Сосудистый белок - 1 адгезии, обладающий аминооксидазной активностью

Сосудистый белок - 1 адгезии, обладающий аминооксидазной активностью

Реферат

 

Изобретение относится к медицине и касается применения сосудистого белка-1 адгезии, обладающего аминооксидазной активностью. Сущность изобретения включает способ манипулирования процессом связывания эндотелиальных клеток с лимфоцитами, опосредованного сосудистым белком-1 адгезии (VAP-1), включающим ингибирование или потенцирование ферментной активности аминооксидазы в указанных эндотелиальных клетках. Преимущество изобретения заключается в разработке способа, опосредующего ранние взаимодействия в процессах связывания лимфоцитов с эндотелиальными клетками. 2 с.п.ф-лы, 6 ил., 2 табл.

Область техники Изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей новый человеческий белок адгезии эндотелиальной клетки, обозначенный VAP-1, который обладает адгезивной функцией и аминоксидазной активностью. Изобретение также относится к применению нуклеиновой кислоты и полипептида VAP-1.

Предпосылки изобретения Непрерывная циркуляция лимфоцитов между кровью и тканью является принципиально важной для функционирования иммунной системы. Этот процесс позволяет лимфоцитам контролировать все участки организма в поисках антигена, что позволяет им развивать и формировать свою реакцию на антигенную угрозу в конкретных условиях тканевого микроокружения. После этого лимфоциты могут специфически возвращаться в сайт с микроокружением, в котором они обнаружили антиген, что повышает селективность иммунного ответа. Адгезивные взаимодействия между множественными рецепторами на циркулирующих лимфоцитах и их лигандами, экспрессируемыми на поверхности эндотелиальных клеток в посткапиллярных венулах, представляют собой как средство осуществления миграции лейкоцитов, так и способ селективно контролировать его. Несмотря на то, что за последнее время был достигнут существенный прогресс в описании каскада процессов, необходимых для проникновения в ткань циркулирующих лейкоцитов из свободного кровотока, многое в данном процессе остается неясным. В частности, известных в настоящее время функций молекул адгезии недостаточно для того, чтобы объяснить все способы рециркуляции и специфичность связывания, наличие которых показано как в норме, так и в условиях воспаления.

Имеющиеся в настоящее время гипотезы исходят из многоступенчатой модели адгезии лейкоцитов с эндотелием, которая основана на каскаде последовательных, но перекрывающихся молекулярных взаимодействий между несколькими парами рецептор-лиганд (Butcher E.G. and Picker L., J. Science, 272:60-66 (1996); Springer Т. A., Cell, 76:301-314 (1994)). Первоначальные временные и ограниченные взаимодействия между лейкоцитом в кровотоке и сосудистой стенкой выполняют преимущественно селектины и их гликопротеиновые лиганды. На этой стадии могут принимать участие интегрины и другие молекулы. За стадиями качения и опробования может при наличии соответствующих сигналов наступить следующая стадия прочной адгезии, осуществляемая через связывание активированных интегринов со своими лигандами из суперсемейства Ig. Локально повышенные уровни иммобилизованных цитокинов и других хемоаттрактантов могут быть вовлечены в процесс инициации такой локальной активации, которая опосредована соответствующими рецепторами и последующей передачей сигналов внутри клетки. Заключительная стадия включает процесс миграции связанных клеток через эндотелиальную выстилку в ткань посредством очень неясного механизма. Тканеспецифичные пути циркуляции основаны на регуляции экспрессии определенных сочетаний рецептор-лиганд молекулы адгезии в соответствующем участке организма.

