Генетически измененные клетки и их применение для профилактики или лечения заболеваний

Генетически измененные клетки и их применение для профилактики или лечения заболеваний

Реферат

 

Изобретение относится к генной терапии и касается способа получения генетически измененных клеток. Сущность изобретения заключается в выделении клеток из крови или жидкостей организма, культивировании полученных клеток в среде для культивирования клеток, содержащей ганглиозиды, фосфолипиды, гликолипиды и/или факторы роста эндотелиальных клеток, на выбор иммортализацию полученных клеток путем трансформации онкогеном, выбранным из группы, состоящей из мутированного cdk-4, cdk-6 и cdk-2, активации протоонкогена или инактивации супрессорного гена, трансфекции полученных клеток с помощью конструкции нуклеиновой кислоты для генной терапии, содержащей эффектор-ген, который можно активировать с помощью пригодных промоторных систем специфически к клетке, специфически к клеточному циклу, специфически к вирусу и/или путем гипоксии. Преимущество заключается в создании эндотелиальных клеток в качестве клеточных носителей трансгенов в генной терапии. 17 з.п.ф-лы, 1 ил. , 2 табл.

Изобретение относится к клеткам для применения в генной терапии, получаемым путем а) выделения мононуклеарных клеток из крови или содержащих клетки жидкостей организма; б) культивирования полученных на стадии а) клеток в среде для культивирования клеток, содержащей ганглиозиды, фосфолипиды, гликолипиды и/или факторы роста эндотелиальных клеток, включая такие факторы, которые влияют на дифференциацию, выживание, миграцию и/или васкуляризацию; в) на выбор иммортализации полученных на стадии а) или б) клеток путем трансформации с помощью онкогена, активации онкогена или инактивации супрессорного гена и г) на выбор трансфекции полученных на стадиях а) и б) или на стадии в) клеток с помощью конструкции нуклеиновой кислоты для генной терапии, содержащей эффектор-ген, который можно активировать с помощью пригодных промоторных систем специфически к клетке, специфически к клеточному циклу, специфически к вирусу и/или путем гипоксии.

Введение трансфецированных ин витро соматических клеток, трансдуцированных для экспрессии биологически активного вещества, представляет собой в настоящее время широко используемый в клинической практике, а также для клинического исследования метод генной терапии. При этом используют различные клетки, включая фибробласты, лимфоциты, кератиноциты и опухолевые клетки.

Эндотелиальные клетки для этой цели впервые использовали в 1989 г. Для этого эндотелиальные клетки трансфецировали ин витро с помощью ретровирусного вектора (Zwiebel и др., Science, 243, 220 (1989)) для экспрессии биологически активного вещества.

Такого рода трансдуцированные эндотелиальные клетки, приросшие ин витро к искусственным кровеносным сосудам из синтетического материала, после трансплантации ин виво этих искусственных кровеносных сосудов способны экспрессировать трансген (Zwiebel и др., Science, 243, 220 (1989); Wilson и др., Science, 244, 1344 (1989)). Вследствие этого Zwiebel и Wilson предложили для целей генной терапии вводить пациентам трансдуцированные эндотелиальные клетки, сросшиеся с синтетическим материалом или коллагеновым носителем. Это предложение экспериментально осуществили Nathan и др. (PNAS USA, 92, 8130 (1995)).

В продолжение этого предложения Nabel и др. (Science, 244, 1342 (1989)) впервые изложили возможность введения суспензии трансдуцированных эндотелиальных клеток в кровоток в качестве генной терапии. Авторами показано, что эндотелиальные клетки, которые получены из сосудов живого млекопитающего путем соскабливания и трансдуцированы ин витро для экспрессии репортер-гена, после локального введения, например в кровеносные сосуды, срастаются там с местами повреждения эндотелиальных клеток и экспрессируют репортер-ген. На основании этих результатов авторами описана возможность введения генетически модифицированных эндотелиальных клеток в целях генной терапии, причем биологически активные вещества этими эндотелиальными клетками непосредственно выделяются в систему кровообращения в целях лечения системных или наследственных заболеваний. Эта идея далее была развита Bernstein и др. (FASEB. J. , 4, 2665 (1990)). Эндотелиальные клетки легких трансфецируют ин витро с помощью плазмид для экспрессии биологически активного вещества и затем вводят путем инъекции "голым" мышам внутрибрюшинно, внутривенно, подкожно или в капсулу почки. У таким образом обработанных животных локально (в кистах почек) или в крови (после введения внутрибрюшинно, внутривенно или подкожно) обнаруживают продуцируемое трансплантатами эндотелиальных клеток биологически активное вещество, что доказывает пригодность введения ин виво трансдуцированных ин витро эндотелиальных клеток в целях генной терапии.

