Ферментационный способ получения l-лизина

Ферментационный способ получения l-лизина

Реферат

 

Изобретение относится к промышленному использованию микроорганизмов. Способ включает культивирование бактерий рода Escherichia, накопление L-лизина в ее культуре и сбора L-лизина из культуры, при этом бактерии несут дигидродипиколинатсинтазу, ингибирование которой по типу обратной связи L-лизином десенсибилизировано, и аспартокиназу, ингибирование которой по типу обратной связи L-лизином десенсибилизировано, и экспрессия гена дигидропиколинатредуктазы в бактериях усилена. Способ позволяет увеличить постадийно продукцию L-лизина. 8 з.п.ф-лы, 24 ил, 22 табл.

Изобретение относится к промышленному использованию микроорганизмов и, в частности, относится к способу ферментационного получения L-лизина.

В известной практике получения L-лизина в результате ферментации для повышения продуктивности используют микробный штамм, выделенный из природного окружения, или искусственный мутантный штамм, полученный из этого микробного штамма. Известно большее число искусственных мутантных штаммов, продуцирующих L-лизин. Большинство из них представляют мутантные штаммы, обладающие устойчивостью к S-2-аминоэтилцистеину (АЕС), и принадлежат к роду Brevibacterium, Corynebacterium, Bacillus или Escherichia. Кроме того, были раскрыты различные методики для повышения продуцирования аминокислоты, например, в результате использования трансформантов с применением рекомбинантных ДНК (патент США 4278765).

В отношении тех, которые принадлежат к роду Escherichia, можно указать, например, японскую открытую патентную выкладку 56-18596, патент США 4346170 и Applied Microbiology and Biotechnology 15, 227-231 (1982), в которых раскрыты способы получения L-лизина в результате использования бактериального штамма, в котором усилена активность дигидродипиколинатсинтазы (здесь и далее иногда используют сокращение "DDPS"). Однако DDPS, используемая в этих случаях, является дикого типа синтазой, у которой неприятным побочным эффектом является ингибирование ее по типу обратной связи L-лизином. В результате оказывается невозможным достичь достаточно высокой производительности L-лизина.

Между прочим, в упомянутой статье в Applied Microbiology and Biotechnology, 15, 227-231 (1982) описывается получение L-лизина в количестве 3 г/л гидрохлорида L-лизина из 75 г/л глюкозы, где коэффициент превращения (число г L-лизина, получаемого из 1 г сахара, или его процент) по расчетам оказался 0,04, или 4%.

С другой стороны, в патентной публикации Кореи 92-8382 раскрыт способ получения L-лизина с использованием бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, в которую введена DDPS, полученная из бактерии, принадлежащей к роду Corynebacterium, который, как известно, лишен недостатка ингибирования по типу обратной связи с помощью L-лизина (коэффициент превращения 17%). Однако верхний предел температуры для роста бактерий, принадлежащих к роду Соrуnеbacterium, ниже, чем верхний предел температур для роста бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, примерно на 10 градусов. Поэтому культивирование следует осуществлять при более низких температурах культивирования, если ДНК, кодирующую DDPS, полученную из бактерий, принадлежащих к роду Corynebacterium, вводят в бактерию, принадлежащую к роду Escherichia с целью использования ее для получения L-лизина. Поэтому слишком рано говорить о том, что трудно продемонстрировать преимущества, которыми обладают бактерии рода Escherichia, то есть что высока температура их культивирования, что они быстро размножаются и что они отличаются высокой скоростью продуцирования L-лизина.

Обычно, если экспрессируется ген, полученный из гетерологичного организма, это иногда вызывает разложение продукта экспрессии с помощью протеазы и образование нерастворимых включений, что приводит к значительно большим трудностям по сравнению со случаем экспрессии гомологичного гена. Далее, если ДНК, кодирующую DDPS, полученную из бактерий, принадлежащих к роду Corynebacterium, вводят в бактерию, принадлежащую к роду Escherichia, для промышленного производства L-лизина, налагаются более строгие ограничения по сравнению со случаем использования рекомбинанта, в который вводят гомологичный ген, в соответствии с требованиями к рекомбинантным ДНК.

Между прочим, дигидродипиколинатсинтаза (DDPS) является энзимом для дегидратации и конденсации аспартополуальдегида и пировиноградной кислоты для синтеза дигидродипиколиновой кислоты. Эта реакция расположена в начале схемы системы биосинтеза L-лизина в биосинтезах аминокислот семейства аспарагиновых кислот. Как известно, этот энзим отвечает за такой важный регуляторный сайт, как аспартокиназа, в бактериях, принадлежащих роду Escherichia.

DDPS кодируется геном под названием dapA в Е. coli [Escherichia coli]. dapA был клонирован, и его нуклеотидная последовательность также была определена (Richaud, F. et al., J. Bacteriol., 297 (1986)).

