2203088 - Терапевтические агенты и аутоиммунные заболевания

Терапевтические агенты и аутоиммунные заболевания

Реферат

Изобретение относится к медицине и касается терапевтического агента для лечения аутоиммунного заболевания. Сущность изобретения включает применение термолабильного энтеротоксина [Etk], В-субъединицы термолабильного энтеротоксина [EtxB] и их смесей, обладающих ганглиозид GМ-1 (GM-1)-связывающей активностью для лечения или предупреждения аутоиммунных заболеваний. Преимущество изобретения заключается в том, что указанные субъединицы, связываясь с GM-1 ганглиозидными рецепторами, вызывают активацию В-клеток. 2 з.п.ф-лы, 11 ил., 3 табл.

Это изобретение относится к терапевтическим агентам, предназначенным для использования в лечении аутоиммунных заболеваний млекопитающих, в особенности человека. Изобретение также относится к терапевтическим агентам, применяемым в лечении лейкемий человека Т-клеточного происхождения, как так называемые "вакцинные носители", и агентам, использующимся для предупреждения у человека отторжения трансплантата и при заболевании трансплантат против хозяина (GVHD).

В статье под названием "Morfologic and Functional Alterations of Mucosal Т-сells by Cholera Toxin and its В-subunit" by Charles O. Elson et al. The Journal of Immunology, 1995, 154; 1032-1040 обнаруживается, что холерный токсин (Ctx) и CtxB-субъединица ингибируют CD8⁺ и CD4⁺ Т-клетки.

Также делались ссылки на статью под названием "Prevention of Acute Graf-Versus-Host Disease by Treatment with a Novel Immunosuppressant" by B. Yankelvich et al. The Journal of Immunology, 1995, 154; 3611-3617. В ней CtxB определяется как агент, предназначенный для использования при трансформации костного мозга для предупреждения острого заболевания трансплантат против хозяина (GVHD).

WO 95/10301 раскрывает иммунологические агенты, индуцирующие толерантность и содержащие молекулы, связанные со слизистой оболочкой и сцеплением со специфическим толерогеном.

При использовании здесь термин "Ctx" обозначает холерный токсин, и "CtxB" обозначает В-субъединицу холерного токсина. В других текстах, они могут иногда определяться соответственно как "СТ" или "Ct" и "СТВ" и "CtB". Термин "Etx" здесь обозначает теплолабильный энтеротоксин Е. coli, и "EtxB" - это В-субъединица Etx. В других текстах, они могут иногда называться как "LT" или "Lt", и "LTB" или "LtB" соответственно.

Обоснованием всех сторон настоящего изобретения является тот факт, что EtxB (чистая В-субъединица теплолабильного энтеротоксина Е.coli) связывается с GM-1-ганглизидными рецепторами, которые обнаруживаются на поверхности клеток млекопитающих, и что это связывание вызывает возникновение эффектов в популяции лимфоцитов, включающих специфическое истощение CD8⁺ Т-клеток и ассоциированную активацию В-клеток. Эти эффекты отсутствуют при применении мутантного EtxB белка, не имеющего GM-1-связывающей активности.

Аутоиммунные заболевания Аутоиммунитет - это термин, использующийся для описания механизма, посредством которого организм дает иммунный ответ на собственные антигены.

В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения, предлагается: (i) агент, обладающий GM-1-связывающей активностью, отличный от Ctx или Etx, или В-субъединица Ctx или Etx; или (ii) агент, обладающий воздействием на GM-1 опосредованные внутриклеточные сигнальные события, но не имеющий GM-1-связывающей активности; для использования в качестве средства для лечения или предупреждения аутоиммунных заболеваний.

Обнаружено, что агент, в соответствии с настоящим изобретением, модулирует популяции лимфоцитов, приводя к индукции апоптоза в CD8⁺ Т-клетках, повышенной активности CD4⁺-клеток и поликлональной активации В-клеток. Эти явления вероятно приводят к сдвигу иммунного ответа в сторону индукции Тh2 ассоциированных цитокинов. Считается, что подобные ответы на собственные или перекрестно-реагирующие агенты опосредуют защиту для определения аутоиммунных заболеваний.

В первом воплощении этого первого аспекта настоящего изобретения, агент используется в методе лечения аутоиммунного заболевания в момент его прогрессирования. В этом воплощении агент назначается пациенту с или без одновременного применения собственных или перекрестно-реагирующих антигенов. Применение агента в соответствии с этим воплощением первого аспекта изобретения модулирует природу иммунного ответа на собственный антиген, исключая активацию вызывающего болезнь воспаления, и, следовательно, предохраняет от аутоиммунного заболевания.

