Синтетический мутантный ген rb (варианты), синтетический мутантный ген p53, плазмида (варианты), способ ингибирования клеточной пролиферации (варианты)

Синтетический мутантный ген rb (варианты), синтетический мутантный ген p53, плазмида (варианты), способ ингибирования клеточной пролиферации (варианты)

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и может быть использовано для ингибирования клеточной пролиферации. Ген Rb, кодирующий функционально активный ретинобластомный белок, мутируют путем изменения в консервативной области гомологии Р5 или ген Rb мутируют путем изменения нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислоту, расположенную в сайте фосфорилирования белка. Мутантный ген р53 получают путем изменения в консервативной области гомологии Р5. Плазмиды, содержащие мутантный ген Rb или р53, экспрессируют активный мутантный белок, способный подавлять клеточную пролиферацию. Изобретение позволяет разрабатывать способы лечения нераковых клеточно-пролиферативных заболеваний. 7 с. и 5 з.п. ф-лы, 9 ил., 2 табл.

Данное изобретение касается в общем области регуляции роста клеток и связанных с пролиферацией клеток заболеваний. Более конкретно, данное изобретение касается мутантов генов RP-1 и р53 и применений таких мутантов в терапии.

Описание родственной области знаний Регуляция пролиферации клеток является сложным процессом, включающим в себя многочисленные взаимодействующие компоненты. Наличие роста клеток или его отсутствие зависит от баланса экспрессии отрицательно действующих на рост и положительно действующих на рост регуляторных генов. Отрицательно действующими на рост регуляторными генами являются те гены, которые при экспрессии в клетке или при предоставлении клетке приводят к супрессии клеточного роста. Положительно действующими на рост регуляторными генами являются те гены, которые при экспрессии в клетке или при предоставлении клетке стимулируют ее пролиферацию.

Недавно были идентифицированы несколько отрицательно действующих на рост регуляторных генов, названных опухолевыми супрессорными генами, которые оказывают отрицательное действие на пролиферацию клеток. Эти гены включают в себя ген ретинобластомы человека, RB-1 и ген р53, но не ограничены ими. Отсутствие или инактивация некоторых из этих отрицательно действующих на рост регуляторных генов коррелировали с некоторыми типами рака.

Ген ретинобластомы человека, RB-1, является прототипом этого класса опухолевых супрессорных генов, в котором отсутствие обоих аллелей этого гена в клетке или ингибирование экспрессии гена или продукта гена приводит к опухолевой или патологической клеточной пролиферации. На молекулярном уровне утрата или инактивация обоих аллелей RВ-1 участвует в клинической манифестации опухолей, таких как ретинобластома и клинически родственные опухоли, такие как остеосаркомы, фибросаркомы, саркомы мягких тканей и меланомы. Кроме того, утрата функции RB-1 была также ассоциирована с другими типами первичного рака, такими как первичный мелкоклеточный рак легких, рак мочевого пузыря, карциномы молочной железы, карциномы шейки матки и карциномы предстательной железы.

Опухолевые супрессорные гены Rb и р53 подавляют пролиферацию раковых и нераковых клеток Было показано, что повторное введение кДНК дикого типа ДВ-1 или р53 частично восстанавливает нормальную регуляцию роста клеток, так как введенные гены индуцируют остановку роста или задержку роста во многих различных типах опухолевых клеток. Обозначение Rb гена как опухолевого супрессорного гена берет свое начало из факта, что инактивация аллеля Rb гена провоцирует развитие рака. Однако подавляющее рост действие Rb гена не ограничивается опухолевыми клетками. Нормальные клетки, имеющие 2 копии, могут обнаруживать остановку или замедление роста при введении дополнительных копий Rb гена при определенных условиях для роста. Также хорошо документирована способность гена р53 дикого типа подавлять рост нераковых клеток. Таким образом, Rb и р53 могут не прямо влиять на онкогенный фенотип, но скорее воздействовать на стадии, регулирующие одинаково рост опухолевых и нормальных клеток.

Механизмы патологической пролиферации нормальных клеток Существует большое разнообразие патологических пролиферативных клеточных состояний, для которых необходимы новые методы, обеспечивающие терапевтическую пользу. Эти патологические состояния могут встречаться почти во всех клеточных типах, способных к аномальной пролиферации клеток. Среди клеточных типов, проявляющих патологический или атипичный рост, находятся (1) фибробласты, (2) эндотелиальные клетки сосудов, (3) эпителиальные клетки. Из вышесказанного можно видеть, что необходимы способы для лечения местных или диссеминированных патологических состояний во всех или почти всех системах органов и тканей индивидуума.

