Очищенный антигенный полипептид, протективный против инфекции echinococcus granulosus, молекула днк, кодирующая указанный антигенный полипептид, препарат, содержащий указанный антигенный полипептид, вакцина, содержащая указанный антигенный полипептид или указанную молекулу днк

Очищенный антигенный полипептид, протективный против инфекции echinococcus granulosus, молекула днк, кодирующая указанный антигенный полипептид, препарат, содержащий указанный антигенный полипептид, вакцина, содержащая указанный антигенный полипептид или указанную молекулу днк

Реферат

 

Изобретение относится к генной инженерии и иммунологии и может быть использовано в ветеринарии. Описан новый антигенный полипептид, а также его фрагменты и варианты, способные генерировать протективный иммунный ответ при заражении организма Echinococcus granulosus. Определены нуклеотидные последовательности, кодирующие названные формы антигенного полипептида, включение которых в соответствующие векторные системы обеспечивает возможность получения новых антигенов методом рекомбинантных ДНК, а также создание, наряду с вакцинами, содержащими готовый антигенный полипептид, рекомбинантных вирусных вакцин, включающих нуклеиновую кислоту, экспрессия которой осуществляется в организме животного. Предложенные вакцины предназначены для защиты хозяев, подверженных заражению паразитами р. Echinococcus. 5 с. и 2 з.п. ф-лы, 6 табл., 4 ил.

Область применения изобретения Настоящее изобретение относится к антигенам, являющимся защитными от inter alia, инфекции Echinococcus granulosus, к вакцинам, содержащим подобные антигены, и к способам защиты хозяев, подверженных заражению паразитами Echinococcus и Taenii.

Предпосылки создания изобретения.

Эхинококкоз возникает в результате заражения личинками (метацестодная стадия) ленточных червей, принадлежащих к роду Echinococcus. Переход происходит в момент поедания хищником добычи, т.е. от травоядных или всеядных промежуточных хозяев к плотоядным окончательным хозяевам.

Из ленточных червей рода Echinococcus наибольший интерес представляет Echinococcus granulosus. Е. granulosus является ввозбудителем поликистозного эхинококкоза (ПКЭ), для которого характерен обмен между домашней собакой и домашними травоядными животными, например: овцами и крупным рогатым скотом, причем человек также может служить промежуточным хозяином для паразита, но обычно не играя важной роли в его жизненном цикле. Соответственно, Е.granulosus географически широко распространен и в его размещении наблюдается явная параллель с теми областями мира, в которых скотоводство является основным занятием. Таким образом, можно предсказать, что ПКЭ является распространенным эндемическим заболеванием на больших территориях Южной Америки, Африки, Австралии, Центральной Европы, Центральной Азии, прибрежного Средиземноморья, включая Северную Африку.

В некоторых странах в настоящее время пытаются вести борьбу с ПКЭ путем разъяснения бесед с хозяевами собак и регулярной антигельминтной обработки собак в качестве окончательных хозяев паразита. Однако, хотя подобные программы, как правило, частично успешны, полного истребления паразита сказалось гораздо труднее достигнуть.

Другой желательный подход в борьбе с ПКЭ состоит в применении вакцины, направленной против кистозной стадии жизненного цикла E. granulosus у восприимчивых к нему промежуточных хозяев. Значительное преимущество такого подхода заключается в том, что при этом предотвращается передача инфекции собаке при поедании ею содержащих кисту потрохов промежуточного хозяина. Как следствие, искоренение болезни становится реальной возможностью.

В широком смысле именно на применение вакцины и направлено настоящее изобретение.

Однако для создания промышленной вакцины существенное значение имеет идентификация характерных защитных антигенов против E. granulosus. Хотя проведенные к настоящему времени исследования (Gemmell M.A., Jmmunology 11, 325-335 (1966). Heafh и др. J.Parasitol 67, 797-799 (1981)) ясно показали, что онкосферы E. granulosus являются мощным источником таких антигенов, никаких характерных антигенов онкосфер E. granulosus, обеспечивающих защиту, идентиицировано не было.

Заявка на Международный патент РСТ/ГР91/00563 (публикация 092/01051) раскрывает иммуногенный E. granulosus пептид, а также кодирующую этот пептид ДНК-последовательность и способы, как диагностики, так и борьбы с инфекцией E. granulosus с применением данного пептида. Однако описанный E. granulosus антиген (известный под названием "антиген 5") не имеет отношения к антигенам онкосфер, исследуемых заявителями. Более того, заявителями в их опубликованном исследовании показано, что присутствие антител к антигену 5 не защищает ягнят при контрольном заражении яйцами E. granulosus (Неаth и др., Jnfl. Journal of Parasitolody 22, 1017-1021(1992)).

Краткое изложение сущности изобретения Таким образом, цель настоящего изобретения состоит в получении особого антигена для применения в вакцине, обеспечивающей защиту от заражения E. granulosus, или хотя бы обеспечения общества правом полезного выбора.