Во втором воплощении этого первого аспекта настоящего изобретения агент используется для "вакцинации" представителей млекопитающих против аутоиммунных заболеваний, при которой агент применяется одновременно с собственным или перекрестно-реагирующими антигенными детерминантами (или с комбинацией различных собственных или перекрестно-реагирующих антигенных детерминант), связанными с названным заболеванием. Подобным образом иммунный ответ субъекта на собственный антиген или на перекрестно-реагирующий антиген исключается из активации патогенеза, что предохраняет в будущем от аутоиммунного ответа на собственный антиген.

В этом первом аспекте изобретения, терапевтический агент и собственная или перекрестно-реагирующая антигенная детерминанта должны или могут быть совместно назначены субъекту. Таким образом мы имеем в виду, что место и время введения каждого терапевтического агента и антигенной детерминанты таковы, чтобы достигалась необходимая модуляция иммунной системы. Таким образом, хотя терапевтический агент и антигенная детерминанта могут быть назначены в один и тот же момент времени и в одном и том же месте, могут существовать преимущества в применении терапевтического агента и антигенной детерминанты в разное время и в разном месте.

Хотя единичная доза терапевтического агента и антигенной детерминанты могут быть достаточными, множественные дозы рассматриваются, как входящие в область этого аспекта изобретения.

В этом втором воплощении первого аспекта изобретения, терапевтический агент и антигенная детерминанта могут связываться, например, ковалентной связью, с образованием единого активного агента, хотя раздельное применение, при котором терапевтический агент и антигенная детерминанта не связаны, предпочтительней, так как это делает возможным раздельное применение различных фрагментов.

Специфические аутоиммунные заболевания, которые можно лечить в соответствии с этим аспектом настоящего изобретения, это такие аутоиммунные заболевания, как ревматоидный артрит, рассеянный склероз и диабет, в которых патология связана с клеточно-опосредованным иммунитетом.

Дополнительно, под этим первым аспектом настоящего изобретения предлагается использование Ctx, Etx или В-субъединиц Ctx или Etx в производстве лекарств для использования, в качестве агентов для предупреждения аутоиммунных заболеваний.

Также предполагается фармацевтическая композиция для лечения аутоиммунного заболевания человека, содержащая (i) агент, обладающий GМ-1-связывающей активность; или (ii) агент, обладающий воздействием на GM-1 опосредованные внутриклеточные сигнальные события, но не имеющие GM-1-связывающей активности; и их фармацевтически приемлемый носитель или растворитель.

Фармацевтическая композиция этого аспекта изобретения может быть представлена в таком виде, чтобы его можно было ввести в организм через слизистую оболочку, например с помощью спрея через нос, или парентерально, причем соединение представлено в форме, пригодной для инъекций, например, для применения внутривенно, внутримышечно или подкожно.

Фармацевтическая композиция может быть оформлена в готовую форму вместе с соответствующим собственным или перекрестно-реагирующим антигеном. И наоборот, комплект может содержать отдельные композиции для каждого терапевтического агента и антигенной детерминанты.

Специфические терапевтические агенты, которые могут быть использованы в этом аспекте изобретения, - это EtxB и CtxB или их мутантные разновидности, сохраняющие GM-1-связывающую активность.

Агенты для использования в первом аспекте настоящего изобретения должны предпочтительно быть в основном нетоксичными, хотя некоторый уровень токсичности может быть допустим при тяжелом лечении подобного рода.

Этот первый аспект изобретения распространяется на использование всех агентов, обладающих GM-1-связывающей активностью, для использования в лечении аутоиммунных заболеваний человека, так же как и тех агентов, которые обладают воздействием на GM-1 опосредованные внутриклеточные сигнальные события, и которые, следовательно, действуют подобно GM-1-связывающим агентам.

Таким образом, этот первый аспект настоящего изобретения не ограничивается использованием EtxB белка в качестве терапевтического агента в лечении аутоиммунных заболеваний человека. Однако использование EtxB белка (который является пентамером из пяти идентичных субъединиц) для подобного лечения представляет собой предпочтительное воплощение настоящего изобретения. В дополнение к дикому типу EtxB, этот предпочтительный аспект изобретения также распространяется на мутантные EtxB, которые имеют GM-1-связывающую активность, так же как и на другие эквивалентные белки, такие как В-субъединица холерного токсина (CtxB), и их мутантные формы, которые обладают GM-1-связывающей активностью.

Другими терапевтическими агентами для лечения аутоиммунных заболеваний в соответствии с первым аспектом этого изобретения являются человеческие моноклональные антитела, которые связываются с GM-1. Способы известного уровня техники для определения и получения таких агентов хорошо известны.

