Косметическая композиция, содержащая соединение с активностью, стимулирующей продуцирование интерлейкина-6

Косметическая композиция, содержащая соединение с активностью, стимулирующей продуцирование интерлейкина-6

Реферат

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к биомолекулярной косметике. Сущность способа состоит в том, что разработана косметическая композиция, содержащая, по крайней мере, одно соединение с активностью, стимулирующей продуцирование ИЛ-6 кератиноцитами, и эксципиенты, пригодные для косметических препаратов. Технический результат изобретения состоит в расширении арсенала косметических средств на основе иммуномодулирующих препаратов. 5 c. и 6 з.п.ф-лы.

Настоящее изобретение относится к косметической композиции, содержащей активное соединение, способное стимулировать in vivo продуцирование интерлейкина-6 (ИЛ-6) кератиноцитами человека.

В широком ряду цитокинов, продуцируемых клетками, особый интерес для использования в косметологии представляет собой специфическое стимулирование синтеза ИЛ-6. Помимо его активирующего действия на клеточный и гуморальный иммунитет ИЛ-6 принимает активное участие в механизмах регенерации эпидермиса. In vitro ИЛ-6 стимулирует синтез коллагена, равно как и пролиферацию кератиноцитов и фибробластов. In vivo у трансгенных мышей со сверхпродукцией ИЛ-6 в коже наблюдается утолщение ороговевшего слоя. Такое увеличение поверхностного слоя эпидермиса происходит без провоспалительного проявления, и предполагается, что оно отражает улучшение в защите кожи против локальных повреждений. Эта совокупность данных, почерпнутых из литературы, указывает на то, что ИЛ-6 способствует восстановлению повреждений, наносимых эпидермису, и замедляет старение кожи.

В качестве ссылок можно привести: К. Yoshisaki et al., Cytokine, 1990, 2, 381-387; R. M. Grossman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6367-6371; Kirbauer et al., J. Immunol., 1989, 142, 1922-1928; К. Turken et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 5068-5072; J. Taylor-Papadimetriou et al., Cell. Differ., 1982, 11, 169-180; L. Arden et al., Limphokines, 1985, 10, 175-182. Хорошо известно, что при старении кожи, во-первых, в эпидермисе ороговевший слой утолщается, но понижается эпидермопоэз и изменяется клеточное сцепление при базальной мембране. Следовательно, для того чтобы защитить кожу от старения, важно обеспечить ее активным агентом, способным стимулировать пролиферацию кератиноцитов с тем, чтобы вызвать утолщение эпидермиса. Во-вторых, в дерме активность клеток, ответственных за конструирование дермальной архитектуры, фибробластов, в значительной мере понижается, следствием чего является уменьшение синтеза коллагена, эластина и гликозаминогликана. Параллельно с этим к ускоренной деградации существующих дермальных волокон приводят эффекты воздействия света (актиническое старение). Эта совокупность эффектов приводит к разупорядочиванию дермальной структуры, которое лишает кожу ее механических свойств, таких как эластичность, прочность и тонус, и тем самым способствует появлению морщин.

Следовательно, для того чтобы противостоять эффектам старения, важно обеспечить кожу активным агентом, который будет стимулировать фибробласты и помогать им восстанавливать их окружение. Чтобы оказаться полезным, этот эффект не должен параллельно сопровождаться увеличением ферментативной активности деградации волокон, в частности активности коллагеназы. Одновременно это не должно изменять естественных функций кожи.

Установлено, что компоненты или экстракты, способные стимулировать продуцирование ИЛ-6 кератиноцитами человека in vivo, составляют "активные агенты", которые могут быть использованы для приготовления косметических композиций; в частности установлено, что косметические композиции, содержащие соединение, способное стимулировать продуцирование ИЛ-6 кератиноцитами человека in vivo, может быть использовано для реорганизации ткани кожи, без вмешательства, однако, при этом в ее природные функции. Показано, что соединения с активностью, стимулирующей ИЛ-6 через кератиноциты человека, называемые здесь далее "активными агентами", способны индуцировать воздействие per se на стимуляцию пролиферации кератиноцитов (аутокринное действие ИЛ-6 на кератиноциты, которое описано в литературе).

Кроме того, показано, что соединения с активностью, стимулирующей ИЛ-6 через кератиноциты человека, способны индуцировать посредством их воздействия на фибробласт увеличение тонуса дермального окружения этой клетки. Эти соединения даже индуцируют небольшое увеличение количества коллагеновых волокон без усиления коллагеназной активности.