Соответственно, одним из своих аспектов изобретением дается по существу в чистом виде антигенный полипептид с молекулярной массой в интервале 23-25 кД (при определении методом НДС-ПАГЭ), включающий аминокислоты 4-77 из приведенной на фиг. 4 последовательности, способный создавать иммунологическую реакцию на инфицирование E. granulosus у восприимчивых к заражению хозяев, или фрагмент или вариант пептида, обладающей эквивалентной защитной иммунологической активностью.

В предпочтительном воплощении изобретения полипептид включает аминокислоты 1-154 из приведенной на фиг.4 последовательности.

В еще более предпочтительном воплощении изобретения пептид представляет собой фрагмент, включающий часть или всю аминокислотную последовательность с фиг.4.

Удобно то, что полипептид или фрагмент пептида является продуктом экспрессии в клетке-хозяине, кодирующих их нуклеотидной последовательности.

Другим своим аспектом изобретение направлено на препарат, способный создавать защитную иммунологическую реакцию на инфицирование E. granulosus у восприимчивых к заражению хозяев, причем препарат включает компонент, выбранный из группы, включающей: (а) вышеохарактеризованный полипептид, (в) пептидный фрагмент полипептида (а), обладающий эквивалентной иммунологической активностью, и (с) вариант (а) или (в), модифицированный вставкой, замещением или делецией одной или нескольких аминокислот и обладающих хотя бы эквивалентной иммунологической активностью.

И еще одним аспектом изобретением дается молекула ДНК, выбранная из группы, включающей: (а) нуклеотидную последовательность, кодирующую вышеохарактеризованный антигенный полипептид, (в) нуклеотидную последовательность, кодирующую пептидный фрагмент антигенного полипептида (а), причем фрагмент обладает эквивалентной с полипептидом (а) защитной иммунологической активностью, и (с) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида (а) или пептида (в), в котором аминокислотная последовательность модифицирована вставкой, замещением или делецией одной или нескольких аминокислот, при этом вариант обладает эквивалентной с полипептдом (а) или пептидным фрагментом (в) защитной иммунологической активностью.

В рекомендуемом воплощении изобретения молекула ДНК включает хотя бы нуклеотиды 10-233 из приведенной на фиг.4 последовательности, более предпочтительно нуклеотиды 3-461 последовательности с фиг.4 и наиболее предпочтительно нуклеотиды 1-461 последовательности с фиг.4.

Другими своими аспектами изобретением даются рекомбинантные экспрессионные векторы, содержащие вышеохарактеризованную молекулу ДНК, клетки-хозяева, трансформированные такими векторами и способные экспрессировать закодированные полипептид или его пептидный фрагмент, или его вариант, а также способы продуцирования антигенного полипептида или его пептидного фрагмента, или его варианта, состоящие в культивировании вышеохарактеризованной клетки-хозяина и выделении продукта экспрессии.

Другим своим аспектом изобретением дается вакцина против инфицирования E. granulosus, содержащая вышеохарактеризованные полипептид E. granulosus, пептидный фрагмент или вариант, в смеси иммунологически приемлемым адъювантом или носителем.

И еще одним своим аспектом изобретением дается способ защиты восприимчивых хозяев от инфицирования Echinococcus или Taeniid паразитами, включающий этап введения указанному хозяину такого количества вышеохарактеризованных полипептида, пептидного фрагмента или варианта, которое обеспечивает защиту от заражения.

Полипептид, пептидный фрагмент или вариант удобно вводить указанному хозяину в виде вышеохарактеризованной вакцины.

Еще одним аспектом изобретением дается антитело, специфичное к вышеохарактеризованным антигенному полипептиду или к его пептидному фрагменту, или к его варианту.

Прочие воплощения изобретения станут очевидными из последующего описания.

Пояснения к диаграммам.

Хотя изобретение достаточно широко охарактеризовано выше, для специалиста понятно, что изобретение не ограничивается приведенной характеристикой, но включает также варианты, для которых в последующем описании приводятся примеры. В частности, лучшему пониманию настоящего изобретения способствует ссылка на прилагаемые диаграммы.

Фиг. 1 показывает IgG₁ и IgG₂ реакцию овечьих антител на вакцинацию полученными методом препаративного НДС-ПАГЭ фракциями онкосфер. Группы овец вакцинируют фракциями онкосфер, представляющими полученные методом НДС-ПАГЭ фракции, включающими антигены с установленной молекулярной массой. Группа 1: все молекулы имеют массу ниже 21 кД, группа 2: 23+25 кД, группа 3: 30 кД, группа 4: 34 кД, группа 5: 40 кД дублет, группа 6: 43 кД, группа 7: все молекулы имеют массу выше 43 кД, группа 8: смесь всех молекул, группа 9: только адъювант, в группе 10 овцы вакцинированы нефракционированными онкосферами, а в остальном обработаны точно также, как овцы групп 1-9, и группа 21 вакцинирована замороженным-оттаянным продуктом обработки ультразвуком активированных онкосфер E. granulosus. На фиг. 1 приведен анализ реакции антител овец в каждой из указанных групп, реагирующих с полными экстрактами онкосфер, полученными методом НДС-ПАГЭ.