Т-лимфоцитарные лейкемии В соответствии со вторым аспектом данного изобретения предлагается: (i) агент, имеющий GM-1-связывающую активность, отличный от Ctx и Etx, или В-субъединицы Ctx или Etx; или (ii) агент, обладающий воздействием на GM-1 опосредованные внутриклеточные сигнальные события, но не обладающий GM-1-связывающей активностью; для использования в лечении лейкемий человека Т-клеточного происхождения, таких как лейкемии человека CD8 Т-клеточного происхождения.

Агенты для использования во втором аспекте настоящего изобретения должны предпочтительно быть в основном нетоксичными, хотя некоторый уровень токсичности может быть допустим при тяжелом лечении такого рода.

Дополнительно под вторым аспектом настоящего изобретения может предусматриваться использование Ctx или Etx, или В-субъединицы Ctx и Etx для получения медикаментов для лечения лейкемий человека Т-клеточного происхождения, таких как лейкемии человека CD8 Т-клеточного происхождения.

Также предлагается фармацевтическая композиция для лечения лейкемий человека Т-клеточного происхождения, содержащая (i) агент, обладающий GM-1-связывающей активностью; или (ii) агент, обладающий воздействием на GM-1 опосредованные внутриклеточные сигнальные события, но не обладающий GM-1-связывающей активностью; и их фармацевтически приемлемые носители и растворители.

Фармацевтическая композиция этого аспекта изобретения может быть представлена в такой форме, чтобы его можно было ввести в организм через слизистую оболочку, например с помощью спрея через нос, или парентерально, причем соединение представлено в форме, пригодной для инъекций, например, для применения внутривенно, внутримышечно или подкожно.

Этот второй аспект изобретения распространяется на все вещества, обладающие GM-1-связывающей активностью, для использования в лечении лейкемий человека Т-клеточного происхождения, так же как те агенты, которые имеют воздействие на GM-1 опосредованные внутриклеточные сигнальные события, и таким образом действуют подобно GM-1-связывающим агентам.

Таким образом, второй аспект настоящего изобретения не ограничивается использованием EtxB белка в качестве терапевтического агента для лечения лейкемий человека Т-клеточного происхождения. Однако использование EtxB белка для такого лечения представляет предпочтительное воплощение настоящего изобретения. В дополнение к дикому типу EtxB, этот предпочтительный аспект изобретения также распространяется на мутантные EtxB, которые имеют GM-1-связывающую активность, так же как и на другие эквивалентные белки, такие как В-субъединица холерного токсина (CtxB), и их мутантные формы, которые обладают GM-1-связывающей активностью.

Отторжение трансплантата и GVHD В соответствии с третьим аспектом данного изобретения предлагается: (i) агент, обладающий GM-1-связывающей активностью, отличный от Ctx и Etx, или В-субъединиц Ctx или Etx; или (ii) агент, обладающий воздействием на GM-1 опосредованные внутриклеточные сигнальные события, но не обладающий GM-1-связывающей активностью; для использования в качестве терапевтического агента для предупреждения/лечения отторжения трансплантата GVHD.

Дополнительно под этим третьим аспектом настоящего изобретения предлагается использование Ctx или Etx или В-субъединиц Etx или Ctx для получения лекарств для предупреждения отторжения трансплантата или GVHD.

В предпочтительном воплощении этого изобретения описанный терапевтический агент может использоваться для предупреждения реакции отторжения трансплантатов твердых органов, как аллогенетических, так и ксеногенетических. Они также могут быть использованы для предупреждения острого заболевания трансплантат против хозяина (GVHD), например при проведении трансплантации костного мозга.

В воплощении этого аспекта изобретения, где пациент получает препарат до трансплантации, терапевтическое вещество должно быть применено одновременно с аллоантигеном и ксеноантигеном. В воплощениях, в которых пациент получает лечение после трансплантации, терапевтический агент применяется без одновременного применения антигена.

В воплощении этого аспекта изобретения, где терапевтическое вещество и алло- и ксено- антигенные детерминанты применяются одновременно, мы имеем в виду, что место и время применения каждого терапевтического вещества и антигенной детерминанты таковы, что достигается необходимая модуляция иммунной системы. Таким образом, хотя терапевтический агент и антигенная детерминанта могут применяться в один и тот же момент и в одно и то же место, есть преимущества в применении терапевтического вещества в другое время и в другом месте, чем антигенная детерминанта. Кроме того, терапевтическое вещество и антигенная детерминанта могут быть ковалентно связаны, образуя единый активный агент, хотя раздельное применение, при котором терапевтический агент и антигенная детерминанта на связаны таким образом, предпочтительно, так как это делает возможным раздельное применение различных фрагментов.

