Нуклеиново-кислотный конструкт для экспрессии активных веществ, которые могут быть активированы протеазами, получение и использование

Нуклеиново-кислотный конструкт для экспрессии активных веществ, которые могут быть активированы протеазами, получение и использование

Реферат

 

Изобретение относится к области биотехнологии и касается нуклеиново-кислотного конструкта для экспрессии активного вещества, которое активируется с помощью фермента-протеазы, который высвобождается из клеток млекопитающего, и может применяться в генной терапии. Конструкт включает нижеследующие компоненты: а) как минимум, один промоторный элемент, b) как минимум, одну последовательность ДНК, которая кодирует активное соединение (протеин В), с) как минимум, одну последовательность ДНК, которая кодирует аминокислотную последовательность (структурную часть С), которая может быть расщеплена специфически с помощью фермента, который высвобождается из клетки млекопитающего, и d) как минимум, одну последовательность ДНК, которая кодирует пептид или белок (структурная часть D), который связывается с соответствующим активным соединением (протеин В) через расщепляемую аминокислотную последовательность (структурная часть С) и ингибирует активность этого активного соединения (протеин В). Преимущество изобретения заключается в разработке конструкта, который может высвобождать активное вещество с помощью протеаз, вырабатываемых клетками. 2 с. и 14 з.п.ф-лы, 3 ил., 2 табл.

Изобретение относится к нуклеиново-кислотному конструкту для экспрессии активных веществ, которые могут быть активированы протеазами и к его получению и использованию.

Как и области воспаления, новообразования отличаются от окружающих нормальных тканей существенным увеличением в образовании и секрецией протеаз [Schmitt с соавт., Fibrinol. 6, 3 (1992), Cottam с соавт., Int. J. Oncol. 2, 861 (1993), Tryggvason с соавт., Anticancer Res. 12, 235 (1992), Hart, Fibrinol. 6, 11 (1992), Albini с соавт., J. Natl. Cancer Inst. 83, 735 (1991)]. Примерами этих протеаз являются активаторы плазминогена, катепсины и металлопротеиназы матрикса.

Существенная функция этих опухолевых протеаз заключается в растворении внеклеточного матрикса, чтобы позволить опухолевым клеткам вторгаться в инфильтрат и расти в нормальной ткани способом инфильтрации. Вместе с тем, эти протеазы защищают соответствующее новобразование от защитных механизмов данного организма таким образом, чтобы определенные активные соединения, необходимые для защиты, расщеплялись и, тем самым, инактивировались этими протеазами, которые образовала опухоль. Так, например, инактивируются опухолевыми протеазами антитела, цитокины и ростовые факторы, факторы комплемента, факторы коагуляции и медиаторы.

В недавнем прошлом цель, поэтому, состояла в том, чтобы подавить инфильтрирующий рост и метастатический рост опухолей и инактивировать соответствующие защитные механизмы данного организма путем ингибирования протеаз опухолевой клетки [Hocman, Int. J. Biochem. 24, 1365 (1992), Troll с соавт., JNCI 73, 1245 (1984), Ray с соавт., Eur. Respir 7, 2062 (1994), Коор с соавт. , Cancer Res. 54, 4791 (1994), Chiriri с соавт., Int. J. Cancer 58, 460 (1994), Denhardt с соавт., 59, 329 (1993), Melchiori с соавт., Cancer Res. 52, 2353 (1992)]. Однако отчасти по стехиометрическим и фармакокинетическим причинам ранее достигнутый некоторый успех в подавлении протеаз опухолевой клетки оказался небольшим.

Поэтому была предпринята попытка применить соответствующие протеазы опухолевой клетки для активации бактериальных токсинов, таких как -гемолизин Staphylococcus aureus [Panchal с соавт., Nature Biotechn. 14, 852 (1996)] . Для этого, аминокислотную последовательность, т.е. ХХ-Аrg-Х, инсерцировали в положения 129-132 -гемолизина и таким способом получали неактивные мутанты, которые только расщепляли и, таким образом, активировали с помощью опухолевых протеаз, таких как катепсин В.

На основании этих результатов были предложены проиммунолизины [Panchal с соавт. , Nature Biotechn. 14, 852 (1996)], проиммунолизины, которые включают антитело, которое присоединяется к -гемолизину Staphilococcus aureus, который может быть активирован опухолевыми протеазами, или к эквинатоксину II морского анемона, когда соответствующее антитело, определяет специфичность данной клетки-мишени, присоединяющей продукт.