Таким образом, первым объектом настоящего изобретения является косметическая композиция, содержащая соединение, которое способно стимулировать продуцирование интерлейкина-6 кератиноцитами человека in vivo, смешанное с косметическим эксципиентом.

Содержащееся в этой косметической композиции соединение с активностью, стимулирующей продуцирование ИЛ-6, или активный агент, может быть соединением непептидной природы, пептидом, экстрактом клеток или тканей растительного происхождения, либо продуктом, полученным в результате ферментации микроорганизма, например бактерии или гриба и в особенности дрожжей.

Свойства штамма SEBR 2002 будут описаны ниже вместе со способом получения экстракта с активностью, стимулирующей продуцирование интерлейкина-6 кератиноцитами.

Штамм Выделение Организмом, который продуцирует экстракты с активностью, стимулирующей продуцирование ИЛ-6 кератиноцитами человека, в соответствии с этим конкретным аспектом данного изобретения является штамм дрожжей, выделенный из образца воды с месторождения нефти, взятого с участка нефтяного бурения в Лойрете (Loiret, Франция), которому присвоен внутренний номер SEBR 2002. Образец этого микроорганизма депонирован 11 февраля 1997 года в Национальной коллекции культур микроорганизмов Пастеровского института (C.N.C.M.), где он зарегистрирован под номером I 1844.

Биохимические свойства этого микроорганизма определены на API 50 СН рядах (специфичных для сахаров), которые поставляются BioMerieux, и с помощью YT-биологического теста (специфичного для дрожжей; поставляется Biolog Inc. USA). В результате установлено, что этот микроорганизм принадлежит семейству Basidiomycetes, род Rhodotorula.

Он представляет собой полиморфные мезофильные дрожжи. Он хорошо развивается при 28^oС на культуральной среде YPG (дрожжевой пептон-глюкоза-агар); расцветка колоний оранжево-розовая.

Этот организм демонстрирует свойства, которые дают возможность отнести его к виду minuta.

Этот дрожжевой штамм Rhodotorula sp, который депонирован в Национальной коллекции культур микроорганизмов (C. N.C.M.) Пастеровского института под номером I 1844, и его мутанты-продуценты также составляют объект настоящего изобретения.

Выделение этого нового штамма осуществлено с использованием традиционного способа, который заключается в разбавлении образца небольшим количеством воды до различных концентраций и рассевании небольшого объема каждого разведения на поверхности чашки Петри, содержащей питательную агаровую среду. После нескольких дней инкубации при 28^oС, которые дают возможность микроорганизму развиться, индивидуально отбирают различные колонии и пересевают на питательные агары для получения обогащенных культур.

После культивирования на питательной агаровой среде и нескольких последующих пересевов, которые дают возможность получить обогащенную и чистую культуру представляющего интерес штамма, получают партию 0 исходного штамма и затем партии первичного и вторичного посевов для консервации.

Для этого готовят дрожжевую суспензию, исходя из культуры на питательной агаровой среде на чашках Петри и используя среду для восстановления; эта среда содержит криопротектор для обеспечения хорошей жизнеспособности микроорганизма во время консервации замораживанием.

Полученную дрожжевую суспензию распределяют по криопробиркам, которые консервируют при -80^oС: эти пробирки составляет партию 0.

Следуя этому же протоколу, но начиная с пробирки из партии 0, готовят партию первичного посева.

Далее, по-прежнему в соответствии с тем же протоколом, готовят партию вторичного посева, начиная с криопробирки из партии первичного посева.

Получение посевных партий 0, 1 и 2 обеспечивает длительный доступ к штамму и, таким образом, к желаемой активности.

Способ Способ получения экстрактов с активностью, стимулирующей продуцирование ИЛ-6 кератиноцитами человека, заключается в культивировании этого нового штамма I 1844 или его мутантов-продуцентов на подходящей среде и в подходящих условиях культивирования и далее в экстрагировании активной фракции.

Активная фракция может находиться в биомассе или в супернатанте.

Ферментация Культивирование штамма I 1844 может быть осуществлено любым способом аэробного культивирования. Для этого применяют различные типы оборудования, обычно используемого для промышленной ферментации. В частности для проведения данных процедур может быть выбран приведенный далее подход.

Культивирование в колбах Используя партию вторичного посева, которой засевают чашки Петри и инкубируют в течение двух-трех дней, получают дрожжевую суспензию, которую используют для засевания встряхиваемых колб Эрленмейера, содержащих подходящую среду. Встряхиваемую колбу также можно непосредственно засеять материалом из пробирки с посевной партией. Культивирование во встряхиваемых колбах может протекать от одного до трех дней.