С другой стороны, аспартокиназа (здесь и далее сокращенно именуемая как "АК") является энзимом для катализирования реакции превращения аспарагиновой кислоты в -фосфоаспарагиновую кислоту, которая служит основным регуляторным энзимом в системе биосинтеза аминокислот семейства аспарагиновых кислот. АК из Е. coli имеет три типа (АК1, АК11, АК111), два из которых являются комплексными энзимами с гомосериндегидрогеназой (здесь и далее иногда сокращаемой до "HD"). Одним из таких комплексных энзимов является AK1-HD1, кодируемый thrA геном, а другой - AK11-HD11, кодируемый metLM геном. АК1 подвержен супрессии с помощью треонина и изолейцина и ингибируется треонином, тогда как АК1 подавляется метионином.

Напротив, известно, что только АК111 является простым функционирующим энзимом, который является продуктом гена, обозначаемого как lysC, и подвержен супрессии и ингибируется L-лизином. Отношение их внутриклеточных активностей АК1:АК11:АК111 = примерно 5:1:4.

Как было указано ранее, DDPS, полученная из бактерий, принадлежащих роду Corynebacterium, лишена недостатка ингибирования по типу обратной связи с помощью L-лизина. Однако, если ее вводят в бактерию, принадлежащую роду Escherichia, для использования для продуцирования L-лизина, возникает проблема температур, при которых ведут культивирование. Ожидается, что L-лизин может эффективно продуцироваться в результате ферментации с использованием бактерий, принадлежащих роду Escherichia, если удастся получить мутантный энзим DDPS или АК111, полученные из бактерий, принадлежащих роду Escherichia, которые лишены недостатка ингибирования по типу обратной связи с помощью L-лизина. Однако в известной литературе нет материалов, которые раскрывали бы такой мутантный энзим DDPS, и также существует одно сообщение о мутантном энзиме АК111 (Boy, E. et al., J. Bacteriol., 112, 84 (1972)), но в нем нет ни одного примера, который предполагал бы, что такой мутантный энзим может также повысить продуктивность L-лизина.

Настоящее изобретение было выполнено с учетом вышеуказанных точек зрения, его целью было получение DDPS и АК111, полученных из бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, с эффективно десенсибилизированным ингибированием по типу обратной связи с помощью L-лизина, и создание способа получения L-лизина в результате ферментации, который был бы усовершенствован по сравнению с известными способами.

В результате длительных повторных исследований для достижения указанных целей авторам удалось получить ДНК, кодирующую DDPS, полученную из бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, в которой ингибирование по типу обратной связи с помощью L-лизина было существенно десенсибилизировано. ДНК, кодирующую DDPS, полученную из Е. coli, в которой недостаток, связанный и ингибированием по типу обратной связи с помощью L-лизина, был существенно десенсибилизирован, иногда называют здесь мутантной dapA или dapA*.

Кроме того, авторы создали бактерию, принадлежащую роду Escherichia, несущую мутантную dapA и аспартокиназу, которая лишена недостатка ингибирования по типу обратной связи с помощью L-лизина. ДНК, кодирующая аспартокиназу, полученную из Е. coli, в которой ингибирование по типу обратной связи с помощью L-лизина достаточно десенсибилизировано, иногда здесь называют мутантной lysC или lysC*.

Кроме того, авторы создали бактерию, принадлежащую роду Escherichia, несущую мутантный dapA и мутантный lysC. И было обнаружено, что значительное количество L-лизина можно получить и накопить в культуре в результате культивирования вышеуказанной бактерии, принадлежащей к роду Escherichia в предпочтительной среде.

Кроме того, авторы обнаружили, что производство L-лизина можно далее увеличить, воздействуя на другие гены в системе биосинтеза L-лизина бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, несущих мутантный dapA и мутантный lysC.

В настоящем изобретении предложен способ получения L-лизина, включающий стадии культивирования любой из бактерий, принадлежащих роду Escherichia, описанному ранее, в соответствующей среде, продуцирования и накопления L-лизина в этой культуре и выделения L-лизина из этой культуры.

В этом описании ДНК, кодирующая DDPS или АК111, или ДНК, содержащая промотор в дополнении к этому, иногда называется "DDPS геном" или "АК111 геном". Кроме того, мутантный энзим, который десенсибилизирует ингибирование по типу обратной связи с помощью L-лизина, и ДНК, кодирующая его, или ДНК, содержащая промотор в дополнении к нему, иногда просто называются "мутантным энзимом" и "мутантным геном" соответственно. Кроме того, фраза "ингибирование по типу обратной связи с помощью L-лизина десенсибилизировано" означает, что достаточно существенной десенсибилизации ингибирования и нет необходимости в полной десенсибилизации.