Однако эта предложенная концепция страдает следующими недостатками при ее использовании в терапии рака: Прежде всего, эти авторы выбрали ксеногенные неэндогенные лизины и/или токсины, которые являются иммуногенными для хозяйского организма (пациента) и как результат те индуцируют иммунную реакцию в данном организме хозяина, чья иммунная реакция нейтрализует и инактивирует конъюгат антитело/токсин.

Во-вторых, известно [Sedlacek с соавт., Antibodies as Carriers of Cytotoxicity, Contrib. to Oncol. 43, Karger Verlag, Munich, 1992], что вследствие их молекулярного размера и реологических условий относительно опухоли опухолеспецифичные антитела и иммунотоксины накапливаются лишь в очень небольших количествах 0,01 - 0,001% от данного антитела или иммунотоксина/г опухоль на опухоли и проникают в опухоль в неполной степени так, чтобы не разрушить все клетки данного новобразования либо разрушить лишь небольшую долю клеток этого новобразования. Кроме того, соответствующий объем раковых антигенов, против которых направлено данное антитело, обычно экспрессируются по-разному среди клеток данного отдельного новобразования, и непостоянен, антиген-негативные раковые клетки легко ускользают от атаки антителами или иммунотоксинами. В дополнение к этому, антигены, которые секретируются клетками данного новобразования, нейтрализуются соответствующими антителами на периферии этого новобразования (Sedlacek с соавт., Monoclonal Antibodies in Tumory Therapy, Contrib. to Oncol., Karger Verlag, 1988).

Поэтому все еще существует большая необходимость в специфичной к клетке-мишени терапии опухолей и воспалений. И поэтому объектом настоящего изобретения является создание активного соединения против новобразований и воспалений, когда активное соединение не проявляет указанных недостатков. Следовательно, настоящее изобретение относится к новому методу, который использует секрецию ферментов в новобразованиях или участках воспаления для осуществления локального высвобождения активных соединений, чьи неактивные предшественники экспрессируются в раковых клетках, клетках, ассоциированных с раком или воспалительными клетками.

Поэтому первая часть содержания настоящего изобретения представляет собой нуклеиново-кислотный конструкт для экспрессии активного вещества, которое активируется с помощью фермента, который высвобождается из клеток млекопитающего, активное вещество которого включает следующие компоненты: a) как минимум, один промоторный элемент, b) как минимум, одну последовательность ДНК, которая кодирует активное соединение (протеин В), c) как минимум, одну последовательность ДНК, которая кодирует аминокислотную последовательность (структурная часть С), которую можно специфически расщепить с помощью фермента, который высвобождается из клетки млекопитающего, d) как минимум, одну последовательность ДНК, которая кодирует пептид или протеин (структурную часть D), который связывается с данным активным компонентом (протеин В) через расщепляемую аминокислотную последовательность (структурная часть С) и подавляет эту активность данного активного соединения (протеин В).

В своей простейшей форме эти индивидуальные компоненты выстроены, например, как показано на Фиг. 1. В этом случае экспрессия протеина BCD, кодированного с помощью компонентов b), с) и d), индуцируется в результате активации данной промоторной последовательности [компонент а)]. Данная аминокислотная последовательность С экспрессированного продукта расщепляется затем клеточными ферментами, например, протеазами, в результате из которого высвобождается протеин В, который составляет данное активное соединение. В рамках содержания настоящего изобретения, протеазы или ферменты следует понимать, как представляющие одну или несколько протеаз или ферментов.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанный фермент представляет собой протеазу, в частности активатор плазминогена, катепсин или металлопротеиназу матрикса. Указанные клетки млекопитающего представляют собой предпочтительно раковые клетки, лейкозные клетки, эндотелиальные клетки, макрофаги, лимфоциты, мышечные клетки, эпителиальные клетки, глиальные клетки, синовиальные клетки или клетки, инфицированные вирусом.

Ферменты предпочтительно высвобождаются в организме с помощью новобразований или раковых клеток, а также с помощью клеток, которые вовлечены в воспалительный процесс [Barrett с соавт., Mammalian Proteases, Academic Press, London 1980; Sedlacek и Mry, Immune Reactions, Springer Verlag, 1995].