За продуцированием активности следят посредством экстрагирования органическими растворителями биомассы, полученной фильтрованием или центрифугированием.

Прямо с первой стадии культивирования в колбах выгодным может быть проведение двух последующих стадий культивирования: первой стадии для увеличения числа клеток и наращивания биомассы, второй - для продуцирования. В этом последнем случае для первой стадии достаточной является продолжительность от одного до двух дней.

Активность стимуляции продуцирования ИЛ-6 кератиноцитами человека, которая содержится в экстрактах биомассы культур, выражают в виде индекса или фактора стимуляции, обозначенного как ИС_ИЛ-6 (ИС), который рассчитывают, составляя отношение количеств ИЛ-6, продуцируемого путем индукции экстрактами, к измеренной базисной величине (без индукции): Экстракт биомассы считают активным, если при анализе при 1%-ной конечной концентрации относительно сухого экстракта на SVK 14 кератиноцитах он дает величину ИС в интервале от 1,2 до 6, предпочтительно от 1,5 до 4,5.

Из одного литра культуры возможно получение приблизительно от 10 до 50 мл экстракта, имеющего индекс стимуляции между 1,5 и 4,5 для 100-кратного разведения (1/100).

Желаемая активность может быть получена путем экстрагирования биомассы культур в колбах, но для того, чтобы получить желаемую активность в большем количестве, выгодным является получение культуры в ферментаторе и затем экстракция ее биомассы.

Культивирование в ферментаторе Ферментатор засевают 1-2-дневной культурой из встряхиваемых колб; предпочтительно, чтобы культура еще находилась в экспоненциальной фазе.

В ферментаторе в зависимости от используемых условий культивирования активность можно наблюдать сразу с первых часов культивирования, однако выгоднее дождаться достижения стационарной фазы роста, прежде чем приступать к экстракции. Культивирование I 1844 в ферментаторе делает возможным осуществление лучшего контроля описанных ниже условий культивирования, например контроля рН и аэрации.

Стимулирующая активность через кератиноциты, получаемая в ферментаторе, может изменяться в зависимости от используемых условий культивирования. Из одного литра культуры после экстракции биомассы возможно получение приблизительно 50 мл экстракта со значением ИС между 1,5 и 4,5 для 100-кратного разведения (1/100).

Условия культивирования Среда для культивирования, используемая в ферментационном способе, должна содержать по меньшей мере один источник углерода, который может быть ассимилирован, один источник азота, который может быть ассимилирован, и минеральные элементы. В качестве источников углерода, которые могут быть ассимилированы, могут быть использованы, например, углеводы, такие как глюкоза, манноза, мальтоза, декстрины, глицерин, аминокислоты и белки.

В качестве источников углерода, которые могут быть ассимилированы, также могут быть использованы уксусная, субериновая, лимонная, пропионовая, янтарная и 2-кетоглутаровая кислоты, либо животные или растительные масла.

Наилучшие источники азота, которые могут быть ассимилированы, следует искать среди белков, пептонов и аминокислот. Эти источники представляют собой, например, казеин, лактальбумин и клейковину, а также их гидролизаты, рыбную муку, дрожжевые экстракты или пептоны.

Продуцирование биомассы может быть увеличено путем добавления во время культивирования одного или другого из этих двух основных субстратов.

Среди минеральных элементов, добавляемых в культуральную среду для обеспечения роста микроорганизма и оптимизации ассимиляции источников углерода и азота клетками микроорганизма, следует упомянуть соли калия, натрия, железа, магния, кальция или марганца, равно как и соединения фосфора, такие как фосфаты, а также микроэлементы.

Культуру перемешивают и аэрируют в течение 10-60 часов, что позволяет получать благоприятные результаты.

Предпочтительно рН культуральной среды поддерживают в слабокислой области, а оптимальная температура инкубации лежит между 23 и 38^oС, предпочтительный интервал составляет 25-33^oС.

Такие условия культивирования, как состав и рН среды, температура инкубации, скорость перемешивания и аэрация во время ферментации, могут изменяться в широких пределах и выбираются таким образом, чтобы получить наилучшие возможные результаты.

Экстракция Получение активного экстракта, проявляющего активность, стимулирующую продуцирование ИЛ-6 кератиноцитами, требует проведения нескольких стадий экстракции.

