Способ получения клонированного тигра путем применения метода межвидовой трансплантации ядер

Способ получения клонированного тигра путем применения метода межвидовой трансплантации ядер

Реферат

 

Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к методам клонирования животных. Способ получения клонированных тигров предусматривает получение линий донорских соматических клеток тигра, выделение ооцитов из яичника коровы или кошки и их созревание in vitro. Далее удаляют клетки кумулуса, окружающие ооциты, и получают энуклеированные реципиентные ооциты. Затем осуществляют перенос ядра донорных клеток в реципиентный ооцит с последующим электрослиянием и активацией электрослитых клеток, что приводит к получению эмбриона. Далее полученные эмбрионы постактивируют и культивируют in vitro. Подрощенные эмбрионы переносят в суррогатную мать с последующим получением клонированных тигров. Данное изобретение применяется в сохранении популяции тигров, а также при использовании данной технологии и других находящихся под угрозой вымирания видов. 12 з.п.ф-лы, 4 ил., 12 табл.

Область изобретения Данное изобретение относится к способу получения клонированных тигров путем применения способа межвидовой трансплантации клеточных ядер, более конкретно к способу получения клонированных тигров путем применения способа межвидовой трансплантации клеточных ядер, посредством которого ядра соматических клеток, полученных из ткани тигра, переносят в зрелые ооциты, происходящие из коровы или кошки. Изобретение относится также к клонированным эмбрионам тигра и клонированным тиграм, полученным описанным выше способом.

Предпосылки изобретения В течение продолжительного времени считалось, что производство животных должно проводиться посредством оплодотворения, включающего в себя мужские и женские гаметы. Однако были приложены огромные усилия по получению клонированных животных с идентичным видом и идентичными генетическими характеристиками.

Было известно, что клонирование зигот возможно только в случае земноводных в течение 30 лет, пока не был достигнут успех в получении клонированного потомства путем замены пронуклеуса одноклеточной зиготы в мышах (см. McGrath and Solter, Science, 220:1300-1302, 1983). Несмотря на этот первый успех в клонировании животных, подобный успех в промышленных животных (см. Wakayama et al. , Nature, 394:369-374, 1998) был сообщен гораздо позднее, поскольку получение клонированных мышей с использованием зрелых ооцитов и бластомеров зиготы после 2-клеточной стадии имело некоторые проблемы, такие как снижение в перепрограммировании.

Что касается получения клонированных промышленных животных с использованием переноса ядер, первым сообщением было то, что потомство было получено у овцы путем применения бластомеров 8-16-клеточной зиготы в качестве донорных клеток (см. Wiladsen, Nature, 320:63-65, 1986). С тех пор считалось, что только бластомеры зиготы с тотипотентностью, вследствие которой клетка может быть дифференцирована в любую отдельную клетку, могут клонироваться посредством переноса ядер. Однако первая клонированная овца была получена введением ядер из соматических клеток (см. Wilmut et al, Nature, 385:810-813, 1997), что внесло поправку в прежнюю теорию развития и позволило сообщить многие успешные примеры в получении клонированных коров (см. Wells et al., Reprod. Fertil. and Develop., 10:369-378, 1998) и свиней.

Эмбрионы, получаемые с использованием соматических клеток существующих диких животных, и способ получения этих эмбрионов воспринимались как очень ценные для перманентного сохранения генетических признаков редких или находящихся под угрозой вымирания видов. Однако еще не было сообщений об успешном клонировании существующих диких животных. При подходах к клонированию этих диких животных клонирование сталкивалось с трудностями в получении реципиентных ооцитов в случае клонирования животных, которые являются редкими или находятся под защитой. Таким образом, их клонированные животные должны быть получены путем применения межвидовой трансплантации клеточных ядер и ооцитов, происходящих из близкородственных видов. Этот способ межвидовой трансплантации ядер был опубликован ранее (см. Dominko et al., Biol. Reprod., 60 (6):1496-1502 (1999). Однако он был направлен на применение ооцитов и соматических клеток промышленных животных, на которых уже была проведена большая исследовательская работа, что делало применение этого способа в получении клонированных диких животных затруднительным.

В этих обстоятельствах существуют убедительные причины для исследования и развития усовершенствованного способа получения клонированных диких животных путем применения межвидовой трансплантации ядер и соматических клеток диких животных.

Сущность изобретения.