Далее, Zwiebel и др., 1992 (международная заявка с номером публикации 93/13807), и Ojeif о и др., (Cancer Res., 55, 2240 (1995)) на различных примерах показали возможность использования метода введения трансдуцированных ин витро эндотелиальных клеток в систему кровообращения для целей генной терапии.

Zwiebel и др. (1992) трансдуцировали ин витро человеческие эндотелиальные клетки пуповины и эндотелиальные клетки из жировой ткани крыс с помощью ретровирусного вектора для экспрессии биологически активного вещества и инъецировали эти эндотелиальные клетки внутривенно животным, у которых сначала за счет инъекции облученных, выделяющих FGF клеток были вызваны локальное повреждение сосудов и ангиогенез. Они показали, что инъецированные эндотелиальные клетки локализуются в месте поражения сосуда и ангиогенеза и там экспрессируют биологически активное вещество. На этом основании авторы в своей заявке на патент описывают применение трансдуцированных ин витро эндотелиальных клеток для экспрессии аденозиндезаминазы, факторов свертывания крови, гематопоэтических факторов роста, цитокинов, антитромботических средств, ингибиторов ферментов и гормонов.

Параллельно этим работам другими авторами усовершенствована технология выделения эндотелиальных клеток и также подробнее исследовано миграционное поведение трансдуцированных ин витро эндотелиальных клеток.

Так, Messina и др. (PNAS USA, 89, 12018 (1992)) показали, что трансфецированные ин витро эндотелиальные клетки после инъекции в систему кровообращения прикрепляются к интактному слою эндотелиальных клеток, а также могут интегрировать в него. Следовательно, с помощью этих результатов можно исключить исключительную локализацию интраваскулярно введенных эндотелиальных клеток в зонах с повреждениями сосудов и ангиогенеза. С другой стороны, показано, что инъецированные в смеси с опухолевыми клетками, трансфецированные ин витро эндотелиальные клетки участвуют в ангиогенезе ложа опухолевых сосудов (Lal и др., PNAS USA, 9, 9695 (1994); Nam и др., Brain Res., 731, 161 (1996)). Этим обусловлено то, что опухолевые клетки, трансплантированные в смеси с эндотелиальными клетками, показывают ин виво отчетливое преимущество роста (Stopeck и др., Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 38, 265 (1997)).

С другой стороны, трансдуцированные эндотелиальные клетки, введенные локально, например в головной мозг или в опухоль мозга, за счет экспрессии кодируемого трансгеном биологически активного вещества могут быть фармакологически активны, соответственно, противоопухолево эффективны (Nam и др., Brain Res. , 731, 161 (1996); Quinonero и др., Gene Ther., 4, 111 (1997)). Например, Robertson и др. (Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 38, 382 (1997)) использовали человеческие эндотелиальные клетки (HUVEC), трансдуцированные ин витро с помощью AV-вектора, для экспрессии тимидинкиназы герпесвируса, в смеси с человеческими клетками рака яичника. После введения ганцикловира, который активируется в опухоли благодаря тимидинкиназе герпесвируса в цитостатическое средство, авторы наблюдали отчетливую регрессию опухоли у "голых" мышей.

Применение эндотелиальных клеток в качестве клеточных носителей трансгенов в генной терапии до сих пор, однако, в значительной мере ограничено двумя существенными областями проблем.

- Получение пригодных эндотелиальных клеток в достаточном количестве до сих пор оказывается крайне затруднительным. Аллогенные эндотелиальные клетки, правда, можно получать относительно просто из пуповины или из клеточных культур, однако, за счет их иммуногенности в реципиенте они применимы только ограниченно; во-вторых, их размножение в клеточной культуре возможно только в ограниченной мере. Аутоэндотелиальные клетки, правда, можно получать, например, механически путем "выскабливания" варикозно расширенных вен или из жировых тканей. Этот вид получения, однако, возможен не в случае всех пациентов и к тому же наносит значительный вред пациенту. Поэтому альтернативно можно получать ангиобласты или клетки-предшественники эндотелиальных клеток из периферической крови (Asahara и др., Science, 275, 964 (1997)). Необходимое для этой цели взятие крови, правда, для пациента немного обременительно, однако, выделение предполагаемых ангиобластов из мононуклеарных клеток крови и дифференциация этих ангиобластов в эндотелиальных клетках является очень дорогостоящей операцией. Так, мононуклеарные, из лейкоцитов крови (выделяют путем центрифугирования с градиентом плотности), CD34⁺ или Flk-1⁺ мононуклеарные клетки крови, которые имеются в крови только в незначительной концентрации (0,1%), обогащают путем иммуноадсорбции на связанных с носителем моноклональных антителах (специфических к CD34 или Flk-1). Затем эти клетки в чашках для культуры тканей, покрытых коллагеном типа 1 или фибронектином, инкубируют в течение примерно четырех недель в культуральной среде, содержащей головной мозг крупного рогатого скота, для дифференции в эндотелиальных клетках, а также для размножения. Размножение этих клеток, однако, возможно только очень ограниченно. Далее, инкубация эндотелиальных клеток с веществом головного мозга, например с головным мозгом крупного рогатого скота, вызывает значительные проблемы безопасности.