В соответствии с настоящим изобретением компонент с), следовательно, выбирали так, чтобы соответствующий экспрессируемый белок, например BCD, расщеплялся предпочтительно по своей структурной части С с помощью протеаз, которые синтезировались в новообразованиях или секретировались с помощью раковых клеток или воспалительных клеток. Примерами этих протеаз являются активаторы плазминогена, такие как активатор плазминогена урокиназного типа или тканевой активатор плазминогена; катепсины, такие как катепсин В, катепсин D, катепсин L, катепсин Е или катепсин Н, или их предшественники (прокатепсины); металлопротеиназы матрикса (ММР), такие как коллагеназы, например из групп I, II, III, IV или V; стромелизин 1, стромелизин 2 или стромелизин 3; метрилизины; желатиназы, такие как желатиназа А (ММР 2), прожелатиназа В (ММР 9) и прожелатиназа A [Pappot с соавт., Lung Cancer 12, 1 (1995), Schmitt с соавт. , Fibrinolysis 614, 3 (1992), Monsky с соавт., Cancer Biol. 4, 251 (1993), Rochefort с соавт., Medicine/Sciences 7, 30 (1991), Као с соавт. , 46, 1349 (1986), Fridman с соавт., Cancer Res. 55, 2548 (1995), Ray с соавт., Eur. Respir. J. 7, 2062 (1994), Cottam с соавт., Int. J. Oncol. 2, 861 (1993), Tryggvason с соавт., Breast Cancer Res. and Tratm. 24, 209 (1993)]; протеазы поверхности раковой клетки [поверхностно-экспрессируемые протеазы = сепраза; Monsky с соавт., Cancer Res. 54, 5702 (1994)] ; эластаза [Као с соавт., Cancer Res. 46, 1355 (1986)]; простат-специфичный антиген [Lundwall, Biochem Biophys. Res. Commun. 161, 1151 (1989), Riegman с соавт. , Biochem Biophys. Res. Commun. 159, 95 (1989)] или панкреатические трипсиногены [Miszuk-Jamska с соавт. , FEBS Lett. 294, 175 (1991)].

В соответствии со следующим вариантом настоящего изобретения соответствующая нуклеотидная последовательность для компонента b) может быть удлинена путем добавления компонента b'). Этот компонент b') кодирует лиганд (структурная часть В'), который может связывать соответствующее активное соединение с мишенной структурой. Компонент b') выстраивали, например, как показано на Фиг. 2. Экспрессия определенного нуклеиново-кислотного конструкта, корреспонидирующая с белком Фиг. 2, т.е. В'BCD, который связывается с мишенированной структурой через данный лиганд (структурная часть В'). Затем данная структурная часть С расщепляется с помощью клеточных протеаз, высвобождая таким образом данное активное соединение, т.е. белок В'В.

В отдельном варианте осуществления настоящего изобретения указанный белок В и структурная часть D являются частями соответствующих естественных предшественников белковых активных соединений с определенной естественной расщепляемой последовательностью, которая соединяет эти структурные части В и D, будучи замещенной на структурную частью С; в частности, указанная структурная часть D представляет собой соответствующую структурную часть естественного предшественника белкового активного соединения.

Новые нуклеиново-кислотные конструкты составляли предпочтительно из ДНК. Данный термин "нуклеиново-кислотные конструкты" следует понимать как означающий искусственные нуклеиново-кислотные структуры, которые могут быть траснкрибированы в соответствующих клетках-мишенях. Они предпочтительно инсерцированы в вектор, в плазмидные векторы или вирусные векторы, являющиеся особенно предпочтительными.

В зависимости от выбранного промоторного элемента [компонент а)] эти новые нуклеиново-кислотные конструкты экспрессируют структурный ген [компонент b) + с) + d) или b') + b) + с) + d)] либо неспецифично, клеточно-специфично, вирус-специфично, в конкретных метаболических условиях, специфично от клеточного цикла, либо в присутствии тетрациклина. По меньшей мере, два идентичных или различных промоторных элемента могут быть также объединены воедино с целью модификации экспрессии этого структурного гена в зависимости от выбора этих промоторных элементов. Компонент а) предпочтительно активирован в эндотелиальных клетках, в клетках, примыкающих к активированным эндотелиальным клеткам, в мышечных клетках, в лейкозных клетках, в раковых клетках, в глиальных клетках, в лимфоцитах, в макрофагах и/или в синовиальных клетках.

Структурная часть В (протеин В) белка, кодируемого новыми структурными составляющими данного гена, действительно нового активного данного соединения, который высвобожден или активирован путем расщепления этой структурной части С и, таким образом, преобразован из неингибированного состояния, например, в виде протеина BCD или в виде протеина B'BCD, в активное состояние, например, в виде протеина В или в виде протеина В'В.