Первая стадия заключается в отделении биомассы от остатков сусла; для этого можно использовать центрифугирование, тангенциальную микрофильтрацию, фильтрацию во вращающемся барабане или любой другой способ отделения биомассы от ферментационного сусла, традиционно используемый специалистами. Далее биомассу на несколько часов приводят в контакт со смесью растворителей, что позволяет экстрагировать молекулы гидрофобной природы.

Выдерживание в контакте предпочтительно проводят в течение ночи, то есть приблизительно в течение 15 часов.

После этого с помощью фронтальной фильтрации производят разделение биомассы и нагруженной органической фазы и биомассу отбрасывают.

Органическую фазу затем подвергают упариванию под вакуумом в температурном интервале от комнатной температуры до 50^oС до получения сухого экстракта.

Получение активного экстракта Полученный таким образом сухой экстракт может быть переведен в различные растворители, традиционно используемые в косметологии.

Концентрацию в растворителях выбирают так, чтобы обеспечить полное растворение экстракта, и так, чтобы она была совместимой с последующим применением.

Экстракт с активностью, стимулирующей продуцирование ИЛ-6 кератиноцитами, переводят в пропорции от 5 до 10% сухого экстракта в зависимости от активности в смесь этанол/вода (50/50; о/о), которая представляет собой предпочтительный растворитель по данному изобретению. В тех случаях, когда желательно получение порошка вместо раствора, сухой экстракт может быть просто высушен вымораживанием.

Анализ активности, стимулирующей продуцирование ИЛ-6 кератиноцитами, проведенный с аликвотной порцией каждого полученного экстракта, дает возможность оценивать их активность и контролировать воспроизводимость способа.

Для удаления каких-либо следов остаточной биомассы и обеспечения микробиологической стабильности экстракта его фильтруют через мембрану с порогом исключения 0,2 мкм и асептически вносят в стерильные колбы. Асептическое приготовление таких растворов позволяет избежать добавления консервантов. Проведение различных биохимических анализов дало возможность продемонстрировать, что экстракты, полученные из этого нового микроорганизма I 1844, обладают очень ценной активностью, стимулирующей продуцирование ИЛ-6 кератиноцитами. Их мощная активность продемонстрирована в различных анализах, которые предсказывают восстановление различных повреждений, нанесенных эпидермису, и замедление старения кожи.

Стимулирующее действие экстракта I 1844 на in vivo синтез ИЛ-6 кератиноцитами человека охарактеризовано, как описано ниже.

Экстракт I 1844 и используемые продукты Используют различные образцы экстракта I 1844, полученные в схожих условиях из различных ферментационных культур. Образцы хранят при 4^oС в смеси этанол/вода (50/50; о/о) в концентрации 0,1 г/г сухого экстракта и затем разводят до конечной концентрации, желательной на момент использования.

Эталонным продуктом для индуцирования синтеза ИЛ-6 является ЛПС (E.coli 055: В5, Sigma), который хранят при -20^oС в концентрации 10 мг/мл в ЗФР (забуференный фосфатом физиологический раствор). Полимиксин В, который является ингибитором ЛПС, получают от Sigma.

Разведение продуктов Продукты разводят в среде для инкубации кератиноцитов (сравни ниже). Если не оговорено особо, полученные, как указано выше, экстракты I 1844 оценивают при конечной концентрации 1% относительно сухого экстракта. Анализ с ЛПС проводят при его концентрации 10 мкг/мл.

Оценочная модель Клетки Используемой линией кератиноцитов человека является линия SVK 14 (J. Taylor-Papadimetriou et al., Cell. Differ., 1982, 11, 169-180), которую поддерживают в культуре в среде DMEM (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла), содержащей 4,5 г/л глюкозы, 100 ммоль пирувата натрия, 50 ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина и 10% фетальной сыворотки теленка (ФСТ). С целью сравнения на той же среде, что описана выше, но содержащей дополнительно 10 мг/мл EGF (эпидермального фактора роста) и 50 мкг экстракта гипофиза быка, проводят культивирование нормальных лимфоцитов человека (PBMNC), очищенных в градиенте фиколла (Ficoll) и полученных от здоровых добровольцев, а также кератиноцитов, происходящих от линии А 431 (АТСС CRL 1555), и нормальных кератиноцитов человека, полученных в результате пластической хирургии молочной железы (Biopredic, Rennes).