Согласно данному изобретению было обнаружено, что клонированные эмбрионы тигра и клонированные тигры, развившиеся из указанных эмбрионов, могут быть получены при помощи способа межвидовой трансплантации клеточных ядер, включающего в себя слияние ооцитов из коровы или кошки с соматическими клетками тигра.

Таким образом, первой целью данного изобретения является представление способа получения клонированных тигров при помощи способа межвидовой трансплантации ядер.

Другой целью данного изобретения является представление клонированных эмбрионов тигра, полученных указанным способом.

Еще одной целью является представление происходящих из соматических клеток клонированных тигров, полученных с использованием указанного способа.

Краткое описание чертежей Указанные выше и другие цели и признаки данного изобретения станут очевидными из нижеследующего описания, даваемого вместе с сопутствующими чертежами, в которых: Фигура 1 является фотографией донорных соматических клеток.

Фигура 2 является фотографией, показывающей процесс разрезания zona pellucida (прозрачной зоны, т.е. блестящей оболочки яйцеклетки) реципиентного ооцита удерживающей пипеткой и разрезающей пипеткой.

Фигура 3 является фотографией, показывающей процесс энуклеации путем удаления первого полярного тельца и ядра из реципиентного ооцита.

Фигура 4 является фотографией, показывающей процесс перенесения соматической клетки в энуклеированный (безъядерный) ооцит удерживающей пипеткой и инъекционной пипеткой.

Подробное описание изобретения Способ получения клонированных тигров данного изобретения предусматривает стадии: получения линий донорных соматических клеток, собранных из тигра; созревания ооцитов, собранных из яичника коровы или кошки, in vitro; удаления клеток кумулуса (cumulus) (яйцевого холмика на стенке Граафова пузырька, в котором помещается яйцо), окружающих ооциты, разрезания части блестящей зоны созревших ооцитов и выжимания части цитоплазмы, включающей в себя первое полярное тельце, с получением энуклеированных реципиентных ооцитов; перенесения ядра в реципиентный ооцит инъекцией донорных клеток в энуклеированные ооциты с последующими последовательными электрослиянием и активацией электрослитых клеток с получением эмбрионов; постактивации и культивирования эмбрионов in vitro и перенесения культивированных эмбрионов в "суррогатных" (заменяющих) матерей для получения клонированных тигров.

Способ получения клонированных тигров данного изобретения дополнительно иллюстрируется следующим образом.

Стадия 1: Получение донорных клеток Соматические клеточные линии, собранные из тигра, получают в качестве донорных клеток, хотя клетки, собранные из тигра, не являются ограничением для донорных клеток, предпочтительные клеточные линии включают в себя клетки, собранные из промывающей матку жидкости, эндометрия, яйцевода, уха или мышцы, клеток кумулуса или фибробластов плода, которые получают с использованием общепринятого известного способа (см. Mather & Barnes, Methods in Cell Biology, vol. 57, Animal Cell Culture Methods, Academic Press, 1998) с некоторыми модификациями.

Например, клетки собирают добавлением ЗФР (забуференного фосфатом солевого раствора), содержащего 1% пенициллин-стрептомицин (Gibco, 10000 Е/мл пенициллина, 10 мг/мл стрептомицина), к промывающей матку жидкости с последующим центрифугированием. Клетки, собранные из промывающей матку жидкости, культивируют в DMEM (модифицированной по способу Дульбекко среде Игла), дополненной не являющимися незаменимыми аминокислотами, 10% ФТС (фетальной телячьей сывороткой) и 1% смесью пенициллин-стрептомицин (10000 Е/мл пенициллина, 10 мг/мл стрептомицина) в условиях 39^oС, 5% СО₂.

Эпителиальные клетки матки, собранные из эндометрия или яйцевода, промывают указанным ЗФР, трипсинизируют и культивируют в условиях, описанных выше.

Для клеток кумулуса комплексы кумулус-ооцит обрабатывают раствором гиалуронидазы для выделения клеток кумулуса, окружающих ооциты. Клетки кумулуса трипсинизируют в течение 30-60 минут в условиях 39^oС, 5% СО₂ перед их культивированием подобно способу, описанному выше.

Что касается фибробластов ушей и фетальных фибробластов, их получают из внутренней стороны кожи, выстланной хрящевой тканью, и из ткани, собранной из туловища и конечностей плода соответственно путем асептического промывания и измельчения этих тканей с последующей обработкой трипсином и коллагеназой типа II в условиях 39^oС, 5% СО₂. Эти клетки также культивируют аналогично культивированию соматических донорных клеток, описанному выше.