Ранее было описано моноклональное антитело (MAT) 1B2, которое распознает новую молекулу адгезии эндотелиальной клетки человека и может блокировать связывание лимфоцита с верхними эндотелиальными венулами миндалин (HEV) в анализе замороженных срезов (Salmi M. and Jalkanen S., Science, 257:1407-1409 (1992); Патенты США NoNo. 5512442 и 5580780 и заявки на Патент США No. 08/447799, которые приведены в настоящем описании в качестве ссылок). MAT 1B2 специфичен для указанного процесса и в этой связи может определять сосудистый белок-1 адгезии (VAP-1). При воспалении индуцируется экспрессия поверхностного VAP-1 и молекулы находятся на поверхности эндотелиальных клеток в просвете сосудов (Salmi M. et al., J. Exp. Med., 178: 2255-2260 (1993)). Методом иммунопреципитации ткани миндалин в присутствии MAT 1B2 могут быть обнаружены два вида VAP-1 с различной молекулярной массой: один из них имеет массу 90 кДа, а второй 170-180 кДа. Однако иммуноблоттинг в невосстановительных условиях приводит к преобладанию молекул массой 170-180 кДа (Salmi M. and Jalkanen S. , J. Exp. Med., 183:569-579 (1996)). Иммунореактивные VAP-1 с незначительно различающимися молекулярными массами также могут быть обнаружены в других участках организма, в частности в клетках гладкой мускулатуры сосудистой сети, а также в других тканях, содержащих гладкомышечные клетки, хотя их функция в таких клетках остается невыясненной. МакНаб с соавторами сообщили, что VAP-1 экспрессируется на клетках эндотелия синусоидов печени и может опосредовать процесс связывания Т-лимфоцитов (McNab G. et al. , Gastroenterology, 110: 522-528 (1996)). Исследования VAP-1 из миндалин путем расщепления специфическими гликозидазами показали, что VAP-1 является сиалогликопротеином, содержащим, по всей видимости, и N-, и O-связанные сахара при наличии большого количества остатков сиаловой кислоты со связями двух типов - 2,36 и 2,6. Было также показано, что VAP-1 опосредует связывание лимфоцита с HEV в лимфатических тканях в условиях сдвига, причем в связи с сиаловой кислотой, поскольку десиалилированная молекула, как показано исследованиями замороженных срезов, уже не может участвовать в связывании лимфоцитов (Salmi M. and Jalkanen S. , J. Exp. Med., 183:569-579 (1996)). Молекула подвергается позитивной регуляции при воспалительных состояниях при заболеваниях кожи, кишечника, миндалин и синовиальной оболочки, хотя медиаторы, вызывающие это явление, еще не определены (Arvilommi А. -М. et al., Eur. J. Immunol., 26: 825-833 (1996); Salmi M. et al., J. Exp. Med. , 178:2255-2260 (1993)). VAP-1 отличается от адрессина (PNAd) из периферического лимфатического узла (PLN), распознаваемого MAT MECA-79, хотя как VAP-1, так и PNAd могут опосредовать связывание лимфоцитов с PLN в условиях сдвига. Однако, в отличие от PNAd, VAP-1 может действовать независимо от L-селектина и способствовать связыванию L-селектин-негативных лимфоцитов (Salmi M. and Jalkanen S., J. Exp. Med., 183:569-579 (1996)). Таким образом, VAP-1 представляет собой молекулу с важной адгезивной функцией в новом каскаде, которая действует независимо от известных селектинов и, по всей видимости, способна опосредовать ранние взаимодействия в процессах связывания лимфоцитов с PLN типа HEV.

Сущность изобретения Изобретение относится к очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей сосудистый белок-1 адгезии (VAP-1), выбранной из группы, состоящей из: (а) очищенной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, включающий аминокислотную последовательность, указанную на фигуре 1 (SEQ ID NO: 2); (б) очищенной молекулы нуклеиновой кислоты, включающей последовательность, кодирующую VAP-1, из нуклеотидной последовательности VAP-1, приведенной на фигуре 1 (SEQ ID NO: 1); (в) очищенной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид VAP-1, включающий аминокислотную последовательность, кодируемую клоном кДНК VAP-1, хранящейся в депозитарии под No. DSM 11536; (г) очищенной молекулы нуклеиновой кислоты, включающей кодирующую VAP-1 последовательность нуклеотидной последовательности, хранящейся в депозитарии под No. DSM 11536; (д) очищенной молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидным последовательностям VAP-1, указанным в (а), (б), (в) или (г); (е) очищенной молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, которая отличается от кодирующей последовательности молекулы нуклеиновой кислоты (б) или (г), в связи с вырожденностью генетического кода, и (ж) очищенной молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется с молекулой (д) и кодирует VAP-1, имеющий аминокислотную последовательность, демонстрирующую, по меньшей мере, 80% идентичность с последовательностью VAP-1, приведенной на фигуре 1 (SEQ ID NO:2).

Далее изобретение относится к способу создания рекомбинантного вектора, включающему введение молекулы, содержащей последовательность молекулы нуклеиновой кислоты для VAP-1, в последовательность ДНК, которая может функционировать в качестве вектора. Кроме того, изобретение относится к рекомбинантному вектору, включающему такую ДНК, кодирующую VAP-1. Изобретение относится к способу доставки VAP-1 в клетку-хозяина, включающему введение ДНК, кодирующей VAP-1, в клетку-хозяина. Изобретение относится, кроме того, к рекомбинантной клетке-хозяину, содержащей введенную таким образом ДНК. Изобретение также относится к способу получения полипептида сосудистого белка-1 адгезии (VAP-1), включающему культивирование рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей ДНК, кодирующую VAP-1 по настоящему изобретению, в условиях, допускающих экспрессию кодируемого полипептида VAP-1.

