Папилломавирусные вакцины

Папилломавирусные вакцины

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения вирусоподобных частиц (VLP) папилломавируса человека, используемых для создания вакцин. Способ включает трансформацию дрожжевой клетки молекулой ДНК, кодирующей L1 HPV или L1+L2 HPV, культивирование трансформированной клетки, сбор VLP из трансформированной клетки и очистку VLP с помощью стадии хроматографии. 2 з.п.ф-лы, 14 ил.

Настоящая заявка является частичным продолжением заявки на Патент США Peг. 08/242794, поданной 16 мая 1994, находящейся на рассмотрении.

Область техники, к которой относится изобретение Разработаны рекомбинантные векторы экспрессии, кодирующие белки L1 и L2 папилломавирусов, способы создания рекомбинантных белков и способы применения рекомбинантных белков.

Известный уровень техники Папилломавирусные инфекции встречаются у самых разных животных, включая человека, овец, собак, кошек, кроликов, обезьян, змей и коров. Папилломавирусы поражают эпителиальные клетки, обычно вызывая на инфицированном участке образование доброкачественных эпителиальных или фиброэпителиальных опухолей. Папилломавирусы являются видоспецифичными инфекционными факторами, папилломавирусы человека не могут поражать животных, не принадлежащих к человеческому роду.

Папилломавирусы можно классифицировать в отдельные группы по хозяину, которого они инфицируют. Папилломавирусы человека (НPV), в частности, классифицированы более чем в 60 типов на основании данных о гомологии последовательности ДНК (см. обзор "Папилломавирусы и рак у человека", Н. Pfister (еd), СRС Рrеss, Inc., 1990). Типы папилломавирусов ведут себя как тип-специфические иммуногены, которые, создавая иммунитет, нейтрализующий инфекцию папилломавирусов одного типа, не создают иммунитет против папилломавирусов другого типа.

У человека отличающиеся типы НРV вызывают разные заболевания. HPV типов 1, 2, 3, 4, 7, 10 и 26-29 вызывают у людей с нормальным или неблагополучным иммунитетом образование доброкачественных бородавок. HPV типов 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19-25, 36 и 46-50 вызывают у людей с неблагополучным иммунитетом патологию эпителия. HPV типов 6, 11, 34, 39, 41-44 и 51-55 вызывают образование незлокачественных кондилом на слизистой половых органов или дыхательных путей.

HPV типов 16 и 18 вызывают эпителиальную дисплазию слизистой половых органов и ассоциированы с большинством преинвазивных и инвазивных карцином шейки, влагалища, вульвы и анального канала. HPV 6 и HPV 11 являются факторами, вызывающими более 90% всех кондилом (генитальные бородавки) и папиллом гортани. Наиболее часто встречаемым субтипом HPV типа 6 является HPV 6а.

Иммунологическими исследованиями на животных показано, что образование нейтрализующих антител к папилломавирусным антигенам предотвращает инфекцию гомологичным вирусом. Созданию эффективных папилломавирусных вакцин препятствовали затруднения, связанные с проведением культивирования папилломавирусов in vitro. Созданию эффективной HPV - вакцины особенно препятствовало отсутствие подходящей животной модели.

Нейтрализация папилломавирусов антителами осуществляется тип-специфически и зависит от конформации эпитопов на поверхности вируса.

Папилломавирусы - это маленькие (50-60 нм) вирусы, содержащие безоболочечную икосаэдрическую ДНК, которая кодирует до восьми ранних и два поздних гена. Открытые рамки считывания (ORFs) вирусных геномов обозначены Е1-Е7 и L1 и L2, где Е означает ранний, а L - поздний ген. Гены L1 и L2 кодируют белки капсида вируса. Ранние (Е) гены ассоциированы с такими функциями, как репликация вируса и клеточная трансформация.

Белок L1 является главным капсидным белком с молекулярным весом 55-60 кД. Белок L2 является минорным капсидным белком с предсказанным молекулярным весом 55-60 кД и уточненным, с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, молекулярным весом, равным 75-100 кД. Иммунологические данные свидетельствуют, что белок L2 является внутренним по отношению к белку L1. У разных папилломавирусов L2-белки высококонсервативны, особенно 10 основных аминокислот на С-конце. У разных папилломавирусов ORF L1 высококонсервативна.

Гены Ll и L2 использовали для производства вакцин, предотвращающих и лечащих папилломавирусную инфекцию у животных. Zhou et al. (1991; 1992) клонировали гены L1 и L2 HPV типа 16 в векторе вируса коровьей оспы и заражали клетки СV-1 млекопитающих рекомбинантным вектором для получения вирусоподобных частиц (VLP).

С помощью рекомбинантных бактериальных папилломавирусов получили белки L1 и L2. Нейтрализующая сыворотка к рекомбинантным бактериальным белкам, перекрестно реагировала с нативным вирусом на низком уровне, что преимущественно связано с различиями в конформации белков, нативного и полученного с помощью бактерий.

Рекомбинантные бакуловирусы, экспрессирующие ОRFs белка L1 НРV 6, HPV 11, HPV 1, HPV 18, HPV 31 или белка L2 НРV 16, использовали для инфицирования SF9-клеток насекомых и получения белков L1 и L2. С помощью вестерн-блот-анализа показали, что белки L1 и L2, продуцируемые бакуловирусом, реагируют с антителами к НРV типа 16. Бакуловирус, продуцирующий белок L1, образует VLPS.