Эти соматические клеточные линии хранят с использованием субкультуры (пассированной культуры), культуры сывороточного голодания или замораживания. Субкультивирование (пересев) донорных клеточных линий проводят при регулярных интервалах путем замены старой среды на новую среду после трипсинизации. Культивирование с сывороточным голоданием проводят с использованием DMEM, дополненной 0,5% ФТС, и способа Wilmut et al. (см. Wilmut et al., Nature, 385:810-813, 1997). Хранящиеся таким образом клеточные линии используют для более поздней стадии в качестве донорных клеток.

Стадия 2: Получение реципиентных ооцитов Незрелые ооциты, собранные из яичника коровы или кошки, доводят до созревания in vitro: незрелые ооциты отбирают из яичника в промывающей среде ТСМ199, содержащей 10 мМ HEPES (N-[гидроксиэтил]пиперазин-N'-[2-этансульфоновая кислоту]) и доводят до созревания в различных культуральных средах в зависимости от типа животного, из которого были получены ооциты. Для созревания ооцитов, полученных из коровы, используют культуральную среду ТСМ199-1 (см. таблицу 1). Для созревания ооцитов, собранных из кошки, клетки культивируют в культуральной среде ТСМ199-2 (см. таблицу 2), дополненной хорионическим гонадотропином человека (hCG). В обоих случаях культивирование проводили в течение 16-22 часов в условиях 39^oС, 5% СО₂.

Стадия 3: Энуклеация реципиентных ооцитов После удаления клеток кумулуса (яйцевого холмика на стенке Граафова пузырька), окружающих зрелые реципиентные ооциты, и разрезания части блестящей зоны ооцитов часть цитоплазмы, включающую в себя первое полярное тельце, удаляют из ооцитов с получением энуклеированных ооцитов: сначала клетки кумулуса, окружающие зрелые ооциты, удаляют физически денудирующей пипеткой в промывающей среде ТСМ199, содержащей гиалуронидазу. Затем денудированные ооциты промывают промывающей средой ТСМ199 и переносят в раствор цитохалазина В. Для энуклеации денудированных ооцитов часть блестящей зоны денудированных ооцитов пронизывается режущей пипеткой с образованием щели, через которую 10-15% цитоплазмы, включающей в себя первое полярное тельце, может выжиматься из ооцитов. Энуклеированные ооциты промывают и инкубируют в культуральной среде ТСМ199. Указанный раствор цитохалазина В получают разбавлением цитохалазина В, растворенного в ДМСО (диметилсульфоксиде), культуральной средой ТСМ199.

Стадия 4: Электрослияние донорных клеток с реципиентными ооцитами и активация электрослитых клеток Донорные клетки переносят в реципиентные ооциты с последующим электрослиянием и активацией электрослитых клеток: перед инъекцией донорных клеток в реципиентные ооциты энуклеированные ооциты промывают культуральной средой ТСМ199 и переносят в раствор РНА-Р (фитогемагглютинина). Затем донорные клетки переносят в энуклеированные ооциты инъекцией донорных клеток в щель, сделанную на блестящей зоне ооцитов, в растворе РНА-Р.

Электрослияние проводят с использованием электроманипулятора клеток Electro Cell Manipulator (BTX ECM2001). Реконструированные эмбрионы в растворе маннита, дополненном промывающим раствором ТСМ199, помещают в камеру с двумя электродами, по одному на каждой стороне. Перед помещением эмбрионов с их донорными клетками, обращенными к катоду в камере, эту камеру заполняют раствором маннита. После электрослияния эмбрионов посредством приложения импульса постоянного тока 0,75-2,00 кВ/см дважды с интервалом в одну секунду в течение 15 мкс каждый раз, электрослитые эмбрионы промывают раствором маннита и промывающей средой ТСМ199, инкубируют в растворе цитохалазина В и активируют. Электрослияние и активацию проводят одновременно при условии, что электрослияние проводят в среде с маннитом, содержащей Са²⁺. В противном случае активацию проводят после электрослияния. При проведении электрослияния в не содержащей Са²⁺ среде с маннитом стадию активации проводят инкубированием эмбрионов в растворе иономицина в темноте. Затем иономицин удаляют из эмбрионов промыванием их промывающей средой ТСМ199, содержащей ФТС или БСА. Указанный раствор иономицина получают разбавлением иономицина, растворенного в ДМСО, промывающей средой ТСМ199, содержащей БСА.