В этом аспекте изобретения, когда агент используется для предупреждения GVHD, он как правило может применяться для воздействия непосредственно на клетки, например клетки костного мозга, предназначенные для трансплантации.

Агент должен быть предпочтительно в основном нетоксичным, хотя некоторый уровень токсичности может быть допустим при тяжелом лечении такого рода.

Также предлагается фармацевтическая композиция для лечения отторжения трансплантата, содержащая (i) агент, обладающий GM-1-связывающей активностью; или (ii) агент, обладающий воздействием на GM-1 опосредованные внутриклеточные сигнальные события, но не имеющий GM-1-связывающей активности; и их фармацевтически приемлемый носитель или растворитель.

Фармацевтическая композиция этого аспекта изобретения может быть представлена в таком виде, чтобы его можно было ввести в организм через слизистую оболочку, например с помощью спрея через нос, или парентерально, причем соединение представлено в форме, пригодной для инъекций, например для применения внутривенно, внутримышечно или подкожно.

Фармацевтическая композиция может быть оформлена в готовую форму вместе с соответствующими алло- или ксено- антигенными детерминантами. И наоборот, комплект может содержать отдельные композиции для каждого терапевтического агента и антигенной детерминанты.

Этот третий аспект изобретения распространяется на использование всех агентов, обладающих GM-1-связывающей активностью для использования в предупреждении/лечении отторжения трансплантата или GVHD, так же как и тех агентов, которые обладают воздействием на GM-1 опосредованные внутриклеточные сигнальные события, и которые, следовательно, действуют подобно GM-1-связывающим агентам.

Таким образом, этот третий аспект настоящего изобретения не ограничивается использованием EtxB белка в качестве терапевтического агента в лечении отторжения трансплантата. Однако использование EtxB белка (который является пентамером из пяти идентичных субъединиц) для подобного лечения представляет собой предпочтительное воплощение настоящего изобретения. В дополнение к дикому типу EtxB, этот предпочтительный аспект изобретения также распространяется на мутантные EtxB, которые имеют GM-1-связывающую активность, так же как и на другие эквивалентные белки, такие как В-субъединица холерного токсина (CtxB), и их мутантные формы, которые обладают GM-1-связывающей активностью.

Вакцинация CtxB и EtxB уже были предложены в качестве так называемых "вакцинных носителей". В настоящее время обнаружено, что основой этого эффекта, частично, является способность EtxB модулировать популяции лимфоцитов (как обсуждалось выше) путем связывания GM-1 рецептора.

Таким образом, в соответствии с четвертым аспектом настоящего изобретения, предлагается: (i) агент, обладающий GM-1-связывающей активностью, отличной от Ctx или Etx, или В-субъединиц Ctx или Etx; или (ii) агент, обладающий воздействием на GM-1 опосредованные внутриклеточные сигнальные события, но не обладающий GM-1-связывающей активностью; для использования и вакцинации млекопитающего.

Агент способен к модуляции иммунного ответа, когда представлен вместе с неродственной чужеродной антигенной детерминантой. Когда агент вводится парентерально, такая иммуномодуляция с точки зрения иммунного ответа будет "прямой" в особенно ожидаемом направлении. Когда агент вводится через слизистую оболочку вместе с неродственным антигеном, таким как так называемый "слизистый адъювант", агент способен к облегчению слизистого иммунного ответа на неродственный антиген. Антиген и агент могут быть введены вместе как отдельные фрагменты, или могут быть связаны вместе, например, ковалентной связью.

Антиген должен быть предпочтительно нетоксичным. Кроме того, когда агент предназначен для введения через гастроэнтеральную слизистую, он должен быть способен сохранять стабильность во время передвижения по гастроэнтеральному тракту; например, он должен быть устойчив к детергентному влиянию желчи.

Также предлагается фармацевтическая композиция для использования при вакцинации млекопитающих, содержащая (i) агент, обладающий GM-1-связывающей активностью; или (ii) агент, обладающий воздействием на GM-1 опосредованные внутриклеточные сигнальные события, но не имеющий GM-1-связывающей активности; и их фармацевтически приемлемый носитель или растворитель.

Фармацевтическая композиция этого аспекта изобретения может быть представлена в таком виде, чтобы его можно было ввести в организм через слизистую оболочку, например с помощью спрея через нос, или парентерально, причем соединение представлено в форме, пригодной для инъекций, например для применения внутривенно, внутримышечно или подкожно.

Фармацевтическая композиция может быть оформлена в готовую форму вместе с соответствующей антигенной детерминантой. И наоборот, комплект может содержать отдельные композиции для каждого терапевтического агента и антигенной детерминанты.