Инкубация с продуктами Для индукции ИЛ-6 клетки засевают в трех повторах в конечном объеме 200 мкл при плотности 510⁴ клеток на лунку в 96-луночные культуральные микропланшеты. После инкубации в течение 24 часов при 37^oС в атмосфере, содержащей 95% воздуха и 5% СO₂, среду удаляют и обновляют таким же объемом среды с 1% ФСТ, содержащей продукты в указанных концентрациях. Через последующие 18-24 часа культивирования из каждого из трех повторов удаляют культуральный супернатант, объединяют и замораживают при -20^oС до проведения определения содержания цитокинов.

Анализы на цитокины С помощью наборов для анализов ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) (R&D, Abington, UK) проводят количественную оценку ИЛ-6, ИЛ-1, ФНО и ИЛ-8. Оценку каждого супернатанта проводят в двух повторах в соответствии с инструкциями производителя. Предел определения для этих анализов составляет 3 пг/мл. В дополнение к иммунологическому анализу белка с помощью методики ELISA проводят оценку активной формы ИЛ-6 посредством биологического анализа на клетках мышиной гибридомы В9 (L. Aarden et al., Lymphokines, 1985, 10, 175-182).

Выражение результатов Результаты выражают либо в абсолютных величинах количествa. секретируемых цитокинов (в пг/мл белка для ELISA-анализов или ед/мл для биологического анализа ИЛ-6 на В9, причем одна единица определяется как количество цитокина, которое вызывает эффект пролиферации клеток В9 величиной в 50% от максимального), либо в виде определенного выше индекса стимуляции ИС, который рассчитывают как соотношение между индуцированным продуцированием цитокина и базисным продуцированием: Результаты Экстракт с активностью, стимулирующей продуцирование ИЛ-6, далее здесь будет называться просто "экстракт I 1844". Номер экстракта, использованного в каждом из экспериментов, равно как и его концентрация, указываются.

Действие экстракта I 1844 на стимуляцию кератиноцитного ИЛ-6 Экстракт I 1844 стимулирует синтез SVK-14-кератиноцитного ИЛ-6 концентрационнозависимым образом. Принимая среднее количество продуцируемого базисного ИЛ-6+3 СО (11,8+[30,8]=13,6 пг/мл) в качестве позитивной пороговой величины, экстракт I 1844 значительно стимулирует синтез ИЛ-6 в концентрациях, равных и выше концентраций, лежащих в области 0,12% (ИС=1,23); ЕС₅₀ равняется 0,25%, а максимальный эффект достигается при концентрации 2%, при которой синтез ИЛ-6 стимулируется с фактором 2,3.

Исследования были распространены на другую линию кератиноцитов человека (линию А 431), равно как и на нормальные кератиноциты человека. В отличие от того, что наблюдается на линии SVK 14, экстракт I 1844 способен стимулировать продуцирование ИЛ-6 с фактором, превышающим 2, как в другой линии кератиноцитов (А 431), так и в первичной культуре нормальных кератиноцитов.

Таким образом, действие экстракта I 1844 не ограничено отдельными линиями, а может быть обобщено на нормальные клетки.

Специфичность действия экстракта I 1844 Специфичность действия экстракта I 1844 проверена на различных уровнях путем демонстрации того: - что действие не обусловлено загрязнением бактериальным ЛПС, способность которого стимулировать продуцирование ИЛ-6 известна, и что клетки лимфоидного происхождения, которые также способны продуцировать ИЛ-6, не чувствительны к экстракту I 1844; - что среди цитокинов, которые могут синтезироваться кератиноцитами, только продуцирование ИЛ-6 стимулируется под влиянием экстракта I 1844.

Присутствие полимиксина, являющегося ингибитором ЛПС, не изменяет индуктивное действие экстракта I 1844 на SVK 14-кератиноцитное продуцирование ИЛ-6, в то время как индуцированная ЛПС стимуляция логично ингибируется этим соединением. Этот результат указывает на то, что действие, наблюдаемое для экстракта I 1844, не обусловлено загрязнением бактериальным эндотоксином. Кроме того, оценка, проведенная с помощью В9-биоанализа, указывает на то, что продуцирование ИЛ-6, стимулируемое экстрактом I 1844, является биологически активным.

Сравнительное изучение различных клеточных мишеней показывает, что лимфоциты крови (PBMNC) в отличие от кератиноцитов являются нечувствительными к действию стимулирующей активности экстракта I 1844 на продуцирование ИЛ-6. Наоборот, ЛПС, способный стимулировать оба клеточных типа, является эффективным в обоих случаях. Таким образом, эти исследования показывают, что экстракт I 1844 стимулирует кератиноциты, не затрагивая клетки лимфоидного происхождения.