Стадия 5: Постактивация и культивирование эмбрионов in vitro Эмбрионы постактивируют и культивируют in vitro: активированные эмбрионы, инкубированные в промывающей среде ТМС199, содержащей ФТС или БСА, постактивируют инкубированием в растворе циклогексимида или DAMP (4-диметиламинопурина) и культивируют in vitro в условиях 5% СО₂ или смеси 5% СО₂, 7% О₂ и 88% N₂. Указанный раствор циклогексимида или раствор DAMP готовят добавлением циклогексимида, растворенного в этаноле, или DAMP к средам для культивирования in vitro соответственно. Среды для культивирования in vitro включают в себя среды mTALP (см. таблицу 3), mSOF (см. таблицу 4) и mCR2aa (см. таблицу 5), все из которых содержат NaCI, KC1, NаНСО₃, NаН₂РO₄, CaCl₂, Na-лактат, глюкозу, феноловый красный, БСА, канамицин, незаменимые аминокислоты, не являющиеся незаменимыми аминокислоты и L-глутамин.

Необязательно эмбрионы, культивируемые in vitro, хранят посредством замораживания для более позднего использования и подвергают оттаиванию, когда их предполагают использовать. Для замораживания эмбрионов их промывают ЗФР, содержащим ФТС, помещают в среду для замораживания, содержащую пенициллин-стрептомицин, CaCl₂, глюкозу, МgСl₂, Na-пируват и ЗФР. Затем эмбрионы в среде для замораживания подвергают медленному замораживанию с последующим быстрым замораживанием в жидком N₂. При вынимании замороженных эмбрионов из жидкого N₂ и оттаивании их помещают на воздух на приблизительно 5 секунд и затем оттаивают в теплой воде. Для удаления среды для замораживания из оттаявших эмбрионов их помещают последовательно в среды, содержащие глицерин от его высокой концентрации до низкой концентрации.

Стадия 6: Получение клонированных тигров Эмбрионы, культивированные in vitro, переносят в "суррогатных" матерей для получения тигров: эмбрионы в ЗФР, содержащем ФТС, имплантируют в матку "суррогатных" матерей.

На основе вышеописанного способа авторы изобретения получили эмбрион, SNU5 (эмбрион Корейского тигра), с использованием клеток ушей тигра и ооцитов Корейской коровы в качестве доноров ядер и реципиентных ооцитов соответственно. Этот эмбрион был депонирован Международным депозитарием, КСТС, Корейской Коллекцией Типовых культур (Korean Collection for Type Cultures; KRIBB # 52, Oundong, Yusong-ku, Taejon, 305-333, Republic of Korea) 10 марта 2000 года под номером доступа КСТС 0752ВР.

Данное изобретение иллюстрируется дополнительно в следующих примерах, которые не должны рассматриваться как ограничение объема данного изобретения.

Пример 1: Получение донорных клеток и реципиентных ооцитов Для получения донорных клеток проводили дезинфекцию этанолом и бетадином вокруг апикальной ушной ткани взрослого самца тигра после сбривания волос около этой ткани. Ткань кожи (1-2 см² по площади) собирали простерилизованными инструментами, переносили в тест-пробирки на 50 мл, содержащие забуференный фосфатом солевой раствор (ЗФР, GIBCO BRL, Life Technologies, USA) с 0,5% пенициллином (10000 Е/мл) - стрептомицином (10 мг/мл). Затем хрящевую ткань и содержащую волосы кожу отделяли от указанной собранной ткани кожи простерилизованными ножницами и хирургическими лезвиями с получением ткани внутренней стороны кожи, выстланной хрящевой тканью, для донорных клеток. Эту ткань промывали ЗФР и измельчали до размера 100 меш. Затем эту ткань инкубировали в ЗФР, содержащем 0,25% трипсин, 1 мМ ЭДТА и 1 мг/мл коллагеназы типа II, в течение 1 часа в условиях 39^oС, 5% СО₂. После расщепления ткани ферментами ее центрифугировали при 1500 об/мин в течение 2 минут и суспендировали в DMEM (модифицированной по способу Дульбекко среде Игла, GIBCO BRL, Life Technologies, USA), дополненной 10% ФТС, 1% NEAA (ненезаменимыми аминокислотами) и 1% смесью пенициллин-стрептомицин. Суспензию переносили на чашки для культивирования клеток и инкубировали в условиях 39^oС, 5% СО₂ с получением линии соматических клеток. После этого клетки трипсинизировали в растворе, содержащем 0,25% трипсин и 1 мМ ЭДТА, и доводили число клеток до 210⁴ клеток/мл для помещения аликвот клеток в пробирки Эппендорфа.