- Миграция эндотелиальных клеток и селективная экспрессия трансгена в желательной целевой области контролируются в недостаточной степени. После интраваскулярного введения эндотелиальных клеток они (как уже было описано выше) локализуются как в областях ангиогенеза, так и в покоящемся слое эндотелиальных клеток. Далее, неясно, дифференцируются ли обратно ин виво после инъекции снова в клетках-предшественниках эндотелиальные клетки, которые образовались в клеточной культуре из клеток-предшественников, и могут ли они распределяться по всему организму.

С помощью настоящего изобретения теперь решаются обе важные проблемы.

А) Изобретение заключается в 1) улучшенном, то есть простом и надежном способе выделения и культивирования мононуклеарных клеток, в особенности эндотелиальных клеток-предшественников, из крови и других, содержащих клетки жидкостей организма и применении этих клеток для профилактики или лечения заболевания; 2) выборе в специфической к клетке, в особенности специфической к эндотелиальной клетке, в случае необходимости, фармакологически контролируемой трансформации этих клеток, так что с помощью клеточной культуры можно легко получать гораздо большие количества таких клеток; 3) получении клеток, в особенности эндотелиальных клеток, в качестве векторов для эффектор-генов таким образом, что в эти клетки, полученные по пп. 1) или 1) и 2), встроен по крайней мере один эффектор-ген, который за счет выбора пригодных промоторных систем экспрессируется специфически к клетке, в особенности специфически к эндотелиальной клетке, и, в случае необходимости, путем гипоксии специфически к клеточному циклу и/или специфически к вирусу; 4) введении этих, таким образом полученных, генетически измененных клеток, в особенности эндотелиальных клеток, для профилактики или лечения заболевания.

Предметом изобретения поэтому являются клетки для применения в генной терапии, получаемые путем а) выделения мононуклеарных клеток из крови или содержащих клетки жидкостей организма; б) культивирования полученных на стадии а) клеток в среде для культивирования клеток, содержащей ганглиозиды, фосфолипиды, гликолипиды и/или факторы роста эндотелиальных клеток, включая такие факторы, которые влияют на дифференциацию, выживание, миграцию и/или васкуляризацию; в) на выбор иммортализации полученных на стадии а) или б) клеток путем трансформации с помощью онкогена, активации онкогена или инактивации супрессорного гена и г) на выбор трансфекции полученных на стадиях а) и б) или на стадии в) клеток с помощью конструкции нуклеиновой кислоты для генной терапии, содержащей эффектор-ген, который можно активировать с помощью пригодных промоторных систем специфически к клетке, специфически к клеточному циклу, специфически к вирусу и/или путем гипоксии.

Ниже описываются остальные объекты изобретения, варианты осуществления изобретения, а также соответствующие примеры.

Получение эндотелиальных клеток 1) Выделение и культивирование клеток-предшественников эндотелиальных клеток Предлагаемый согласно изобретению способ выделения клеток-предшественников эндотелиальных клеток можно разделить на следующие стадии.

Жидкости организма, содержащие клетки, с помощью известных специалисту инвазивных способов отбирают из соответствующих органов. К этим жидкостям организма, содержащим клетки, относятся, например, кровь, получаемая из вен, капилляров, артерий или пуповины, соответственно, плаценты; суспензии клеток костного мозга; суспензии клеток селезенки; суспензии клеток лимфатических узлов; суспензии перитонеальных клеток; суспензии плевральных клеток; лимфа; жидкость соединительной ткани (выступающая, например, на поверхности механически поврежденного эпидермиса).

Эритроциты, гранулоциты и другие компоненты клеток выделяют из этих жидкостей организма путем центрифугирования с градиентом плотности, а тромбоциты - путем дифференциального центрифугирования соответственно известным специалисту способам.