Далее изобретение относится к способу обеспечения аминоксидазной активности клетки-хозяина путем трансформации нуклеиновой кислотой, кодирующей VAP-1, клетки-хозяина.

Далее изобретение относится к методу изменения экспрессии сосудистого белка-1 адгезии (VAP-1), включающему: (а) введение в клетку-хозяина конструкции ДНК, содержащей: (i) целевую последовательность VAP-1 и (ii) регуляторную последовательность, связанную с целевой последовательностью VAP-1, и (б) содержание клетки-хозяина в условиях, подходящих для проведения гомологичной рекомбинации между конструкцией ДНК и эндогенной последовательностью VAP-1. Изобретение также относится к такой клетке-хозяина, в которой экспрессия VAP-1 была изменена указанным выше способом.

Изобретение также относится к рекомбинантной клетке-хозяина, содержащей: (а) целевую последовательность VAP-1 и (б) регуляторную последовательность, связанную с целевой последовательностью VAP-1.

Изобретение относится к способу окисления амина, включающему взаимодействие амина с полипептидом VAP-1 по настоящему изобретению. Амин может представлять собой, например, бензиламин или метиламин. Полипептид VAP-1 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 95% идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из: (а') очищенного полипептида, включающего аминокислотную последовательность VAP-1, приведенную на фигуре 1 (SEQ ID NO: 2); (б') очищенного полипептида, включающего аминокислотную последовательность VAP-1, кодируемую нуклеотидной последовательностью VAP-1, приведенной на фигуре 1 (SEQ ID NO:1): (в') очищенного полипептида, включающего аминокислотную последовательность, кодируемую клоном кДНК VAP-1, хранящимся в депозитарии под No. DSM 11536; (г') очищенного полипептида, включающего аминокислотную последовательность VAP-1, кодируемую нуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется с комплементом ДНК, кодирующей полипептид типа (а')-(в'), и кодирует VAP-1, и имеет аминокислотную последовательность, которая демонстрирует, по меньшей мере, 80% идентичность с последовательностью, приведенной на фигуре 1 (SEQ ID NO:2), (д') очищенного полипептида, включающего аминокислотную последовательность эпитопсодержащей части полипептида по пункту (а') или (б').

Изобретение также относится к способу ингибирования аминоксидазной активности, включающему введение эффективного количества ингибитора в образец, обладающий аминоксидазной активностью. Указанный ингибитор может представлять собой, например, семикарбазид, гидроксиламин, пропаргиламин, изониазид, ниаламид, гидраллазин, прокарбазин, монометилгидразин, 3,5-этокси-4-аминометилпиридин или MDL72145 ((Е)-2-(3,4-диметоксифенил)-3-фтораллиламин).

Изобретение также относится к способу манипулирования процессом связывания эндотелиальных клеток с лимфоцитами, опосредованного сосудистым белком-1 адгезии (VAP-1), включающему изменение ферментной активности аминоксидазы в эндотелиальных клетках посредством ингибирования или потенциирования.

Краткое описание чертежей Фиг. 1. Последовательность кДНК VAP-1, выделенная из библиотеки кДНК, выделенной из легкого человека, и предсказанная последовательность белка VAP-1. N-концевой, триптический и V8 пептиды, которые были очищены и секвенированы из иммуноочищенного белка VAP-1, заключены в прямоугольник. Аминокислотные остатки, особо выделенные в участках, очерченных в прямоугольник, указывают на то, что к указанному циклу при секвенировании пептидов не может быть отнесен какой-то аминокислотный остаток. Потенциальные сайты N-гликозилирования указаны стрелками с кружками, тогда как аспарагины и предположительные сайты О-гликозилирования указаны стрелками с квадратами. Трансмембранный домен между остатками 5 и 27 отмечен затемнением. Масштаб диаграммы в нижней части фигур указывает положение трансмембранного домена (показан заполненным TMD регионом), а относительное расположение предположительных сайтов гликозилирования во внеклеточной части молекулы помечено N или О для того, чтобы обозначать соответственно N- и O-связанный сахар. Масштабная стрелка обозначает 50 аминокислот.