Фигура 1 изображает соматические клетки, выделенные в виде отдельных клеток для ядерного донора.

С другой стороны, для реципиентных ооцитов, фолликулы, размер которых был 2-6 мм в диаметре, отсасывали из яичников Корейских коров шприцом на 10 мл, имеющим иглу 18G. Затем эту фолликулярную жидкость переносили в чашку 100 мм с сеткой (длина между линиями была 1 см), нарисованной на ее дне, и ооциты с гомогенной цитоплазмой и достаточным числом слоев клеток кумулуса вокруг них подвергали скринингу. Отобранные ооциты промывали три раза 2 мл промывающей среды ТСМ199 (см. таблицу 6) в чашках 35 мм и затем один раз культуральной средой ТСМ199-1 (см. таблицу 1). Наконец, ооциты культивировали в культуральной среде ТСМ199, содержащей 0,1% раствор эстрадиола (см. таблицу 7), 2,5% раствор фолликулостимулирующего гормона (см. таблицу 8) и 10% ФТС, с получением реципиентных ооцитов.

Пример 2: Перенос ядер соматических клеток Реципиентные ооциты, полученные в примере 1, промывали один раз промывающей средой ТСМ199 и переносили в 0,1% раствор гиалуронидазы (Sigma Chemical Co. , USA), полученный смешиванием 1 мл промывающей среды ТСМ199 с 111 мкл исходного раствора гиалуронидазы (10 мг/мл в промывающей среде ТСМ199). После удаления клеток кумулуса из ооцитов в присутствии 0,1% раствора гиалуронидазы денудированные ооциты промывали три раза и инкубировали в промывающей среде ТСМ199. Затем эти ооциты переносили в раствор цитохалазина В (Sigma Chemical Co. , USA), полученный смешиванием 1 мл промывающей среды ТСМ199, содержащей 10% ФТС, с 1 мкл исходного раствора цитохалазина (7,5 мг/мл в ДМСО), и блестящую зону каждого ооцита разрезали с использованием микроманипулятора для образования щели, через которую можно выжать 10-15% цитоплазмы из ооцита с получением энуклеированного (лишенного ядра) ооцита. Стадия энуклеации более конкретно иллюстрируется следующим образом: рабочую чашку помещали на чашку микроманипулятора и микроманипулятор снабжали удерживающей пипеткой на его левом плече и режущей пипеткой на его правом плече. Затем удерживающую пипетку и режущую пипетку помещали в направлении 9 часов и 3 часов соответственно и корректировали для свободного перемещения во всех направлениях путем помещения контроллера (регулятора) пипеток в середину. Эти две пипетки дополнительно корректировали, чтобы не давать им прикасаться к рабочей чашке, и их кончики помещали в середину микрокапельки путем перемещения их вверх и вниз по этой микрокапельке. Затем ооциты переносили из промывающей среды ТСМ199 в раствор цитохалазина В с использованием промывающих пипеток с раструбом (внутренний диаметр >200 мкм). Микроманипулятор сначала фокусировали на ооците с использованием его рукоятки грубой регулировки и рукоятки тонкой регулировки и этот фокус дополнительно корректировали перемещением этих двух пипеток вверх и вниз. Ооцит помещали с его первым полярным тельцем, ориентированным в направлении 12 часов, и удерживающую пипетку помещали вблизи этого ооцита в направлении 9 часов ооцита для фиксации ооцита путем применения гидравлического давления. Фигура 2 показывает процесс разрезания блестящей зоны ооцита с использованием удерживающей пипетки и режущей пипетки. Как показано на фигуре 2, ооцит пронизывался режущей пипеткой (2) от направления 1 час к направлению 11 часов с особым вниманием в отношении того, чтобы не повредить цитоплазму ооцита. После этого к удерживающей пипетке (1) прилагали гидравлическое давление для отделения ооцита (3) и удерживающую пипетку приводили в контакт с режущей пипеткой, проникающей через окаймляющую блестящую зону на верхней части первого полярного тельца, для разрезания части блестящей зоны путем соприкосновения этих двух пипеток. Щель на ооците, сделанную, как описано выше, использовали как для энуклеации, так и для инъекции донорной клетки. Фигура 3 показывает процесс энуклеации, удаляющий первое полярное тельце и ядро из ооцита. Как показано на фигуре 3, ооцит (3) помещали таким образом, что его щель была ориентирована вертикально, удерживали удерживающей пипеткой (1) на его нижней части для предотвращения его перемещения и мягко нажимали на его верхнюю часть режущей пипеткой (2) для получения энуклеированного ооцита. Энуклеированный ооцит промывали три раза промывающей средой ТСМ199 и инкубировали в культуральной среде ТСМ199.