Фиг.2 показывает IgG₁ и IgG₂ реакцию овечьих антител на вакцинацию клонированными антигенами. Группы: 11, клон S_2, 12 клон S3, 13, клон 48, 14, клон 95, 15, клон 101, 16, клон 119, 17, клон 123, 18, смесь клонов, 19, клоны 33, 42 и 85, 20, GST - контроль, 21, объединенная сыворотка от 5 овец, иммунизированных замороженным - оттаянным продуктом обработки ультразвуком активированных онкосфер Е.

Методика иммунизации аналогична методике, применяемой для антигенов групп 11-20.

Фиг. 3 показывает реакцию овечьего IgG₂ на вакцинацию полученными препаративными НДС-ПАГЭ фракциями антигенов онкосфер или клонированными антигенами. Группы те же, что и выше.

На фиг. 4 приведена нуклеотидная последовательность и выведенная на ее основе аминокислотная последовательность пептидного фрагмента защитного антигена изобретения. Цифрами с левой стороны указаны номера нуклеотидов от 5' к 3'-концу, цифрами с правой стороны указаны номера аминокислот. Трансляционный терминационный кодон подчеркнут.

Подробное описание изобретения.

Как указано выше, в своем основном аспекте изобретение направлено на создание антигена, способного защищать хозяина от инфицирования E. granulosus независимо от того, заражен ли хозяин червем или заражение находится на стадии цисты. К хозяевам, восприимчивым к инфицированию E. granulosus, относятся млекопитающие, включая и человека. Соответственно, примеры хозяев, для которых потенциально применимо настоящее изобретение, включают: овец, коров, свиней, коз, лошадей и человека.

В своих исследованиях заявители идентифицировали E. granulosus полипептид, способный участвовать в защите восприимчивого к инфицированию E. granulosus хозяина. Такой E. granulosus полипептид - это полипептид, молекулярная масса которого находится в интервале 23-25 кД.

Настоящее изобретение включает в свой объем антигены, происходящие из нативного E. granulosus полипептида, охарактеризованного выше, причем такие производные обладают защищающей хозяина активностью. Подобные производные обычно представляют собой пептидные фрагменты нативного полипептида, содержащими защитный эпитоп, но могут быть также и функционально эквивалентными вариантами нативного полипептида, модифицированного хорошо известными методами, например, сайтспецифичным мутагенезом (см. Adelman и др., D NA 2, 183 (1983)). К примеру, применением подобных методов можно заменить в последовательности одни аминокислоты на другие эквалентные аминокислоты. Группы аминокислот, для которых известна эквивалентность, включают: (а) Ala Ser Thr Pro Gly (в) Asn Asp Glu Gln (c) His Arg Lys (d) Met Leu Jls Val (e) Phe Tyr Trp В предпочтительном воплощении изобретения антиген представляет собой пептидный фрагмент, включающий часть или всю аминокислотную последовательность, приведенную на фиг.4.

Более предпочтительно, если пептидный фрагмент состоит из аминокислот 4-77 последовательности с фиг.4. Еще более предпочтительно, если пептидный фрагмент состоит из аимитнокислот 1-77 из последовательности с фиг.4. Наиболее предпочтительно, одноко, если пептидный фрагмент состоит изаминокислот 1-153 последовательности, приведенной на фиг.4.

Защитный антиген изобретения может быть получен выделением комплемента из нативных онкосфер E. granulosus использованием обычных методов очистки. Тем не менее, общепризнанно, что для получения антигена в промышленных масштабах желателен синтетический путь его получения. Подобные пути синтеза включают поэтапный твердофазный подход, описанный в работе Merryfield J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-2156(1963)), и получение применением методов биотехнологии. Последний путь, в частности, и был применен заявителями.

В еще одном своем аспекте изобретение, соответственно, относится к продуцированию рекомбинантными методами вышехарактеризованных антигенных полипептида или пептида.

В общем смысле продуцирование защитного антигена изобретения методами биотехнологии включает трансформирование приемлемого микроорганизма - хозяина или клетки-хозяина экспрессивным вектором, содержащим кодирующую антиген ДНК-последовательность, с последующим культивированием трансформированного хозяина и затем выделением экспрессированного антигена. Подобные методы в целом представлены в работе Sambrook и др., "Молекулярное клонирование", второе издание, Коулд Спринг Харбор Пресс (1987).