Фиг. 2. Анализ методом сортировки клеток по интенсивности флюоресценции (FACS анализ) COS-7 клеток, трансфицированных относительно VAP-1, для определения ориентации мембраны и расположения VAP-1 в клетке. Диаграмма, показывающая структуру двух плазмид экспрессии VAP-1, используемых для трансфекции COS-7 клеток, приведена в верхней части фигуры. VAP-1 представляет собой нативную конструкцию экспрессии VAP-1. FLAG VAP-1 представляет собой VAP-1 с эпитопом FLAG, введенным для маркировки. Негативный контроль на псевдотрансфекцию, назовем его для краткости "псевдоконтроль", обеспечивается конструкцией, в которой VAP-1 имеет обратную ориентацию вектора экспрессии. Колонка 1: Экспрессия конструкции, используемой для трансфекции. Колонка 2: Отсутствие пермеабилизации (-) или наличие пермеабилизации (+) у трансфицированных клеток. Колонка 3: Негативный контроль при MAT окрашивании. Колонка 4: Окрашивание с использованием MAT 1B2 против VAP-1. Колонка 5: Окрашивание с использованием MAT M2 против FLAG. Ряды A-F указывают конструкцию экспрессии или тест на "псевдоконтроль", используемый при трансфекции, и результаты окрашивания трансфицированных клеток. Стрелки указывают позитивно окрашиваемые популяции клеток. На непермеабилизованных клетках окрашивание отмечается при использовании MAT 1B2 против VAP-1 (ряды В и С картины сортировки клеток по интенсивности флюоресценции, колонка 4). Тест на "псевдоконтроль" трансфицированных клеток был негативным (ряд А картины сортировки клеток по интенсивности флюоресценции, колонка 4). Не отмечается окрашивания при использовании MAT против FLAG в VAP-1 FLAG-трансфицированных клетках (ряд С, колонка 5). Однако, в случае пермеабилизованных клеток, VAP-1-трансфицированные клетки все еще являются позитивными на окрашивание (ряд Е, колонка 4), при этом VAP-1 FLAG-трансфицированные клетки также окрашиваются позитивно с использованием MAT против FLAG (ряд F, колонка 5), что указывает на то, что пермеабилизация клеток в отношении MAT против FLAG позволяет указанным антителам осуществить доступ к FLAG эпитопу, и это свидетельствует в пользу того, что данный эпитоп лежит внутри клетки.

Фиг. 3. Выстраивание представителей семейства медьсодержащих аминоксидаз млекопитающих, для которых имеются данные по последовательности, включая VAP-1. Метки слева относятся к конкретному, расположенному правее белку. БСАО обозначает аминоксидазу из сыворотки быка; VAP-1 обозначает человеческий сосудистый белок адгезии; ПДАO1 обозначает плацентарную диаминоксидазу человека 1; ПДАO2 - плацентарную диаминоксидазу человека 2; ДАО крысы - крысиную диаминоксидазу. Цифры соответствуют первой аминокислоте в каждом ряду сгруппированных белков. Последовательности взяты из самой свежей доступной базы данных и сгруппированы с использованием программы GCG Pileup. Остатки, характеризующиеся идентичностью с VAP-1, выделены с использованием программы GCG Box-shade.

Фиг. 4. Обработка сиалидазой VAP-1, экспрессируемого в COS-7 клетках. Клеточные лизаты из VAP-1-трансфицированных и псевдотрансфицированных COS-7 клеток обрабатывают сиалидазой (+) или не обрабатывают (-) перед проведением ДСН-ПААГ, после чего проводят иммуноблоттинг и обработку зондом MAT 1B2 для VAP-1 (дорожки 1-4) или тест на негативный контроль с использованием MAT 3G6 (дорожки 5-8).

Фиг. 5. А. Нозерн-блоттинг мРНК VAP-1 с поли А⁺ РНК, выделенной из гладкой мускулатуры кишки человека и стромы миндалин, из которых лимфоциты были частично удалены промыванием и сжатием. Гибридизованная мРНК размером 4,2 килобайта видна на обоих треках. В. Нозерн-блоттинг мРНК VAP-1 из различных тканей человека. Нозерн-блотты получают от Clon-tech Laboratories и на каждую дорожку вводят равное количество мРНК. Все фильтры нагружают ³²Р-меченными зондами кДНК VAP-1, содержащими полную кодирующую последовательность, и промывают их под строгим контролем (условия промывания после гибридизации: 0,1 х SSC, 0,1% ДСН при 65^oС, дважды в течение 45 минут).

Фиг. 6. Ax клетки, трансфицированные кДНК VAP-1, опосредуют адгезию лимфоцитов. А. Экспрессия VAP-1 на поверхности Ах клеток, стабильно трансфицированных кДНК VAP-1 или в тесте на "псевдоконтроль". На гистограммах интенсивность окрашивания на логарифмической шкале показана на оси Х и относительное количество клеток показано на оси Y. В. Увеличение уровня VAP-1-зависимого связывания лимфоцитов с VAP-1-трансфектантами. Значительное большее количество PBL (малые круглые сферы на верхней части монослоя, примеры которых указаны стрелками) связывается с VAP-1-трансфектантами (слева), чем с псевдотрансфектантами (справа). Фазовоконтрастные микрофотографии, увеличение х 100. С. Количественное определение связывания. Результаты пяти независимых экспериментов, представлены в виде среднего значения СКО.