Этот четвертый аспект изобретения распространяется на использование всех агентов, обладающих GM-1-связывающей активностью, таких как иммуномодуляторы, так же как и тех агентов, которые обладают воздействием на GM-1 опосредованные внутриклеточные сигнальные события, и которые, следовательно, действуют подобно GM-1-связывающим агентам.

Таким образом, этот четвертый аспект настоящего изобретения не ограничивается использованием EtxB белка в качестве иммуномодулятора. Однако использование EtxB белка (который является пентамером из пяти идентичных субъединиц) подобным образом представляет собой одно из воплощений настоящего изобретения. В дополнение к дикому типу EtxB, этот предпочтительный аспект изобретения также распространяется на мутантные EtxB, которые имеют GM-1-связывающую активность, так же как и на другие эквивалентные белки, такие как В-субъединица холерного токсина (CtxB), и их мутантные формы, которые обладают GM-1-связывающей активностью.

Другими терапевтическими агентами для использования в качестве иммуномодуляторов, в соответствии с этим аспектом изобретения, являются человеческие моноклональные антитела, которые связываются с GM-1. Способы известного уровня техники для определения и получения таких агентов хорошо известны.

Когда терапевтический агент настоящего изобретения является белком, таким как EtxB-субъединица или CtxB- субъединица, он может быть получен, для использования во всех аспектах данного изобретения, способом, в котором ген или гены, клонирующие специфическую полипептидную цепь (или цепи), из которых образован белок, встраиваются в подходящий вектор и затем используются для трансфекции подходящего хозяина. Например, ген, кодирующий полипептидную цепь, составляющую EtxB, может быть встроен в, например, плазмид рММВ68, который затем используется для трансфекции клеток хозяина, такого как Vibrio sp. 60. Белок очищается и выделяется способом, известным per se. Мутантные гены, экспрессирующие мутантный EtxB белок, могут затем быть получены известными методами из гена дикого типа.

Как ранее сообщалось, агенты, обладающие GM-1-связывающей способностью, такие как специфически предназначенные человеческие моноклональные антитела, могут быть задуманы и получены, как подчеркивалось выше, известными в технологии способами.

Во всех аспектах изобретения, агент, обладающий GM-1-связывающей активностью, может также быть способен к перекрестному связыванию GM-1-рецепторов. EtxB является одним из таких агентов, которые способны к перекрестному связыванию GM-1-рецепторов благодаря своей пентамерной форме.

Теперь изобретение будет проиллюстрировано ссылками к сопровождающим чертежам и следующими примерами: фиг. 1 представляет анализы физико-химических свойств EtxB и мутантных форм EtxB (EtxB (G33D)); фиг. 2 иллюстрирует, что рецепторное связывание EtxB необходимо для их сильной иммуногенности in vivo; фиг. 3 иллюстрирует кинетику пролиферации лимфоцитов, следующую за инъекцией мыши EtxB; фиг. 4 иллюстрирует, что EtxB вызывает повышение активации В-клеток; фиг. 5 иллюстрирует, что EtxB вызывает повышение активности CD4⁺ Т-клеток и истощение CD8⁺ Т-клеток; фиг. 6 показывает выборочное истощение OVA-ответственных CD8⁺ Т-клеток под действием EtxB; фиг. 7 показывает, что рецепторное связывание EtxB вызывает изменения морфологических характеристик лимфоцитарного ядра клеток, подвергнутых апоптозу; фиг. 8 показывает EtxB рецепторно опосредованный апоптоз CD8⁺ Т-клеток, как определено при исследовании клеточного цикла; фиг. 9а и 9б показывает результаты экспериментов, проводимых с целью показать, что GM-1-связывание EtxB вызывает развитие коллаген индуцированного артрита на модели животного; фиг. 10 показывает результаты эксперимента, проводимого для того, чтобы проиллюстрировать, что EtxB, но не EtxB (G33D), вызывает апоптоз в популяции нормальных человеческих мононуклеарных клеток периферической крови; фиг. 11 показывает результаты эксперимента, который показывает, что перекрестное связывание GM1 ведет к апоптозу в части мышиных CTLL клеток.

Детальное описание чертежей Фиг. 1 Анализы физико-химических свойств EtxB и EtxB (G33D).

(а) SDS-PAGE анализы EtxB или EtxB (G33D): 5 мкг каждого белка анализировались в восстановительных условиях в присутствии -меркаптоэтанола с или без предварительного нагревания. Линия 1, дикий тип EtxB, ненагретый. Линия 2, EtxB (G33D), ненагретый. Линия 3, дикий тип EtxB, нагретый до 95^oС. Линия 4, EtxB (G33D), нагретый до 95^oС. Молекулярный вес стандартов (Bio-Rad.) показан слева от панели.