Carter et al. (1991) показали, что рекомбинантные штаммы Saccharomyces cerevisiae продуцируют белок L1 HPV типа 16 и белок L2 HPV типа 16.

Carter et al. продемонстрировали также получение белков L1 и L2 HPV типа 6b. Белок Ll HPV 6b не является полноразмерным белком L1. Рекомбинантные белки получали в виде секретируемых и в виде внутриклеточных продуктов. Рекомбинантные белки L1 и L2 были сходны с нативными белками по молекулярным весам. Было обнаружено, что когда белки экспрессировались внутриклеточно, главный белок оказывался нерастворим при лизисе клеток, в отсутствие денатурирующих агентов. Хотя нерастворимость может содействовать очистке белка, она может препятствовать анализу нативных эпитопов белка.

Было показано, что рекомбинантные белки, секретируемые дрожжами, содержат углеводы, синтезируемые дрожжами. Присутствие этих N-связанных олигосахаридов может маскировать нативные эпитопы. Кроме того, рекомбинантные белки могут иметь другие модификации, такие как удерживание секреторной лидерной последовательности.

Было бы полезно разработать способы получения больших количеств папилломавирусных белков любого вида и типа в результате культивирования рекомбинантных дрожжей. Было бы полезно получать большие количества папилломавирусных белков, обладающих свойствами природных белков, придающих иммунитет, таких как конформация природного белка.

Настоящее изобретение касается получения рекомбинантных папилломавирусных белков, обладающих свойствами природных папилломавирусных белков и иммунитетом, также как и способов их получения и использования. Настоящее изобретение относится прежде всего к получению профилактической и, возможно, терапевтической вакцины от папилломавирусной инфекции. Рекомбинантные белки настоящего изобретения способны производить вирусоподобные частицы. Эти VLP иммуногенны и предотвращают образование бородавок на модельных животных. В настоящем изобретении использовали папилломавирусы (CRPV) американского жесткошерстного кролика и HPV типа 6 (субтип 6а) в качестве модельных систем.

Краткое изложение существа изобретения Разработаны рекомбинантные экспрессионные векторы, кодирующие папилломавирусные белки L1 и L2, способы создания рекомбинантных белков и способы использования рекомбинантных белков.

Краткое описание чертежей Фигура 1 представляет двунаправленный экспрессионный вектор дрожжей, использованный для экспрессии капсидных белков L1 и/или L2 папилломавируса.

Фигура 2 (A и В) представляет экспрессию L1 HPV типа 6а у дрожжей (иммуноблот).

Фигура 3 представляет экспрессию L2 HPV типа 6b у дрожжей. Иммуноблот экспрессированного в дрожжах белка L2 HPV типа 6а: дорожка 1, маркеры молекулярного веса; дорожка 2, слитой белок trpE-L2, экспрессированный в Е.coli в качестве положительного контроля; дорожка 4, белок L1 HPV типа 6а, экспрессированный в дрожжах в качестве негативного контроля; дорожка 5, белок L2 HPV типа 6а, экспрессированный в дрожжах (детали эксперимента смотрите в тексте).

Фигура 4 представляет электронную микрофотографию VLPs белка L2 HPV типа 6а, экспрессированного в дрожжах.

Фигура 5 представляет электронную микрофотографию VLPs белков Ll/L2 HPV 6а, экспрессированных в дрожжах.

Фигура 6 представляет иммуноблот белков L1 и L2 CRPV и белков L1+L2, экспрессированных в дрожжах. Панель (А): экспрессия белка L1 CRPV измерена по реакции с анти-СRРV L1-антисывороткой. Панель (В): экспрессия белка L2 CRPV измерена по реакции с анти-СRРV L2-анти-сывороткой. Дорожка 1, маркеры молекулярных весов в кД (Маркеры Amersham Rainbow, 14300-200000 дальтон), дорожка 2, штамм ВJ5462, содержащий экспрессионный вектор белка L2 CRPV, дорожка 3, штамм 1569, содержащий экспрессионный вектор белка L2 CRPV, дорожки 4 и 5, два изолята штамма 1569, котрансформированного двумя плазмидами для экспрессии белка L1 CRPV и белка L2 СRРV, дорожки 6-8, три изолята штамма 1569, содержащего единственный вектор для коэкспрессии белков L1 и L2 CRPV; дорожки 9 и 10, два изолята штамма BJ 5462, содержащего единственный вектор для коэкспрессии белков L1 и L2 СRРV. Местоположение миграции белков L1 и L2 отмечено на правой оси соответствующей панели.

Фигура 7 дает схематическое изображение конструирования штамма 1558 S. cerevisiae.

Фигура 8 дает схематическое изображение конструирования штамма 1569 S. cerevisiae.

Фигура 9 представляет основные этапы методики выделения очисткой.

Фигура 10 представляет перечень штаммов.