Подробное описание изобретения Взаимодействие между рецепторами на поверхности лейкоцитов и их лигандами на эндотелиальных клетках сосудов представляет собой решающий этап в механизме контроля перемещения лимфоцитов между кровью и различными лимфоидными органами, а также имеет отношение к транссудации лейкоцитов в места воспаления. Описан клон кДНК, кодирующей сосудистый белок-1 адгезии (VAP-1), который опосредует реакцию адгезии лейкоцит-эндотелиальная клетка. Оказалось, что кодируемый VAP-1 обладает аминоксидазной активностью. Считается, что в высших организмах аминоксидаза включается в метаболизм биогенных аминов (McIntire W. and С. Hartmann, in Principles and Applications of Quinoproteins, V. L. Davidson, ed. , Marcel Dekker, Inc., N. Y., Chap. 6 (1992)).

Настоящее изобретение относится к очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, включающей полинуклеотид, кодирующий полипептид сосудистого белка-1 адгезии (VAP-1), имеющий аминокислотную последовательность, показанную на фигуре 1 (SEQ ID NO:2), которая было определена секвенированием клона кДНК, имеющего нуклеотидную последовательность, указанную на фигуре 1 (SEQ ID NO: 1). Клон, содержащий указанную нуклеотидную последовательность, был депонирован в соответствии с условиями Будапештского Договора в Международном депозитарии (International Depository Authority of DSMZ-Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen Und Zeilkulturen GmbH) по адресу Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Германия, 7 мая 1997 года под No. DSM 11536. Депонированный клон содержится в плазмиде pUC19.

На колонке с моноклональным антителом (MAT) для иммуноаффинного разделения были очищены мономерные и димерные формы VAP-1, размером 90 и 170-180 кДа соответственно, которые были выделены из обработанных детергентом лизатов гладких мышц в достаточном количестве для того, чтобы определить внутреннюю пептидную последовательность после расщепления трипсином и протеазой V8. Часть VAP-1 размером 90 кДа подвергнута процедуре N-концевого секвенирования и использована далее для конструирования частично вырожденных олигонуклеотидных праймеров для экспериментов в рамках полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой ОТ-ПЦР с использованием мРНК, полученной из гладких мышц кишки человека.

Один фрагмент кДНК размером примерно 700 нуклеотидных пар амплифицируют с использованием указанных праймеров и клонируют в pUC18 с целью определения его последовательности. Для обнаружения более длинных клонов кДНК методом ПЦР анализируют набор из четырех человеческих кДНК в библиотеке кДНК для определения тех из них, которые содержат кДНК VAP-1, и библиотеки, демонстрирующие наивысший сигнал, подвергают скринингу с использованием фрагмента кДНК VAP-1, полученного в результате ПЦР. Указанным способом выделяют из библиотек кДНК, выделенных из легкого и сердца человека, множество перекрывающихся клонов кДНК. Из указанных клонов была получена одна кДНК размером 2501 нуклеотидных пар, описанная на фигуре 1 (SEQ ID NО:1), которая содержит непрерывную открытую рамку считывания размером в 2292 п.н., начинающуюся от АТГ-метионинового кодона, и далее субклонирована в pUC19. Определенная таким образом нуклеотидная последовательность кДНК VAP-1, содержащаяся в этом клоне и показанная на фигуре 1 (SEQ ID NО:1), содержит открытую рамку считывания, кодирующую белок из 763 аминокислотных остатков, представленный на фигуре 1 (SEQ ID NO:2), с расположением инициирующего кодона на участке 80-82 нуклеотидной последовательности, показанной на фигуре 1 (SEQ ID NО:1), имеющей молекулярный вес около 84,6 кДа.

VAP-1 по настоящему изобретению обладает выраженной идентичностью к семейству ферментов, относящихся к медьсодержащим аминоксидазам (ЕС 1.4.3.6.). Белок VAP-1, показанный на фигуре 1 (SEQ ID NО:2), характеризуется примерно 24% идентичностью к Сu-моноаминоксидазе Escherichia coli и имеет 41-81% сходство с представителями этого семейства у млекопитающих. Наивысшая идентичность была показана с аминоксидазой из бычьей сыворотки (81%).