После этого донорные клетки, полученные заранее, переносили в энуклеированные ооциты с использованием микроманипулятора. Сначала инъекционную микрокапельку 4 мкл помещали на середину рабочей чашки с использованием раствора РНА-Р, полученного смешиванием 400 мкл промывающего раствора ТСМ199 и 100 мкл исходного раствора РНА-Р (фитогемагглютинина) (0,5 мг/мл в промывающем растворе ТСМ199). Затем делали две микрокапельки для донорных клеток, одну из которых помещали выше, а другую ниже инъекционной микрокапельки на той же самой рабочей чашке с использованием ЗФР, содержащего 1% ФТС. После распределения этих микрокапелек с минеральным маслом рабочую чашку помещали на чашку микроманипулятора.

Режущую пипетку, установленную на микроманипуляторе, заменяли инъекционной пипеткой. Энуклеированные ооциты промывали три раза промывающей средой ТСМ199 и переносили в инъекционную микрокапельку. Донорные клетки оттягивали в инъекционную пипетку и переносили в инъекционную микрокпельку. Фигура 4 показывает процесс перенесения соматической клетки в энуклеированный ооцит. Как показано на фигуре 4, энуклеированный ооцит помещали с его щелью, ориентированной в направлении 1 часа, фиксировали при помощи удерживающей пипетки и инъецировали донорной клеткой через щель с использованием инъекционной пипетки и гидравлического давления с получением реконструированного эмбриона. Этот эмбрион промывали три раза промывающей средой ТСМ199 и инкубировали в промывающей среде ТСМ199.

Пример 3: Электрослияние и активация Реконструированные эмбрионы подвергали электрослиянию с использованием электроманипулятора клеток Electro Cell Manipulator (ECM 2001, ВТХ, USA) с последующей активацией. 15 мкл раствора маннита, содержащего 0,28 М маннит, 0,5 мМ HEPES (рН 7,2), 0,1 мМ MgSО₄ и 0,05% БСА, добавляли к культуральной среде ТСМ199, содержащей реконструированные эмбрионы, с использованием пипетки с раструбом для промывания. После 1-минутной инкубации в указанной среде эмбрионы инкубировали в течение 1 минуты в растворе маннита, дополненном промывающим раствором ТСМ199, и наконец переносили в раствор маннита с использованием пипетки с раструбом для промывания. Камеру (камеру 3,2 мм 453) клеточного электроманипулятора наполняли раствором маннита, дополненным промывающей средой ТСМ199, и затем эмбрионы помещали в эту камеру таким образом, что их часть с донорной клеткой была обращена к катоду. После электрослияния эмбрионов путем приложения импульса постоянного тока 0,75-2,00 кВ/см дважды с интервалом 1 сек в течение 15 мкс каждый раз их переносили в промывающую среду ТСМ199 и промывали три раза этой средой от раствора маннита.

Для активации электрослитых эмбрионов их инкубировали в темноте в течение 4 минут в растворе иономицина (Sigma Chemical Co., USA), который был промывающей средой ТСМ199, содержащей 5 мкМ иономицин и 1% БСА. Исходный раствор иономицина получали путем растворения 1 мг иономицина в 1,34 мл ДМСО. Активированные эмбрионы инкубировали в течение 5 минут в чашке 35 мм, содержащей промывающую среду ТСМ199, дополненную 10% ФТС, для удаления иономицина из этих эмбрионов.

Пример 4: Постактивация и культивирование in vitro электрослитых эмбрионов Активированные эмбрионы постактивировали в течение 4 часов в 25 мкл раствора циклогексимида (Sigma Chemical Co., USA), полученного добавлением исходного раствора циклогексимида (10 мг/мл в этаноле) к среде для культивирования in vitro, mTALP (см. таблицу 3), в конечной концентрации 10 мкг/мл. Затем эмбрионы подвергали скринингу и отобранные эмбрионы инкубировали в течение 7 дней в условиях 39^oС, 5% СО₂.