Фигура 11 отражает объем проанализированных в SDS/ПАГ-электрофорезе, выделенных очисткой из дрожжей белков L1+L2 HPV типа 16. Кроме конечного очищенного продукта VLP, показаны результаты выделения на промежуточных этапах. Таблица позволяет идентифицировать образец на каждой дорожке. Представлены результаты окрашивания геля коллоидальным Кумасси и Вестерн-блот с антисывороткой к белкам L1 и L2.

Фигура 12 представляет альтернативную схему процесса выделения очисткой белка L1 папилломавируса американского жесткошерстного кролика.

Фигуры 13 и 14 представляют результаты анализа очищенного препарата VLP в SDS/ПАГ-электрофорезе.

Подробное описание изобретения Разработаны способы, препараты и процедуры по предотвращению, характеристике, обнаружению и лечению папилломавирусной (PV) инфекции. Способы основаны на получении в дрожжах рекомбинантного белка L1 или рекомбинантного белка L2 или рекомбинантных белков L1 и L2. Рекомбинантные белки обладают способностью имитировать конформационную нейтрализацию эпитопов природного PV. Рекомбинантные белки L1 или L1 и L2 способны также образовывать вирусоподобные частицы (VLP). Препараты настоящего изобретения включают, но не ограничены ими, рекомбинантные молекулы ДНК, кодирующие белки L1 или L2 или L1 и L2, рекомбинантные белки либо отдельно, либо в комбинации с другими рекомбинантными белками, VLP, включающие в себя не менее одного рекомбинантного белка, фрагменты рекомбинантных белков, фармацевтические препараты, включающие в себя рекомбинантные белки, препараты вакцин, включающие в себя рекомбинантные белки, антитела к рекомбинантным белкам или VLP, иммуногенные препараты, включающие в себя не менее одного рекомбинантного белка, и диагностические комплекты, включающие в себя рекомбинантные молекулы ДНК или рекомбинантные белки. Способы настоящего изобретения включают, но не ограничены ими, способ получения рекомбинантного белка, включающего в себя трансформацию соответствующей дрожжевой клетки-хозяина с рекомбинантной молекулой ДНК, культивирование трансформированных дрожжей в условиях, которые позволяют экспрессировать ДНК, кодирующую рекомбинантный белок и выделять рекомбинантный белок. Способы настоящего изобретения включают также введение рекомбинантного белка, препаратов рекомбинантного белка или VLP животным, включая человека, но не ограничены им. Соответствующие клетки-хозяина включают, но не ограничены ими, штаммы дрожжей из родов Saccharomyces, Pichia, Kluvvermyces, Schizosaccharomyces и Hansenula.

Папилломавирусные инфекции наблюдаются у разных животных, включая человека, овец, собак, кошек, кроликов, обезьян, змей и коров. Папилломавирусы поражают эпителиальные клетки, обычно индуцируя на инфицированном участке образование доброкачественных эпителиальных и фиброэпителиальных опухолей.

Папилломавирусы могут быть классифицированы в отдельные группы по хозяину, которого они инфицируют. Папилломавирусы человека (HPV), в частности, классифицированы на основании данных о гомологии последовательности ДНК более чем в 60 типов (см. обзор "Папилломавирусы и рак у человека", Н. Pfister (ed), CRC Press, Inc., 1990). Типы папилломавирусов ведут себя как иммуногены, которые создавая иммунитет, нейтрализующий инфекцию папилломавирусов одного типа, не создают иммунитета против папилломавирусов другого типа.

У человека отличающиеся типы HPV вызывают разные заболевания. HPV типов 1, 2, 3, 4, 7, 10 и 26-29 вызывают у людей с нормальным или неблагополучным иммунитетом образование доброкачественных бородавок. HPV типов 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19-25, 36 и 46-50 вызывают у индивидуумов с неблагополучным иммунитетом патологию эпителия. HPV типов 6, 11, 34, 39, 41-44 и 51-55 вызывают образование незлокачественных кондилом на слизистых половых органов и дыхательных путей. HPV типов 16 и 18 вызывают эпителиальную дисплазию половых путей и ассоциированы с большинством преинвазивных и инвазивных карцином шейки, влагалища, вульвы и анального канала. HPV типа 6 и HPV типа 11 вызывают в большинстве случаев образование генитальных бородавок и папиллом гортани.

Иммунологическими исследованиями на животных показано, что образование нейтрализующих антител к белкам капсида папилломавирусов защищает от инфицирования гомологичным вирусом. Созданию эффективных папилломавирусных вакцин препятствовали затруднения, связанные с осуществлением культивирования папилломавирусов in vitro. Созданию эффективной HPV-вакцины особенно препятствовало отсутствие подходящей модели на животных.

Нейтрализация папилломавирусов антителами осуществляется тип-специфически и зависит от конформации эпитопов на поверхности вируса.

Папилломавирусы - это маленькие (50-60 нм) вирусы, содержащие безоболочечную икосаэдрическую ДНК, которая кодирует до восьми ранних и два поздних гена. Открытые рамки считывания(ORFs ) получили обозначения Е1-Е7 и L1 и L2, где Е означает ранний, а L - поздний ген. Гены L1 и L2 кодируют белки капсида вируса. Ранние (Е) гены ассоциированы с такими функциями, как репликация вирусов и трансформация. Белок L1 является главным белком капсида и имеет молекулярный вес 55-60 кД. Белок L2 является минорным белком капсида с предсказанным ранее молекулярным весом 55-60 кД и уточненным, с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, молекулярным весом 75-100 кД.

