Иммуностимулятор, вызывающий специфичный к опухоли клеточный иммунный ответ и способ его получения

Иммуностимулятор, вызывающий специфичный к опухоли клеточный иммунный ответ и способ его получения

Реферат

 

Изобретение относится к медицине и касается иммуностимулятора, вызывающего специфичный к опухоли клеточный иммунный ответ, и способа его получения. Иммуностимулятор содержит опухолевые клетки, по меньшей мере, часть которых имеет на клеточной поверхности, как минимум, один гаплотип ГКГ-I больного и которые были нагружены таким образом одним или несколькими пептидами, связывающими молекулу ГКГ-I, что упомянутые опухолевые клетки узнаются как чужеродные в окружении с пептидами иммунной системой больного и вызывают клеточный иммунный ответ. Нагрузка происходит в присутствии поликатиона, такого как полилизин. Преимущество изобретения заключается в повышении противоопухолевой активности. 2 с. и 24 з.п.ф-лы, 5 ил., 1 табл.

Разработка терапевтической вакцины на основе опухолевых клеток базируется по существу на следующих принципах: имеются качественные или количественные различия между опухолевыми клетками и нормальными клетками; иммунная система в принципе обладает способностью распознавать эти различия; иммунная система может быть стимулирована путем активной специфической иммунизации вакцинами таким образом, чтобы на основании этого узнавать эти различия и способствовать их отторжению.

Для того чтобы добиться противоопухолевого ответа, должны быть выполнены, по меньшей мере, два условия: во-первых, опухолевые клетки должны выражать антигены или неоэпитопы, которые не существуют в нормальных клетках. Во-вторых, иммунная система должна быть соответственно активирована, чтобы реагировать на эти антигены. Существенным препятствием при иммунотерапии опухолей является их низкая иммуногенность, прежде всего у людей. Это более удивительно, чем можно было ожидать, так как большое число генетических изменений злокачественных клеток должно было приводить к образованию пептидных неоэпитопов, которые узнаются в окружении с молекулами главного комплекса гистосовместимости (ГКГ-I) цитотоксическими Т-лимфоцитами.

Ранее были обнаружены ассоциированные с опухолью и специфичные к опухоли антигены, которые представляют такие неоэпитопы и поэтому должны были быть потенциальными целями для атаки иммунной системы. То, что иммунной системе все-таки не удается устранить опухоли, которые эти эпитопы выражают, может, очевидно, происходить не из-за недостатка неоэпитопов, а потому что иммунологический ответ на эти неоантигены недостаточен.

Для иммунотерапии рака на клеточной основе были разработаны две общие стратегии: с одной стороны, воспринимаемая иммунотерапия, которая служит in vitro распространению реактивных к опухоли Т-лимфоцитов и их повторному введению больным; с другой стороны, активная иммунотерапия, которая использует опухолевые клетки в ожидании, что при этом вызываются либо новые, либо усиленные иммунные ответы против опухолевых антигенов, которые приводят к системному опухолевому ответу.

Противоопухолевые вакцины, составляющие основу активной иммунотерапии, получали различными способами; примером этого являются облученные опухолевые клетки, которые перемещают с помощью иммуностимулирующих адъювантов, как, например, Corynebacterium parvum или Bacillus Calmette Guerin (BCG), чтобы вызвать иммунные реакции против опухолевых антигенов (Oettgen и Old, 1991).

В последние годы были использованы прежде всего генетически модифицированные опухолевые клетки для активной противораковой иммунотерапии, причем введенные в опухолевые клетки чужеродные гены относятся к трем категориям.

Некоторые использованные для этого опухолевые клетки модифицируют генетически, чтобы продуцировать цитокины. Местное сосуществование опухолевых клеток и цитокинового сигнала должны дать стимул, вызывающий противоопухолевый иммунитет. Обзор, относящийся к применению этой стратегии, представили Pardoll, 1993, Zatloukal и др., 1993, и Dranoff и Mulligan, 1995.

Что касается опухолевых клеток, которые были изменены генетически, чтобы секретировать цитокины, например интерлейкин-2 (IL-2), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) или -интерферон (IFN-), или чтобы выразить состимулирующие молекулы, на экспериментальных моделях животных было показано, что они генерируют сильный противоопухолевый иммунитет (Dranoff и др., 1993; Zatloukal и др., 1995). У человека с обнаруживаемой уже при осмотре опухолью и с развившейся толерантностью к опухоли существенно более сложно, однако, полностью охватить каскады комплексных взаимодействий так, чтобы могла происходить эффективная противоопухолевая реакция. Фактическая эффективность секретирующих цитокин противоопухолевых вакцин для применения на людях еще не доказана.