Например, только в глазу новые методы могут быть использованы для лечения большого разнообразия патологических состояний, которые обусловлены аномальной пролиферацией нормальных, доброкачественных или злокачественных клеток или тканей, в том числе (но не только) следующих патологических состояний: фибропролиферативных, вазопролиферативных и/или опухолевых заболеваний глаза: ретролетальной фиброплазии, пролиферативной витреоретинопатии, пролиферативной диабетической ретинопатии, капиллярной гемангиомы, хороидальных неоваскулярных сетей, субретинальных неоваскулярных сетей, старческой дегенерации пятна сетчатки и роговицы, вызываемой субретинальной неоваскуляризацией (новообразованием сосудов), корнеальной неоваскуляризацией, сморщивания пятна, вызываемого профилерацией эпиретинальной мембраны, катаракты взрослых, вызываемой ядерным склерозом, фиброзного врастания после травмы или хирургии, глиомы зрительного нерва, ангиоматоза сетчатки, неоваскулярной глаукомы, кавернозной гемангиомы, покраснения радужной оболочки (rubeosis iridis), пролиферативной ретинопатии с образованием менискоцитов, эпителиальных выростов после хирургии или повреждения глаза, пленки после катаракты, папилломы, новообразования сосудов в сетчатке при талассемии, субретинальной неоваскуляризации, вызываемой эластичной псевдоксантомой (pseudoxanthoma elasticum), и нейрофиброматоза типа I и II, ретинобластомы, увеальной меланомы глазницы. Другие доброкачественные клеточные пролиферативные заболевания, для которых полезно данное изобретение, включают (но не ограничиваются ими) псориаз, ихтиоз, папилломы, базалиомы, плоскоклеточный рак и синдром Стивенса-Джонсона.

Следует заметить, что в случае нормальных клеток уже имеются два нормальных аллеля каждого из генов Rb и р53 и все же соответствующие этим генам белки дикого типа не могут предотвращать пролиферацию клеток при предоставлении им факторов роста, например, в условиях роста в культуре ткани. Такая неконтролируемая пролиферация обычно покоящихся клеток в патологических состояниях также обусловлена экспонированием этих клеток факторам роста, индуцируемым этими патологическими состояниями (см. ниже). Например, неконтролируемая пролиферация кровеносных сосудов в глазу при талассемии может привести к отслоению сетчатки, если пролиферация не будет остановлена. Введение дополнительных копий гена Rb или гена р53 в такие клетки может быть, но может и не быть достаточной для подавления клеточного роста. Действительно, введение экзогенного гена Rb в клетки многих опухолей только задерживало скорость роста этих клеток вместо полной остановки роста. Сообщенные ранее клеточные линии, такие как Saos-2 и DU 145, являются хорошими примерами этого феномена. Возможна необходимость введения значительно большего числа копий этого гена, и, с одной стороны, трудно контролировать число копий, которые должны быть введены или могли бы быть введены, а с другой стороны, экспозиция с факторами роста может приводить к инактивации экспрессируемых геном Rb белков.

Регуляция активности белка Rb фосфорилированием Если инактивация ростовых супрессорных генов является существенной стадией в удалении влияния на рост клеток, должны быть механизмы, посредством которых ативности этих генных продуктов регулируются таким образом, что клетки могут пролиферировать контролируемым образом. Понятно, что экспрессия данного ростового супрессорного гена может регулироваться количественно или качественно. В случае гена Rb отношение уровня этого белка в устойчивом состоянии (steady state) к объему клетки является постоянным в течение всего клеточного цикла. Это отсутствие изменений в концентрации белка предполагает, что должны существовать другие механизмы, посредством которых клетка может регулировать активность этого белка. Существует несколько линий доказательств, которые могут показать, что активность Rb белка (рRb) регулируется состоянием его фосфорилированности. Различные стимулирующие или ингибирующие рост факторы оказывают свое действие путем изменения фосфорилирования продуктов супрессорных генов роста, таких как Rb белок. Доказательство роли стимулирующих рост факторов в индуцировании фосфорилирования Rb белков было получено из наблюдения, что Rb белки существуют в виде недостаточно фосфорилированных форм в покоящихся клетках. Кроме того, при стимулировании пролиферации покоящихся клеток выдерживанием с сывороткой или факторами роста, такими как EGF (эпидермальный фактор роста), вместе с инсулином и трансферином, преобладающая форма Rb белка была недостаточно фосфорилированной в G1, но становилась гиперфосфорилированной, когда клетки входили в пограничную фазу G1/S.