Начальный этап метода рекомбинантного продуцирования антигена включает легирование кодирующей антиген ДНК-последовательности в приемлемый экспрессионный вектор, содержащий промотор и участок связывания с рибосомой, работающими в клетке-хозяина, в которой будет трансформирована кодирующая последовательность. Наиболее обычные примеры таких экспрессионных векторов включают плазмиды, представляющие собой двуцепочечные ДНК-петли, автономно-реплицирующиеся в клетке-хозяие. Однако необходимо указать, что при осуществлении изобретения могут быть использованы и другие, отличные от плазмид приемлемые векторы.

Рекомендуется, чтобы клетка-хозяин, в которой клонируется и экспрессируется кодирующая полипептид ДНК-последовательность, была прокариотной, например, Е. сoli. Например, могут быть использованы Е.сoli Н5 (Raleigh E.A., и др. , Nucleic Acid Pеsearch 16(4) 1563-1575 (1988)), E.сoli К12 штамм 294 (АТСС 31446), E.coli В., E.coli, Х1776 (АТСС 31537), E.сoli штамм SТ9 или E. сoli JM101. Могут быть также использованы и другие прокариоты, например: бациллы, такие как Bacillus subtilis и энтеробактерии, такие как Salmonella typhimurium, Serratia marcesans или ослабленный штамм Mycobacteriuvbomis под названием Бацилла Calmette - Guerin (BCG).

В целом, если клетка-хозяина является прокариотом, применяют экспрессионные или клонирующие вектора, содержащие репликационные или контрольные последовательности, происходящие из видов, совместимых с клеткой-хозяином. Вектора кроме того могут нести маркерные последовательности, способные обеспечить фенотипный отбор трансформированных клеток. К примеру, E.сoli обычно трансформируют плазмидой рВР322, происходящей из видов E.сoli (Bolivar и др. , Gene 2, 95 (1977)). Плазмида рВР322 содержит гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину, в силу чего обеспечивает средства легкого обнаружения трансформированных клеток.

Для применения в экспрессии плазмида, содержащая экспрессируемую ДНК, включает в себя промотор. Промоторы, наиболее часто применяемые в рекомбинантных ДНК-конструкциях, предназначены для прокариотных хозяев, включают (-лактамазу (пенициллиназу) и лактозные промоторные системы (Chang и др. Nature 275,615 (1978), Hаkura и др. Science 198, 1056 (1977), Goedel и др., Nature 281, 544 (1979)) и триптофановую (trp) промоторную систему (Goeodel и др. , Nucleic Acld Res 8, 4057 (1980), ЕРО публ. 0036776). Хотя вышеприведенные промоторы применяются наиболее часто, были сконструированы и применены и другие микробиальные промоторы, например, Iac промотор (Amann и др., Gene 25, 167-178 (1983)), подробности, касающиеся их нуклеотидных последовательностей, опубликованы, что позволяет специалисту легировать их функционально методами генной инженерии с генами в векторах (Siebenlist и др., Cеll 20, 269 (1980)).

Помимо прокариотов могут быть также применены эукариотные микробы, например, дрожжи. Из эукариотных микроорганизмов наиболее часто применяют Saccharomyces cerevisiae или обычные пекарские дрожжи, хотя легко доступен целый ряд других штаммов. Для экспрессии в Saccharomyces наиболее часто применяют, например, плазмиду УРр7 (Stinchomb и др. Nature 282, 39 (1979), Kingsman и др. , Gene 7, 141 (1979), Tschemper и др., Gene 10, 157 (1980). Данная плазмида уже содержит trp1 ген, обеспечивающий маркер для отбора мутантного штамма дрожжей, не обладающего способностью расти в триптофане, например: АТСС 44076 или РЕР4-I (Jones, Genetics 85, 12 (1977)). Наличие trp1 повреждения в качестве характеристики генома дрожжевых клеток-хозяев обеспечивает эффективное средство обнаружения трансформации по росту в отсутствии триптофана.

Приемлемые промотирующие последовательности в дрожжевых векторах включают промоторы для 3-фосфоглицераткиназы (Hitzeman и др., J.Biol Chew 255, 2073 (0980) или других гликолитических ферментов (Hess и др., J.Aov Enzyme Reg 7, 149 (1968), Holland и др., Biochemistry 17, 4900 (1978)). К другим промоторам, обладающие дополнительным преимуществом транскрипции, регулируемой условиями роста, относятся промотирующая область для спиртовой дегидрогеназы, изоцитохром С, кислая фосфатаза, разрушающие ферменты, связанные с метаболизмом азота, и вышеупомянутая глицеральдегид -3-фосфатдегидрогеназа, а также ферменты, ответственные за усвоение мальтозы и галактозы. Приемлим любой плазмидный вектор, содержащий совместимый с дрожжами промотор, ориджин репликации и терминирующие последовательности.