Другая категория генов, с помощью которых изменяются опухолевые клетки, имея в виду их использование в качестве противоопухолевой вакцины, кодирует так называемые добавочные белки; цель этой постановки задачи состоит в том, что для того, чтобы опухолевые клетки функционировали в представляющих антигены клетках (нео-АПК), заставить их непосредственно генерировать специфичные к опухоли Т-лимфоциты. Пример подобного подхода описывается у Ostrand-Rosenberg, 1994.

Идентификация и выделение опухолевых антигенов (ОА) или производных от них пептидов, описанные, например, Wlfel и др., 1994 а) и 1994 б); Carrel и др. , 1993, Lehmann и др., 1989, Tibbets и др., 1993, или в опубликованных международных заявках на патенты 92/20356, 94/05304, 94/23031, 95/00159, явились предпосылкой для того, чтобы использовать опухолевые антигены в качестве иммуногенов для противоопухолевых вакцин как в виде белков, так и в виде пептидов. Противоопухолевая вакцина в виде опухолевых антигенов как таковых не является, однако, удовлетворительным иммуногеном, чтобы вызвать клеточный иммунный ответ, как это было бы необходимо для элиминирования несущих опухолевый антиген опухолевых клеток; также совместное применение адъювантов предоставляло только относительную возможность для усиления иммунного ответа (Oettgen и Old, 1991).

Третья стратегия активной иммунотерапии для повышения эффективности противоопухолевых вакцин базируется на ксеногенизированных (превратившихся в чужеродные) аутологичных опухолевых клетках. В основе этой концепции лежит предположение, что иммунная система реагирует на опухолевые клетки, которые выражают чужеродный белок, и что в ходе этой реакции вызывается также иммунный ответ против тех опухолевых антигенов (ОА), которые представляются опухолевыми клетками вакцины.

Обзор этих различных вариантов, при которых опухолевые клетки в расчете на усиленную иммуногенность превращаются в чужеродные путем введения различных генов, представлен Zatloukal и др., 1993.

Центральную роль при регуляции специфичного иммунного ответа играет тримолекулярный комплекс, состоящий из компонентов, включающих рецептор антигенов Т-лимфоцитов, молекулу ГКГ и его лиганд, который является происходящим от белка пептидным фрагментом.

Молекулы ГКГ-I (или соответствующие человеческие молекулы, антигены лейкоцитов человека /HLA/) являются пептидными рецепторами, которые при строгой специфичности позволяют осуществить связывание миллионов различных лигандов. Условие для этого предоставляют специфичные к аллелям пептидные мотивы, которые обнаруживают следующие критерии специфичности: пептиды имеют в зависимости от гаплотипа ГКГ-I определенную длину, как правило, от восьми до десяти аминокислотных остатков. Обычно два из положений аминокислот представляют так называемый "якорь", они могут быть заняты отдельной аминокислотой или остатками аминокислот с похожими боковыми цепями. Точное расположение якорных аминокислот в пептиде и требование к их свойствам варьируются гаплотипами ГКГ-I. С-конец пептидных лигандов часто является алифатическим или заряженным остатком. Такие специфичные к аллелям мотивы пептидных лигандов для ГКГ-I до сих пор известны среди прочего для Н-2К^d, К^b, К^k, К^kml, D^b, HLA-A*0201, А*0205 и В*2705.

В рамках обмена белка внутри клетки регулярные, дегенерированные и чужеродные генные продукты, например вирусные белки или опухолевые антигены, разлагаются в мелкие пептиды; при этом получают некоторые потенциальные лиганды для молекул ГКГ-I. Таким образом, имеется предпосылка для их представления молекулами ГКГ-I и, как следствие, появление клеточного иммунного ответа, причем до сих пор еще в отдельности не выяснено, как пептиды продуцируются в клетке в качестве лигандов ГКГ-I.