Таким образом выделенные мононуклеарные (содержащие ядро) клетки суспендируют в содержащей сыворотку среде для культивирования клеток. Используемая среда для культивирования клеток содержит указанные ниже ганглиозиды, фосфолипиды и/или факторы роста.

В одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения выделенные мононуклеарные (содержащие ядро) клетки культивируют в этой среде для культивирования клеток и дифференцируют до клеток, подобных эндотелиальным.

Согласно следующему предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения выделенные мононуклеарные (содержащие ядро) клетки инкубируют с антителом против типичных моноцитных/макрофаговых поверхностных маркеров (CD11, CD11b, CD13, CD14, CD34, CD64, CD68), которое связано с покрытой полисахаридом частицей железа, соответственно, оксида железа, промывают и затем таким образом нагруженные клетки получают с помощью магнита. Клетки вносят в среду для культивирования клеток, которая содержит указанные ниже ганглиозиды, фосфолипиды и/или факторы роста, и далее ин витро размножают и дифференцируют в эндотелиальные клетки. Иммортализацию и/или трансфекцию осуществляют после размножения и/или дифференциации клеток ин витро.

Согласно следующему варианту осуществления настоящего изобретения выделенные, содержащие ядро клетки предварительно инкубируют в указанной среде для культивирования клеток в течение более 1 часа для дальнейшей дифференциации и размножения. При этих условиях клетки, распознаваемые как эндотелиальные клетки-предшественники, в возрастающей мере экспрессируют типичные моноцитные/макрофаговые поверхностные маркеры (CD11, CD11b, CD13, CD14, CD34, CD64, CD68). Эти клетки затем выделяют, например, вместе с антителом, которое направлено против этих моноцитных маркеров (например, CD11, CD14) и которое связано с покрытой декстраном частицей железа, получают с помощью магнита. Клетки размножают далее и дифференцируют в эндотелиальные клетки.

Альтернативно этому из неприлипающих мононуклеарных клеток, как, например, описывается Asahara и др., Sciense, 275, 964 (1997), выделяют CD34-положительные клетки (гематопоэтические стволовые [исходные] клетки) и ин витро размножают далее и дифференцируют в эндотелиальные клетки.

В особом варианте осуществления изобретения выделенные, содержащие ядро клетки суспендируют в среде для культивирования клеток и остающиеся фагоцитирующие клетки (например, моноциты, макрофаги, гранулоциты) удаляют за счет сцепления с поверхностью, соответственно, путем фагоцитоза "нагруженных" протеином, покрытых декстраном частиц железа с помощью магнита и/или путем противоточного центрифугирования, соответственно известным специалисту способам, и содержащие остающиеся CD34-пoлoжитeльныe клетки мононуклеарные клетки культивируют в предлагаемой согласно изобретению среде для культивирования клеток и дифференцируют в подобные эндотелиальным клетки.

Чашки для культивирования клеток могут быть покрыты внеклеточным матричным компонентом (см. Связывающие и матричные факторы, например, фирмы Сигма), как, например, фибронектин. К среде для культивирования клеток добавляют или ганглиозиды, фосфолипиды и/или гликолипиды, и/или предпочтительно согласно настоящему изобретению добавляют факторы роста для эндотелиальных клеток, как, например: - васкулярный эндотелиальный фактор роста (VEGF) и/или другие KDR или FLt-лиганды, как - фибробластовый фактор роста (FGF, FGF), и/или - эпидермальный фактор роста (EGF), и/или - инсулиноподобный фактор роста (IGF-1, IGF-2), и/или - -эндотелиальный клеточный фактор роста (ECGF), и/или - эндотелиальный клеточный фактор связывания (ECAF), и/или - интерлейкин-3 (IL-3), и/или - GM-CSF, и/или - G-CSF, и/или - интерлейкин-4 (IL-4), и/или - интерлейкин-1 (IL-1), и/или - колониестимулируюший фактор (CSF-1), и/или - интерлейкин-8 (IL-8), и/или - фактор роста, полученный из тромбоцитов, (PDGF), и/или - -интерферон, и/или - онкостатин М, и/или - фактор, подавляющий колониеобразование лейкоцитов (LIF), и/или - В61, и/или - тромбоцитарный эндотелиальный клеточный фактор роста (PDEGF), и/или - фактор стволовых клеток (SCF), и/или - трансформирующий -фактор роста TGF-, и/или - ангиогенин, и/или - плейотрофин, и/или - Fit-3-лиганд (FL), и/или - Fie-2-лиганды, как, например, ангиопоэтин-1, и/или - стромальный фактор-1 (SDF-1), и/или - мидкины.