Помимо микроорганизмов в качестве хозяев могут быть использованы культуры клеток, происходящие из многоклеточных организмов, например: млекопитающих или насекомых. В принципе, срабатывает любая такая клеточная культура, как от позвоночных, так и беспозвоночных. Однако наибольший интерес представляют клетки позвоночных, и размножение клеток позвоночных в культуре (тканевая культура) стала обычной процедурой в последние годы (Тканевые культуры, академик Пресс, под ред. Kruse и Patterson (1973). Примеры таких применимых линий клеток-хозяев включают: VERO и HELA-клетки и клетки яичников китайского хомячка (СНО клетки). Экспрессионные векторы для таких клеток включают (если необходимо): ориджин репликации, промотор, расположенный в восходящем направлении от экспрессируемого гена, а также любые необходимые участки связывания рибосомы, сайты полиаденилирования и последовательности терминации транскрипции.

При использовании в клетках млекопитающих регулирующие функции в экспрессионных векторах часто обеспечивают вирусным материалом. Например, обычно применяемые промоторы происходят из полиомы, аденовируса 2 и наиболее часто из обезьяньего вируса 40 (ОВ40). Особенно полезны ранний и поздний промоторы ОВ40, поскольку оба легко могут быть получены из вируса в виде фрагмента, содержащего также вирусный ориджин репликации ОВ40 (Tiers и др. Nafure 273, 113 (1978)). Могут быть использованы также меньшие и более крупные фрагменты ОВ40 при условии, что они включают в себя последовательности примерно в 250 п. о., простирающуюся от Hind III в направлении BglI сайта, расположенного в вирусном ориджине репликации. Кроме того, возможно также, а часто и желательно использовать промотор или регулирующие последовательности, обычно связанные с последовательностью целевого гена, при условии, что такие регулирующие последовательности совместимы с системами клетки-хозяина.

Ориджин репликации может быть обеспечен либо конструированием вектора, включающего экзогенный оридэин, происходящий, например, из ОВ40 или иного вирусного источника (напр. : полиомы, аденовируса, VSV, BPV), либо хромосомным механизмом репликации клетки-хозяина. Если вектор интегрирован в хромосому клетки-хозяина, этого часто достаточно.

После трансформации выбранного хозяина соответствующим вектором закодированные антигенные полипептид или пептид могут быть получены культивированием клетки-хозяина. В результате выделяют слитый белок.

После выделения антигенные полипептид или пептид при желании очищают. Принятая методика очистки, разумеется, будет зависеть от степени чистоты, необходимой от той области применения, для которой полипептид или пептид предназначены. Для большинства целей вакцинации достаточно отделить слитый белок от большей части остальных компонентов клеточной культуры, поскольку антиген может быть введен в вакцину в сравнительно сырой форме. Однако в случаях, если требуется более высокая степень чистоты, несущий компонент слитого белка может быть отщеплен от антигенного компонента. И вновь, как будет показано приведенными характерными примерами, этого легко достигнуть созданием соответствующего участка ферментативного расщепления между несущим компонентом и антигеном.

Если, как и рекомендуется, для продуцирования антигенного пептида применяются методы биотехнологии, первый этап состоит в получении ДНК, кодирующей целевой продукт. Такие молекулы ДНК составляют еще один аспект настоящего изобретения.

Молекула ДНК изобретения предпочтительно включает хотя бы часть или всю нуклеотидную последовательность, приведенную на фиг.4. В одном из вариантов молекула ДНК включает нуклеотиды 10-233 последовательности с фиг.4. В более предпочтительном варианте молекула ДНК включает нуклеотиды 3-233 последовательности с фиг.4. Однако наиболее предпочтительно, если молекула ДНК состоит из нуклеотидов 3-461 последовательности с фиг. 4, если не полной нуклеотидной последовательности, приведенной на фиг. 4.

ДНК молекула изобретения может быть получена в виде части, содержащейся в пределах ДНК молекулы, выделенной из соответствующего природного источника, или же может быть получена в виде безинтронной к ДНК применением обычных методов, например, приведенных в нижеследующем специальном описании. Рекомендуется кДНК.

Однако, как указано выше, настоящее изобретение включает также варианты полипептида, отличающиеся от нативных аминокислотных последовательностей вставкой, замещением или делецией одной или нескольких аминокислот. Если желателен такой вариант, изменяют нуклеотидную последовательность нативной молекулы ДНК. Подобное изменение в молекулу может быть внесено избирательным синтезом ДНК с помощью соответствующего синтезатора, например, ДНК синтезатора фирмы Эпплайд Биосистемс или, например, сайт-специфичным или кассетным мутагенезом с модификацией нативной ДНК.

После получения молекулу ДНК подготавливают для вставки вместе с выбранной регулирующей последовательностью в соответствующий блокирующий и/или экспрессионный вектор. Для этого ДНК расщепляют, наращивают и религируют по мере необходимости.