Подход, который использует этот механизм для отчуждения опухолевых клеток, в расчете на усиление иммунного ответа, состоит в том, что опухолевые клетки обрабатывают химическими мутагенами, как, например N-метил-N'-нитрозогуанидин. Это должно привести к тому, что опухолевые клетки мутированных вариантов являют собой происходящие от клеточных белков неоантигены, которые представляют чужеродные генные продукты (Van Pel и Boon, 1982). Так как, однако, мутагенные явления случайно распределяются через геном и, кроме того, чтобы ожидать, что отдельные клетки в результате различных мутагенных явлений также представляют различные неоантигены, этот способ трудно контролировать в качественном и количественном отношении.

При другом подходе опухолевые клетки превращают в чужеродные в результате того, что их подвергают трансфекции генами одного или нескольких чужеродных белков, например геном чужеродной молекулы ГКГ-I или белков ГКГ отличающегося гаплотипа, который затем содержится в определенной форме на клеточной поверхности (заявка на европейский патент 0569678; Plautz и др., 1993; Nabel и др. , 1993). Этот подход основывается на вышеупомянутом положении, что опухолевые клетки, когда они вводятся в виде вакцины из клеточной массы, распознаются как чужеродные с помощью выраженного белка или происходящих от него пептидов или что в случае экспрессии аутологичных молекул ГКГ-I с помощью повышенного количества молекул ГКГ-I на клеточной поверхности оптимизируется представление опухолевого антигена. Изменение опухолевых клеток с помощью чужеродного белка может привести к тому, что клетки представляются в окружении ГКГ происходящими от чужеродного белка пептидами и изменение от "самого себя" к "чужому" происходит в рамках узнавания комплекса ГКГ-пептид. Узнавание белка или пептида как чужеродного имеет последствием то, что в ходе иммунного узнавания вырабатывается иммунный ответ не только по отношению к чужеродному белку, но также и по отношению к собственным опухолевым антигенам опухолевых клеток. В ходе этих процессов активируются представляющие антиген клетки (АПК), которые подвергают процессингу имеющиеся в опухолевой клетке вакцины белки (включая ОА) в пептиды и используют в качестве лигандов для их собственных молекул ГКГ-I и ГКГ-II. Активированные, нагруженные пептидом АПК переходят в лимфатические узлы, где некоторые немногие из простых Т-лимфоцитов узнают в АПК происходящие от ОА пептиды и могут их использовать в качестве стимула для клоновой экспансии, другими словами, для генерации специфичных к опухоли цитотоксических Т-лимфоцитов и Т-клеток-хелперов.

В основе представленного изобретения лежит задача приготовления новой противоопухолевой вакцины на базе превращенных в чужеродные клеток опухоли, с помощью которой может быть вызван активный клеточный противоопухолевый иммунный ответ.

При решении поставленной задачи исходили из следующих соображений: в то время как иммунная система толерантна к незлокачественным нормальным клеткам организма, организм реагирует иммунной защитой на нормальную клетку, когда она, например, вследствие вирусной инфекции синтезирует чужеродные организму белки. Причина этого заключается в том, что молекулы ГКГ-I представляют чужеродные пептиды, которые происходят от чужеродных организму белков. И, как следствие, иммунная система отмечает, что нечто нежелательное, чуждое происходит с этой клеткой. Клетка ликвидируется, АПК активируются и генерируется новый специфический иммунитет против выражающих чужеродные белки клеток.

Хотя опухолевые клетки и содержат соответствующие специфичные к опухоли опухолевые антигены, они, однако, сами по себе недостаточные вакцины, так как из-за незначительной иммуногенности они игнорируются иммунной системой. Если опухолевую клетку нагружают в отличие от известных приготовлений не чужеродным белком, а чужеродным пептидом, то дополнительно к чужеродным пептидам собственные опухолевые антигены клетки также различаются этой клеткой как чужеродные. Путем отчуждения пептидом должно стать возможным, чтобы вызванный чужеродными пептидами клеточный иммунный ответ направлялся против опухолевых антигенов.

Причина недостаточной иммуногенности опухолевых клеток не может быть только качественной проблемой, но является и количественной.

Для происходящего от опухолевого антигена пептида это может означать, что, хотя он и представляется молекулами ГКГ-I, однако, в такой концентрации, которая слишком незначительна, чтобы вызвать клеточный специфичный к опухоли иммунный ответ. Повышение количества специфичных к опухоли пептидов в опухолевой клетке должно было, таким образом, также способствовать превращению опухолевой клетки в чужеродную, что приводит к возникновению клеточного иммунного ответа. В отличие от вариантов, при которых опухолевый антиген или происходящий от него пептид так представлялся на поверхности клетки, что он подвергался трансфекции с помощью ДНК, кодирующей соответствующий белок или пептид, как описано в опубликованных международных заявках на патенты 92/20356, 94/05304, 94/23031 и 95/00159, следовало бы подготовить такую вакцину, которая при однократном получении вызывает эффективный иммунный ответ.