(б) Определение действительной молекулярной массы EtxB и EtxB (G33D) методом гель-фильтрационной хроматографии: стандартная кривая (кружки) получена с использованием, с верху до основания: бычьего сывороточного альбумина (66 кД), куриного яичного альбумина (45кД), карбоангидразы бычьих эритроцитов (29 кД) и цитохрома сердца лошади (12,4 кД); EtxB и EtxB (G33D) элюировали с соответствующими молекулярными массами 36 и 38 кД соответственно; V_e - элюирующий объем белка, V_o - свободный объем гель-фильтрационной колонки.

(в) ELISA для сравнительного связывания EtxB и EtxB (G33D) с ганглиозидом GM-1; платы были покрыты GM-1, блокированы и инкубировались с 1 мкг/мл или EtxB или EtxB (G33D) разведенными серийно (3 кратно) от 1 мкг/мл.

Фиг. 2 Рецепторное связывание EtxB необходимо для их сильной им-муногенности in vivo.

Мышам BALB/c (по 4 в каждой группе) проводились подкожные инъекции или EtxB или EtxB (G33D) в PBS, или белки вводились через рот в бикарбонатном буфере. Сыворотка исследовалась в течение 10 дней, следующих за двумя подкожными инъекциями (А) или в течение 1 недели, следующей за 3 оральными дозами (В), и кишечные выделения исследовались в течение 1 недели, следующей за 3 оральными дозами (С). В образцах, полученных от контрольных мышей, реакция не была определена. Результаты выражены в титрах антител IgG в сыворотке, в то время как IgA в кишечных выделениях выражены в "специфической активности", как описано ниже.

Фиг. 3 Кинетика пролиферации лимфоцитов Мышам проводились интраперитонеальные инъекции 30 мкг EtxB (G33D) в полном адъюванте Фрейда. MLNs были изолированы 10 днями позже и клетки инкубировали в отсутствие антигена (незакрашенный квадрат) или в присутствии 80 мкг/мл EtxB (закрашенный треугольник), EtxB (G33D) (незакрашенный треугольник) или несобранных мономерных форм EtxB (закрашенный треугольник) и EtxB (G33D) (незакрашенный круг), полученных при нагревании до 95^oС. После 6 часов каждого дня исследования клетки импульсно метили с 1 мкКи (³Н) Thd. Данные представляют среднее срm (число импульсов в минуту) и SEM из трех лунок.

Фиг. 4 EtxB вызывают повышенную активность В-клеток.

Мышей иммунизировали EtxB (G33D) в CFA. Клетки изолировали из MLN 10 дней спустя и инкубировали в присутствии 80 мкг/мл или EtxB или EtxB (G33D), или смеси из 40 мкг/мл каждого белка. Клетки метили биотинилированным анти-СD25 (7D4) и Фикоэритрином (РЕ) анти-В220 (Ra3-6D2). Стрептавидин FITC использовался в качестве вторичного конъюгата антител. Включались также контроли для антител (не показаны). Двойной проточный цитометрический анализ проводился на 4 день пролиферации.

Фиг. 5 EtxB вызывает повышенную активность CD4⁺ Т-клеток и истощение CD8* Т-клеток.

Процесс иммунизации, выделение клеток и контрольное заражение in vitro такие же, как в описании фиг. 4. Для определения CD25 использовались биотинилированный анти-СD25 (7D4) и Стрептавидин FITC. Для определения CD4 и CD8 использовались FITC, меченный aнти-CD4 (RNRM4-5), и FITC, меченный aнти-CD8 (53-6.7). Соответствующие контроли для антител включались (не показаны).

Фиг. 6 Выборочное истощение ОVА-чувствительных CD8⁺ Т-клеток с помощью EtxB.

Культуры клеток из MLN, взятых у OVA-праймированных мышей, культивировались в течение 5 дней в отсутствие антигена или в присутствии OVA+EtxB, OVA+EtxB (G33D) или одного OVA при 100 мкг OVA и по 40 мкг/мл EtxB или EtxB (G33D) или 100 мкг только одного OVA. Клетки метили следующими крысиными антителами: FITC-aнти-CD4 или FIТС-анти-СD8, и они оба с биотин-анти-CD25 (IL-2R) с последующим Стрептавидин-фикоэритрином. Непомеченные клетки или клетки, помеченные только вторым антителом, также включались в качестве контроля. Клетки исследовались с помощью FACS (Becton Dickinson). Большее увеличение количества клеток, являющихся CD25⁺ в культурах, содержащих EtxB по сравнению с другими способами обработки, происходит благодаря присутствию большего количества В-клеток, экспрессирующих этот маркер (не показано). Шкала интенсивности флюоресценции дана в виде логарифма.