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно.

1. ДНК, кодирующая мутантную дигидродипиколинатсинтазу (DDPS) настоящего изобретения ДНК, кодирующая мутантную DDPS настоящего изобретения, содержит мутацию для десенсибилизации ингибирования по типу обратной связи с помощью L-лизина DDPS, кодируемой ДНК, кодирующей дикого типа DDPS. Примерами DDPS могут служить те, которые получены из бактерий, принадлежащих роду Escherichia, особенно DDPS, полученные из Е. coli. Мутации DDPS для десенсибилизации ингибирования по типу обратной связи с помощью L-лизина, представлены следующими мутациями: (1) мутацией в результате замены 81-го аланинового остатка остатком валина; (2) мутацией в результате замены 118-го гистидинового остатка тирозиновым остатком; и (3) мутацией в результате замены 81-го аланинового остатка валиновым остатком, и в результате замены 118-го гистидинового остатка тирозиновым остатком; считая с N-конца DDPS в аминокислотной последовательности DDPS, представленной в последовательности SEQ ID 4 в описании последовательностей.

ДНК, кодирующая дикого типа DDPS, специально не ограничена при условии, что она кодирует DDPS, полученную из бактерий, принадлежащих роду Escherichia, что конкретно представлено ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность, определенную в последовательности SEQ ID 4, и дополнительно конкретно представлено последовательностью, представленной основаниями под номерами 272-1147 в основной последовательности, определенной в последовательности SEQ ID 3. В этих последовательностях те последовательности, которые содержат мутацию в нуклеотидной последовательности для того, чтобы вызвать замену аминокислотных остатков, описанных ранее, находятся ДНК, кодирующие мутантную DDPS настоящего изобретения. Любой кодон, соответствующий замененному аминокислотному остатку, доступен независимо от его типа при условии, что он кодирует идентичный аминокислотный остаток. Кроме того, постулируется, что имеющаяся DDPS слегка отличается в последовательности в зависимости от различий в бактериальных видах и бактериальных штаммах, однако те, у которых есть замена, делеция или вставка аминокислотного остатка (остатков) в положении (положениях), не связанном с энзиматической активностью, также включены в мутантный DDPS ген настоящего изобретения.

Способ получения такого мутантного гена следующий. Вначале ДНК, содержащую дикого типа DDPS ген или DDPS ген, содержащий другую мутацию, подвергают in vitro мутационной обработке и ДНК после мутационной обработки лигируют с векторной ДНК, адаптированной хозяину для получения рекомбинантной ДНК. Рекомбинантную ДНК вводят в микроорганизм хозяина для получения трансформантов. Когда один из них, который экспрессирует мутантную DDPS, выбирают из вышеуказанных трансформантов, такой трансформант содержит мутантный ген. В другом варианте ДНК, содержащую дикого типа DDPS ген или DDPS ген, содержащий другую мутацию, можно лигировать с векторной ДНК, адаптированной хозяину для получения рекомбинантной ДНК. После этого рекомбинантную ДНК подвергают in vitro мутационной обработке и рекомбинантную ДНК после мутационной обработки вводят в микроорганизм хозяина для получения трансформантов. Когда один из них, который экспрессирует мутантную DDPS, выбирают из вышеуказанных трансформантов, такой трансформант содержит также мутантный ген.

Можно также микроорганизм, который продуцирует дикого типа энзим, подвергнуть мутационной обработке для создания мутантного штамма, который продуцирует мутантный энзим, а затем получить мутантный ген из мутантного штамма. В другом варианте трансформант, в который вводят рекомбинантную ДНК, лигированную с дикого типа геном, можно заменить мутантной обработкой для создания мутантного штамма, который продуцирует мутантный энзим. Если после этого выделить рекомбинантную ДНК из мутантного штамма, мутантный ген создается на основе вышеуказанной ДНК.

Агентом для осуществления in vitro мутантной обработки ДНК может быть гидроксиламин и т. п. Гидроксиламин является химическим мутагеном, который вызывает мутацию замены цитозина на тимин в результате изменения цитозина на N⁴-гидроксицитозин. В другом варианте, если сам микроорганизм подвергают мутационной обработке, эту обработку проводят, используя УФ-излучение, или мутаген, который обычно используют для осуществления искусственных мутаций, например N-метил-N-нитро-N-нитрозогуанидин (NTG) или азотистую кислоту.

Никаких проблем не возникает, если использовать в качестве донорного микроорганизма для ДНК, содержащей дикого типа DDPS ген или DDPS ген, содержащий другую мутацию, описанную ранее, при условии, что этот микроорганизм принадлежит к роду Escherichia. Конкретно можно использовать те, которые описаны в книге, написанной Neidhardt et al. [Neidhardt, F.C. et al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology; Washington, D.C., 1208, таблица 1]. Так, например, можно использовать штаммы Е. coli JM109 и МС1061. Если в качестве донорного микроорганизма для ДНК, содержащей DDPS ген, используют дикий штамм, получают ДНК, содержащую дикого типа DDPS ген.