Mandelboim и др. , 1994 и 1995, предложили инкубировать клетки RMA-S с пептидами, происходящими от опухолевых антигенов, чтобы при этом вызвать клеточный иммунный ответ против соответствующих аутогенных опухолевых антигенов. Из предложенных Mandelboim и др. для вакцинирования опухоли клеток принимаются обозначенные RMA-S ((Krre и др., 1986), чтобы они могли выполнять функции АПК. Они характеризуются такой особенностью, что их молекулы HLA на клеточной поверхности свободны, благодаря дефекту в клеточном механизме транспорта антигенных пептидов (ТАП-механизм, ответственный за процессинг пептидов и их связывание при молекулах HLA). При этом в распоряжении находятся клетки для нагрузки пептидом, они также действуют как бы в качестве представленного носителя для введенного извне пептида. Направленное противоопухолевое действие основывается на возникновении иммунного ответа против представленного в клетках пептида, который предлагается иммунной системе без непосредственного окружения антигенным составом опухолевой клетки.

Изобретение относится к противоопухолевой вакцине для введения больному, состоящей из опухолевых клеток, которые представляются производными от опухолевых антигенов пептидами в окружении HLA и, по меньшей мере, часть которых имеет, как минимум, один гаплотип ГКГ-I больного на клеточной поверхности, и которые были нагружены одним или несколькими пептидами а) и/ или б) таким образом, что опухолевые клетки в окружении с пептидами узнаются как чужеродные иммунной системой больного и вызывают клеточный иммунный ответ, причем пептиды а) действуют в качестве лигандов для гаплотипа ГКГ-I, одинакового для больного и опухолевых клеток вакцины, и отличаются от пептидов, являющихся производными белков, которые выражаются клетками больного, или б) действуют в качестве лигандов для гаплотипа ГКГ-I, одинакового для больного и опухолевых клеток вакцины, и происходят от опухолевых антигенов, которые выражаются клетками больного и находятся в опухолевых клетках вакцины в концентрации, которая выше, чем концентрация пептида, происходящего от того же самого опухолевого антигена, который выражался в опухолевых клетках больного.

Молекулы ГКГ человека в соответствии с международными традициями в дальнейшем обозначаются также HLA (антиген лейкоцитов человека).

Под понятием " клеточный иммунный ответ" следует понимать опосредованный цитотоксическими Т-лимфоцитами иммунитет, который вследствие генерирования специфичных к опухоли цитотоксических позитивных к CD8 Т-лимфоцитов и позитивных к CD4 Т-хелперов вызывает разрушение опухолевых клеток.

Действие вакцины из опухолевых клеток согласно изобретению основывается прежде всего на том, что иммуногенное действие имеющегося в опухолевых клетках запаса опухолевых антигенов усиливается пептидом.

Пептиды типа а) в дальнейшем обозначают тоже как "чужеродные пептиды" или "ксенопептиды".

В одном из вариантов осуществления изобретения опухолевые клетки вакцины аутологичны. Причем речь идет о клетках, которые берутся у подвергающегося лечению больного, обрабатываются ex vivo пептидом (пептидами) а) и/или б), при необходимости инактивируются и затем опять вводятся больному. (Способы получения аутологичных противоопухолевых вакцин описываются в международной заявке на патент 94/21808, где ссылаются на их открытие).

В одном из вариантов осуществления изобретения опухолевые клетки являются аллогенными, то-есть они не принадлежат подвергающемуся лечению больному. Применению аллогенных клеток прежде всего отдают предпочтение тогда, когда играют роль экономические соображения; получение индивидуальных вакцин для каждого отдельного больного требует затрат труда и денег, кроме того, возникают трудности с отдельными больными при ex vivo культивировании опухолевых клеток, так как не получают достаточно большого количества опухолевых клеток, чтобы можно было приготовить вакцину. В случае аллогенных опухолевых клеток следует учитывать, что они должны подходить подтипу HLA больного.