Расщепление проводят обработкой ДНК ферментами рестрикции в приемлемом буфере. Любой из большого числа промышленных ферментов рестрикции может быть использован согласно указаниям изготовителя. После расщепления нуклеиновую кислоту выделяют, например, осаждением этанолом.

Наращивание расщепленной ДНК осуществляют обычными методами. К примеру, если необходимы тупые концы, ДНК может быть образована ДНК-полимеразой I (полимераза Кленова), экстрагирована фенолом и хлороформом и осаждена этанолом.

Религация может быть проведена добавлением эквимолярных количеств целевых компонентов, соответствующим образом нарощенных для необходимого соответствия, и обработкой приемлемой лигазой (напр., Т₄ ДНК-лигазой).

Помимо защитных антигенов изобретения и способа их получения настоящим изобретением дается вакцина от инфицирования E. granulosus. Такая вакцина включает в качестве необходимого компонента защищающее количество вышеуказанных E. granulosus полипептида, пептидного фрагмента или варианта в смеси с приемлемым адъювантом или носителем.

Примеры приемлемых, известных специалистам адъювантов включают: сапонины (или их производные или родственные им продукты), мурамилдипептид, димиколлят трегалозы, полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда, другие эмульсии типа вода в масле, декстран, диэтиламиноэтилдекстран, алюминат калия, фосфат алюминия, гидроксид алюминия, бентонит, зимозан, полиэлектролиты, ретинол, фосфат кальция, потамин, саркозин, глицерин, сорбит, пропиленгликоль, не летучие масла и синтетические эфиры высших жирных кислот. В частности, найдено, что сапонины являются особенно эффективными адъювантами.

В других вариантах вакцина может дополнительно содержать иные лечебные для хозяина средства. Такие лечебные для хозяина средства включают противогельминтные или другие вакцины или иммуностимуляторы, например: интерфероны или интерлейкины.

Вакцина может быть введена хозяину любым известным специалисту способом. Тем не менее рекомендуется парентеральный путь введения вакцины. Термин "парентеральный" в применяемом здесь значении означает внутривенную, внутримышечную, накожную и подкожную инъекцию. Наиболее удобный путь введения подкожный.

Количество вводимой хозяину вакцины зависит от типа, размера и массы тела хозяина, а также от иммуногенности вакцины. Удобно готовить вакцину таким образом, чтобы сравнительно небольшие дозировки вакцины (1-5 мл) были достаточными для защиты.

Вакцина также может иметь вид живой рекомбинантной вирусной вакцины, включающей нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, пептид или вариант. Вакцину вводят хозяину в таком виде, и уже в самом хозяине происходит экспрессия закодированных полипептида, пептидного фрагмента или варианта, создающих защищающую хозяина реакцию.

Известен ряд таких систем живых рекомбинантных вирусных вакцин. Примером подобной системы является система вируса Vaccinia (патент США 4603112 и др., Nature 354, 520 (1991)).

Еще одним своим аспектом изобретением дается способ защиты хозяина, восприимчивого к инфицированию паразитами Echinococcus и Taeniid. Способ изобретения включает в качестве необходимого этапа введение хозяину антигенного полипептида или пептидного фрагмента, или варианта как таковых, либо введение вышеописанной вакцины.

Хотя нижеследующие характерные примеры раскрывают применение антигенов изобретения только в защите от инфицирования Е.granulosus, для специалиста понятно, что применением антигенов, происходящих от одного вида паразитов, может быть достигнута защита от перекрещивающихся видом (см., например, Lightowlers, Acta Leidensia 57, 135-142 (1989)). B связи с этим понятно, что антигены изобретения являются кандидатами в защитные антигены хотя бы от следующих, отличных от Е. granulosus, Eсhinococcus или Taeniid паразитов: E. multilocularis. E. vogelii T. ovis, T. saginata, T. solium, T. multiceps и T. hyoatigena.

В качестве еще одного аспекта изобретения предлагается применение вышеописанной молекулы ДНК или ее субпоследовательности в качестве зонда. Согласно этому аспекту, молекулу ДНК применяют для идентификации путем гибридизации с ДНК Echinococcus или Taeniid паразита, например: T. saginata T. hydatigena или E. multilocularis, кодирующей иммуногенный антиген данного паразита. Этим путем могут быть выявлены дополнительные антигены паразита, пригодные для применения в вакцине.

Способ применения в качестве зонда молекулы ДНК изобретения не требует разъяснения для специалиста. К примеру, может быть применена методика, предложенная и др., "Молекулярное клонирование, лабораторное руководство", Коулд Спринг Харбор (1982).

Или же для выявления гомологичных ДНК других паразитов может быть применен способ амплификации ДНК, например, полимеразной цепной реакцией (Saiki и др. , S'cience 239, 487 (1988)) с ПЦР праймерами, основанными на нуклеотидной последовательности, приведенной на фиг.4.