Было сообщено о получении рекомбинантных белков L1 НРV типа 16, L2 HPV типа 16b, L1 HPV типа 6 с помощью рекомбинантных штаммов Saccharomyces cerevisiae. Было бы полезно разработать способы получения больших количеств папилломавирусных белков любых видов и типа путем культивирования рекомбинантных дрожжей. Было бы полезно получать большие количества папилломавирусных белков, обладающих свойствами природных белков, придающими иммунитет, такими как конформация природного белка.

Настоящее изобретение касается получения рекомбинантных папилломавирусных белков, обладающих иммунитетом, придающим им свойства природных папилломавирусных белков, также как и способов по их получению и использованию. Настоящее изобретение относится прежде всего к получению профилактической вакцины от папилломавирусной инфекции. Настоящее изобретение иллюстрируется папилломавирусом американского жесткошерстного кролика (CRPV) и человеческим папилломавирусом типа 6 (HPV типа 6, или HPV 6) как модельными системами. Иллюстрация не ограничивается объемом изобретения, которое включает другие типы и субтипы папилломавирусов (PV), включая, но не ограничиваясь ими, тип 11 HPV, тип 16 HPV и тип 18 HPV, также как и субтип 6а HPV и субтип 6b HPV.

Фармацевтически полезный препарат, включающий в себя белки или VLP, может быть получен согласно известным способам, таким как примешивание фармацевтически переносимого носителя. Примеры таких носителей и способы их использования можно найти в Фармацевтических науках Ремингтона. Для образования фармацевтически переносимого препарата, пригодного для эффективного применения, такие препараты должны содержать достаточное количество белка или VLP. Такие препараты могут содержать белки или VLP, выделенные из более чем одного типа HPV.

Терапевтические или диагностические препараты настоящего изобретения вводили индивидуумам, инфицированным PV, в количествах, достаточных для лечения или диагностики. Эффективное количество может изменяться в соответствии с разнообразными факторами, такими как состояние индивидуума, его вес, пол и возраст. Другие факторы охватывают режим введения. Обычно препараты должны вводиться в дозах, колеблющихся от 1 до 250 мкг.

Фармацевтические препараты можно разрабатывать для индивидуального применения с использованием разнообразных способов введения, таких как подкожный, местный, пероральный, через слизистую и внутримышечный.

Вакцины настоящего изобретения включают в себя рекомбинантные белки или VLP, которые содержат антигенные детерминанты, необходимые для стимуляции образования нейтрализующих антител у хозяина. Такие вакцины достаточно безопасны для введения, без риска клинического инфицирования, не проявляют побочных токсических эффектов, могут быть введены эффективным способом, стабильны и обладают совместимостью с носителями для вакцин.

Вакцины можно вводить с помощью разнообразных способов, например перорально, парэнтерально, подкожно, через слизистую или внутримышечно. Вводимую дозу можно варьировать в зависимости от состояния индивидуума, его веса, пола и возраста; способа применения и типа PV-вакцины. Вакцину можно использовать в таких лекарственных формах, как капсулы, суспензии, эликсиры или жидкости. Вакцину можно приготовить с иммунологически приемлемым носителем.

Вакцины вводят в терапевтически эффективных количествах, т.е. в количествах, достаточных для получения защитного иммунного ответа. Терапевтически эффективное количество может изменяться в зависимости от типа PV. Вакцину можно вводить в виде однократной или многократной доз.

Способы, изложенные в настоящем изобретении, делают возможным готовить субвирусные вакцины для защиты от PV -инфекции. Согласно указанным способам можно создавать моновалентные или поливалентные PV-вакцины. Например, моновалентную вакцину HPV типа 16 можно создать с помощью рекомбинатных белков L1 или L2 или L1 и L2. Изготовить же поливалентную вакцину можно путем смешивания белков L1 или L2, или L1 и L2, или VLР от различных типов HPV.

Рекомбинантные белки и VLP настоящего изобретения можно использовать для приготовления иммуногенных препаратов. Такими препаратами, которые вводят в соответствующего хозяина, можно индуцировать у него иммунный ответ.

Рекомбинантные белки и VLP можно использовать для образования антител. Использованный здесь термин "антитело" охватывает поликлональные и моноклональные антитела, также как и их фрагменты, такие как Fv, Fab и F(ab)2-фрагменты, способные связывать антиген или гаптен.

Рекомбинантные белки, VLР и антитела настоящего изобретения можно использовать для серотипирования инфекции HPV и скринирования HPV. Рекомбинантные белки, VLP и антитела сами по себе пригодны для создания наборов по обнаружению и серотипированию HPV. Такой набор должен представлять собой изолированный несущий элемент, пригодный для удержания в ограниченном пространстве, как минимум, одного контейнера. Далее, несущий элемент должен содержать такие реагенты, как рекомбинантный белок HPV или VLP, или анти-HPV антитела, необходимые для обнаружения разных типов HPV. Несущий элемент должен также содержать средства для обнаружения таких веществ, как меченый антиген или ферментные субстраты и т.п.

Рекомбинантные белки и VLP настоящего изобретения пригодны также для использования в качестве маркеров молекулярного веса и размера молекул.