Эти данные предполагают, что Rb белок является мишенью пути трансдукции сигнала, индуцируемого сывороткой или факторами роста. Наконец, стареющие фибробластные клетки человека, не способные отвечать на стимулирующее пролиферацию действие факторов роста, также неспособны фосфорилировать Rb белок.

Имеется также доказательство роли ингибирующих рост факторов в отрицательной регуляции фосфорилирования Rb белков, Было обнаружено, что при обработке активно растущих клеток лейкоза или нейробластомы ретиновой кислотой или витамином D3, DМSO или другими индуцирующими дифференциацию агентами, белки являются недостаточно фосфорилированными перед наступлением остановки клеточного роста в ранней G-1 фазе и индуцируются к дифференциации. Кроме того, обработка эпителиальных клеток легких паракринными ингибирующими рост полипептидами трансформирующим фактором роста бета 1 (TGF 1) приводила к отрицательной регуляции фосфорилирования Rb белка и сопутствующей остановке клеточного роста в поздней G1. Взятые вместе, эти данные предполагают, что недостаточно фосфорилированная форма Rb белка активно подавляла клетки, препятствуя их пересечению границы С1/S и что киназа (S), активируемая в G1, может активировать Rb белок таким образом, что клетки могут переходить в фазу S.

Тогда как перманентное удаление Rb гена делецией или мутацией в опухолевых клетках делало возможным рост клеток, удаление возможности влияния на рост в нормальных клетках, имеющих нормальную экспрессию Rb гена, достигается зависимой от клеточного цикла посттрансляционной модификацией продукта этого гена, т.е. Rb белка (pRb). Белок pRb существует в мультифосфорилированных формах, и имеющиеся данные предполагают, что активной формой является недостаточно фосфорилированная форма.

Например, большой Т антиген (супер-Т-антиген) SV 40 предпочтительно связывается с недостаточно фосфорилированной формой Rb белка. Фосфорилирование Rb белка освобождает его от большого Т-антигена SV40 и только недостаточно фосфорилированные рRb связываются с Е2 промотором и ингибируют транскрипцию от Е2 промотора. Таким образом, недостаточно фосфорилированная форма Rb белка активно подавляет клеточный рост, в то время как пролиферация клеток связана с гиперфосфорилированием Rb белка. Различные стимулирующие или ингибирующие факторы могут оказывать свое действие, влияя на фосфорилирование Rb белка. Поэтому, хотя нормальная клетка может экспрессировать Rb белки, она может быть индуцирована для роста при экспонировании с подходящими факторами роста, так как это может быть обнаружено в различных условиях роста, в том числе в патологических состояниях. При некоторых патологических состояниях нормальная в других условиях клетка может быть индуцирована к нежелательной пролиферации. Пролиферация покоящихся в норме фибробластов в глазах при диабетической ретинопатии является примером такой нежелательной индукции клеточного роста. При отсутствии лечения пролиферирующие фибробласты со временем присоединятся к сетчатке и приведут к ее быстрому отслаиванию.

Активация белка р53 Подобно Rb гену инактивация или мутация р53 гена часто наблюдалась в опухолевых и неопухолевых клеточных линиях. Белок р53 дикого типа также отрицательно регулируется при связывании его с вирусными антигенами, такими как большой Т-антиген SV 40. Белок р53 функционирует как фактор транскрипции и связывается со специфическими последовательностями ДНК. Способность белка р53 дикого типа связываться с ДНК является критической для его правильного функционирования. В мутантном р53 способность белка связываться со специфическими последовательностями-мишенями ДНК или активировать транскрипцию потеряна, что позволяет предположить, что эти активности важны для супрессорной функции этого белка. Однако недавно было также показано, что активность связывания со специфической последовательностью ДНК белка р53 является загадочной. Вновь синтезированный белок р53 является неактивным в том смысле, что он не может связываться со специфической для него последовательностью ДНК, если он не модифицирован. Одним из сайтов для модификации являются аминокислотные остатки 365-393 при С-конце. Этот район является сайтом присоединения РНК, а также связывания с бактериальными белками теплового шока dnaK. Связывание антитела Pab421 с аминокислотными остатками 365-393 активирует белок путем изменения его конформации таким образом, что он приобретает способность связываться с его специфической последовательностью ДНК.