Развившиеся в течение времени между 6 часами и 8 неделями клетки обрабатывают дальше согласно изобретению.

Таким образом выделенные эндотелиальные клетки можно также непосредственно использовать для стимуляции эндотелизации поврежденных сосудов и для стимуляции ангиогенеза.

2) Выделение эндотелиальных клеток Альтернативно предлагаемому согласно изобретению способу, представленному в разделе 1), эндотелиальные клетки также можно получать с помощью известных специалисту способов, например, из жировой ткани, путем выскабливания вен или путем отделения от эндотелия пуповины. Их культивирование осуществляют, как уже описано в разделе 1).

3) Иммортализация эндотелиальных клеток Согласно настоящему изобретению в одну или несколько предлагаемых согласно изобретению неприлипших мононуклеарных клеток или эндотелиальных клеток вводят нуклеотидную последовательность протеина (компонент а), который способствует тому, что эти клетки непрерывно проходят цикл цитокинеза и таким образом становятся нестареющей, "перманентно" делящейся клеточной линией. Такие иммортализирующие нуклеотидные последовательности, соответственно, гены, уже известны. К этим нуклеотидным последовательностям относятся, например, онкогены. Согласно настоящему изобретению онкогены могут быть клеточного или вирусного происхождения. Примеры клеточных онкогенов уже представлены в виде обзора Wynford-Thomas, J. Pathol., 165, 187, (1991); Harrington и др., Curr. Opin. Genet. Developm., 4, 120 (1994); Gonos и др., Anticancer Res., 13, 1117 (1993), и Baserga и др., Cancer Surveys, 16, 201 (1993).

Такого рода онкогены можно вводить в клетку известными специалисту способами. Однако клетки в своем геноме содержат также протоонкогены, которые, согласно настоящему изобретению, можно активировать с помощью известных специалисту способов, то есть превращать в онкогены.

В особом варианте осуществления настоящего изобретения компонент а) представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую протеин, который инактивирует протеин супрессорного гена.

Примеры супрессорных генов уже представлены в виде обзора Каrр и Broder, Nature Med. , 4, 309 (1995); Skuse и Ludlow, The Lancet, 345, 902 (1995); Duan и др. , Science, 269, 1402 (1995); Huh и др., Cancer Res., 55, 2225 (1995); Knudson, PNAS USA, 90, 10914 (1993).

Примеры гена (компонент а)), кодирующего протеин, который инактивирует продукт экспрессии супрессорного гена, приведены в табл.1.

В следующем предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения компонент а) представляет собой мутированную нуклеотидную последовательность протеина регуляции клеточного цикла, который вследствие мутации изменен так, что он может еще полностью активировать клеточный цикл, однако, в этой функции более не является ингибируемым клеточными ингибиторами. Согласно настоящему изобретению сюда относятся мутированные нуклеотидные последовательности, кодирующие циклинзависимые киназы, которые, несмотря на мутацию, сохраняют свою киназную активность, однако теряют способность связываться с клеточными cdk-ингибиторами.

Примерами компонента а) являются следующие: - cdk-4, мутированный таким образом, что р16, р15 и/или р21 более не могут ингибировать; -cdk-6, мутированный таким образом, что р15 и/или р18 не могут более ингибировать; cdk-2, мутированный таким образом, что р21 и/или р27 и/или WAF-1 не могут более ингибировать.

Например, мутация cdk-4 может представлять собой обмен аргинина на цистеин в положении 24, так что этот мутированный cdk-4 обладает киназной активностью, однако более не ингибируется за счет р15 и р16 (Wulfel и др., Science, 269, 1281 (1995)).

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения компонент а) представляет собой трансформирующий ген, экспрессия которого регулируется самоусиливающим промоторным элементом, в случае необходимости в сочетании с фармакологически контролируемым промотором (см. по этому поводу раздел Иммортализация).

Согласно дальнейшему предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения в эндотелиальные клетки, особенно также в клетки-предшественники эндотелиальных клеток или в клетки смеси клеток, которая содержит долю эндотелиальных клеток или клеток-предшественников эндотелиальных клеток или повышенную, по сравнению с кровью, долю положительных клеток CD34, CD11, CD11b, CD14, CD13, CD64 и CD68, вводят нуклеотидную последовательность, которая состоит из специфической к эндотелиальным клеткам промоторной или энхансерной последовательности (компонент б)) и компонента а), причем транскрипцию компонента а) активируют за счет связывания факторов транскрипции эндотелиальной клетки с компонентом б).