Если не указывается иное, то приведенный в описании термин "нуклеотидная последовательность" относится к последовательности дезоксирибонуклеотидов (сокращенно A, G, С и Т). При этом под "нуклеотидной последовательностью" молекулы нуклеиновой кислоты или полинуклеотида подразумевается молекула ДНК или полинуклеотида, состоящая из последовательности дезоксирибонуклеотидов. В случае молекулы РНК или полинуклеотида соответствующая последовательность состоит из рибонуклеотидов (А, G, С и U), где каждый тимидиновый дезоксирибонуклеотид (Т) в специфической дезоксирибонуклеотидной последовательности замещен рибонуклеотидом уридином (U).

Молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению могут представлять собой РНК, такой как мРНК или ДНК, включая кДНК и геномную ДНК, получаемые при клонировании или в ходе синтеза. ДНК может быть двухцепочечной или одноцепочечной. Одноцепочечные ДНК или РНК могут представлять собой кодирующую цепь, известную также как смысловая цепь, или некодирующую цепь, которую также называют антисмысловой цепью, или комплементом.

Под термином молекула(ы) "очищенной" нуклеиновой кислоты подразумевается молекула нуклеиновой кислоты - ДНК или РНК, которую выделяют из нативного источника или получают синтетически. Очищенные молекулы РНК включают полученные in vitro транскрипты РНК или молекулы ДНК по настоящему изобретению.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к молекулам очищенной нуклеиновой кислоты, кодирующим полипептид VAP-1, обладающий аминокислотной последовательностью, кодируемой клоном кДНК, содержащейся в плазмиде, депонированной в депозитарии 7 мая 1997 г. под No. DSM 11536. Изобретение также относится к молекуле очищенной нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность, показанную на фигуре 1 (SEQ ID NO:1), или нуклеотидную последовательность кДНК VAP-1, содержащейся в описанном выше депонированном клоне, или к молекуле нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность, комплементарную к одной из вышеуказанных последовательностей. Такие изолированные молекулы, в особенности молекулы ДНК, используют в качестве зондов для генного картирования при гибридизации in situ с хромосомами и для обнаружения экспрессии гена VAP-1 в тканях человека, например, методом нозерн-блотт-анализа.

Далее настоящее изобретение относится к фрагментам молекул очищенной нуклеиновой кислоты, приведенным в настоящем описании. Под фрагментом молекулы очищенной нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеиновую последовательность VAP-1 депонированной кДНК или нуклеотидную последовательность VAP-1, показанную на фигуре 1 (SEQ ID NO:1), понимают фрагменты размером, по меньшей мере, около 15 нуклеотидов и более предпочтительно, по меньшей мере, около 20 нуклеотидов, еще более предпочтительно, по меньшей мере, около 30 нуклеотидов и еще более предпочтительно, по меньшей мере, около 40 нуклеотидов в длину, которые используют в качестве диагностических зондов и праймеров в соответствии с приведенным описанием. Разумеется, более крупные фрагменты длиной 50-1500 нуклеотидов также могут применяться в рамках настоящего изобретения, если они являются фрагментами, соответствующими в основном или полностью, нуклеотидной последовательности депонированной кДНК или последовательности, приведенной на фигуре 1 (SEQ ID NO:1). Поскольку ген VAP-1 был депонирован, и известна нуклеотидная последовательность, показанная на фигуре 1 (SEQ ID NO: 1), создание таких фрагментов ДНК представляет собой рутинную процедуру для специалистов в данной области. Так, например, для создания фрагментов различной длины могут использоваться такие процедуры, как расщепление рестриктазами, разрушение озвучиванием или олигонуклеотидный синтез.

В другом своем аспекте изобретение относится к молекуле очищенной нуклеиновой кислоты, включающей полинуклеотид, которая гибридизуется под строгим контролем гибридизации с частью полинуклеотида в молекуле нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, описанной выше, например с клоном кДНК VAP-1, хранящейся в депозитарии под No. DSM 11536. Под "строгим контролем гибридизации" понимают инкубацию в течение ночи при 42^oС в растворе, включающем 50% формамида, 5 x SSC (150 мМ NaCl, 15 мМ тринатрийцитратной соли), 50 мМ фосфата натрия (рН 7,6), 5 х раствора Денхардта, 10% сульфата декстрана и 20 г/мл денатурированной, разрушенной ДНК спермы лосося, с последующим промыванием фильтров в 0,1 x SSC при температуре примерно 65^oС.