(1) Получение дикого типа DDPS гена Пример получения ДНК, содержащей DDPS ген, будет раскрыт далее. Вначале Е. coli, содержащую дикого типа dapA, например МС1061 штамм, культивируют для получения культуры. Если культивируют описанный ранее микроорганизм, культивирование можно вести в соответствии с обычными способами ведения твердой культуры, однако предпочтительно вести культуру в жидкой среде, учитывая эффективность сбора бактерий. Можно использовать среду, в которую добавляют один или более из источников азота, например дрожжевой экстракт, пептон, мясной экстракт, кукурузный сироп и эксудат сои или пшеницы с одной или более из неорганических солей, таких как первичный кислый фосфат калия, вторичный кислый фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, хлорид магния, хлорид железа, сульфат железа или сульфат магния, и, кроме того, необязательно добавляют сахара, витамины и т.п. Удобно устанавливать исходное значение рН среды 6-8. Культивирование ведут в течение 4-24 часов при 30-42^oС, предпочтительно при около 37^oС в культуре с аэрацией и перемешиванием в результате встряхивания, или в стационарной культуре, или т.п.

Полученную таким образом культуру центрифугируют, например, при 3000 об/мин в течение 5 минут для получения клеточного осадка Е. coli MC061 штамма. Хромосомную ДНК можно получить из клеточного осадка, например, с помощью способа Saito and Miura (Biochem. Biophys. Аста., 72, 619 (1963)), или по способу K.S. Kirby (Biochem. J., 64, 405 (1956)).

Для того чтобы выделить DDPS ген из хромосомной ДНК, полученной таким образом, приготавливают библиотеку ДНК. Вначале хромосомную ДНК частично переваривают подходящим рестрикционным энзимом для получения смеси различных фрагментов. Можно использовать широкий круг рестрикционных энзимов, если степень разрезания контролируется временем реакции разрезания и т.п. Так, например, SauЗA1 оставляют реагировать на хромосомной ДНК при температуре не менее 30^oС, предпочтительно при 37^oС при концентрации энзима 1-10 ед/мл в течение различных промежутков времени (1 минута, до 2 часов) для ее расщепления.

Затем полученные ДНК фрагменты лигируют с векторной ДНК, автономно реплицируемой в клетках бактерий, принадлежащих роду Escherichia, для получения рекомбинантной ДНК. Более конкретно рестрикционный энзим, который создает терминальную нуклеотидную последовательность, которая комплементарна полученной с помощью рестрикционного энзима SauЗA1, использованного для нарезания хромосомной ДНК, например BamHI, оставляют реагировать с векторной ДНК в температурных условиях не менее 30^oС и при концентрации энзима 1-100 ед/мл в течение не менее 1 часа, предпочтительно в течение 1-3 часов для полного расщепления, нарезания и отщепления. Далее смесь фрагментов хромосомной ДНК, полученную, как указано ранее, смешивают с расщепленной и нарезанной векторной ДНК, на которую ДНК лигаза, предпочтительно Т4 ДНК лигаза, воздействовала в температурных условиях 4-16^oС при концентрации энзима 1-100 ед/мл в течение, по крайней мере, 1 часа, предпочтительно в течение 6-24 часов, для получения рекомбинантной ДНК.

Полученную рекомбинантную ДНК используют для трансформации микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, например DDPS дефицитного мутантного штамма, такого как Escherichia coli K-12 штамм, предпочтительно JE7627 штамм (ponB704, dacB12, pfv+, tonA2, dapA, lysA, str, malA38, metB1, ilvH611, leuA371, рrоА3, lac-3, tsx-76) для получения библиотеки хромосомных ДНК. Такую трансформацию можно провести, например, по способу D.M. Morrison (Methods in Enzymology 68, 326 (1979)) или способом, в котором реципиентную бактерию обрабатывают хлоридом кальция для повышения проницаемости ДНК (Mandel, M. and Higa, A. , J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)). Штамм JE7627 доступен из национального Института Генетики (Mishima-shi, Shizuoka-ken, Japan).

Бактериальный штамм, содержащий рекомбинантную ДНК гена DDPS, получают из штаммов с повышенной активностью DDPS, или из штаммов, в которых ауксотрофия, возникающая в результате дефицита в DDPS гене, компенсирована, среди полученной библиотеки хромосомных ДНК. Так, например, мутантный штамм с дефицитом DDPS требует диаминопимелиновой кислоты. Так, если DDPS дефицитный мутантный штамм используют в качестве хозяина, ДНК фрагмент, содержащий DDPS ген, можно получить, выделяя бактериальный штамм, который становится способным расти на среде, не содержащей диаминопимелиновой кислоты, и выделяя рекомбинантную ДНК из бактериального штамма.