При использовании чужеродных пептидов категории а) речь идет в случае аллогенных опухолевых клеток о клетках одной или нескольких клеточных линий, из которых, как минимум, одна линия клеток выражает, как минимум, один, предпочтительно несколько, опухолевых антигенов, которые идентичны опухолевым антигенам подвергающегося лечению больного, то-есть противоопухолевая вакцина соответствует признакам опухоли больного. Вследствие этого обеспечивается то, что вызванный представленным ГКГ-I чужеродным пептидом в опухолевых клетках вакцины клеточный иммунный ответ, который приводит к распространению специфичных к опухоли цитотоксических Т-лимфоцитов и Т-хелперов, направляется также против опухолевых клеток больного, так как они выражают такой же опухолевый антиген, как и клетки вакцины.

Например, если нужно подвергнуть лечению противоопухолевой вакциной согласно изобретению больную раком молочной железы с метастазами, которые обнаруживают мутацию Her2/neu (Allred и др., 1992; Peopoles и др., 1994; Yoshino и др., 1994 a); Stein и др., 1994; Yoshino и др., 1994 б); Fisk и др., 1995; Наn и др., 1995), вводят в качестве вакцины аллогенные, согласованные с гаплотипом HLA больного опухолевые клетки, которые тоже выражают мутированный Her2/neu в качестве опухолевого антигена. Ранее выделяли многочисленные опухолевые антигены и выясняли их связь с одним или несколькими раковыми заболеваниями. Известны другие примеры подобных опухолевых антигенов (Fenton и др. , 1993; Gedde Dahl и др., 1992; Jung и др., 1991; Morishita и др., 1993; Peace и др. , 1991; Skipper и др., 1993), опухолевых антигенов MAGE (Boon и др., 1994; Slingluff и др., 1994; van der Bruggen и др., 1994; международная заявка на патент 92/20356); обзор различных опухолевых антигенов в добавление к этому приводит Carrel и др., 1993.

В таблице приводится обзор известных, применяемых в рамках изобретения опухолевых антигенов и производных от них пептидов.

Опухолевые антигены больного определяют в общем стандартными способами в ходе установления диагноза и плана лечения, например с помощью анализов на основе цитотоксических Т-лимфоцитов со специфичностью к определяющему опухолевому антигену. Такие анализы были среди прочего описаны Hrin и др., 1987; Coulie и др., 1993; Сох и др., 1994; Rivoltini и др., 1995; Kawakami и др. , 1995, а также в международной заявке на патент 94/14459; эти литературные источники также включают различные опухолевые антигены или происходящие от них пептидные эпитопы. Возникающие на поверхности клеток опухолевые антигены могут быть также обнаружены с помощью иммунных анализов на основе антител. Когда опухолевые антигены являются ферментами, например тирозиназами, они могут быть обнаружены с помощью ферментных анализов.

В другом варианте осуществления изобретения может быть использована смесь аутологичных и аллогенных опухолевых клеток в качестве исходного материала для вакцины. Этот вариант осуществления изобретения находит, в частности, применение, когда выраженные больным опухолевые антигены неизвестны или только неполностью охарактеризованы и/или когда аллогенные опухолевые клетки выражают только часть опухолевых антигенов больного. Путем примешивания аутологичных, обработанных чужеродным пептидом опухолевых клеток обеспечивается то, что, по меньшей мере, часть опухолевых клеток вакцины содержит насколько возможно большое количество опухолевого антигена собственно больного. В случае аллогенных опухолевых клеток речь идет о таких, которые в одном или нескольких гаплотипах ГКГ-I совпадают с таковыми для больного.

Пептиды типа а) и б) в соответствии с требованием связываться с молекулой ГКГ-I определяют в отношении их последовательности с помощью подтипа HLA больного, которому должна вводиться вакцина. Определение подтипа HLA больного представляет, таким образом, одно из важнейших условий для выбора или построения подходящего пептида.

При применении противоопухолевой вакцины согласно изобретению в виде аутологичных опухолевых клеток автоматически проистекает подтип HLA через генетически детерминированную специфичность молекулы HLA больного. Подтип HLA больного может быть определен стандартными способами, как, например, с помощью микротеста лимфотоксичности (MLC-тест, MLC = смешанная культура лимфоцитов) (Practical Immunol., 1989). MLC-тест основывается на принципе смешивания выделенных из крови больного лимфоцитов сначала с антисывороткой или моноклональным антителом против определенной молекулы HLA в присутствии кроличьего комплемента (С). Положительные клетки подвергают лизису и окрашивают с помощью индикаторного красителя, в то время, как неповрежденные клетки остаются неокрашенными.