Различие в способе функционирования pRb и р53 Хотя как Rb, так и р53 считаются опухолевыми супрессорными генами, способы их действия являются очень разными. Ранее было получено доказательство, что эти два гена могут действовать различными путями. Мыши, не имеющие гена Rb, обнаруживают летальность на стадии эмбрионов, тогда как мыши, не имеющие гена р53, развиваются нормально, хотя они более восприимчивы к развитию рака. На клеточном уровне раковые клетки, не имеющие р53, могут иметь остановку или замедление роста при избыточной экспрессии гена Rb даже в отсутствие экзогенного р53. С другой стороны, клетки, не имеющие Rb, чувствительны к супрессии роста геном р53. На молекулярном уровне р53 и pRb взаимодействуют с различными белками-мишенями и последовательностями ДНК (прямо или косвенно).

Применение генов Rb и р53 в терапии Хотя эти два белка различны в способах их действия, они сходны в одном аспекте, т. е. избыточная экспрессия (сверхсинтез) активных форм этих двух белков при экспериментальных условиях приводит к супрессии или задержке роста клеток. Поскольку известно, что рост клеток регулируется экспрессией супрессорных генов, таких как Rb и р53, и что их белки должны быть в активных конформациях для успешного функционирования, желательно иметь активные формы этих генов для генной терапии. В случае pRb вновь синтезированные белки являются недостаточно фосфорилированными и активными. Инактивация может происходить при экспонировании этих клеток с факторами роста. Было бы желательно иметь мутантные формы pRb, которые оставались бы в активной форме и были устойчивы к инактивации посредством фосфорилирования. В случае р53 вновь синтезированный белок является неактивным в том смысле, что он не может связываться с ДНК не будучи модифицированным. В генной терапии было бы крайне желательно иметь мутантные формы гена р53, экспрессирующие белок, который активен даже без дальнейшей модификации. Наконец, поскольку эти два белка имеют различные способы действия, было бы желательно использовать комбинацию генов Rb и р53 в терапии таким образом, что мутации или условия роста, которые делают клетку устойчивой к супрессорному действию одного гена, могли быть восприняты вторым геном.

В предшествующих исследованиях не была продемонстрирована мутация опухолевого супрессорного гена таким образом, что генный продукт (белок) является перманентно активным и может функционировать даже при экспонировании клетки с факторами роста. Более конкретно, прежние работы не смогли продемонстрировать эффективных и функциональных мутированных форм генов р53 и Rb. Прежние исследования не продемонстрировали также одновременного применения генов Rb и р53 дикого типа или их мутантных форм в лечении пролиферативных заболеваний раковых и нераковых клеток.

Краткое изложение сущности изобретения В одном аспекте данное изобретение обеспечивает обобщенный подход к лечению нежелательного или патологического клеточного роста, такого, который наблюдается в нераковых клеточно-пролиферативных заболеваниях, а также в раковых клеточно-пролиферативных заболеваниях. Более конкретно, данное изобретение обеспечивает способы лечения патофизиологических клеточно-пролиферативных заболеваний путем введения мутированного ростового супрессорного гена и/или продуктов гена.

В одном варианте данного изобретения обеспечена выделенная молекула ДНК, причем эта молекула представляет собой функционально активную форму мутированного ростового супрессорного гена или комбинацию различных мутированных ростовых супрессорных генов.

В другом варианте данного изобретения обеспечена новая плазмида, содержащая функционально активный мутант гена ретинобластомы (Rb) или р53 гена.

Еще в одном варианте данного изобретения обеспечен способ последовательного или одновременного введения генов Rb и р53 дикого типа и/или активных мутантов генов Rb, и р53 для терапевтических целей.

В других вариантах данного изобретения обеспечены способы лечения патологических клеточно-пролиферативных заболеваний, предусматривающие совместное или последовательное введение в нераковую пролиферирующую клетку мутированного гена Rb и мутированного гена р53.