Подтверждением факта, содержит ли штамм-кандидат, содержащий рекомбинантную ДНК, содержащую DDPS ген, действительно рекомбинантную ДНК, в которую DDPS ген клонирован, можно получить в результате получения клеточного экстракта из штамма-кандидата и получения из него неочищенного энзимного раствора для подтверждения того, повысилась ли DDPS активность. Процедуру определения энзиматической активности DDPS можно осуществить по способу Yugari et al. (Yugari, Y. and Gilvard, C., J. Biol. Chem. 240, 4710 (1962)).

Рекомбинантную ДНК, в которой ДНК, содержащая DDPS ген, встроена в векторную ДНК, можно выделить из описанного ранее бактериального штамма, например в результате способа Р. Guerry et al. (J. Bacteriol., 116, 1064 (1973)) или в результате способа D. B. Clewell (J. Bacteriol., 110, 667 (1972)).

Получение дикого типа DDPS гена можно также осуществить в результате получения хромосомной ДНК из штамма, содержащего DDPS ген на хромосоме, по способу Saito and Miura или аналогично, и амплификации DDPS гена с помощью полимеразной цепной реакции (PCR) (см. White, T.J., et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) праймеры ДНК, которые можно использовать в реакции амплификации, должны быть комплементарны с обоими 3'-концами двухцепочечной ДНК, содержащей полный участок или частичный участок DDPS гена. Если амплифицирован только частичный участок DDPS гена, необходимо использовать такие ДНК фрагменты, как праймеры, чтобы осуществить скринирование ДНК фрагмента, содержащего полный участок из библиотеки хромосомных ДНК. Если амплифицирован полный участок DDPS гена, раствор PCR реакции, содержащий фрагменты ДНК, содержащие амплифицированный DDPS ген, подвергают обработке с помощью электрофореза на агарозном геле, а затем экстрагируют целевой ДНК фрагмент. Так, ДНК фрагмент, содержащий DDPS ген, можно выделить.

ДНК праймеры можно соответствующим образом получить на основании, например, последовательности, известной в Е. coli (Richeud F., et al., J. Bacteriol., 297 (1986)).

Более конкретно праймеры, которые позволят амплифицировать участок, содержащий 1150 оснований, кодирующих DDPS ген, предпочтительны, и два вида праймеров, определенные в последовательностях SEQ ID 2 и SEQ ID 1, подходят для этой цели. Синтез праймеров можно осуществить такими обычными способами, как фосфодиамидитный способ (см. Tetrahedron Letters, 22, 1859 (1981)), используя коммерчески доступный ДНК синтезатор (например, ДНК синтезатор Модель 380В от Applied Biosystems Inc.). Кроме того, PCR можно осуществить, используя коммерчески доступный прибор PCR (например, ДНК Thermal Cycler Model PJ2000 от Takara Shuzo Co, Ltd.), используя Taq ДНК полимеразу (поставляемую Takara Shuzo Co., Ltd.) в соответствии с инструкциями изготовителей.

Что касается DDPS гена, амплифицированного в PCR, такая операция, как введение мутаций в DDPS ген, становится легкой, если его лигировать с векторной ДНК, автономно реплицируемой в клетках бактерии, принадлежащей роду Escherichia и введенной в клетки бактерии, принадлежащих роду Escherichia. Векторная ДНК, которую можно использовать, способ трансформации и способ подтверждения присутствия DDPS гена те же, что и в вышеописанной процедуре.

(2) Осуществление мутации в DDPS гене Способ осуществления такой мутации, как замена, вставка и делеция аминокислотных остатков, можно показать на примере способа рекомбинантной РСР (Higuchi, R. , 61 в PSR Technology (Eriich, H.A., Eds., Stockton press (1989)) и способом сайтспецифического мутагенеза (Kramer, W. and Frits, H.J. , Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987); Kunkel Т.A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)). Используя эти способы, можно вызвать нужные мутации в нужном сайте.

Кроме того, в соответствии с химическим синтезом нужного гена можно ввести мутацию или получить случайную мутацию в нужном сайте.

Далее, доступен способ, в котором DDPS ген на хромосоме или плазмиде непосредственно обрабатывают гидроксиламином (Hashimoto Т. and Sekiguchi M., J. Bacteriol. , 159, 1039 (1984)). В другом варианте можно использовать способ, в котором бактерию, принадлежащую роду Escherichia, содержащую DDPS ген, облучают УФ-излучением, или способ, основанный на обработке химическим агентом, таким как N-метил-N'-нитрозогуанидин или азотистая кислота. В соответствии с этими способами мутацию можно осуществить статистически.