Для определения гаплотипа HLA больного можно также использовать полимеразную цепную реакцию с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) (Curr. Prot. Mol. Biol. , глава 2 и 15). Для этого у больного берут кровь и выделяют из нее РНК. Эту РНК подвергают сначала обратной транскрипции, благодаря чему образуется кДНК больного. кДНК служит матрицей для ПЦР с праймерными парами, которые специфически способствуют амплификации фрагмента ДНК, относящегося к определенному гаплотипу HLA. Наблюдаемая полоса ДНК при электрофорезе в агарозном геле свидетельствует о том, что больной выражает соответствующую молекулу HLA. Если полосы не наблюдают, значит больной в отношении этого негативен. Для каждого больного ожидаются, по меньшей мере, две полосы.

При применении изобретения в виде аллогенной вакцины используют клетки, из которых, по меньшей мере, часть согласуется, как минимум, с одним подтипом HLA больного. Принимая во внимание по возможности широкую используемость вакцины согласно изобретению, целесообразно исходить из смеси различных линий клеток, которые выражают два или три различных наиболее часто представленных подтипа HLA, причем, в частности, имеются в виду гаплотипы HLA-А1 и HLA-A2. С помощью вакцины на основе смеси аллогенных опухолевых клеток, выражающих эти гаплотипы, можно охватить широкую популяцию больных; таким образом, можно защитить около 70% европейского населения (Mackiewicz и др., 1995).

Определение применяемых согласно изобретению пептидов через подтип HLA характеризует их относительно их якорных аминокислот и их длины; определенные якорные положения и длина гарантируют, что пептиды подходят друг к другу в линии связывания пептидов соответствующих молекул HLA так, чтобы быть представленными на клеточной поверхности образующих вакцину опухолевых клеток таким образом, что клетки узнаются как чужеродные. Вследствие этого стимулируется иммунная система и вызывается клеточная иммунная реакция также против опухолевых клеток больного.

Пептиды, которые в рамках представленного изобретения являются подходящими в качестве чужеродных пептидов согласно категории а), имеются в распоряжении в широком диапазоне. Их последовательность может происходить от встречающихся в природе иммуногенных белков или их клеточных продуктов расщепления, например вирусных или бактериальных пептидов, или от чужеродных больному опухолевых антигенов.

Подходящие чужеродные пептиды могут, например, быть выбраны на основе известных в литературе пептидных последовательностей, например, описанных Rammensee и др., 1993, Falk и др., 1991, для различных мотивов HLA, на основе производных пептидов от иммуногенных белков различного происхождения, которые подходят друг другу в линиях связывания молекул соответствующих подтипов HLA. Для пептидов, имеющих частичную последовательность белка с иммуногенным действием, можно на основе уже известной или при необходимости еще требующих определения полипептидных последовательностей твердо установить путем регулирования последовательностей, учитывая специфичные к HLA требования, какие пептиды являются подходящими кандидатами. Примеры подходящих пептидов встречаются, например, у Rammensee и др., 1993, Falk и др., 1991, и у Rammensee и др., 1995, а также в международной заявке на патент 91/09869 (ВИЧ-пептиды); производные от опухолевых антигенов пептиды были среди прочих описаны в опубликованных международных заявках на патенты 95/00159, 94/05304. Имеются ссылки на публикации этих литературных источников и цитируемые в них статьи, связанные с пептидами.

Предпочтительными кандидатами для ксенопептидов являются пептиды, иммуногенность которых уже была продемонстрирована, а также пептиды, являющиеся производными известных иммуногенов, например, вирусных или бактериальных белков. Подобные пептиды демонстрируют на основе их иммуногенности сильную реакцию в MLC-тесте.

Вместо того, чтобы применять подлинные пептиды, а также неизмененные, происходящие от природных белков, можно на основании указанных минимальных требований к последовательности подлинного пептида в отношении якорных положений и длины использовать любые варианты, в этом случае применяются также синтетические пептиды согласно изобретению, которые получают в соответствии с требованиями к лиганду ГКГ-I. Так могут, например, исходя из лиганда для типа H2-K^d Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile (LFEAIEGFI), быть изменены аминокислоты, не являющиеся якорными аминокислотами, чтобы получить пептид с последовательностью Phe Phe Ile Gly Ala Leu Glu Glu Ile (FFIGALEEI); кроме того, якорная аминокислота Ilе в положении 9 может быть замещена Leu.