На основе вышеописанного способа авторы изобретения получили эмбрион, SNU5 (эмбрион Корейского тигра NT), с использованием клеток ушей тигра и ооцитов Корейской коровы в качестве доноров ядер и реципиентных ооцитов соответственно. Этот эмбрион был депонирован Международным депозитарием, КСТС, Корейской Коллекцией Типовых культур (Korean Collection for Type Cultures; KRIBB # 52, Oun-dong, Yusong-ku, Taejon, 305-333, Republic of Korea) 10 марта 2000 года под номером доступа КСТС 0752ВР.

Пример 5: Получение эмбрионов путем применения ооцитов, полученных из кошки Авторы данного изобретения получили и культивировали эмбрионы путем применения способа, описанного в примерах 1-4, за исключением того, что использовали ооциты, полученные из кошки, в качестве рецепиентных ооцитов.

Пример 6: Замораживание и оттаивание эмбрионов и трансплантация Эмбрионы, полученные в примерах 4 и 5, замораживали для долгосрочного хранения. Сначала среду для замораживания (см. таблицы 9 и 10) распределяли в чашки 35 мм и морозильник включали для поддержания температуры при -5^oС. Эмбрионы, отобранные для замораживания, промывали ЗФР, содержащим 10% ФТС, и инкубировали в среде для замораживания в течение 20 минут. Затем эмбрионы оттягивали во французскую соломинку на 0,25 мл таким образом, что соломинка имела среду для замораживания, содержащую эмбрионы, в середине и два слоя воздуха. После герметизации нагреванием соломинки на обоих концах с использованием нагретого пинцета ее помещали в морозильник, выдерживали при -5^oС в течение 5 минут и отделяли пинцетом, предварительно охлажденным жидким N₂. После отделения соломинку охлаждали при скорости 0,3^oС/мин до -30^oС, выдерживали в течение 10 минут, когда температура достигала -30^oС. В конце концов эти эмбрионы хранили в резервуаре с жидким N₂.

Для оттаивания замороженных эмбрионов среду для оттаивания, содержащую ЗФР, дополненный 20% ФТС, получали в чашках 35 мм и дополняли глицерином для получения сред для оттаивания, каждая из которых содержала 0%, 3% и 6% глицерина (см. таблицы 9 и 11). Затем замороженную соломинку вынимали из жидкого N₂, выдерживали на воздухе в течение 5 секунд и оттаивали в резервуаре (>20 см в диаметре), содержащем теплую воду (30^oС). После оттаивания соломинку разрезали в местах слоев воздуха на обоих концах и среду, содержащую эмбрионы, собирали. Эмбрионы исследовали под микроскопом. Для удаления среды для замораживания из эмбрионов их последовательно инкубировали в средах для оттаивания, содержащих 6% глицерина, 3% глицерина и 0% глицерина, каждый раз по 5 минут.

Оттаявшие эмбрионы помещали в ЗФР, содержащий 20% ФТС, и натягивали в соломинку. Затем их переносили в матку "суррогатной" матери.

Пример 7: Сравнение эмбрионов, использующих различные донорные клетки Для сравнения различий между эмбрионами, полученными с использованием различных реципиентных ооцитов, эмбрионы, полученные в примерах 4 и 5, имплантировали в "суррогатных" матерей и сравнивали в отношении следующих показателей: числа электрослитых ооцитов, степени электрослияния (%), степени деления (%), количества (%) 8-клеточных эмбрионов, количества (%) 16-клеточных эмбрионов, количества (%) 32-клеточных эмбрионов, числа (%) развившиеся морулы/бластоцисты, количества перенесенных эмбрионов и количества беременностей после переноса эмбрионов (см. таблицу 12). Число (%) морулы/бластоцисты представляет отношение эмбрионов, развившихся в культуре in vitro к стадии непосредственно перед имплантацией, к общему числу эмбрионов, полученных переносом ядер.

Как показано в таблице 12, использование ооцитов коровы показало более высокую степень развития и возможности беременности, чем использование ооцитов кошки. Это может объясняться тем фактом, что многие предыдущие исследования по применению ооцитов коровы помогли установить оптимальные условия для трансплантации ядер, тогда как по применению ооцитов кошек не проводились большие исследования.

Прежние исследования показали, что промышленные животные, на которых проводились большие исследования, могут использоваться для межвидовой трансплантации клеточных ядер. Однако ни одному из этих исследований не удалось получить успеха в получении клонированного потомства. Таким образом, в связи с описанными выше обстоятельствами данное изобретение достигло большого прогресса в получении полученных из соматической клетки клонированных животных, так как оно получило произведенное из соматической клетки клонированное потомство.