Дополнительно обеспечен способ лечения злокачественных клеточных заболеваний индивидуумов, предусматривающий совместное или последовательное введение в пролиферирующую раковую клетку мутированного гена Rb и мутированного гена р53.

Другие и дополнительные аспекты, особенности и преимущества данного изобретения будут ясны из следующего далее описания предпочтительных в настоящее время вариантов этого изобретения, даваемых с целью раскрытия изобретения.

Краткое описание чертежей Фиг. 1 показывает обнаружение района гомологии между рRb и р53 иммунопреципитацией клеточных белков при помощи поликлональных антител против Rb RB1-Ab 18 и 20.

Фиг.2 показывает подтверждение района гомологии между pRb и р53 иммунопреципитацией клеточного белка при помощи поликлональных антител против Rb RB1-Ab 18 и 20.

Фиг.3 показывает способность P1, Р3, Р5 мутантных р53 белков связываться со специфическими последовательностями ДНК в отсутствие Раb421.

Фиг. 4 показывает двухмерное картирование распределения фосфорилирования мутантных Rb белков по сравнению с белками дикого типа, (А) меченых in vivo белков, (В), меченых in vitro белков.

Фиг.5 показывает связывание ретинобластомного белка (Rb) с большим Т-антигеном SV 40 и диссоциацию этого комплекса фосфорилированием.

Фиг. 6 показывает двухмерное картирование двух различных форм фосфорилированного ретинобластомного белка (тех, которые связаны большим Т-антигеном SV 40, и тех, которые не связаны).

Фиг. 7 показывает двухмерный анализ изменения в распределении фосфорилирования ретинобластомного белка при различных условиях роста.

Фиг. 8 показывает способность m89 Rb мутанта подавлять рост нормальной клетки W S1.

Фиг. 9 показывает способность m89 Rb мутанта подавлять рост линии опухолевых клеток мочевого пузыря TCCSVP.

Детальное описание изобретения Определения Термин "функциональная экспрессия гена" включает в себя супрессию транскрипции гена, деградацию генного транскрипта (предшественника информационной (матричной) РНК), ингибирование сплайсинга, разрушение информационной РНК, предотвращение трансляции информационной РНК, предотвращение посттрансляционных модификаций белка, разрушение белка или ингибирование нормальной функции белка.

Термин "трансфицируемая плазмида" включает в себя бактериальную плазмиду, содержащую мутированный ретинобластомный ген или р53 ген для переноса (трансфицирования) в выбранную клетку.

Термин "генная терапия" обозначает введение части или всего гена, конструкции ДНК, РНК или генного продукта в клетку, группу клеток, ткань, патологическое повреждение, орган или организм для модулирования экспрессии генов и/или функции генного продукта.

Термин "профилактическая генная терапия" обозначает гены, которые могут быть использованы для частичного или полного ингибирования или предотвращения заболевания или распространения заболевания, а также гены, которые могут быть использованы для дополнения или замены отсутствующего или недостаточного отрицательного роста в клетках, тканях или линиях эмбриональных клетках.

Термин "клеточно-пролиферативное заболевание" обозначает любое заболевание или нарушение человека или животного, действующее на любой орган или любую комбинацию органов, полости или части тела, которое характеризуется одиночным или множественными местными атипичными пролиферациями клеток, групп клеток или ткани (тканей); доброкачественных или злокачественных.

Термин "прокариоты" включает в себя все бактерии, которые могут быть трансформированы ДНК для экспрессии рекомбинантных молекул данного изобретения.

Термин "эукариоты" включает в себя все дрожжи, грибы, клетки животных и растений, которые могут быть трансформированы ДНК для экспрессии рекомбинантных молекул данного изобретения.

ДНК для конструкций ДНК данного изобретения может быть синтетической или может быть получена из любого вида млекопитающих. Все, что требуется, это то, чтобы генетическая последовательность генов Rb или р53 была функционально экспрессируемой в прокариотическом или эукариотическом организме. Предпочтительна синтетическая ДНК.

Рекомбинантную молекулу ДНК, кодирующую конструкции ДНК данного изобретения, можно применять для трансформации хозяина при помощи любого из способов, обычно известных специалистам обычной квалификации в этой области.

Способы получения слитых, оперативно соединенных генов и их экспрессии в бактериях известны и показаны, например, в US Patent 4366246, включенном здесь в виде ссылки. Генетические конструкции и способы, описанные в нем, можно применять для конструирования конструкций ДНК данного изобретения и трансфекции в прокариотические или эукариотические хозяева.