В соответствии с настоящим изобретением это активное соединение может быть ферментом, который активирует или ингибирует биологический активированный каскад и/или представляет собой активный компонент этого каскада. Примерами биологических активированных каскадов этого рода являются система коагуляции, которая может быть активирована или ингибирована, фибринолиз, который предпочтительно активирован, система комплемента, которая также предпочтительно активирована, или кининовая система, которая также предпочтительно активирована. Это активное соединение может быть также ферментом, который преобразует соответствующий неактивный предшественник фармакологического вещества в активное вещество или которое само по себе является фармакологически активным веществом. Особое предпочтение отдано активному соединению (протеин В), который представляет собой фактор коагуляции, который выбран из тромбина, фактора Va, фактора VIIa, фактора IXа, фактора Ха, TF-фрагментов, активирующих коагуляцию, или фактора XIIа; тромбина, который мутировал в области сайта расщепления Arg-Thr (аминокислотная позиция 327/328); фибринолитического белка, который выбран из урокиназы, tPA или его функциональных гибридов; фактора комплемента, который выбран из CVF, С3b или его функционально расщепленных продуктов; антитромботического белка, который выбран из протеина С, ингибитора С-1S, 1-антитрипсина, гирудина АТ-III, TFPI, PAI-2 или PAI-3; калликреина; цитостатического, цитотоксического или белка, вызывающего воспаление; антиангиогенного белка; иммуномодуляторного белка; противовоспалительного белка; белка, который ослабляет повреждение нервной системы; белка, который ингибирует или нейтрализует нейротоксический эффект TNF; белка, стимулирующего развитие кровеносных сосудов; гипотензивного белка; противовирусного белка; цитокина; интерферона; фактора некроза опухоли; онкостатина М или LIF; цитокинового рецептора; определенной составляющей цитокинового рецептора, которая находится снаружи на клетке; цитокинового антагониста; ростового фактора; рецептора ростового фактора; определенной составляющей рецептора ростового фактора, которая находится снаружи на клетке; хемокина; ангиостатина; фактора 4 тромбоцитов; TIMP 1, ТIMP 2 или ТIMP 3; нитроредуктазы; -глюкуронидазы; карбоксипептидазы; -лактамазы; цитозиндезаминазы; каталазы; пероксидазы; фосфатазы; оксидазы; калликреина или синтазы окиси азота эндотелиальной клетки.

Структурная часть В' белка, кодируемого этим новым структурным геном, составляет новый лиганд для связывания соответствующего активного соединения (протеин В) с мишенированной структурой. Предпочтительной мишенированной структурой является поверхность клеток, предпочтительно рецептор мембраны клетки, антиген мембраны клетки, адгезионная молекула, локализованная на мембране клетки или во внеклеточном матриксе, например, эндотелиальных клеток, в частности, активированных или пролиферирующих эндотелиальных клеток, раковых клеток, мышечных клеток, в частности клеток гладкой мускулатуры, фибробластов, макрофагов, клеток печени, клеток почек, синовиальных клеток, воспалительных клеток, клеток, инфицированных вирусом, бронхиальных эпителиальных клеток, глиальных клеток, лейкозных клеток или клеток других тканей и органов. Особенно предпочтительной мишенированной структурой является поверхность активированных и/или пролиферирующих эндотелиальных клеток.

Другая предпочтительная мишенированная структура составлена компонентами внеклеточного матрикса, например коллагенами [Prockop с соавт., Annu. Rev. Biochem. 64, 403 (1995), Wetzels с соавт., Am. J. Pathol. 139, 451 (1991)]; фиколином [Ichijo с соавт., J. Biol. Chem. 268, 14505 (1993)]; сиалопротеином [Bellahcene с соавт., Cancer Res. 54, 2823 (1994)]; ламинином [von der Mark с соавт., Biochem. Biophys. Acta 823, 147 (1985); Hunt. Expl. Cell Biol. 57. 165 (1989)]; протеогликанами [Schmidtchen с соавт., Biomed. Chromatography 7, 48 (1993)] или тенасцином [Oyama с соавт., Cancer Res. 51, 4853 (1991)].

Этот новый лиганд (структурная часть В') может быть, например, антителом или фрагментом антитела, таким как составляющая, связанная с определенным эпитопом антитела, Fab, Fv, одноцепочечным Fv или Fc, которые специфически связываются с антигеном мембраны клетки или с антигеном на внеклеточном матриксе, или другим пептидом или белком, которые связываются с рецептором на актуальной клеточной мембране. Они включают, например, ростовые факторы, цитокины, интерфероны, фактор некроза опухоли, хемокины, их рецептор-связывающие части последовательностей, пептидные гормоны, ангиотензин, кинин или фолиевую кислоту. Этот лиганд может быть также адгезионной молекулой или ее адгезионной последовательностью, которая связывается с корреспондирующей молекулой на данной клеточной мембране или на внеклеточном матриксе, или составляющей, связывающей клетку-мишень, внеклеточную составляющую Fc-рецептора, гликопротеин вируса, связывающий клетку-мишень, который обладает тропизмом для избранных клеток, или частью последовательности этого гликопротеина, который связывается с этими клетками, или пептидом, с чьей помощью данное активное соединение заякоривается в данной клеточной мембране данной клетки, которая экспрессируют его. Примерами этих заякоривающихся пептидов являются трансмембранные домены рецепторов или белки вирусов или гликофосфолипидные якоря.