Что касается выбора способа для мутантного гена, рекомбинантная ДНК, содержащая ДНК фрагмент, содержащий DDPS ген и векторную ДНК, первой подвергают непосредственной мутации с помощью гидроксиламина или т.п., который используют для трансформации, например, Е. coli штамма. Затем трансформированные штаммы культивируют на такой минимальной среде, как М9, содержащей S-2-аминоэтилцистеин (АЕС) в качестве аналога L-лизина. Штаммы, содержащие рекомбинантную ДНК, содержащую дикого типа DDPS ген, не могут синтезировать L-лизин и диаминопимеловую кислоту (ДАР), и их рост подавляется, так как DDPS, экспрессируемая из рекомбинантной ДНК, является ингибитором АЕС. Напротив, штамм, содержащий рекомбинантную ДНК, содержащую DDPS ген, в котором ингибирование L-лизина десенсибилизировано, содержит мутантный энзим, кодируемый DDPS геном в вышеуказанной рекомбинантной ДНК, которая не ингибируется АЕС. Поэтому он способен расти на минимальной среде, в которую добавляем АЕС. Этот факт можно использовать для отбора штамма, который устойчив к АЕС как аналогу L-лизина, то есть штамма, содержащего рекомбинантную ДНК, содержащую мутантный DDPS ген, в котором ингибирование десенсибилизировано.

Полученный таким образом мутантный ген можно ввести как рекомбинантную ДНК в подходящий микроорганизм хозяина и экспрессировать. Так можно получить такой микроорганизм, который содержал бы DDPS, в которой десенсибилизировано ингибирование по типу обратной связи. Хозяином предпочтительно является микроорганизм, принадлежащий роду Escherichia, примером которого может служить Е. coli.

В другом варианте фрагмент мутантного DDPS гена можно взять из рекомбинантной ДНК и встроить в другой вектор для использования. Векторная ДНК, которую можно использовать для целей настоящего изобретения, предпочтительно является плазмидной векторной ДНК, для которой примерами могут служить pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, PSF1010, pMW119, pMW219 и pMW218. Кроме того, можно использовать также векторы фаговой ДНК.

Кроме того, для эффективной экспрессии мутантного DDPS гена другой промотор, который функционирует в микроорганизмах, например, lac, trp и PL, можно лигировать в обратном направлении от ДНК последовательности, кодирующей мутантную DDPS, или промотор, содержащийся в DDPS гене, можно использовать как он есть, или после амплификации промотора.

Далее, как было указано ранее, мутантный ген можно встроить в автономно реплицируемую векторную ДНК, которая введена в хозяина, и оставить ее в хозяине как внехромосомную ДНК, как плазмиду. В другом варианте мутантный ген можно интегрировать в хромосому микроорганизма хозяина способом, в котором используют трансдукцию, транспосон (Berg, D.E. and Berg, C.M. Bio. Technol., 1, 417 (1983)), Mu фаг [японская открытая патентная выкладка 2-109985] или гомологичную рекомбинацию [Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lac. (1972)].

2. ДНК, кодирующая мутантную аспартокиназу 111 (ДК111), используемая в настоящем изобретении ДНК, кодирующая мутантную AK111, используемая в настоящем изобретении, имеет мутацию для десенсибилизации ингибирования по типу обратной связи кодируемой AK111 L-лизином в ДНК, кодирующей дикого типа AK111. Примером мутации для десенсибилизации ингибирования AK111 по типу обратной связи с помощью L-лизина может служить: (a) мутация для замены 323-го глицинового остатка остатком аспарагиновой кислоты; (b) мутация для замены 323-го глицинового остатка остатком аспарагиновой кислоты и замены 408-го глицинового остатка остатком аспарагиновой кислоты; (c) мутация для замены 34-го аргининового остатка цистеиновым остатком и замены 323-го глицинового остатка остатком аспарагиновой кислоты; (d) мутация для замены 325-го лейцинового остатка фенилаланиновым остатком; (e) мутация для замены 318-го метионинового остатка изолейциновым остатком; (f) мутация для замены 318-го метионинового остатка изолейциновым остатком и замены 349-го валинового остатка метиониновым остатком; (g) мутация для замены 345-го серинового остатка лейциновым остатком; (h) мутация для замены 347-го валинового остатка метиониновым остатком; (i) мутация для замены 352-го треонинового остатка изолейциновым остатком; (j) мутация для замены 352-го треонинового остатка изолейциновым остатком и замены 369-го серинового остатка фенилаланиновым остатком; (k) мутация для замены 164-го остатка глутаминовой кислоты лизиновым остатком; и (l) мутация для замены 417-го метионинового остатка изолейциновым остатком и замены 419-го цистеинового остатка тирозиновым остатком; считая с N-конца АК111 в аминокислотной последовательности АК111, определенной в последовательности SEQ ID 8 в описании последовательностей.