Под нуклеотидом, который гибридизуется с "частью" полинуклеотида понимают полинуклеотид (либо ДНК, либо РНК), гибридизующийся, по меньшей мере, на протяжении 15 нуклеотидов (нт) и более предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 20 нт, еще более предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 30 нт и еще предпочтительнее примерно на 30-70 нт со стандартным полинуклеотидом. Они могут использоваться как диагностические зонды и праймеры. Разумеется, полинуклеотиды, гибридизующиеся на большем протяжении со стандартным полинуклеотидом (например, с клоном депонированной кДНК), например на участке длиной 50-750 нт или еще большей протяженности со стандартным полинуклеотидом, также могут использоваться в качестве зондов по настоящему изобретению, если они представляют собой полинуклеотиды, соответствующие в основном или полностью нуклеотидной последовательности VAP-1 депонированной кДНК или нуклеотидной последовательности, приведенной на фигуре 1 (SEQ ID NO: 1). Такие части используются с диагностической целью либо как зонды в рамках традиционной техники гибридизации ДНК, либо как праймеры для амплификации целевой последовательности в полимеразной цепной реакции (ПЦР), как описано в литературе (например, в Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, Sambrook J., Fritsch E. F. and Maniatis Т., eds.. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)), которые включены в настоящее описание в качестве ссылки.

Молекулы очищенной нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению включают молекулы ДНК, содержащие открытую рамку считывания (ОРС) с положением инициирующего кодона на участке 80-82 на нуклеотидной последовательности VAP-1, показанной на фигуре 1 (SEQ ID NО:1), а также молекулы ДНК, которые включают последовательность, принципиально отличную от описанной выше, но которая в связи с вырожденностью генетического кода может кодировать белок VAP-1. Несомненно, генетический код хорошо известен специалистам в данной области, и для специалистов со средним уровнем знаний в данной области получение выраженных вариантов представляет собой рутинную процедуру.

Далее настоящее изобретение относится к вариантам молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, которые кодируют части, аналоги или производные белка VAP-1. Варианты могут быть природными, такими как натуральные аллельные или сплайсинг-варианты. Под "аллельным вариантом" понимают одну из нескольких альтернативных форм гена, занимающего определенный локус на хромосоме организма (Genes II, Lewin В. , ed., John Wiley & Sons, New York (1985)). Варианты, не встречающиеся в естественном состоянии, могут быть получены с использованием техники мутагенеза, известной специалистам.

Такие варианты включают формы, получаемые при осуществлении замещения нуклеотидов, делеций или вставок. Замещения, делеции или вставки могут включать один или более нуклеотидов. Варианты могут содержать изменения в кодирующих регионах, некодирующих регионах или в обоих типах регионов. Изменения в кодирующих регионах могут приводить к получению консервативных или неконсервативных аминокислотных замещений, делеций или вставок. Особенно предпочтительными среди них являются молчащие замены, вставки и делеции, которые не изменяют свойств и активности белка VAP-1 или его частей. Также к числу особенно предпочтительных в этом отношении относятся консервативные замены.

Другие варианты реализации настоящего изобретения включают молекулы очищенной нуклеиновой кислоты, которая содержит полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 90% и более предпочтительно, по меньшей мере, на 95, 96, 97, 98 или 99% (а) молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, включающий аминокислотную последовательность, приведенную на фигуре 1 (SEQ ID NO:2); (б) молекуле нуклеиновой кислоты, включающей кодирующую последовательность VAP-1 из нуклеотидной последовательности VAP-1, приведенной на фигуре 1 (SEQ ID NО:1); (в) молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид VAP-1, включающий аминокислотную последовательность, кодируемую клоном кЦНК VAP-1, хранящейся в депозитарии под No. DSM 11536; (г) молекуле нуклеиновой кислоты, включающей кодирующую последовательность нуклеотидной последовательности VAP-1, хранящейся в депозитарии под No. DSM 11536; (д) молекуле нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидным последовательностям VAP-1, приведенным в пунктах (а), (б), (в) или (г); (е) молекуле нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, которая отличается от кодирующей последовательности молекулы нуклеиновой кислоты по пунктам (б) или (г) в связи с вырожденностью генетического кода, и (ж) молекуле нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется с молекулой (д) и кодирует VAP-1, имеющий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90% демонстрирует идентичность последовательности VAP-1, приведенной на фигуре 1 (SEQ ID NO: 2). Указанное свойство не зависит от того, имеет ли кодируемый ими полипептид VAP-1 активность. Поскольку если даже данная молекула нуклеиновой кислоты не кодирует полипептид, обладающий VAP-1 активностью, любой специалист со средним уровнем в данной области знает, как использовать молекулу нуклеиновой кислоты, например, в качестве гибридизационного зонда или в качестве праймера в полимеразной цепной реакции (ПЦР). При этом предпочтительны молекулы нуклеиновой кислоты, которые имеют последовательности, идентичные, по меньшей мере, на 90, 95, 96, 97, 98 или 99% последовательности нуклеиновой кислоты VAP-1, показанной на фигуре 1 (SEQ ID NО:1), или последовательности нуклеиновой кислоты VAP-1 депонированной кДНК, которая фактически кодирует полипептид, обладающий активностью VAP-1 белка.