Нижеследующие примеры приводятся для дополнительного раскрытия существа изобретения, не ограничивая вместе с тем рамок изобретения спецификой этих примеров.

Пример 1 Получение штамма U9 дрожжей Штамм 2150-2-3 Saccharomyces cerevisiae (MATa, 1eu 2-04, ade1, cir) получен от Dr. Leland Hartwell (University of Washington, Seattle, WA). Клетки штамма 2150-2-3 размножили в течение ночи при 30^oС в 5 мл YEHD-среды (Carty et аl. , J. Ing. Micro, 2 (1987) 117-121). Клетки отмывали 3 раза стерильной дистиллированной водой, ресуспендировали в 2 мл стерильной дистиллированной воды и 0,1 мл суспензии клеток внесли в каждую из шести чашек, содержащих 5-фтороротовую кислоту (FOA), с целью отбора ura3-мутантов (Cold Spring Harbor Laboratory, Руководство по генетике дрожжей). Чашки инкубировали при 30^oС. Среда содержала на 250 мл дистиллированной воды: 3,5 г дрожжевого азотного основания Difco без аминокислот и сульфата аммония, 0,5 г 5-фтороротовой кислоты, 25 мг урацила и 10 г декстрозы.

Среду стерилизовали фильтрацией через 0,2 мкм мембранный фильтр и затем смешивали с 250 мл 4% бактоагара (Difco), выдержанного при 50^oС, 10 мл раствора аденина (1,2 мг/мл) и 5 мл раствора L - лейцина (180 мг/мл). Полученную таким образом среду разливали в чашки Петри по 20 мл.

После 5 дней инкубации появились многочисленные колонии. Одиночные колонии выделяли в результате перештрихования колоний с исходных FOA-чашек на свежие FОА-чашки, которые затем инкубировали при 30^oС. Ряд колоний из второго комплекта FОА-чашек тестировали на наличие ura3-мутации путем реплицирования колоний на YFHD-чашку и на чашку без урацила. Получили один изолят (U9), который обладал указанными свойствами. Его хранили замороженным про запас в глицерине (штамм 325) при -70^oС для последующего использования.

Пример 2 Приготовление вектора для разрыва гена MNN9 дрожжей С целью изготовления вектора для разрыва гена МNN9 необходимо было прежде всего клонировать ген MNN9 из геномной ДНК S. cerevisiae. Это достигали с помощью стандартной технологии полимеразной цепной реакции (ПЦР). 5'-смысловой праймер и 3'-антисмысловой праймер для ПЦР кодирующего последовательность полноразмерного гена МNN9, был разработан на основе опубликованной последовательности для гена МNN9 дрожжей (Zymogenetics: EPO Patent Application 88117834.7, Publication 0-314-096-A2). Использовали нижеследующие олигодезоксинуклеотидные праймеры, содержащие фланкирующие HindIII-сайты: Инициирующий метионин кодон гена МNN-9 светился на темном фоне. Проводили ПЦР, используя в качестве матрицы геномную ДНК штамма JRY 188 S. сerevisiae Таq-полимеразу ДНК (Perkin Elmer) и 25 циклов амплификации (94^oС 1 мин, 37^oС 2 мин, 72^oС 3 мин). Полученный ПЦР-фрагмент размером 1,2 т.п.н. разрушали рестриктазой HindIII, извлекали из геля и лигировали с плазмидой pUC13 (Pharmacia), расщепленной с помощью рестриктазы НindIII и обработанной щелочной фосфатазой. Полученную плазмиду обозначили р1183.

С целью отделить ген МNN9 от дрожжевого гена URA3, плазмиду pBR322-URA3 (которая содержала фрагмент Hind III, размером 1,1 т.п.н., кодирующий ген URA3 S. cerevisiae, субклонированный в Нind III - сайте рВR322) расщепляли рестриктазой Hind III и фрагмент ДНК размером 1,1 т.п.н., переносящий функциональный ген URA3, извлекали из геля, тупили концы с помощью Т4 ДНК-полимеразы и затем лигировали с плазмидой, расщепленной с помощью рестриктазы Pm 11 (Pm 11 разрезала последовательность, кодирующую ген MNN9). Полученная плазмида р1199 содержала ген MNN9, разорванный функциональным геном URA3.

Пример 3 Конструирование U9-производного штамма 1372, содержащего разорванный ген MNN9 Для разрыва гена MNN9 в штамме U9 ( 325) 30 мкг плазмиды р1199 расщепляли рестриктазой Hind III для создания линеаризированной разрывающей кассеты mnn 9:: URA3. Клетки штамма 325 трансформировали рестриктазой Hind III, расщепляющей ДНК плазмиды р1199 методом сферопластов (Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA & 5:1929-1933) и трансформанты отбирали на синтетической агаровой среде, не содержащей урацила и содержащей 1,0 М сорбитола. Синтетическая среда содержала в расчете на 1 литр дистиллированной воды: агара 20 г, дрожжевых азотноосновных (w/о) аминокислот 6,7 г, аденина 0,04 г, L-тирозина 0,05 г, сорбитола 182 г, глюкозы 20 г и безлейционового раствора # 2 10 мл. Не содержащий лейцина раствор # 2 содержал в расчете на 1 л дистиллированной воды: L-аргинина 2 г, L-гистидина 1 г; L-лейцина 6 г, L-изолейцина 6 г, L-лизина 4 г, L-метионина 1 г, L-фенилаланина 6 г, L-треонина 6 г, L-триптофана 4 г.