Пептиды, происходящие от опухолевых антигенов, а также от белков, которые выражаются в опухолевой клетке и которые не содержатся в соответствующей нетрансформированной клетке или содержатся в значительно уменьшенной концентрации, могут применяться в рамках представленного изобретения как пептиды типа а) и/или типа б).

Длина пептида соответствует предпочтительно в отношение связывания на молекуле ГКГ-I требуемой минимальной последовательности от 8 до 10 аминокислот с необходимыми якорными аминокислотами. При необходимости пептид может быть удлинен также по С- и/или N-концу, если это удлинение не наносит вреда связывающей способности, или удлиненный на минимальную последовательность пептид может участвовать в клеточном процессинге.

В одном из вариантов осуществления изобретения пептид может быть удлинен с помощью отрицательно заряженных аминокислот или можно вставить отрицательно заряженные аминокислоты в пептид и по другим положениям, чем положения якорных аминокислот, чтобы достигнуть электростатического связывания пептида на поликатионе, например полилизине.

Под понятие "пептиды" в рамках представленного изобретения подпадают в соответствии с определением также более длинные фрагменты белков или полные белки, для которых гарантировано, что после применения АПК они превращаются в пептиды, которые подходят молекуле ГКГ.

В этом варианте осуществления изобретения антиген, таким образом, вставляется не в виде пептида, но в виде белка или фрагмента белка или в виде смеси белков или фрагментов белков. Белок представляет антиген или опухолевый антиген, от которого происходят полученные после процессинга фрагменты. Относящиеся к клеткам белки или фрагменты белков подвергаются процессингу и могут после этого в окружении ГКГ представлять иммуноэффекторные клетки и, таким образом, вызывать или усиливать иммунный ответ (Braciale и Braciale, 1991; Kovacsovics Bankowski и Rock, 1995; York и Rock, 1996).

В случае применения белков или белковых фрагментов можно подтвердить идентичность конечных продуктов после процессинга с помощью химического анализа (деградация по Эдману или масс-спектрометрия фрагментов после процессинга; сравните обзорную статью Rammensee и др., 1995, а также цитируемые в ней оригинальные источники) или биологических анализов (способность АПК к стимуляции Т-лимфоцитов, специфичных к процессированным фрагментам).

Выбор кандидатов в пептиды с точки зрения их пригодности в качестве чужеродных пептидов происходит в принципе в несколько этапов: в общем, целесообразно для серийных исследований сначала проверить кандидаты в тесте по связыванию пептида на способность связываться с молекулой ГКГ-I.

Подходящим способом исследования является, например, основывающийся на проточной цитометрии анализ, использующий установку для сортировки клеток с возбуждением флуоресценции (FACS-анализ)(Flow Cytometry, 1989; FACS Vantage^TM User's Guide, 1994; CELL Quest^TM User's Guide, 1994). Причем пептид метят флуоресцентным красителем, например флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ), и вносят в опухолевые клетки, которые выражают соответствующую молекулу ГКГ-I. При протекании отдельные клетки подвергаются воздействию лазерного луча определенной длины волны; измеряют испускаемую флуоресценцию, она зависит от количества связанного клеткой пептида.

Другим способом определения связанного количества пептида является Скэтчард-блот. Для этого используют пептид, меченный ¹²⁵J или ионами редкоземельных металлов (например, европием). Клетки нагружают при 4^oС различными определенными концентрациями пептида от 30 до 240 минут. Для определения неспецифичного обменного взаимодействия пептида с клетками прибавляют к отдельным пробам избыток немеченого пептида, который препятствует специфическому взаимодействию меченого пептида. Затем клетки промывают, при этом удаляется неспецифичный ассоциированный с клетками материал. Количество связанного клеткой пептида устанавливают теперь либо в сцинтилляционном счетчике на основании измеренной радиоактивности, либо в подходящем для измерения долгоживущей флуоресценции фотометре. Обработку полученных таким образом данных производят стандартными способами.

При втором подходе кандидаты с подходящими свойствами для связывания испытываются на их иммуногенность.

Иммуногенность ксенопептидов, происходящих от белков, чье иммуногенное действие неизвестно, может, например, быть исследована с помощью MLC-теста, пептиды, используемые в этом тесте, который также целесообразно проводить в серии с различными пептидами, причем в качестве стандарта целесообразно применять пептид с известным иммуногенным действием, вызывают особенно сильную реакцию и пригодны для рассматриваемого изобретения.