Под фразой "полинуклеотид, обладающий нуклеотидной последовательностью, которая, по меньшей мере, например, на 90% "идентична" стандартной нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид VAP-1", подразумевают, что нуклеотидная последовательность полинуклеотида идентична стандартной последовательности, за исключением того, что полинуклеотидная последовательность может включать до десяти точечных мутаций на каждые 100 нуклеотидов стандартной нуклеотидной последовательности, кодирующей VAP-1 полипептид. В том случае, когда молекула любой конкретной нуклеиновой кислоты идентична, по меньшей мере, на 90, 95, 96, 97, 98 или 99%, например, нуклеотидной последовательности VAP-1, показанной на фигуре 1 (SEQ ID NО:1), или нуклеотидной последовательности клона депонированной кДНК, она может быть определена традиционным способом с использованием известных компьютерных программ, таких как Bestfit program (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711).

Векторы и клетки-хозяины Настоящее изобретение также относится к векторам, которые включают молекулы очищенной ДНК по настоящему изобретению, клеткам-хозяинам, которые были сконструированы генетическими методами с помощью ДНК, кодирующей VAP-1, и к получению полипептидов VAP-1 или их фрагментов с помощью рекомбинантной техники.

Полинуклеотиды могут быть соединены с вектором, содержащим селектируемый маркер, для размножения в клетке-хозяине. В общем случае плазмидный вектор вводят в виде осадка, такого как осадок фосфата кальция или в комплексе с заряженным липидом. Если вектор представляет собой вирус, он может быть собран in vitro с использованием соответствующей сборочной клеточной линии и перенесен в клетки-хозяина методом трансдукции. Селектируемые маркеры включают дигидрофолатредуктазу или устойчивость к неомицину культур эукариотических клеток, или наличие генов устойчивости к тетрациклину или ампицилину в культурах Е. coli и других бактерий.

Предпочтительными являются векторы, включающие цис-активные контролирующие участки в отношении интересующих полинуклеотидов. Соответствующие транс-активные факторы также могут быть введены в клетку-хозяина с помощью комплементного вектора или самим рассматриваемым вектором при его интродукции в клетку-хозяина. В некоторых предпочтительных в этом отношении вариантах реализации изобретения векторы обеспечивают специфическую экспрессию, которая может быть индуцибельной и/или специфичной для того или иного типа клеток. Особенно предпочтительными среди них являются индуцибельные под действием факторов окружающей среды векторы, которыми можно легко манипулировать с помощью таких факторов, как температура и пищевые добавки.

Векторы экспрессии, применяемые по настоящему изобретению, включают векторы, производные из хромосом, эписом и вирусов, например векторы, полученные на основе бактериальных плазмид, бактериофага, дрожжевых эписом, хромосомных элементов дрожжей, вирусов, таких как бакуловирусы, паповавирусы, вирусы осповакцины, аденовирусы, вирусы оспы птиц, вирусы псевдобешенства и ретровирусы, а также векторы, полученные из их сочетаний, такие как космиды и фагемиды.

ДНК-вставка должна оперативно связываться с соответствующим промотором, таким как промотор фага лямбда _L, промоторы Е. coli lac, trp и tac, ранние и поздние промоторы SV40, а также промоторы ретровирусных длинных повторов на конце генома (LTR), которых можно назвать несколько. Специалистам в данной области известны другие подходящие промоторы. Экспрессируемые конструкции должны также содержать сайты для инициации транскрипции, ее терминации, а в транскрибируемых регионах - сайты связывания с рибосомами для осуществления трансляции. Кодирующая часть зрелых транскриптов, экспрессируемых указанными конструкциями, предпочтительно включает участок инициации трансляции в ее начале и терминирующий кодон (UAA, UGA или UAG), расположенный соответственно в конце кодирующей последовательности.

Технология, основанная на рекомбинантной ДНК, включает также методы рекомбинации, описанные в работе Треко с соавт. (Treco et al., WO 94/12650 и Treco et al. , WO 95/31560), которые приведены в настоящем описании в качестве ссылки, и эти методы могут применяться для изменения экспрессии VAP-1 и активности аминоксидазы в клетках. Специфически регуляторные участки (например, промоторы) могут быть введены в хозяйский