Для лучшего удерживания продукта экспрессии компонента а) в клеточном ядре к компоненту а) можно присоединять нуклеарный сигнал локализации (компонент в)). Достигаемое в результате этого расположение компонентов представлено, например, на чертеже.

За счет введения конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей представленные на чертеже компоненты, только эндотелиальные клетки и предшественники эндотелиальных клеток, которые содержатся в гетерогенной смеси клеток, переводят в иммортализованную стадию, то есть в непрерывно делящиеся клетки, так что спустя несколько дней эти эндотелиальные клетки по количеству преобладают в клеточной культуре и спустя зависимое от условий культивирования, однако, обозримое время находятся исключительно в клеточной культуре.

С помощью этих предлагаемых согласно изобретению конструкций нуклеиновой кислоты и способа, таким образом, за относительно короткое время при небольших затратах и также из небольшого количества эндотелиальных клеток или из небольшого количества клеток-предшественников эндотелиальных клеток, а также в случае, когда они находятся в виде гетерогенной смеси клеток, можно получать большие количества единообразных эндотелиальных клеток для профилактики или лечения.

Получение ген-модифицированных эндотелиальных клеток для профилактики и/или лечения Согласно изобретению в полученные по любому из предлагаемых в изобретении способов эндотелиальные клетки нужно вводить конструкцию нуклеиновой кислоты, которая по крайней мере содержит следующие компоненты: - промотор (компонент г)); - структурный, ген, кодирующий биологически активное вещество, или фермент (компонент д)).

Выбор промоторных последовательностей Согласно изобретению в качестве промоторных последовательностей нужно использовать нуклеотидные последовательности, которые после связывания факторов транскрипции активируют транскрипцию расположенного вблизи 3'-конца трансгена, как, например, структурного гена. Согласно изобретению в эндотелиальную клетку вводят по крайней мере одну специфическую к эндотелиальной клетке промоторную последовательность (компонент б)) и/или компонент г). Эту специфическую к эндотелиальной клетке промоторную последовательность можно сочетать по крайней мере с одной другой промоторной последовательностью. Выбор сочетаемой со специфическим к эндотелиальной клетке промотором промоторной последовательности (последовательностей) осуществляют в зависимости от излечиваемого заболевания. Так, дополнительная промоторная последовательность может быть неограниченно, специфически к эндотелиальной клетке и при определенных метаболических условиях индуцируема, как, например, путем гипоксии, или индуцируема или "выключаема" с помощью фармакона, активируема специфически к вирусу и/или специфически к клеточному циклу. Такого рода промоторы уже указаны в следующих заявках на патенты: заявки на европейские патенты NoNo 95931204.2; 95930524.4; 95931205.9; 95931933.6; 96110962.2; 97101507.8; 97102547.3; 97110995.8; а также заявки на патент ФРГ NoNo 1970430.1 и 19710643.9. Эти заявки на патент включены в настоящее описание в виде ссылки. К выбираемым промоторным последовательностям, например, относятся следующие.

1) Неограниченно активируемые промоторы и активаторные последовательности, как, например, промотор РНК-полимеразы III; промотор РНК-полимеразы II; промотор и энхансер вируса огуречной мозаики (CMV); промотор вируса дикого типа 40 (SV40-промотор).

2) Метаболически активируемые промоторные и энхансерные последовательности, как, например, индуцируемый путем гипоксии энхансер (Semenza и др., PNAS, 88, 5680 (1991); McBurney и др., Nucl. Acids Res., 19, 5755 (1991)).

3) Активируемые специфически к клетке промоторы.

Таковыми являются, например, промотор cdc258-гена, cdc25C-гена, циклин-А-гена, cdс2-гена, B-myb-гена, DHFR-гена, F2F-1-гена или, однако, связывающие последовательности образующихся во время пролиферации клеток или активированных факторов транскрипции. К этим связывающим последовательностям относятся, например, связывающие последовательности с-mус-протеинов. К этим связывающим последовательностям нужно причислить мономеры или мультимеры обозначаемой как Мус Е-Box нуклеотидной последовательности: 5'-GGAAGCAGACCACGTGGTCTGCTTCC-3' (последовательность No 2) (Blackwood и Eisenmann, Science, 251, 1211 (1991)).

4) Самоусиливающие и/или фармакологически контролируемые промоторы.