Компонент d) кодирует пептид (структурная часть D), который связан с протеином В или протеином В'В через структурную часть С и, таким образом, ингибирует активность протеина В. Компонент d) может быть любой произвольной нуклеиново-кислотной последовательностью. Предпочтительно, однако, чтобы она была составлена из нуклеиново-кислотных последовательностей, которые кодируют эндогенные пептиды или белки, с целью избежать или снизить повреждающее действие иммунной реакции. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения компоненты b) и d) нового структурного гена кодируют эндогенные белки или пептиды.

Значительное количество белковых активных соединений встречается в природе в форме неактивных предшественников (протеин BSD). Предшественник этого типа активируется с помощью фермента, расщепляющего этот предшественник на структурную часть, которая составляет реальный белок активного соединения (протеин В), и на неактивную структурную часть (структурная часть D). Этот предшественник расщепляется, по меньшей мере, на одну определенную аминокислотную последовательность, например, на так называемую последовательность расщепления (структурная часть S).

Она представляет собой отдельный раздел содержания настоящего изобретения в том, что эта последовательность расщепления (структурная часть S), которая естественно встречается в предшественниках белковых активных соединений, замещается структурной частью С. Это замещение является эффективным для последовательности, кодирующей структурную часть S, будучи замещенной компонентом с), кодирующей структурную часть С, в соответствующей нуклеиново-кислотной последовательности, которая кодирует естественный предшественник (протеин BCD). После добавления компонентов а) и, где подходит, b') получали новый нуклеиново-кислотный конструкт, который включает, например, компоненты a)b')c)d) или a)b)c)d), данную структурную часть С, чей экспрессируемый продукт, т. е. протеин В'BCD или, соответственно, BCD, расщепляли с помощью протеаз образованными в новобразованиях или секретированными раковыми клетками или воспалительными клетками так, чтобы образовалось данное активное соединение, т.е. протеин В'В или В.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения, этот новый конструкт включает, по меньшей мере, два идентичных или различных компонента b)c)d) и/или b')b)c)d), компоненты, которые соединены друг с другом через так называемый участок внутреннего входа рибосом (IRES).

Инсерцированный в невирусный вектор или вирусный вектор, этот новый нуклеиново-кислотный конструкт, предназначаемый, в целом, для профилактики и/или терапии расстройств, вводили местно или инъецировали в циркулирующую кровь. Эти нарушения, прежде всего, включают раковые заболевания и воспаления. Такие воспаления могли быть, например, инициированы в результате физико-химического повреждения, инфекции или иммунной реакции против эндогенной или чужеродной ткани.

Поэтому настоящее изобретение, кроме того, относится к определенному использованию нового нуклеиново-кислотного конструкта для получения лекарственного средства для локального или системного введения при профилактике и/или терапии новобразований, лейкемий, аллергий, аутоиммунных заболеваний, инфекций, воспалений, реакций отторжения трансплантата, тромбозов, окклюзии кровяных сосудов, коагуляции крови и нарушениях кровообращения, травмах тканей и/или поражения нервной системы.

Выбор соответствующих компонентов этого нового нуклеиново-кислотного конструкта зависит от определенного заболевания, которое лечат путем введения данного нуклеиново-кислотного конструкта, и может осуществляется следующим образом.

Промоторные последовательности [компонента а)]: В соответствии с настоящим изобретением особое предпочтение отдано в одном случае промоторным последовательностям [компонент а)], которые представляют собой промоторы и активаторные последовательности, которые могут быть активированы неограничиваемым способом, таким как промотором РНК-полимеразы III, промотором РНК-полимеразы II и т.п., CMV-промотором и CMV-энхансером или SV40-промотором, а в другом случае вирусным промотором и активаторными последовательностями, такими как HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV или HIV.

Например, в случае HIV-промотора полная LTR-последовательность, включающая TAR-последовательность [позиции -453 - -80, Rosen с соавт., Cell 41, 813 (1985)] , может быть использована в качестве вирус-специфического промотора.