ДНК, кодирующая дикого типа АК111, особенно не ограничена, и примером для ДНК, кодирующей АК111, полученной из бактерии, принадлежащей роду Escherichia, может служить Е. coli. Более конкретно она представлена примерами ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность, определенную в последовательности SEQ ID 8, и последовательность, представленную основаниями под 584-1930 в основной последовательности, определенной в последовательности SEQ ID 7. АК111 Е. coli кодируется lysC геном.

В этих последовательностях те, которые содержат мутацию в основной последовательности для того, чтобы вызвать замену аминокислотных остатков, описанных ранее, являются ДНК, кодирующими мутантные АК111 настоящего изобретения. Любой кодон, соответствующий замещенному аминокислотному остатку, доступен независимо от его типа при условии, что он кодирует идентичный аминокислотный остаток. Кроме того, существуют такие, в которых аминокислотные последовательности, содержащие дикого типа АК111, слегка отличаются в зависимости от различия в бактериальных видах и бактериальных штаммах. Те, которые содержат замещения, делении или вставки аминокислотного остатка (остатков) в положении (положениях), не связанном с энзиматической активностью, таким образом также включены в мутантный АК111 ген настоящего изобретения. Так, например, основная последовательность дикого типа lysC гена, полученная в примере 2, описанная далее (SEQ ID 7), отличается от уже опубликованной последовательности lysC Е. coli K-12 JC411 штамма по 6 сайтам (Саssan, M. , Parsot, С., Cohen, G.N., and Patte, J.C., J. Biol Chem., 261, 1052 (1986)). Закодированные аминокислотные остатки отличаются по 2 их сайтам (в lysC JC411 штамма 58-ой глициновый остаток заменен цистеиновым остатком, а 401-ый глициновый остаток заменен аланиновым остатком, считая с N-конца в аминокислотной последовательности lysC, определенной в последовательности SEQ ID 8). Ожидается даже для lysC, имеющей ту же последовательность, что и lysC в Е. coli K-12 JC411 штамма, что lysC с мутацией, в которой ингибирование по типу обратной связи с помощью L-лизина десенсибилизировано, получают, если осуществлена любая из вышеперечисленных мутаций (а) до (l).

Способ получения ДНК, кодирующей мутантные АК111, в которых ингибирование по типу обратной связи с помощью L-лизина десенсибилизировано, следующий. Вначале ДНК, содержащую дикого типа АК111 ген или АК111 ген, содержащий другую мутацию, подвергают in vitro мутационной обработке, а ДНК, полученную в результате такой мутационной обработки, лигируют с векторной ДНК, адаптированной к хозяину для получения рекомбинантной ДНК. Рекомбинантную ДНК вводят в микроорганизм хозяина для получения трансформантов. Когда один из них, который экспрессирует мутантные АК111, выбирают из указанных трансформантов, такой трансформант содержит мутантный ген. В другом варианте ДНК, содержащая дикого типа АК111 ген или АК111 ген, содержащий другую мутацию, может быть лигирована с векторной ДНК, адаптированной к хозяину, для получения рекомбинантной ДНК. После этого рекомбинантную ДНК подвергают in vitro мутационной обработке, а рекомбинантную ДНК после мутационной обработки вводят в микроорганизм хозяина для получения трансформантов. Если один из них, который экспрессирует мутантные АК111, выбирают из вышеуказанных трансформантов, такой трансформант содержит мутантный ген.

В другом варианте можно также микроорганизм, который продуцирует дикого типа энзим, подвергнуть мутационной обработке для создания мутантного штамма, который продуцирует мутантный энзим, а затем из этого мутантного штамма получить мутантный ген. Примером агента для осуществления непосредственной мутационной обработки ДНК может служить гидроксиламин и т.п. Гидроксиламин представляет собой химический мутаген, который вызывает мутацию от цитозина до тимина, в результате замены цитозина на N⁴-гидроксицитозин. В другом варианте, если сам микроорганизм подвергают мутационной обработке, обработку осуществляют с помощью УФ-излучения, или используя такой мутаген, который обычно используют для искусственной мутации, как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (NTG).

В качестве донорного микроорганизма для ДНК, содержащей дикого типа АК111 ген или АК111 ген, содержащий любую из других мутаций, указанных выше, можно использовать при условии, что этот микроорганизм принадлежит к роду Escherichia. Более конкретно можно использовать те, которые описаны в книге, написанной Neidhardt et al. (Neidhardt, F.C., et al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, табл. 1). Так, например, Е. coli M109 штамм и МС1061 штамм могут служить примерами. Если АК111 ген получают из этих штаммов, получение библиотеки хромосомных ДНК и т.п. можно осуществить таким же способом, что и получение DDSR гена, описанное ранее. В качестве хозяина для получения такой библиотеки предпочтительно использовать штамм, полностью лишенный АК1, 11 и 111, такой как, например, Е. coli CT3 штамм (доступный от Е. coli Genetic Stock Center (Connecticut, USA)).