Чашки инкубировали при температуре 30^oС в течение пяти дней и на них появлялись многочисленные колонии. Из 10 колоний готовили препараты хромосомной ДНК и затем обрабатывали ее рестриктазами ЕсоR1 плюс Hind III. Затем обработанную ДНК оценивали Саузерн-блотом (J. Sambrook et аl., Молекулярное клонирование: Руководство для лабораторных работ, 2-е издание, Соlg Spring Harbor Laboratory Press, 1989), используя в качестве зонда фрагмент Hind III размером 1,2 т. п.н., несущий ген MNN 9 (изолированный из плазмиды р1199). Изолят идентифицировали (штамм # 1372) и показали ожидаемый сдвиг полосы ДНК в Саузерн-блоте, также как и чрезвычайную скученность, обычно проявляемую мутантами MNN5.

Пример 4 Конструирование гена для разрыва гена HIS5 дрожжей Чтобы сконструировать разорванную кассету, в которой ген HIS3 S. cerevisiae разорван геном URA3, плазмиду YЕрб (К. Struhl et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76:1035) расщепляли рестриктазой BаmHI. Фрагмент BamHI размером 1,7 т.п.н., несущий ген HIS3 извлекали из геля, тупили концы с помощью Т4 ДНК-полимеразы и лигировали с плазмидой pUC 18, которую предварительно расщепляли рестриктазой BamHI и обрабатывали Т4 ДНК-полимеразой. Результирующую плазмиду (обозначенную р1501 или pUC18-HIS3) расщепляли рестриктазой NheI (которая разрезала последовательность, кодирующую HIS3) и фрагмент вектора извлекали из геля, тупили концы ДНК-полимеразой фага Т4 и затем обрабатывали щелочной фосфатазой из телячьего кишечника. Ген URAS выделяли из плазмиды pBR322-URA3 в результате расщепления рестриктазой Hind III и фрагмент размером 1,1 т.п.н., несущий ген URA3, извлекали из геля, тупили концы ДНК-полимеразой и лигировали с вышеуказанным NheI-фрагментом pUC18-HIS3. Полученная плазмида (обозначенная pUC18-his3:: URA3 или р1505) содержала разорванную кассету, в которой ген HIS3 был разорван функциональным геном URA3.

Пример 5 Конструирование вектора для разрыва гена PRB1 дрожжей геном HIS3 Плазмида FP8 Н, несущая ген PRBl S. cerevisiae создана Dr. E. Jones из университета Карнеги-Меллон (С.М. Моеhle et аl., 1987, Genetics, 115:255-263). Ее расщепляли рестриктазами Нind III плюс XhoI и фрагмент ДНК размером 3,2 т.п.н., несущий ген PRBl, извлекали из геля, тупили концы обработкой Т4 ДНК-полимеразой. Плазмиду pUC18 расщепляли рестриктазой ВаmH1, извлекали из геля и тупили концы обработкой Т4 ДНК-полимеразой. Полученный фрагмент вектора лигировали с вышеуказанным фрагментом гена PRB1, чтобы получить плазмиду pUCl8-PRBl. Плазмиду YEр6, содержащую ген HIS3, расщепляли рестриктазой BamHI. Полученный фрагмент BamHI размером 1,7 т.п.н., несущий функциональный ген HIS3, извлекали из геля и затем тупили концы обработкой Т4 ДНК-полимеразой. Плазмиду pU C18-PRB1 расщепляли смесью рестриктаз EcoRV и NcoI, которые разрезали последовательность, кодирующую ген РRВ1, а протеазой В удаляли активный сайт и фланкирующую последовательность. EccRV-NcoI-фрагмент, несущий остатки 5' и 3'-частей гена PRBl, кодирующего последовательность в pUC18, извлекали из геля, тупили концы путем обработки Т4 ДНК-полимеразой, дефосфорилировали щелочной фосфатазой из кишечника теленка и лигировали с представленным выше затупленным фрагментом HIS3. Результирующая плазмида (обозначенная pUC18-prbl: : HIS3, штамм 1245) содержала функциональный ген HIS3, в месте расположения части гена РRВ1, который ранее был делетирован.