Метаболически активируемые промоторная и энхансерная последовательности, такие как энхансер, индуцирующий гипоксию, промоторы, которые могут быть активированы специфическим образом в цикле клеточного деления, такие как промоторы гена cdc25C, гена циклин А, гена cdc2, гена Bmyb, гена DHFR или гена E2F-1, или промоторы, активируемые тетрациклином, такими как тетрациклиновый оператор в сочетании с подходящим репрессором, также являются особенно предпочтительными в качестве компонента а).

В соответствии с настоящим изобретением нуклеотидные последовательности, которые после связывания транскрипционных факторов активируют транскрипцию данного структурного гена, которые примыкают к ним по 3'-концу, также использовали в качестве промоторных последовательностей.

Кроме того, промоторы, которые могут быть специфически активированы в цикле клеточного деления, особенно предпочтительны в качестве компонента а). Эти промоторы предпочтительно включают последовательности промоторов или активатора, составленные из промоторов или энхансеров из тех генов, которые предпочтительно кодируют белки в выбранных клетках. Например, промоторы для следующих белков являются предпочтительными для использования в нижеследующих клетках.

Последовательности промотора и активатора, которые активируются в эндотелиальных клетках, такие как мозг-специфичные, эндотелиального глюкозо-I транспортера, эн-дольгина, VEGF-рецептора 2 (flt-1), VEGF-рецептора 2 (flk-1, KDR), tiel-1 или tiel-2, В61-рецептора (Eck-рецептор), B61, эндотелина, особенно эндотелина В и эндотелина 1, рецепторов эндотелина, в частности рецептора эндотелина В, рецепторов маннозо-6-фосфат, фактора von Willebrand, IL-1, Il-1, IL-1-рецептора, молекулы межклеточной адгезии (VCAM 1) или синтетические активаторные последовательности.

В качестве альтернативы естественным промоторам, специфичным к эндотелиальным клеткам, можно также использовать созданные синтетические активаторные последовательности, которые составлены из олигомеризованных сайтов связывания для факторов транскрипции, которые предпочтительно или селективно активны в эндотелиальных клетках. Примером является фактор транскрипции GATA 2, чей сайт связывания в гене эндотелин 1 представляет собой 5'-ТТАТСТ-3' [Lee с соавт. , Biol. Chem. 226, 16188 (1991), Dormann с соавт., J. Biol. Chem. 267, 1279 (1992) и Wilson с соавт., Mol. Cell. Biol. 10, 4854 (1990)].

Промоторные или активаторная последовательности, которые активируются в клетках вблизи активированных эндотелиальных клеток, в частности в клетках гладкой мускулатуры, представлены, например, в VEGF-гене. Ген-регуляторные последовательности для гена VEGF представляют собой 5'-фланкирующую область, 3'-фланкирующую область, ген c-Src или ген v-Src.

Рецепторы стероидных гормонов и их промоторные элементы, в частности промотор вируса молочной железы мыши, или промоторные элементы гена, кодирующего тропомиозин, -актин, -миозин, рецептор для PDGF, рецептор для FGF, MRF-4, фосфофруктокиназу А, фосфоглицератмутазу, тропонин С, миогены, рецепторы для эндотелина А, десмина или отдельные "искусственные" промоторы, также являются подходящими. Промоторные элементы, с которыми факторы спираль-петля-спираль (HLH) семейства миогенов MyoD, Myf 5 и MRF4 [обзор Olson и Klein, Genes Dev. 8, 1 (1994)] могут связываться в качестве транскрипционных факторов, специфичных для мышц, также является подходящими. Эти транскрипционные факторы, специфичные для мышц, включают также белок типа цинкового пальца GATA-4 [Arceci с соавт., Mol. Cell Biol. 13, 2235 (1993), Ip с соавт. , Mol. Cell Biol. 14 7517 (1994)] и группы транскрипционных факторов MEF [Yu с соавт., Gene Dev. 6, 1783 (1992)].

HLH-белки, а также GATA 4, проявляют сходную транскрипцию, специфичную для мышц, не только с промоторами из мышечно-специфичных генов, но также в ситуации с разнородными элементами, которые представлены "искусственными" промоторами. Примерами таких искусственных промоторов являются множественные копии (ДНК) связывающего сайта мышеч-но-специфичных HLH-белков, таких как Е-блок (myo D), например, 4 х AGCAGGTGTTGGGAGGC [Weintraub с соавт., PNAS 87, 5623 (1990) или множественные копии ДНК-связывающего сайта для GATA 4 гена тяжелой цепи -миозина, например, 5'-GGCCGATGGGCAGATAGAGGGGGCCGATGGGCAGATAGAGG3' [Molkentin с соавт., Mol. Cell Biol. 14, 4947 (1994)].