Прокариотическими хозяевами могут быть грамположительные, а также грамотрицательные бактерии, такие, как E. coli, S. tymphimurium, Serratia marcescens и Bacillus subtilis.

Эукариотическими хозяевами могут быть дрожжи, такие как Pichia pastoris или клетки млекопитающих.

Как правило, используют экспрессирующие векторы, содержащие промоторные последовательности, облегчающие эффективную транскрипцию встроенного фрагмента ДНК, в связи с хозяином. Экспрессирующий вектор в типичном случае содержит начало репликции, промотор (промоторы), терминатор (терминаторы), а также специфические гены, способные обеспечить фенотипический отбор в трансформированных клетках. Трансформированные хозяева можно ферментировать и культивировать согласно способам, известным в качестве пригодных для достижения оптимального роста клеток.

Примерами промоторов, которые можно использовать в этом изобретении, являются (но не только) промотор -актина человека, промотор металлотионина, начало репликации SV40, ММТV LTR промотор и MULV LTR промотор. Примеры некоторых плазмид или бактериофага, которые можно использовать в этом изобретении, перечислены в Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories 1982, и другие, известные специалистам в этой области, и могут быть легко установлены.

Ген представляет собой последовательность ДНК, кодирующую через посредство его матричной или информационной РНК, последовательность аминокислот, характерную для специфического пептида. Термин кДНК включает в себя гены, из которых удалены промежуточные последовательности. Термин "рекомбинантная ДНК" (рДНК) включает молекулу, которая была рекомбинирована сплайсингом кДНК или геномных последовательностей ДНК in vitro.

Клонирующий вектор представляет собой плазмидную или фаговую ДНК или иную последовательность ДНК, которая способна реплицироваться в клетке-хозяине и которая характеризуется одним сайтом узнавания эндонуклеазой или небольшим числом сайтов узнавания эндонуклеазами, при которых такие последовательности ДНК могут быть разрезаны детектируемым образом без потери основной биологической функции этой ДНК, и которая содержит маркер, пригодный для использования в идентификации трансформированных клеток. Маркерами являются, например, устойчивость к тетрациклину или неустойчивость к ампициллину. Для клонирующего переносчика иногда используют слово "вектор".

Экспрессирующим переносчиком (вектором) является вектор, сходный с клонирующим переносчиком (вектором), но способный экспрессировать конкретный структурный ген в хозяине, обычно под контролем определенных регуляторных последовательностей.

Термин "индивидуум" включает животных и человека.

Термин "биологическое ингибирование" или "ингибирование" роста пролиферирующих клеток обозначает частичное или полное ингибирование роста, а также уменьшение в скорости пролиферации или роста клеток. Биологически ингибирующая доза мутантов данного изобретения может быть определена оценкой влияний тестируемого элемента на рост целевых злокачественных или атипично пролиферирующих клеток в культуре ткани, на рост опухоли в животных или клеточной культуре или каким-либо иным способом, известным лицам с обычной квалификацией в этой области.

В применении здесь термин "консервативный район гомологии" относится к аминокислотному району, который гомологичен между Rb и р53, как иллюстрируется в таблице 1.

Белки данного изобретения могут вводиться топически, внутриглазным, парентеральным, пероральным, интраназальным, внутривенным, внутримышечным, подкожным или любым другим пригодным способом. Предпочтительным способом введения для лечения глазных заболеваний является внутриглазное или окологлазное введение. Предпочтительным способом введения для лечения кожных клеточно-пролиферативных заболеваний является топическое нанесение или подкожная инъекция.

В другом варианте конструкции ДНК данного изобретения могут доставляться непосредственно к очагу пролиферативного заболевания. В случае глазного пролиферативного заболевания конструкции ДНК данного изобретения могут вводиться непосредственно в глаз. Конструкции ДНК данного изобретения можно доставлять непосредственно к очаговым сайтам заболевания во внутренних органах, полостях тела и т.п. с применением томографических устройств, применяемых для направления иглы для инъекции непосредственно к очагу заболевания. Конструкции ДНК данного изобретения можно вводить также к местам заболевания во время хирургического вмешательства.