Аналогично применению молекул ДНК изобретения для выявления ДНК, кодирующих соответствующий защитный антиген других паразитов, антитела-зонды со специфичностью к защитным антигенам изобретения могут быть использованы для отбора антигенов, экспрессируемых микроорганизмами, трансформированными ДНК рассматриваемого паразита. Местоположение положительного клона (клона, экспрессирующего антиген, распознаваемый антителом) позволяет идентифицировать как сам защитный антиген, так и кодирующую его ДНК. Такие антитела-зонды могут быть и поликлональными, и моноклональными, и могут быть получены любым известным способом. В частности, моноклональные антитела могут быть получены по методике Kohler и Milstein (Kohler и Milstein. C. "Непрерывные культуры слитых клеток, секретирующих антитела заданной специфичности", Nature 256, 495-497 (1975)).

Иммуногенность антигенного полипептида изобретения и пептидных фрагментов этого полипептида станет очевидной из следующих, неограничивающих изобретение примеров.

Пример 1 Испытания антигенов, полученных из онкосфер ECHIIOCOCC GRANULOSUS препаративным НДС-ПАГЕ методом Предшествующие исследования заявителей, о которых не сообщалось, привели в индентификации ряда кандидатов в защитные антигены из E. granulosus. Эти кандидаты в защитные антигены имели следующие молекулярные массы, определенные методом НДС-ПАГЭ: - 23-25 кД - 30 кД - 34 кД - 40 кД.

Для выявления из вышеприведенных кандидатов защищающего хозяина антигена -(ов) заявителями проведены следующие эксперименты.

Материалы и методы Препаративный гель. Применением НДС препаративной ячейки (Биорад) в камеру на 32 мм на высоту 5,5 см наливают 50 мл 15%-ного раствора полиакриламида. После отстаивания верхнюю часть заливают 8 мл концентрирующего геля и оставляют отстаиваться.

Антиген. Девять миллионов проклюнувшихся онкосфер получают следующим образом. Подсчитывают яйца E.granulosus с полностью развитыми эмбриоформами и необходимое число яиц (из расчета на 20%-ый выход активированных онкосфер) помещают в разовые пластиковые центрифужные пробирки на 15 мл (Фалькон Пластикс). В каждую пробирку помещают не более 500000. Яйца центрифугируют 2 мин при 20 g, надосадочную жидкость отбрасывают и при 37^oС добавляют 10 мл искусственного желудочного сока (ИЖС), пропущенного через мембрану на 0,2 микрона (Неаth D.D. и Smyth J.D. Jn vitro культивирование Echinocoсcus granylosus, Taenia hydatigena T. ovis, T. pisiformis и T. serialis из онкосферы ди цистной личинки, Parasitology 61, 329-343 (1970). Пробирки перемешивают в роторе 1 ч при 37^oС.

Яйца центрифугируют 2 мин при 200 g, надосадочную жидкость отбрасывают и заменяют при 37^oС 10 мл искусственного желудочного сока (ИЖС) (Hеath и Smyth см. выше), пропущенного через мембрану на 0,2 микрона. Яйца перемешивают 30 мин при 37^oС в роторе, после чего центрифугируют 2 мин при 1000 g. Надосадочную жидкость отбрасывают и заменяют 15 мл Перколля (Франция, Швеция), разбавленного асептически в отношении 9:1 (об./об.) 10x концентрированным NCTC 135 (Гибко, Н-Й) эмбриофорные блоки, активированные и неактивированные онкосферы, образующие осадок, смешивают с Перколлем инверсией. Затем пробирки центрифугируют 10 мин при 1000 g и надсадочную жидкость, содержащую онкосферы, из каждой пробирки пипеткой переносят в новые стерильные центрифужные пробирки на 15 мл. Половину надосадочной жидкости (7,5 мл) пипеткой переносят в другую стерильную центрифужную пробирку и в каждую из двух пробирок добавляют по 7,5 мл NCTC 135. Пробирки перемешивают инверсией и центрифугируют 5 мин при 1000 g. Надосадочные жидкости удаляют, а содержащие онкосферы осадки промывают 2 х по 10 мл NСТС 135, центрифугируя каждый раз 2 мин при 1000 g. Наконец осадок суспендируют в соответствующем количестве NСТС с получением в результате образцов по 10 микролитров, содержащих 40-200 онкосфер. Затем определяют число активированных и неактивированных онкосфер подсчетом всего объема 4 х 10 микролитров образцов, нанесенных на обе стороны двух слайд гемоцитометра (Импрувд Найбауэр) при 200-кратном увеличении, позволяющем отличить неактивированные онкосферы от онкосфер, лишенных своих онкосферальных мембран (активированные онкосферы).

