержит приблизительно 0,2 мг/мл следующих пептидов: бурсин (мол. масса = 449), пептид WLFR (мол. масса = 619), ангиотензин (мол. масса = 1181), GRF (мол. масса = 5108) и цитохром С (мол. масса = 12394). Данные стандарты выбирают потому, что молекулярная масса лейпролида заключена между их значениями и все они имеют основную рl (изоэлектрическую точку) (9,8-11,0), близкую pl лейпролида.

Процент (%) площадей пиков записывают для всех пиков. Молекулярные массы разделенных образцов вычисляют, используя приведенные ниже уравнения.

V_s = скорость потока (мл/мин) ( время удерживания пика образца (мин); V_o = скорость потока (мл/мин) время удерживания пика свободного объема (мин); V_t = скорость потока (мл/мин) время удерживания пика общего объема (мин); где V_s = объем стандарта или образца; V_o = свободный объем; V_t = общий объем, V_s вычисляют для пика каждого стандартного пептида. Затем вычисляют Kd для каждого стандартного пептида, используя определенные ранее значения V_t и V_o. Линию линейной регрессии из графика logMW vs. относительно Kd^-1 используют для определения молекулярной массы для каждого пика в образце, исследуемом на стабильность. Записывают также % площадей пиков для образцов, исследуемых на стабильность.

5. Оборудование и материалы Для RP-HPLC и SEC используют следующее оборудование и материалы.

Систему ВЭЖХ Waters Millennium, состоящую из автоматического пробоотборника 717, насоса 626, контроллера 6000S, детектора с фотодиодной матрицей 900 и рефрактометрического детектора 414 (Waters Chromatography, Milford, MA).

Флаконы для ВЭЖХ; кассеты с 48 положениями и 96 положениями (Waters Chromatography, Milford, MA).

Колонку для ВЭЖХ HaiSil С18, 120 А, 5 мкм 4,6250 мм (Higgins Analytical, Mountain View, CA).

Колонку для SEC Pharmacia Peptide, HR 10/30 (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

6. Чистота Исследуемые на стабильность образцы анализируют, используя RP-HPLC. Площадь под кривой для пика лейпролида, деленная на сумму площадей под кривой для всех пиков, дает % чистоты. [Следует отметить, что данные по % концентрации, представленные данными по % чистоты (Примеры 6, 8, 9 и 10), неубедительны. Способы анализа, используемые для определения % концентрации, являются ненадежными].

Следующие