Вводимая доза ДНК зависит от возраста, клинического состояния и степени заболевания или генетического предрасположения индивидуума типа сопутствующей обработки (лечения), если она имеется, и природы патологического или злокачественного состояния. Эффективная система доставки, применимая в способе данного изобретения, может быть применена в таких формах, как капсулы, таблетки, жидкие растворы, суспензии или элексиры, для перорального введения, или стерильные жидкие формы, такие как растворы, суспензии или эмульсии. Предпочтительно использование инертного носителя, такого как солевой раствор, или солевой раствор с фосфатным буфером, или любой такой носитель, в котором соединения, используемые в способе данного изобретения, имеют приемлемые свойства растворимости.

Предпочтительно для внутриглазного введения и для доставки к другим локализованным местам заболевания системы доставки, используемые в способе данного изобретения, могут быть применены в таких стерильных жидких формах, как растворы, суспензии или эмульсии. Для топического применения они могут быть использованы в таких формах, как мази, кремы и спреи. Предпочтительно применяют любой инертный носитель, такой как солевой раствор, или солевой раствор с фосфатным буфером, или любой такой носитель, в котором соединения, применяемые в способе данного изобретения, имеют приемлемые свойства растворимости.

Для местного введения в клетки можно применять любой способ, известный специалистам в этой области (но не только), такой как трансфекция, электропорация, микроинъекция клеток, или в носителях, таких как липосомы, липофектин, или в виде незащищенной ДНК или РНК. ДНК данного изобретения может быть доставлена при помощи известных систем доставки генов, таких как (но не только) ретровирусные векторы (Gilboa (1982) J. Virology 44:845; Hocke (1986) Nature 320:275; Wilson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014), система вируса коровьей оспы (Chakrabarty et al., (1985) Mol. Cell Biol. 5: 3403) или при помощи других эффективных систем доставки ДНК (Yates et al., 1985) Nature 313: 812), известных специалистам в этой области. Эти ссылки приводятся лишь в качестве примеров. Для специфической доставки или переноса в клетки, которые аномально пролиферируют, и для сохранения неделящихся клеток предпочтительно применять ретровирусную систему доставки, известную специалистам в этой области. Поскольку для интеграции ретровирусной ДНК необходима репликация ДНК хозяина и ретровирус не сможет самореплицироваться вследствие отсутствия ретровирусных генов, необходимых для его жизненного цикла, использование такой ретровирусной системы доставки данного изобретения будет иметь мишенью указанные антипролиферативные элементы патологически размножающихся клеток и не будут попадать в неделящиеся нормальные клетки.

Мутантные белки данного изобретения можно вводить в любом биологически эффективном носителе. Биологически эффективные носители могут включать в себя ретровирусы, липосомы и использовать любой другой механизм трансфекции, способный вводить чужеродные белки в геном клетки. Такие механизмы трансфекции известны специалистам в данной области. Носитель может также включать в себя любой агент или растворитель, с которыми совместимы конструкции данного изобретения и которые нетоксичны для индивидуумов или клеток, подвергаемых обработке (лечению), при вводимых количествах.

Подвергаемые лечению патологические клеточно-пролиферативные состояния Существует большое разнообразие патологических раковых и нераковых клеточно-пролиферативных состояний, для которых способ данного изобретения может обеспечить терапевтические преимущества. Эти патологические состояния могут встречаться почти во всех клеточных типах, способных к отклоняющейся от нормы пролиферации. Среди типов клеток, проявляющих патологический или атипичный рост, находятся (1) фибробласты, (2) эндотелиальные клетки сосудов и (3) эпителиальные клетки. Из вышесказанного видно, что способ данного изобретения применим в лечении локальных или диссеминированных патологических состояний во всех или почти во всех системах органов или тканей индивидуума.