Как ясно показано и объяснено выше, данное изобретение представляет способ получения клонированных тигров с использованием способа межвидовой трансплантации ядер, предусматривающего слияние соматических клеток тигра с ооцитами, полученными из коровы или кошки. Оно обеспечивает также клонированные эмбрионы тигра и клонированных тигров, развившихся из этих эмбрионов, полученные указанным способом. В соответствии со способом данного изобретения генетические признаки редких или находящихся под угрозой вымирания видов могут быть сохранены перманентно путем применения межвидовой трансплантации ядер для получения их клонированных эмбрионов как пути сохранения диких животных. Ожидается, что, кроме сохранения диких животных, способ данного изобретения может быть применен для разработки многих родственных применений, включающих в себя способ межвидовой трансплантации ядер.

Разнообразные модификации данного изобретения, кроме показанных и описанных здесь, будут очевидными для специалистов в данной области из предыдущего описания. Подразумевается, что подобные модификации находятся в объеме прилагаемой формулы изобретения. То

Формула изобретения

1. Способ получения клонированного тигра, предусматривающий стадии: (i) получения линий донорных соматических клеток тигра; (ii) созревания in vitro яйцеклеток из яичника коровы или кошки; (iii) удаления клеток кумулуса, окружающих яйцеклетки, разрезания части блестящей зоны зрелой яйцеклетки с получением щели и выжимания части цитоплазмы, включающей в себя первое полярное тельце, через эту щель с получением энуклеированной реципиентной яйцеклетки; (iv) переноса ядра в реципиентную яйцеклетку введением целой донорной соматической клетки в энуклеированную реципиентную яйцеклетку с последующими последовательными электрослиянием и активацией электрослитой клетки с получением эмбриона; (v) постактивации и культивирования эмбриона in vitro; и (vi) переноса культивированного эмбриона в суррогатную мать для получения клонированного тигра.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что линии соматических клеток, полученные на стадии (i), включают в себя клетки из маточного лаважа, эндометрия, яйцевода, уха или мышцы, клеток кумулуса или фетальных фибробластов.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что линии соматических клеток хранят с использованием субкультивирования (пересева), бессывороточной культуры или замораживания.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что клетки кумулуса, окружающие яйцеклетки на стадии (iii), физически удаляют денудирующей пипеткой после обработки гиалуронидазой.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что энуклеацию яйцеклетки на стадии (iii) проводят образованием щели на яйцеклетке путем разрезания ее микроманипулятором; помещением этой яйцеклетки с щелью, ориентированной вертикально, и удерживанием нижней части яйцеклетки удерживающей пипеткой для предотвращения перемещения клетки; выжиманием верхней части яйцеклетки режущей пипеткой, чтобы выпустить 10-15% цитоплазмы, содержащей первое полярное тельце, из яйцеклетки через эту щель.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что перенос ядра на стадии (iv) проводят введением донорной клетки в реципиентную энуклеированную яйцеклетку через щель, сделанную в блестящей зоне яйцеклетки.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что электрослияние на стадии (iv) проводят приложением двух импульсов постоянного тока 0,75-2,00 кВ/см с интервалом 1 с, длиной 15 мкс каждый.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что активация на стадии (iv) происходит одновременно с электрослиянием при условии, что электрослияние выполняют в среде, содержащей Са²⁺.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что активацию на стадии (iv) проводят в растворе иономицина в темноте при условии, что электрослияние выполняют в не содержащей Са²⁺ среде.

10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что постактивацию на стадии (v) проводят культивированием эмбриона в растворе циклогексимида или раствора DMAP (4-диметиламинопурина).

11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что культивирование in vitro на стадии (v) проводят культивированием постактивированного эмбриона в среде mTALP, mSOF или mCR2aa.

12. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополнительно предусматривает стадию хранения эмбриона, культивированного in vitro в стадии (v), для более позднего использования после замораживания эмбриона в среде для замораживания, содержащей пенициллин-стрептомицин, СаСl₂, глюкозу, MgCl₂, пируват натрия и фосфатный буферный раствор.

13. Способ по п.1, отличающийся тем, что предусматривает получение эмбриона корейского тигра NT, КСТС 0752ВР, (SNU5) с использованием клетки уха тигра и яйцеклетки корейской коровы (Bos taurus coreanae) соответственно в качестве донора ядра и реципиентной яйцеклетки.

Приоритеты по пунктам: 30.06.1999 по пп.1,3-12; 28.01.2000 по пп.2 и 13.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8,