И наконец, экстракт I 1844 стимулирует синтез ИЛ-6 без одновременного увеличения уровня ИЛ-1, ИЛ-8 и ФНО. Среди этих цитокинов ИЛ-8 является особенным ввиду того, что он способен в силу своих хемотаксических свойств локально рекрутировать нейтрофильные многоядерные клетки. Вследствие этого он играет важную роль в воспалении. Экстракт I 1844 стимулирует продуцирование ИЛ-6 без усиления продуцирования других изученных цитокинов.

Совокупность данных, а именно отсутствие ЛПС-эффекта, нацеленность только на кератиноциты и стимуляция, ограниченная ИЛ-6, позволяет сделать заключение о том, что действие экстракта I 1844 является специфичным и что оно не вызывает провоспалительного эффекта.

Следовательно, экстракт I 1844 воспроизводимо стимулирует кератиноцитное продуцирование ИЛ-6. Это действие наблюдается как на кератиноцитах человека, установленных в качестве линий, так и на нормальных кератиноцитах человека, происходящих из первичной культуры. Свойство экстракта I 1844 стимулировать синтез ИЛ-6 кератиноцитами является специфичным. Это обусловлено внутренней особенностью экстракта I 1844, а не экзогенным загрязнением, таким как бактериальный эндотоксин, оно не затрагивает клетки лимфоидного происхождения, и среди протестированных цитокинов оно наблюдается только для ИЛ-6: специфичность экстракта I 1844 является двоякой, как клеточной, так и молекулярной. Установление характера действия стимулирующей активности экстракта I 1844 на кератиноцитный ИЛ-6 делает возможным определение индексов стимуляции ИЛ-6, лежащих в интервале от 1,5 до 4,5, как критерия активности для любого образца, активность которого оценивается на клетках SVK 14.

Изучение характера влияния экстракта I 1844 на сокращение коллагенового волокна проводят, как описано далее.

Целью этого исследования является тестирование влияния экстракта I 1844 на сокращение коллагенового волокна. Используют гель коллагена, приготовленный путем смешивания фибробластов и коллагена. Под влиянием напряжений, вызываемых клетками, коллаген организуется в волокна. Это явление количественно характеризуется сокращением геля.

Используемой клеточной линией является штамм MRC5, представляющий собой штамм фибробластов, происходящий из легкого эмбриона человека. Клетки культивируют на среде ВМЕ (Basal Eagle Medium; основная среда Игла) с Glutamax I, содержащей 10% ФСТ, 1% пенициллин/стрептомицин, 1% фунгизона и 1% NEAA (заменимые аминокислоты) Gibco. Применяемый коллаген является коллагеном типа I, полученным из сухожилий крысиных хвостов, в виде раствора в концентрации 2 мг/мл в уксусной кислоте.

Способ получения гелей Получение клеточной суспензии После обработки трипсином полученной на 75-см² чашке Петри культуры MRC5 готовят клеточную суспензию в DMEM, содержащей 10% ФСТ и антибиотики, в пропорции 110⁶ клеток в миллилитре, с таким расчетом, чтобы получить 500000 клеток на гель.

С целью задержки гелеобразования смесь готовят во льду.

В указанных далее порядке и пропорциях при перемешивании добавляют различные составляющие: 1,76DMEM - 2,3 мл Коллаген, тип I - 1,5 мл 0,1н. NaOH - 0,25 мл ФСТ - 0,45 мл Клеточная суспензия - 0,5 мл Эту хорошо гомогенизированную смесь распределяют на чашке Петри диаметром 5 см (тип бактериологический, NUNC) и инкубируют при 37^oС. Гель образуется в течение 10 минут. Приблизительно через 2 часа с помощью лезвия скальпеля гель отделяют от стенок чашки.

Диаметр гелей далее измеряют через 24, 48 и 72 часа после образования, используя линейку, градуированную в миллиметрах.

Обработка Экстракт I 1844 разводят в среде 1,76 х DMEM во время приготовления геля таким образом, чтобы получить конечные концентрации 0,1, 0,2 и 0,5%. В качестве контроля ингибирования сокращения используют раствор фенола в конечной концентрации 6,4 г/л.