В простейшем случае при сочетании одинаковых или разных промоторов один промотор может быть индуцируемым, например, в форме активируемого, соответственно, "выключаемого" тетрациклином промотора, в форме тетрациклинового оператора в сочетании с соответствующим репрессором.

Согласно изобретению, однако, промотор может быть также самоусиливающим с или также без фармакологически контролируемой промоторной единицы.

Такого рода самоусиливающие и/или фармакологически контролируемые промоторы уже описаны в заявке на патент ФРГ 19651443.6, которая включена в настоящее описание в виде ссылки.

5) Активируемые специфически к эндотелиальным клеткам промоторы.

К ним относятся промоторы или активаторные последовательности из промоторов или энхансеров таких генов, которые кодируют протеины, предпочтительно образующиеся в эндотелиальных клетках.

Согласно изобретению нужно использовать, например, промоторы генов следующих протеинов: - специфический к головному мозгу, эндотелиальный глюкоза-1-транспортер; - эндоглин; - VEGF-рецептор-1 (flt-1); - VEGF-рецептор-2 (flk-1, KDR); - tie-1 или tie-2; - В61-рецептор (Eck-рецептор); - B61; - эндотелии, особенно эндотелин-В или эндотелин-1; - рецепторы эндотелина, в особенности рецептор эндотелина-В; - манноза-6-фосфатные рецепторы; - фактор Виллебранда; - интерлейкин-1, интерлейкин-1; - рецептор интерлейкина-1; - фактор васкулярной клеточной адгезии (VCAM-1); - фактор межклеточной адгезии (ICAM-3); - синтетические активаторные последовательности.

В качестве альтернативы природным, специфическим к эндотелиальным клеткам промоторам можно использовать также синтетические активаторные последовательности, которые состоят из олигомеризованных мест связывания факторов транскрипции, предпочтительно или селективно активных в эндотелиальных клетках. Примером их является фактор транскрипции GATA-2, местом связывания которого в эндотелин-1-гене является 5'-ТТАТСТ-3' (Lee и др., Biol. Chem. , 16188 (1991); Dormann и др., J. Biol. Chem., 1279 (1992), и Wilson и др., Mol. Cell Biol., 4854 (1990)).

Сочетание одинаковых или разных промоторов Сочетание одинаковых промоторов осуществляют, например, путем последовательного соединения нескольких промоторов в направлении считывания от 5' к 3' нуклеотидной последовательности.

Для сочетания одинаковых или разных промоторов, однако, предпочтительно используют технологии, которые уже подробно описаны в следующих заявках на патенты: заявка на патент Великобритании 9417366.3; заявка на европейский патент 97101507.8; заявка на европейский патент 97102547.3; заявки на патенты ФРГ NoNo19710643.9; 19617851.7; 19639103.2 и 19651443.6. Эти заявки на патенты включены в настоящее описание в виде ссылки. Примерами такого рода технологий являются следующие.

1) Химерные промоторы Химерный промотор представляет собой сочетание расположенной выше, активируемой специфически к клетке, метаболически или специфически к вирусу активаторной последовательности с расположенным ниже промоторным модулем, который содержит нукдеотидную последовательность CDE-chr или E2FBS-chr, с которой связываются супрессорные протеины, которые благодаря этому могут ингибировать активацию последовательности, расположенной выше активаторной, в G₀- и G₁-фазе клеточного цикла (заявка на патент Великобритании 9417366.3; Lucibello и др., EMBO J., 12 (1994)).

Продолжающиеся исследования действия, в особенности промоторного элемента CDE-chr, показывают, что зависимая от клеточного цикла благодаря CDE-chr-элементу регуляция последовательности, расположенной выше активаторной, в значительной степени зависит от того, что активаторная последовательность факторов транскрипции активируется с помощью обогащенных глутамином доменов активации (Zwicker и др., Nucl. Acids Res., 3822 (1995)).

К такого рода факторам транскрипции относятся, например, Sp-1 и NF-Y.

Такой фактор консеквентно ограничивает использование промоторного элемента CDE-chr для химерных промоторов. То же самое можно предполагать для промоторного элемента E2F-BS-CHB B-myb-гена (Zwicker и др., Nucl. Acids Res., 23, 3822 (1995)).