Пример 6 Конструирование U9-связанного штамма дрожжей, содержащего разрывы генов MNN9 и РRВ1 U9 - связанный штамм 1372, который содержит разорванный ген MNN9, представлен в примере 3. Выделенные клоны штамма 1372 пассировали на FОА-чашки для отбора ura3-мутантов. Получили ряд ura3-изолятов штамма 1372 и один из них (штамм 12930-190-S1-1) для последующего разрыва геном HIS3. Вектор (р1505) pUC18-his3:: URA3, разорванный геном, обрабатывали смесью рестриктаз для образования линеаризованной разорванной кассеты his3::URA3 и использовали для трансформации штамма 12930-190-S1-l ацетатно-литиевым методом (Методы энзимологии, 194:290, 1991). Ura + трансформанты отбирали на синтетической агаровой среде без урацила, повторно штриховали клоновые изоляты на той же среде и затем получали реплику на среде без урацила или без гистадина для скринирования изолятов Ura+ и His+. Отобрали один из них (штамм 12930-230-1) для последующего разрыва геном РRВ1. Вектор (pUC18-prb1:: HS13, штамм # l245), разорванный геном РRВ1, обрабатывали смесью рестриктаз SacI и XbaI для получения линеаризованной разорванной кассеты рrb1:: HIS3 и использовали для трансформации штамма 12930-230-1 ацетатно-литиевым методом. His+ трансформанты отбирали на агаровой среде без гистидина и штриховали на той же среде для клонирования изолятов. Из ряда полученных His+ изолятов выделяли геномную ДНК, расщепляли ее рестриктазой ЕсоRI и подвергали электрофорезу в 0,8% агарозном геле. Затем проводили Саузерн-блот анализ, используя меченый зонд размером 617 п. н. для гена PRB1, который был приготовлен с помощью ПЦР с применением нижеследующих праймеров: 5' ТGG ТСА ТСС САА АТС ТТG ААА 3' (SEQ ID NO:3) 5' САС СGТ АGТ GTT ТGG ААG CGA 3' (SEQ ID NО:4) Получили девять изолятов, которые показали ожидаемую гибридизацию зонда с prbl: : HIS3 - фрагментом ДНК размером 2,44 т.п.н. Это контрастировало с гибридизацией зонда с фрагментом PBBl-гена дикого типа размером 1,59 т.п.н. Один из этих изолятов, содержащий желаемый разрыв prb1::HIS3, отобрали для дальнейшего использования и обозначили как штамм #1558.

Пример 7 Конструирование вектора для разрыва гена РЕР4 дрожжей Ген РЕР4 S. cerevisiae, клонировали из геномной библиотеки дрожжей следующим образом. Клетки Е. соli, содержащие геномную библиотеку дрожжей pLS101 (Schultz and Friesen, 1983, J. Bacteriol., 155:8-14) размножали в 5 мл LB-среды, содержащей 100 мкг/мл ампициллина. Эту культуру с разведением 10^-4 и 10^-5 помещали на чашках с LB-средой и ампициллином. Колонии извлекали из чашек, используя нитроцеллюлозные фильтры. Зонд размером 600 п.н. для дрожжевого гена РЕР4 готовили с помощью ПЦР, используя Таq-ДНК-полимеразу, тотальную плазмидную ДНК из библиотеки pLS 101 дрожжей и нижеприведенные олигодезоксинуклеотидные праймеры, обозначенные на основании опубликованной последовательности ДНК гена РЕР4 (С.A. Woolford et al., Mol. Cell Biol., 6: 2500 (1986)).

Смысловой праймер: 5'-GAG GCT ACC АGC GAG CCG GGC-3' (SEQ ID NO:5) Антисмысловой праймер: 5'- GGC CAC TCG GCC AAC AGG TTC-3' (SEQ ID NO:6) Проводили ПЦР с 25 циклами амплификации (94^oС 1 мин, 37^oС 2 мин, 72^oС 3 мин). ПЦР-пробу извлекали из геля, метили и гибридизовали с вышеуказанными колониями на фильтрах. Несколько колоний были позитивными по гибридизации с пробой РЕР4 и их повторно штриховали на чашках, содержащих LB-среду с ампициллином, для получения одиночных колоний. Плазмидную ДНК выделяли путем лизиса щелочным SDS (Sambrook et al., как указано выше) из нескольких изолятов и расщепляли рестриктазой ВаmHI. Наблюдали ожидаемую полосу вектора размером 14 т. п. н. и инсерционную полосу РЕР4 размером 6,9 т.п.н. При двойном расщеплении смесью рестриктаз EcoRl и ХhoI получали ожидаемую полосу размером 1,5 т. п.н. для гена РЕР4. Один из изолятов, показавший ожидаемый результат, отобрали для дальнейшего использования. Плазмидную ДНК из штамма 860 расщепляли рестриктазой ВаmHI и ВаmHI-фрагмент ДНК размером 6,9 т.п.н., несущий хромосомный ген РЕР4, субклонировали в ВаmHI-сайте pUC13 для создания плазмиды р890. Плазмиду р890 затем расщепляли рестриктазой NсоI (которая разрезала последовательность, кодирующую ген РЕР4), извлекали из геля, тупили концы в результате обработки Т4 ДНК-полимеразой и лигировали с затупленными концами фрагмента размером 1,1 т.п.н., несущим функциональный ген URA3 (приготовленный, как в примере 2). Полученную плазмиду, содержащую ген РЕР4, разорванную геном URA3, обозначили pUC13-pep4:: URA3 (штамм #906).

Пример 8 Конструирование дрожжевого штамма #1569, который является производным штамма U9, содержащего мутации prb1 и рер4.