Например, только в глазу способ данного изобретения может быть использован для лечения большого разнообразия патологических болезненных состояний, вызываемых аномальной пролиферацией нормальных (доброкачественных) или злокачественных клеток или тканей, в том числе (но не только) следующих фибропролиферативных, вазопролиферативных и/или опухолевых заболеваний глаза: ретролетальной фиброплазии (синдрома Терри), пролиферативной витреоретинопатии, пролиферативной диабетической ретинопатии, капиллярной гемангиомы, хороидальных неоваскулярных сетей, субретинальных неоваскулярных сетей, старческой дегенерации пятна роговицы, вызываемой субретинальной неоваскуляризацией (новообразованием сосудов), корнеальной васкуляризацией, сморщивания пятна, вызываемого пролиферацией эпиретинальной мембраны, катаракт взрослых, вызываемых ядерным cклерозом, фиброзного врастания после травмы или хирургии, глиом зрительного нерва, ангиоматоза сетчатки, неоваскулярной глаукомы, кавернозной гемангиомы, покраснения радужной оболочки (rubeosis iridis), пролиферативной ретинопатии с образованием менискоцитов, эпителиальных выростов после хирургии глаза или повреждения, пленок после катаракты, папилломы, новообразования сосудов в сетчатке при талассемии, субретинальной васкуляризации, вызываемой эластичной псевдоксантомой (pseudoxanthoma elasticum) и нейрофиброматоза типа I и II, ретинобластомы, увеальной меланомы глазницы. Другие доброкачественные клеточно-пролиферативные заболевания, для которых полезно данное изобретение, включают в себя (но не ограничиваются ими) псориаз, ихтиоз, папилломы, базалиомы, плоскоклеточный рак и синдром Стивенса-Джонсона.

В общем данное изобретение применимо ко всем формам рака, в том числе (но не только) к ракам, в которых принимает участие инактивация гена Rb и/или гена р53, таким как остеосаркома, саркомы мягких тканей, меланомы, фибросаркома, ретинобластома, карцинома молочной железы, мочевого пузыря, шейки матки, легких, толстой кишки, яичника, почки, поджелудочной железы и предстательной железы.

Обнаружение определяющего конформацию консервативного домена, сохраняемого в pRb и р53 Данное изобретение описывает консервативный гомологичный структурный домен, контролирующий конформации двух опухолевых супрессорных генных продуктов, Rb и р53, что позволяет создание мутантов этих генов и способов их применения. Так, данное изобретение обеспечивает выделенную молекулу ДНК, которая представляет собой мутированный ростовой супрессорный ген. Мутированный ростовой супрессорный ген данного изобретения может быть любым геном, ингибирующим пролиферацию клеток. В одном предпочтительном варианте данного изобретения мутированный супрессорный ген представляет собой ген Rb. В другом предпочтительном варианте данного изобретения мутированный ростовой супрессорный ген представляет собой мутированный ген р53.

Для выяснения взаимодействия между рRb и его клеточными мишенями получали антитела к различным гидрофильным районам Rb белка. Поскольку различные районы Rb белка могут взаимодействовать с различными белками, было необходимо получить антитела ко многим различным районам так, чтобы некоторые из этих антител связывались с белковым комплексом между Rb белком и его мишенями без нарушения их взаимодействия. Из панели поликлональных антител против Rb, полученных против синтетических пептидов с последовательностями, соответствующими различным гидрофильным доменам, два из них (Rb1-Аb 18 и Rb1-Аb 20) стойко осаждали, кроме Rb белка, белок с мол. массой 53 кД (фиг. 1А, дорожки 1,2, 8 и 9). Оказалось, что эти же два антитела вырабатываются против одного и того же синтетического пептида, р5. Появление белка 53 кД специфично для антисывороток, выработанных против р5. Антисыворотки против других районов, например Rb-Ab В (фиг.1, дорожки 4-5) и Rb1-Ab С (фиг.1, дорожки 6-7), не иммуноосаждали белок 53 кД, хотя они все еще узнавали белок Rb. Вследствие сходства по мол. массе этого белка и р53 кажется, что этот белок был самим белком р53. Иммунопреципитация клеточных линий при помощи Раb 122, мноклонального антитела против р53 показала, что р53 действительно имеет ту же самую точно совпадающую мол. массу, что и белок 53 кД (дорожка 10). Кроме того, если р53 сначала удаляли из клеточного лизата при помощи Раb 122, то ни Rb1-Аb 18, ни Rb1-Ab 20 не могли иммунопреципитировать белок 53 кД, хотя они все еще могли осаждать Rb белок (дорожка 11). Для дальнейшего подтверждения, что белок 53 кД действительно является белком р53, проводили иммунопреципитацию на нескольких клеточных линиях, которые не экспрессировали эндогенный р53 и/или Rb белок. Во всех случаях (дорожки 1-20) эти антитела действительно могут узнавать р53 белок в соответствии с состоянием присутствия или отсутствия гена р53 в этих клеточных