Фиг. 7 Рецепторное связывание EtxB вызывает изменение в морфологической характеристике ядра лимфоцитов в клетках, подвергнутых апоптозу.

MLNC, содержащие >90% CD3⁺ Т-клеток и лишенные макрофагов, инкубировали в течение 18 часов с 80 мкг/мл EtxB или с 80 мкг/мл EtxB (G33D) и метили акридоном оранжевым. Клетки исследовались под обычным или конфокальным флуоресцентным микроскопом (Leica TCS 4D). Показана характерная микроскопическая картина ( 540) для каждого опыта [EtxB, снимок слева; EtxB (G33D), снимок справа] . Клетки, которые инкубировали в присутствии антигена, дают такой же результата, как клетки, обработанные EtxB (G33D) (не показано).

Фиг. 8 EtxB рецепторно-опосредованный апоптоз CD8⁺ Т-клеток, как определено при анализе клеточного цикла.

Количество CD4⁺ и CD8⁺ SPLTC в суб-G₀/G₁ стадии клеточного цикла определялось проточным цитометрическим анализом содержания DNA, после окрашивания с пропидиум йодидом. SPLTC выделяли из селезенки отрицательным отбором, как описано выше. Клетки обрабатывали в течение 18 часов: (а) без антигена, (b) с 80 мкг/мл EtxB (G33D) или (с) с 80 мкг/мл EtxB и затем метили FITC-крысиными aнти-CD4 или FITC-крысиными анти-CD8. Клетки последовательно метили пропидиум йодидом. Количество клеток, помеченных пропидиум йодидом, определялось путем установки дискриминационного окна на клетки, меченные или анти-СD4, или анти-CD8 антителами.

Этот эксперимент проведен на клетках, результаты также представлены на фиг. 7 и в таблице 3.

Примеры Пример 1 Этот пример иллюстрирует условия GM-1-связывания для достижения различных эффектов на популяции лимфоцитов.

Материалы и методы Получение рецептор-связанного мутанта EtxB.

Замещение Gly-33 на Asp происходит на участке, ответственном за рецепторное связывание человеческого EtxB, с использованием плазмида pTRH29, производного фагемид вектора pBluescript IIKS+, который содержит гены для А- и В- субъединиц (частиц) Etx (Yu J. , Webb H. & Hirst T.R. (1992). Molec. Microbiol. 6, 1949-1958). Мутагенез осуществляют с оленуклеотид-направленным комплектом для проведения мутагенеза in vitro (Amersham International), используя одноцепочечный pTRH29 в качестве матрицы и синтетический олигонуклеотид (5'-TCTCTTTTATCTGCCATCG-3')(из Microanalytical Facility, IAPGR, Cambridge Research Station, UK) в качестве мутагенного праймера. Правильность замещения Gly на Asp подтверждают дидеокси последовательностью, используя Sequenase II (United States Biochemical Corp.), и полученный в результате плазмид называют pTRH56. Мутантный etxB ген из pTRH56 возбуждается при использовании EcoRI и Spel рестрикционных ферментов, и встраивается в рММВ68 (Sandkvist М. , Hirst T. R. & Bagdasarian, M.,(1987) J. Bacteriol. 169, 4570-4576) для получения широкого радиуса действия экспрессирующего вектора, pTRH64 экспрессирующего EtxB (G33D).

Антигены Дикий тип EtxB и EtxB (G33D) очищают от культуральных супернатантов Vibrio sp. 60 (рММВ68) и Vibrio sp. 60 (pTRH64) соответственно, используя модификацию метода, предложенного Amin и Hirst (Amin, Т., & Hirst T.R. (1994) Prot. Express, and Purif. 5, 198-204). Кратко, белки очищают дифракцией и гидрофобной связывающей хроматографией и концентрируют анион-обменной хроматографией. Растворы белка обессоливают на колонке PD10 (Pharmacia, UK), уравновешенной фосфатным буферным солевым раствором (PBS; 10 мМ фосфата натрия, 150 мМ NaCl, pH 7,4) и хранят при -30^oС.

Чистота EtxB и EtxB (G33D) подтверждается электрофорезом на SDS полиакриламидном геле. Молекулярная масса отдельных мономеров подтверждается лазерной дезорпционной масс-спектрометрией (Protein Science Facility, University of Kent).