Другая возможность испытания связывающих ГКГ-I пептидных кандидатов на их иммуногенность состоит в том, чтобы исследовать связывание пептидов при Т2-лимфоцитах. Подобный тест основывается на характерной особенности Т2-лимфоцитов (Alexander и др., 1989) или клеток RMA-S (Krre и др., 1986) участвовать в недостаточном количестве в механизме транспорта антигенный пептид - пептид и сначала, кроме того, представлять стабильные молекулы ГКГ-I. когда на них наносят пептиды, которые представляются в окружении ГКГ-I. Для теста используют, например, Т2-лимфоциты или клетки RMA-S, которые стабильно подвергаются трансфекции с помощью гена HLA, например генов HLA-A1 и/или HLA-A2. Если клетки нагружают пептидами, которые являются хорошими лигандами ГКГ-I, так как они так представляются в окружении ГКГ-I, что могут узнаваться иммунной системой как чужеродные, то такие пептиды способствуют тому, что молекулы HLA обнаруживаются в значительном количестве на клеточной поверхности. Доказательство наличия антигенов лимфоцитов человека на клеточной поверхности, например, с помощью моноклональных антител позволяет идентифицировать подходящие пептиды (Malnati и др., 1995; Sykulev и др., 1994). В этом случае также целесообразно применить стандартный пептид с известной хорошей способностью к связыванию HLA или ГКГ.

В одном варианте осуществления изобретения аутологичная или аллогенная опухолевая клетка вакцины может иметь несколько ксенопептидов с различными последовательностями. Примененные пептиды могут в данном случае, с одной стороны, так отличаться, что они связываются при различных подтипах HLA. Этим может достигаться то, что охватываются некоторые или все подтипы HLA больного или большой группы больных. Вакцину вводят в форме, полученной после облучения.

Другая, при необходимости дополнительная изменчивость в отношении представленных в опухолевой клетке ксенопептидов может состоять в том, что пептиды, связанные с определенным подтипом HLA, различаются относительно их, не являющейся важной для связывания HLA, последовательности тем, что они, например, происходят от белков различного происхождения, например вирусных и/ или бактериальных белков. От одной такой изменчивости, которая предоставляет вакцинированному организму большой диапазон при отчуждении, можно ожидать усиления стимуляции иммунного ответа.

В варианте осуществления изобретения, когда противоопухолевая вакцина состоит из смеси аллогенных опухолевых клеток различных клеточных линий, а также при необходимости дополнительно из аутологичных опухолевых клеток, могут все без исключения опухолевые клетки быть обработаны одинаковым/одинаковыми пептидом/пептидами или опухолевые клетки различного происхождения могут также иметь в каждом случае различные ксенопептиды.

В рамках проведенных исследований по представленному изобретению применяли в качестве чужеродного пептида типа а) вирусный пептид с последовательностью Leu Glu Ala Ile Glu Gly Phe , происходящий от гемагглютинина вируса гриппа и являющийся лигандом для типа H2-К^d; якорные аминокислоты подчеркнуты.

С помощью этого встречающегося в природе вирусного пептида в качестве чужеродного пептида была получена противоопухолевая вакцина и испытана на животной модели (модель меланомы и модель рака толстого кишечника).

Другой вирусный пептид с последовательностью Ala Ser Asn Glu Met Glu Thr , который происходит от нуклеопротеина вируса гриппа и является лигандом гаплотипа HLA-1 H2-K^b (Rammensee и др., 1993; якорные аминокислоты подчеркнуты), был использован для получения противоопухолевой вакцины; защитное действие вакцины было подтверждено на другой модели меланомы.

Была получена другая вакцина таким образом, что опухолевые клетки превращались в чужеродные с помощью чужеродного пептида с последовательностью Phe Phe Ile Gly Ala Leu Glu Glu Ile (FFIGALEEI). При этом речь идет о синтетическом, неизвестном ранее в природе пептиде. Поэтому при выборе последовательности было важно, чтобы выполнялись требования относительно пригодности в качестве лиганда для молекулы ГКГ-I типа Н2-К^d. Пригодность пептида для того, чтобы вызвать противоопухолевый иммунитет согласно концепции активной иммунотерапии, была подтверждена на раке толстого кишечника мыши СТ-26 ( сингенный для мышиного штамма Balb/c).

В другом варианте осуществления изобретения противоопухолевая вакцина может содержат