Примерами последовательностей промоторов и активатора, которые активируются в лейкозных клетках, являются промоторы для c-myc, HSP-70, bcl-1/cyclin D-1, bcl-2, IL-6, IL-10, TNF, TNF, HOX-11, BCR-Ab1, E2A-PBX-1 или PML-RATA.

Примерами промоторных или активаторной последовательностей, которые активируются в раковых клетках, являются промоторная или активаторная последовательности, которые взаимодействуют с транскрипционными факторами, которые образуются или активируются в раковых клетках. Эти предпочтительные промоторная или активаторная последовательности включают последовательности гена-регулятора или элементы генов, которые кодируют белки, которые образуются, в частности, в клетках карциномы или клетках саркомы. Так, например, промотор белка N-CAM использовали в случае мелкоклеточных бронхиальных карцином, промотор рецептора фактора роста гепатита или L-пластин использовали в случае овариальных карцином, а промотор L-пластина или полиморфного эпителиального муцина (РЕМ) использовали в случае панкреатических карцином.

Последовательности промоторов и активатора, которые активируются в глиальных клетках, представляют собой, в частности, ген-регуляторные последовательности или элементы генов, которые кодируют, например, следующие белки: периаксин, белок, специфичный для Шванновской клетки, глутамин-синтетазу, белок, специфичный для глиальной клетки (глиальный фибриллярный кислый белок = GFAP), белок глиальной клетки S100b, IL-6 (CNTF), рецепторы 5-НТ, TNF, IL-10, рецептор инсулиноподобного фактора роста I и II или VEGF. Ген-регуляторные последовательности для VEGF-гена уже перечислялись выше.

Примерами последовательностей промоторов и активатора, которые активируются в лимфоцитах и/или макрофагах, являются последовательности промотора и активатора гена, кодирующего цитокины, цитокиновые рецепторы и адгезионные молекулы, и рецепторы для Fc-фрагмента антител. Примерами последних являются: рецептор IL-1, IL-1, IL-1, рецептор IL-2, IL-3, рецептор IL-3 (-субъединица), рецептор IL-3 (-субъединица), IL-4, рецептор IL-4, IL-5, IL-6, рецептор IL-6, регуляторный фактор 1 интерферона (IRF-1), (промотор IRF-1 активируется с помощью IL-6 в той же мере, как и с помощью IFN или IFN), IFN-респонсивный промотор, IL-7, IL-8, IL-10, IL-11, IFN, GM-CSF, рецептор GM-CSF (-цепь), IL-13, LIF, рецептор макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF), рецепторы сапрофитного макрофага типа I и II, МАС-1 (лейкоцитарный функционирующий антиген), LFA-1 (лейкоцитарный функционирующий антиген) или р150,95 (лейкоцитарный функционирующий антиген).

Примерами последовательностей промотора и активатора, которые активируются в синовиальных клетках, являются последовательности промотора для металлопротеиназ матрикса (ММР), например для: ММР-1 (интерстициальная коллагеназа), или ММР-3 (стромелизин/транзин). Последние также включают промоторные последовательности для тканевых ингибиторов металлопротеиназ (TIMP), например, TIMP-1, TIMP-2 и TIMP-3.

В соответствии с настоящим изобретением некоторые из промоторных последовательностей, которые были перечислены в качестве примера, можно объединять друг с другом для осуществления наивысшей специфичности клетки-мишени в экспрессии соответствующего нового нуклеиново-кислотного конструкта. Можно также объединить два идентичных промотора. Можно объединить несколько промоторных последовательностей, используя химерные промоторы или гибридные промоторы. Химерный промотор представляет собой объединение вышележащей активаторной последовательности, которая может быть активирована клеточно-специфически, метаболически или вирус-специфически, с нижележащим промоторным элементом, который связывает транскрипционные факторы семейств CDF и CHF или семейств E2F и СНF и может, таким образом, подавлять активацию вышележащей активаторной последовательности в фазах G0 и G1 данного клеточного цикла (Lucibello с соавт., ЕМВО J. 14, 132 (1994)].

Для случая гибридных промоторов, когда ТАТА-бокс промотора является, например, мутантным, эта мутация является компенсаторной по соответствующей мутации в данном гене для белка, связывающего ТАТА, и этот ТАТА-связывающий белок находится под контролем другого промотора.

Нуклеиново-кислотная последовательность[компонент b'], которая кодирует лиганд (структурная часть В'): В соответствии с настоящим изобретением данный лиганд представляет собой вещество, которое связывает мембранный антиген с рецептором или с адгезионной молекулой на клетке-мишени или которое интегрируется в клеточную мембрану и/или связывается с внеклеточным матриксом. Обзоры по важным цитокинам и ростовым факторам и их рецепторам, адгезионным молекулам и белкам внеклеточного матрикса написали Ayad с соавт., The Extracellular Matrix, Academic Press 1994; Callard с соавт., The Cytokine, Academic Press 1994; Pigott с соавт., The Adhesion Molecule, Academic Press 1994 и Barclay с соавт., The Leukocyte Antigen, Academic Press 1994.