Приблизительную молекулярную массу EtxB и EtxB (G33D) определяют гель-фильтрационной хроматографией с использованием SMART системы (Pharmacia). Белки элюируют из колонки Superdex 75 PC 3.2/30 в PBS, pH 7,5.

Необратимая денатурация В-субъединиц пентамера для использования в исследовании лимфотарной пролиферации (см. ниже) достигается нагреванием белков до 95^oС в течение 5 минут.

Животные, набор образцов и схемы иммунизации Мыши BALB/c (H-2^d; с высоким ответом на EtxB) 7-12 недельного возраста были приобретены в Charles River Laboratories и содержались в питомнике Университета Кента. Ответы антител на EtxB или EtxB (G33D) измеряли после подкожной инъекции мышам 30 мкг белка в PBS, с последующей поддерживающей инъекцией через 10 дней. Другой группе мышей тот же белок вводили через рот в бикарбонате натрия (50 мкг/мл) за три приема с интервалом в одну неделю. Контрольным мышам давали PBS. Забор крови производился в течение 10 дней, следующих за последней подкожной инъекцией, или в течение 1 недели, следующей за последним оральным применением. Кишечные выделения живых мышей выделяли в раствор ингибитора протеаз, как ранее описывалось (Elson С.О., Еаlding, W. & Lefkowitz, J. (1984) J. Immunol. Meth. 67, 101-108), в течение одной недели, следующей за последним кормлением. Образцы затем разрушали ультразвуком и осветляли цетрифугацией (13,226 g, 10 минут, при 4^oС).

Для исследования пролиферации мышам проводили интраперитонеальную инъекцию с 30 мкг EtxB или EtxB (G33D) в полном адъюванте Фрейда (CFA), и мезентериальные лимфоузлы выделялись 10 днями позже. В исследование также включались контрольные иммунизированные мыши и их лимфоузлы, выделенные подобным же образом.

Энзим-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA's) (Твердо-фазный иммуносорбентный метод) Связывание EtxB или EtxB (G33D) с GM-1 исследовались методом GM-1-ELISA (Amin, Т., & Hirst. T.R. (1994) Prot. Express. and Purif. 5, 198-204).

Сыворотку и кишечные выделения исследуют в присутствии анти-В-субъединиц IgG и IgA антител методом ELISA's, в котором образцы помещают в микротитровальные платы (Immulon I, Dyna-teck, USA), покрытые 5 мкг/мл или EtxB или EtxB (G33D) в PBS. Анти-В-субъединицы антител IgA в супернатантах кишечных выделений экстраполируют из стандартной кривой, полученной при покрытии двух рядов лунок на каждой плате 1 мкг/мл кроличьего антимышиного IgA цепь специфичная; Zymed, Lab, USA) в PBS, с последующим добавлением 1мкг/мл IgA мышиной миеломы (МОРС 315, Sigma, USA). Для измерения общего количества IgA лунки покрывают кроличьим анти-мышиным IgA с последующим добавлением супернатантов кишечных выделений. Все образцы серийно разводят. Пероксидазный конъюгат козьего анти-мышиного IgG (Fc специфический фрагмент; Jackson Lab., USA) или козьего анти-мышиного IgA (специфическая цепь; Sigma) разводят и добавляют во все лунки. Определяют титр анти-В-субъединиц IgG, дающий A_450nm0,2. Ответ анти-В-субъединиц IgA для EtxB и EtxB (G33D) в кишечных выделениях высчитывают как "IgA специфическую активность" [среднее отношение IgA анти-В-субъединиц (мкг/мл)/общее количество IgA (мкг/мл)].

Метод ELISA для измерения уровня цитокинов IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 и IFN- применялся, как ранее описано (Harper H.M., PhD thesis, University of Bristol (1995)). Коротко, микротитровальные платы покрывают крысиными антителами к мышиным IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 и IFN-. Платы блокируют с 2% (вес/объем) бычьего сывороточного альбумина. Супернатант из культуральной среды добавляют в лунки и разводят. Один ряд на каждой пластинке для каждого цитокина содержит стандартное количество рекомбинантных цитокинов. Затем пластинки инкубируют с 0,5 мкг/мл биотинилированных антицитокин моноклональных антител, с последующим добавлением авидин-перксидазы и 3,3', 5,5'-Тетраметил-бензиденового (ТМВ) субстрата и читают при _450nm.

Исследование пролиферации лимфоцитов Мышей убивают шейным вывихом, мезентеральные лимфоузлы асептически выделяют и измельчают в сите из нержавеющей стали в сбалансированном солевом растворе Хенкса (HBSS). (Flow Laboratories Irvine, Renfrewshire, UK.). Клетки промывают

Терапевтические агенты и аутоиммунные заболевания

Патент 2203088