Количественные анализы Экстракт I 1844 в концентрации, равной и превышающей 0,1%, вызывает значительное усиление сокращения. Фенол, применяемый в качестве контроля ингибирования сокращения, дает 0% сокращения. Количественный анализ посредством наблюдений с помощью электронного микроскопа сократившихся гелей через 72 часа в присутствии и отсутствие экстракта I 1844 показывает наличие активных клеток, по-видимому, находящихся в фазе синтеза белка. Обработка экстрактом I 1844, по-видимому, не приводит к значительным изменениям в количестве и размере волокон.

Экстракт I 1844 эффективен в дозах, равных и превышающих 0,1%. Он усиливает активность фибробластов, которая обнаруживается по усилению сокращения коллагенового геля и только при наиболее высокой концентрации - по увеличению числа волокон.

Оценку характера влияния экстракта I 1844 на активацию коллагеназы проводят, как описано далее.

Целью этого исследования является тестирование влияния экстракта I 1844 на активацию коллагеназы. Для этого используют коллагеновый гель, приготовленный путем смешивания фибробластов и меченного тритием коллагена. В таком окружении фибробласты реорганизуют, изменяют и вызывают сокращение коллагена, приводя к образованию структуры, подобной структуре дермы. Для этого фибробласты продуцируют коллагеназу, высвобождающуюся в культуральную среду в латентной форме, которая может быть активирована под действием протеиназ. Активность коллагеназы измеряют по ее способности гидролизовать меченный тритием коллагеновый субстрат до растворимых радиоактивных пептидов. Латентная коллагеназа активируется трипсином, обработанным 1,1 -тозиламид-2-фенилэтилхлорметилкетоном (ТРСК). В качестве клеточной линии используют штамм MRC5, представляющий собой штамм фибробластов, происходящий из легкого эмбриона человека. Клетки культивируют на среде ВМЕ (Basal Eagle Medium; основная среда Игла) с Glutamax I, содержащей 10% ФСТ, 1% пенициллин/стрептомицин, 1% фунгизона и 1% NEAA (заменимые аминокислоты) Gibco. Применяемый коллаген является коллагеном типа I, полученным из сухожилий крысиных хвостов, в виде раствора в концентрации 2 мг/мл в уксусной кислоте. Меченный тритием коллаген применяется в виде раствора в концентрации 0,3 мг/мл в уксусной кислоте, и его активность составляет 0,06 мКи/мл (Dupont Net-660).

Способ получения гелей Получение клеточной суспензии После обработки трипсином полученной на 75-см² чашке Петри культуры MRC5 готовят клеточную суспензию в DMEM, содержащей 10% ФСТ и антибиотики, в пропорции 110⁶ клеток в миллилитре.

С целью задержки гелеобразования смесь готовят во льду.

В указанных далее порядке и пропорциях при перемешивании добавляют различные составляющие: 2DMEM - 400 мкл Коллаген типа I, меченный тритием - 300 мкл 0,1н. NaOH - 100 мкл ФСТ - 100 мкл Клеточная суспензия - 100 мкл 200 мкл этой хорошо гомогенизированной смеси вносят в 24-луночный планшет и инкубируют при 37^oС. Радиоактивность составляет 0,4 мкКи на лунку.

Через один час 500 мкл среды DMEM + 3% ФСТ добавляют в каждую лунку.

Каждые 24 часа в течение 7 дней измеряют активность активированной и латентной коллагеназы. Для этого 500 мкл среды отбирают из каждой лунки и радиоактивность подсчитывают на жидкостном сцинтилляционном счетчике. 300 мкл раствора трипсин/ТРСК в концентрации 25 мг/мл в DMEM добавляют в каждую лунку и инкубируют при 37^oС в течение 15 минут. Действие трипсина останавливают добавлением 200 мкл раствора ингибитора трипсина в концентрации 100 мг/мл в дистиллированной воде. 500 мкл среды отбирают и радиоактивность подсчитывают на жидкостном сцинтилляционном счетчике. В каждую лунку еще раз добавляют 500 мкл среды DMEM + 3% ФСТ и планшет еще раз оставляют инкубироваться в течение следующих 24 часов.

Экстракт I 1844 разводят в среде 2 DMEM в ходе приготовления геля таким образом, чтобы получить конечные концентрации 0,1 и 0,5%.

Экстракт I 1844 не изменяет общую коллагеназную активность. За данный интервал времени соответственные пропорции латентной и активированной коллагеназы не изменяются относительно контроля, хотя увеличение в латентной коллагеназе наблюдается со временем в контролях и в образцах, подвергнутых обработке. Продукт не вызывает какой-либо активации коллагеназы.