2) Гибридные промоторы Гибридные промоторы уже описаны в заявке на патент ФРГ 19639103.2. Для сочетания специфического к эндотелиальной клетке промотора по крайней мере с одним другим промотором выбирают, например, ген-конструкцию, которая в целом содержит следующие компоненты: нуклеотидную последовательность специфического к эндотелиальным клеткам промотора в форме, в которой мутировано по крайней мере одно место связывания фактора транскрипции. Благодаря этой мутации блокируется инициирование транскрипции эффектор-гена; трансген, который кодирует в качестве эффектор-гена биологически активное вещество; по крайней мере одну другую, активируемую неспецифически, специфически к клетке, специфически к вирусу, с помощью тетрациклина и/или специфически к клеточному циклу промоторную или энхансерную последовательность, которая активирует транскрипцию по крайней мере одного гена по крайней мере одного фактора транскрипции, который мутирован таким образом, что он может связываться с мутированным местом связывания (мутированными местами связывания) в специфическом к эндотелиальным клеткам промоторе и активировать его.

В одном приводимом в качестве примера варианте осуществления настоящего изобретения мутация в промоторной последовательности может представлять собой, например, мутацию ТАТА-Вох cdc258-пpомотоpa.

Мутацией ТАТА может быть, например, TGTATAA. Благодаря этой мутации более нельзя распознавать место связывания ДНК нормального, связывающего ТАТА-Вох протеина (ТВР) и эффекторный ген более нельзя эффективно транскрибировать. Соответственно, кодирующая ТВР нуклеотидная последовательность должна обладать комутацией. Благодаря этой комутации ТВР связывается с мутированным ТАТА-Вох (например, в TGTATAA) и таким образом приводит к эффективной транскрипции эффектор-гена. Такого рода комутации ТВР-гена, например, описаны Strubin и Struhl (Cell, 721 (1992)) и Heard и др., (EMBO J., 3519 (1993)).

3) Множественные промоторы в сочетании с нуклеарным сигналом удерживания и нуклеарным экспорт-фактором Эта технология уже описана в заявке на патент ФРГ 19617851.7. Эта заявка на патент включена в настоящее описание в виде ссылки.

Такого рода промотор содержит согласно изобретению следующие компоненты: - первая, специфическая к эндотелиальным клеткам, активируемая промоторная или энхансерная последовательность, которая активирует базальную транскрипцию трансгена; - трансген, который кодирует в качестве эффектор-гена биологически активное вещество; - нуклеарный сигнал удерживания (NRS), кДНК которого по 5'-концу прямо или косвенно связана с 3'-концом структурного гена (б); - предпочтительно продукт транскрипции нуклеарного сигнала удерживания имеет структуру связывания нуклеарного экспорт-фактора; - другая неспецифическая, специфическая к клетке, специфическая к вирусу, активируемая метаболически и/или специфически к клеточному циклу промоторная или энхансерная последовательность, которая активирует базальную транскрипцию нуклеарного экспорт-фактора; - нуклеиновая кислота, кодирующая нуклеарный экспорт-фактор (NEF), который связывается с продуктом транскрипции нуклеарного сигнала удерживания и благодаря этому способствует транспорту продукта транскрипции трансгена из клеточного ядра.

Ген, кодирующий нуклеарный сигнал удерживания, предпочтительно выбирают из группы, состоящей из Rev-реактивного элемента (RRE) ВИЧ-1 или ВИЧ-2, эквивалентного RRE сигнала удерживания ретровирусов или эквивалентного RRE сигнала удерживания вируса гепатита В.

Нуклеарный экспорт-фактор предпочтительно представляет собой ген, выбираемый из группы, состоящей из Rev-гена вирусов ВИЧ-1, ВИЧ-2, вируса Maedl-Visna, артритного вируса энцефалита Caprine, вируса инфекционной анемии лошади, вируса иммунодефицита кошек, ретровирусов, Т-клеточного лимфотрофического вируса человека или гена hnRNP-A1-протеина или гена фактора транскрипции TFIII-A.

Активатор-реактивная промоторная единица Активатор-реактивные промоторные единицы уже подробно описаны в заявке на патент ФРГ 19617851. Эта заявка на патент включена в настоящее описание в виде ссылки.

Активатор-реактивная промоторная единица состоит из следующих компонентов: - одна или несколько одинаковых или разных промоторных или энхансерных последовательностей, которые активируются, например, специфически к клеточному циклу, в зависимости от пролиферации клеток, метаболически, специфически к эндотели-альным клеткам или специфически к вирусу или как специфически к клеточному циклу, так и также метаболически, специфически к эндотелиальным клеткам или специфически к вирусу (так называемые химерные промоторы); - одна или несколько одинаковых или разных активаторных субъединиц, которые находятся, смотря по обстоятельствам, ниже промоторных или энхансерных последовательностей и активируются ими при их базальной транскрипции; - активатор-реактивный промотор, который активируется продуктами экспр