Из полученной библиотеки хромосомных ДНК получают бактериальный штамм, содержащий рекомбинантную ДНК АК111 гена в виде штамма, в котором АК111 активность усилена, или штамм, в котором дополнена ауксотрофия. Клеточные экстракты получают из штаммов-кандидатов, а неочищенные энзимные растворы получают из них для подтверждения АК111 активности. Процедура измерений для АК111 энзиматической активности может быть осуществлена в соответствии со способом Stadtman et al. (Stadtman, E.R., Cohen, G.N. Lebras, G., и Pobichon-Szumajsten H., J. Biol. Chem., 236, 2033 (1961)).

Так, например, если мутантный штамм, полностью лишенный АК, используют в качестве хозяина, ДНК фрагмент, содержащий АК111 ген, можно получить в результате выделения трансформированного штамма, который становится способным к росту на среде, не содержащей L-лизина, L-треонина, L-метионина и диаминопимелиновой кислоты, или на среде, не содержащей гомосерина и диаминопимелиновой кислоты, и выделения рекомбинантной ДНК из бактериального штамма.

Если АК111 ген амплифицирован из хромосомной ДНК в результате PCR, ДНК праймеры, которые следует использовать для PCR реакции, можно соответствующим образом получить на основании, например, последовательности, известной в Е. coli (Cassan, M. , Parsot, С., Cohen, G.N., и Patte, J.C., J. Biol. Chem. , 261, 1052 (1986)). Однако праймеры, которые могут амплифицировать участок, содержащий 1347 оснований, кодирующих lysC ген, также годятся, и, например, подходят два праймера, имеющие последовательность, определенную в последовательности SEQ ID 5 и SEQ ID 6.

Способ осуществления такой мутации, как замещение, вставка и делеция аминокислотного остатка (остатков) на АК111 гене, полученном, как указано ранее, представлен примером рекомбинантной PCR, методом сайтспецифического мутагенеза и т. п. , точно так же, как и мутационной обработкой DDPS гена, описанной ранее. Кроме того, в соответствии с химическим синтезом целевого гена оказывается возможным осуществлять мутацию или получать случайную мутацию в целевом сайте.

Кроме того, доступен способ, в котором ДНК АК111 гена на хромосоме или внехромосомную рекомбинантную ДНК непосредственно обрабатывают гидроксиламином (Hashimoto, Т. and Sekiguchi, M., J. Bacteriol., 159, 1039 (1984)). В другом варианте можно использовать способ, в котором бактерию, принадлежащую к роду Escherichia, содержащую АК111 ген на хромосоме, или внехромосомную рекомбинантную ДНК облучают УФ-светом, или способ, в котором осуществляют обработку таким химическим агентом, как N-метил-N'-нитрозогуанидин или азотистая кислота.

В отношении способа отбора мутантного АК111 гена штамм, полностью лишенный АК, например Е. coli GT3 штамм, вначале трансформируют рекомбинантной ДНК, содержащей АК111 ген, который был подвергнут мутационной обработке. Затем полученные трансформированные штаммы культивируют на минимальной среде, такой как М9, содержащей значительное количество L-лизина. Штаммы, содержащие рекомбинантную ДНК, содержащую дикого типа АК111 ген, не могут синтезировать L-треонин, L-изолейцин, L-метионин и диаминопимелиновую кислоту (ДАР), и их рост подавляется, так как только один АК ингибируется L-лизином. Напротив, штамм, содержащий рекомбинантную ДНК, содержащую мутантный АК111 ген, в котором ингибирование с помощью L-лизина десенсибилизировано, должен быть способен расти на минимальной среде, в которую добавлено значительное количество L-лизина. Этот факт можно использовать для отбора штамма, который устойчив во время роста к L-лизину или АЕС, как аналогу L-лизина, то есть, штамм, содержащий рекомбинантную ДНК, содержащую мутантный АК111 ген, в котором ингибирование десенсибилизировано.

Полученный таким образом мутантный ген можно ввести как рекомбинантную ДНК в подходящий микроорганизм (в хозяина) и экспрессировать. Таким образом можно получить микроорганизм, который содержит АК111, в которой было десенсибилизировано ингибирование в результате обратной связи.

Хозяином предпочтительно является микроорганизм, принадлежащий роду Escherichia, примером которого является Е. coli.

В другом варианте фрагмент мутантного АК111