С целью разрыва геном HIS3 в штамме U9, разорванный вектор pUCl8-his3:: URA3 расщепляли смесью рестриктаз EcoRI и XbаI и затем использовали для трансформации штамма U9 с помощью ацетатно-литиевого метода. Ura+ трансформанты отбирали на агаровой среде без урацила и клонировали на той же среде повторным штрихованием. Ряд полученных Ura+ изолятов реплицировали затем на агаровую среду, не содержащую урацила или гистидина, и скринировали на наличие мутантов Ura+ и His-. Один из мутантов (штамм #1524) отбирали для последующего разрывания геном PRB1. Вектор pUC18-prb1:: HIS3, разорванный геном PRBl, расщепляли смесью рестриктаз SacI и XbaI и затем использовали для трансформации штамма # 1524 с помощью ацетатно-литиевого метода. His+ трансформанты отбирали на агаровой среде, не содержащей гистидина, и клонировали изоляты на той же среде повторным штрихованием. Геномную ДНК выделяли из ряда His+ изолятов и оценивали с помощью гибридизации Саузерн-блот с меченым зондом РRB1. Один из изолятов, обнаруживающий желаемый отрыв PRpl-гена HIS3-геном (т. е. prbl: : НIS3) был отобран для последующего разрыва геном РЕР4. Штамм #1537 пассировали на FOA-чашки с целью получения urа3-изолятов и один из них (штамм #1541) отобрали для дальнейшего использования.

Для получения разрыва геном РЕР4 в штамме #1541, вектор рuc13-рер4:: URA3, разорванный геном РЕР4, обрабатывали рестриктазой XhoI, для получения линеаризованной разорванной кассеты рер4:: URA3, и использовали для трансформации штамма # 1541 с помощью ацетатно-литиевого метода. Ura+ трансформанты отбирали на агаровой среде, не содержащей урацила, и клоновые изоляты пересевали на ту же среду повторным штрихованием. Геномную ДНК выделяли из нескольких Ura+ трансформантов и оценивали Саузерн-блотом, используя меченый зонд для гена РЕР4. Один из изолятов (штамм #1569), обнаруживающий желаемый отрыв гена РЕР4 геном URA3 отобрали для последующего использования.

Пример 9 Конструирование экспрессионного вектора CRPV L1 Ген L1 вируса CRPV амплифицировали с помощью ПЦР из плазмиды pLA 11, содержащей полный вирусный геном CRPV (Dr. Peter Howley, NCI), используя Vent - полимеразу (Ntw Еngland Biolabs, Inc.), 35 циклов амплификации (94^oС 1 мин, 50^oС 1 мин, 72^oС 2 мин) и нижеследующие олигонуклеотидные праймеры, которые содержали фланкирующие Bgl II - сайты (подчеркнуты): Смысловой праймер интродуцирует дрожжевую нетранслируемую лидерную последовательность выше инициирующего метионин кодона гена L1 вируса CRPV (высвечивал на темном фоне). Продукт ПЦР гена L1 обрабатывали рестриктазой Вg1 II, извлекали из геля и субклонировали в Bg1 II-сайта вектора pSP 72 (Promega) для создания плазмиды pSP72-CRPV-L1 (pl2930-314-4-l). Один из субклонов полностью секвенировали и обнаружили разницу с опубликованной последовательностью CRPV L1 по 4 нуклеотидам. Данные замены не приводили к аминокислотным заменам. Ген L1 вырезали из плазмиды pSP 72-CRPV-L1 в виде Bg1 II-фрагмента и субклонировали в уникальном BamHi-сайте, расположенном между GAL10-промотором дрожжей и АDH1 - терминаторе транскрипции в дрожжевом экспрессионном векторе pC1/1-GAL10p-ADH1t, содержащем GAL10-промотор из YЕр52 (Broach еt al., Exp. Manipulation of Gene Expression, 1983, 83:81-116) и АDН1-терминатор транскрипции в остове вектора pCl/1). Созданную плазмиду обозначили р12930-323-6-1.

Пример 10 Конструирование экспрессионного вектора CRPV L2 Ген L2 вируса CRPV амплифицировали ПЦР, используя Vent-полимеразу (New England Biolabs, Inc. ) из плазмиды pLAII после расщепления плазмиды рестриктазой Sa1I, гель для выделения фрагмента размером 7,9 т.п.н. и лигировали его с самим собой. Проводили амплификацию из тридцати пяти циклов (90^oС 1 мин, 50^oС 1 мин, 72^oС 2 мин) и использовали олигонуклеотидные праймеры, содержащие фланкирующие ЕсоRI-сайты (подчеркнуты): Смысловой праймер интродуцирует дрожжевую нетранслируемую лидерную последовательность выше инициирующего метионин кодона гена L1 вируса CRPV (высвечивает на темном фоне). Продукт ПЦР размером 1,5 т.п.н. извлекали из геля и субклонировали в EcoRI-сайте двунаправленного промоторного вектора pUC18-GAL10p, содержащего дивергентный дрожжевой GAL1/GAL10-промотор. Этот вектор содержит уникальный BamHI-сайт между GAL1-промотором и первой копией ADН1-терминатора транскрипции, уникальные ЕсоRI- и SmаI-сайты, расположенные между GAL10-промотором и второй копией АDН1-транскрипционного терминатора. Созданная экспрессионная кассета несет SphI - фрагмент размером 1,4 т.п.н. Один из клонов (р12930-295-2-2), содержащий желаемую вставку L2, примыкающую к GAL10-промотору, полностью секвенировали и обнаружили, что он содержит 6