Примерами веществ, которые связываются с рецепторами, являются ростовые факторы, такие как VEGF, PDGF, EGF, TGF, TGF, KGF, SDGF, FGF, IGF, HGF, NGF, BDNF, нейротрофины, BMF, бомбезин, M-CSF, тромбопоэтин, эритропоэтин, SCF, SDGF, онкостатин, PDEGF или эндотелин-1, цитокины, такие как IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, интерфероны , и , факторы некроза опухолей TNF и TNF, хемокины, такие как RANTES, MCAF, MIP-1, или MIP-1, NAP или -тромбоглобулин, пептидные гормоны, такие как SRH, SIH или STH, MRH или MSH, PRH, PIH или пролактин, LH-RH, FSH-RH, LH/ICSH или FSH, TRH или TSH, CRH или АСТН, ангиотензин, кинины, их гомологи и аналоги, или витамины, такие как фолиевая кислота.

В соответствии с настоящим изобретением данный лиганд может быть также адгезионной молекулой, частью адгезионной молекулы или аналогом адгезионной молекулы, который связывается с соответствующей адгезионной молекулой, которая локализована в данной клеточной мембране или с другой связывающейся структурой, специфической для адгезионной молекулы на клетке-мишени или во внеклеточном матриксе.

Примерами таких адгезионных молекул, которые обладают способностью функционировать в качестве лигандов, являются Lewis Х (для GMP-140), S Lewis Х (для ELAM-1), LFA-1 (для ICAM-1 и ICAM-2), МАС-1 (для ICAM-1), VLA-4 (для VCAM-1), РЕСАМ (для РЕСАМ), витронектин (для соответствующего витронектинового рецептора), GMP-140 (для Lewis X), S Lewis X (для ELAM-1), ICAM-1, ICAM-2 (для LFA-1 и MAC-1), VCAM-1 (для VLA-4), фибронектин (для VLA-4), ламинин (для VLA-6), ламинин (для VLA-1, VLA-2 и VLA-3), фибриноген (для GPIIb-IIIa), B7 (для CD28), CD28 (для В7), CD40 (для CD40L) или CD40L (для CD40).

В соответствии с настоящим изобретением этим лигандом может быть также внеклеточная составляющая Fc-рецептора [Dougherty с соавт., Transfusion Science 17, 121 (1996)]. Кроме того, этим лигандом может быть также молекула антитела или эпитоп-связывающая составляющей молекулы антитела. Соответствующие мышиные моноклональные антитела должны предпочтительно использоваться в форме, приближенной к человеческим. Способ эффективной гуманизации описан у Winter с соавт. , Nature 349, 293 (1991) и Hoogen-booms с соавт., Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993).

Фрагменты рекомбинантного антитела получают либо непосредственно из существующих гибридом, либо выделяют из библиотек фрагментов мышиного или человеческого антитела [Winter с соавт., Annu. Rev. Immunol. 12, 433 (1994)], используя метод фаговой индикации [Smith, Science 228, 1315 (1985)]. Фрагменты соответствующего антитела используют затем непосредственно, на генетическом уровне, для последующих манипуляций, например для слияния с другими белками.

С целью получения фрагментов рекомбинантного антитела из гибридом генетическая информация, которая кодирует соответствующие антиген-связывающие домены (VH и VL) данных антител, получали путем выделения мРНК, обратного транскрибирования РНК в кДНК, и последующей амплификации этой кДНК при помощи полимеразной цепной реакции [Saiki с соавт., Science 230, 1350 (1985)] и использования олигонуклеотидов, которые комплементарны по 5' и 3'-концам вариабельных фрагментов (Orlandi с соавт., 1989). Фрагменты VH и VL клонировали затем в бактериальные экспрессионные векторы, например, в форме Fv-фрагментов [Skerra & Plckthun, Science 240, 1038 (1988)], одноцепочечных Fv-фрагментов (scFv) [Bird с соавт., Science 242, 423 (1988), Huston с соавт., PNAS-USA 85, 5879 (1988)] или в виде Fab-фрагментов [Better с соавт., Science 240, 1041 (1988)].

Метод фаговой индикации можно также использовать для выделения новых антительных фрагментов из антительных библиотек (иммунных библиотек или первичных библиотек) мышиного или чело