При получении косметических композиций по настоящему изобретению составленные таким образом экстракты I 1844 смешивают с традиционными разбавителями и водными и неводными растворителями, совместимыми с местным применением, равно как и с активными компонентами фактически существующих композиций. Подходящие растворители и/или разбавители выбирают в соответствии с их способностью транспортировать активный компонент экстракта по изобретению в эпидермальные и дермальные кожные структуры.

Кроме этого, в Ames и ДНК-репарационных анализах показано, что экстракты I 1844 по изобретению полностью свободны от генотоксичности.

Их стабильность совместима с их применением в косметических композициях.

Косметические композиции по настоящему изобретению содержат экстракт I 1844 (в процентах) от 0,00001 до 5% по массе по отношению к общей массе композиции, смешанный с эксципиентами, которые обычно используются при получении косметических препаратов для нанесения на кожу.

Указанные проценты могут варьировать в пределах интервала, отмеченного выше, как функция внутренней активности экстракта I 1844, введенного в композицию.

Указанный экстракт I 1844 предпочтительно представлен в процентах в диапазоне от 0,0001 до 2% по массе по отношению к общей массе композиции.

При получении композиций по настоящему изобретению экстракт I 1844 смешивают с традиционными разбавителями и водными или неводными растворителями, совместимыми с применением на коже, равно как и с другими компонентами самой композиции. Подходящие растворители и/или разбавители выбираются в соответствии с их способностью к депонированию на коже активного экстракта I 1844 по изобретению.

Обычно эти композиции содержат эксципиенты или добавки, которые выбираются из ингредиентов, традиционно используемых в композициях, предназначенных для местного применения, в соответствии с необходимостью в конкретных рассматриваемых препаратах.

Они могут содержать, например, загустители, умягчители, смягчающие вещества, стабилизаторы, консерванты, пеногасители, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, красители и/или пигменты и/или другие типы наполнителей, отдушки, силиконы и разнообразные жировые субстанции.

Экстракт I 1844 всегда составляет от 0,00001 до 5% по массе, предпочтительно от 0,0001 до 2% по массе, по отношению к общей массе композиции, причем указанное количество вычислено по отношению к массе сухого экстракта.

Композиции по настоящему изобретению предпочтительно содержат экстракт ферментационного сусла нового штамма I 1844 в пропорциях (как отношение масса/масса в процентах), которые зависят от степени активности используемого экстракта и, следовательно, от концентрации сухой субстанции и от специфической активности этой субстанции.

Для получения косметических композиций по изобретению может оказаться подходящим использование неочищенных экстрактов, которые получаются непосредственно после ферментации без какой-либо стадии очистки, в пропорциях от 0,00001 до 5%, преимущественно от 0,0001 до 2%, еще лучше от 0,001 до 2% по массе по отношению к общей массе композиции, и предпочтительно от 0,01 до 2% по массе по отношению к общей массе композиции.

Эти проценты по массе рассчитаны, естественно, на основе массы полученного сухого экстракта.

Более конкретно композиции по настоящему изобретению содержат более или менее очищенные экстракты, которые растворены и которые могут быть получены путем ферментации штамма Rhodotorula, депонированного в C.N.C.M. Пастеровского института под номером I 1844, или его мутантов-продуцентов, с эксципиентами, обычно используемыми для препаратов такого типа, такими как упомянутые выше.

Композиции по настоящему изобретению могут быть в виде эмульсии, в которой составляющее или смесь составляющих, возможно, со стабилизатором, объединяют с эксципиентами, которые в настоящее время используются в косметических композициях и которые совместимы с указанными составляющими, такими как ланолин или растительные, минеральные или синтетические масла.

Кроме того, композиции по изобретению могут быть представлены в форме геля в подходящих эксципиентах, таких как эфиры целлюлозы или другие гелеобразующие агенты, как, например, акриловые производные, и могут содержать действующее начало в растворенной форме или суспендированное в микрогранулах.

Кроме того, композиции по изобретению могут иметь форму лосьона или раствора, в котором разбавляется или микродиспергируется смесь составляющих.

Таким образом, композиции по изобретению могут быть в форме микродисперсии в жидкости, содержащей воду, равно как и одно или более чем одно совместимое поверхностно-активное вещество. Дисперсии проявляют свойства микроэмульсий, в частности по прозрачности и низкой вязкости, и практически выступают как истинные растворы. Они также могут быть приготовлены для незамедлительного употребления.

Одной из преимущественных форм композиций по изобретению является жидкость, которая применяется местно посредством адгезивной подложки, обозначенной здесь и далее