Отделение белка онкосфер. Онкосферы (прим. 50% неактивированных и 50% активированных) кипятят в НДС образцовом буфере (Laemmli U.К. Расщепление структурных белков в ходе сборки головки бактериофага Т4, Nafure (Лондон) 277, 680-685 (1970), содержащим дитиотрейтол (ДТТ) (Сигма, 10 мг/мл) вместо меркаптоэтанола, и переносят в колонку НДС препаративной ячейки (Биорад). После того, как фронт красителя бромфенилового голубого почти достигает нижней части колонки, 24 ч отбирают фракции по 2,5 мл.

Ингибиторы ферментов. Каждый поставлен фирмой Сигма. Ингибиторы готовят в 20 мМ Трис-HCl (рН 8) таким образом, что при разбавлении (об./об.) получают следующие конечные концентрации: йодацетамид 20 мМ, апротинин 10 мкл/мл, пепстатин 2 мкг/мл, N-тозил-L-фенилаланин-хлорметилкетон (ТФХК 50 мкг/мл, Nа-п-тозил-L-лизин-хлорметилкетон (ТФХК) 50 мкг/мл, Nа-п-тозил-L-лизин-хлорметилкетон (ТЛХК) 50 мкг/мл этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТК) 2 мМ, фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ) 1 мМ). Ингибиторы добавляют во все фракции. Образцы каждой фракции прогоняют через 5-25% гель методом НДС-ПАГЭ и для выявления молекул соответствующей молекулярной массы гель окрашивают серебром. Отобранные фракции концентрируют до 10 мл в перемешиваемой ячейке на мембране Амикон UМЗ. Затем их центрифугируют 30 мин при 1^oС и 2200 об/мин недостаточную жидкость отделяют от осадка НДС и диализуют 3 дня относительно 4 перемен 20 мМ Трис-буферного солевого раствора, содержащего ингибиторы ферментов (рН 7,5).

Подлежащие рассмотрению молекулярные массы были отобраны по молекулярным массам фракций следующим образом: 1. (все молекулы с молекулярной массой ниже 21 кД), 2. (2325 кД), 3. (30 кД), 4. (34 кД), 5. (40 кД, дублет), 6. (43 кД), 7. (все молекулы с молекулярной массой выше 43 кД), 8. (смесь всех молекул), 9. (только адъювант), 10. (образец антигена перед его загрузкой на гель. Образец обработан также центрифугированием на холоду и интенсивным диализом).

Методика иммунизации. Каждый антиген представлял собой 10 мл надосадочной жидкости. Каждая фракция представляет конкретную(ые) молекулу(ы) из 5 миллионов онкосфер, в то время как смесь состоит из всех молекул из 2 миллионов, также как и антиген перед загрузкой на гель (группа 10). Для первой инъекции 1 мл антигена гомогенизируют с 1 мл SТМ адъюванта (Bokhout и др. Veterinary Jmmunology and Immunopathology 2, 94-500 (1981), половину животных инъектируют подкожно под левые ребра, а вторую половину инъектируют в левую заднюю ногу. При втором инъектировании состав и путь введения инъекции те же за исключением того, что в каждую инъекцию включают 2 мг высушенных замораживанием Mycobacferium phlei. Инъектирование проводят с правой стороны.

Контрольное заражение яйцами. Через месяц после повторного инъектирования все ягнята получают перорально по 1000 яиц E.granulosus. Яйца хранят 6 недель при 4^oС. Яйца извлечены и червей, собранных у экспериментально зарaженных собак по методике Heath D.D. и Lawrence S.B. Ежедневное продуцирование яиц собаками, инфицированными Eсhinococcus granuloss, Archivos de la Hidalidosis 30, 321-328 (1991).

Экспериментальные животные. Используют ягнят пород Ромни и Дорсет, рассеянных по всем группам. Выращивают их в условиях, исключающих заражение E. granulosus и первую инъекцию получают в возрасте 8 месяцев. Во время первого и второго инъектирования для анализа сыворотки у каждого животного с помощью вакуумного заборника отбирают по 10 мл крови, еще раз кровь отбирают после контрольного заражения. Сыворотку отделяют в асептических условиях и хранят при -20^oС до момента испытания культивирования in vitro онкосфер или иммуноблоттированием.

Аутопсия. Через шесть месяцев после контрольного заражения берут еще один образец крови, затем ягнят обескровливают после оглушения пистолетом для оглушения скота. Печень и легкие животных удаляют и в них делают тонкие разрезы для определения числа и состояния присутствующих цист. В печени разрезы делают с интервалом в 2-3 мм и каждый разрез тщательно исследуют на глаз. В легких разрезы делают с интервалом в 4 мм цисты определяют пальпированием, а также осмотром на глаз.

Иммуноблоттирование. Антигены онкосферы Eсhinococcus granulosus разделяют методом НДС-ПАГЭ по опублик