Штамм бактерий pseudoalteromonas issachenkonii кмм 3549t - продуцент фукоидан-гидролазы и питательная среда для его культивирования

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и предназначено для использования в производстве гидролитических ферментов. Штамм Pseudoalteromonas issachenkonii KMM 3549T выделен из таллома бурой водоросли Fucus evanescens в результате поиска продуцентов гликозид-гидролаз. Питательная среда для его культивирования содержит источники азота, источники углерода и энергии и источники ростовых веществ. В качестве источника азота среда содержит пептон, в качестве источника углерода и энергии - ксилозу, в качестве источника ростовых веществ - морскую воду. Питательная среда имеет следующее соотношение компонентов, г/л: пептон 2,5-5,0; ксилоза 1,0-5,0; морская вода - до 1 л. Изобретение обеспечивает увеличение биосинтеза фукоидан-гидролазы и снижение активностей сопутствующих гликозидаз-гидролаз, повышение выхода фукоидан-гидролазы на среде простого состава, снижение себестоимости продукта. 2 с.п. ф-лы, 7 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и предназначено для использования в производстве гидролитических ферментов, применяемых при получении биологически активных водорастворимых фукоолигосахаридов.

Сульфатированные водорастворимые полисахариды бурых водорослей - фукоиданы, а также их низкомолекулярные фрагменты (фукоолигосахариды) обладают широким спектром биологического действия и могут быть использованы в терапии некоторых заболеваний человека [1-3]. Структура фукоиданов и соответствующая ей биологическая активность варьируют от источника к источнику их получения. В общих чертах фукоиданы бурых водорослей представляют собой семейство гомо- и гетерополисахаридов, состоящих преимущественно из остатков фукозы сульфатированной иногда по третьему [4], чаще по второму и/или четвертому положениям, которые связаны в основной цепи -1,3-, или -1,2-, или, возможно, -1,4-О-гликозидными связями [5, 6]. Помимо фукозы фукоиданы могут содержать минорные моносахара: маннозу, галактозу, глюкозу, ксилозу, рамнозу, уроновые кислоты [1].

Известно, что фукоидан-гидролазы, специфически катализирующие гидролитическое расщепление фукоиданов, синтезируются как макро-, так и микроорганизмами - обитателями морской среды. У наземных организмов фукоидан-гидролазы не обнаружены.

Микроорганизмы как источники получения ферментов с уникальной специфичностью привлекают все большее внимание, так как они обладают огромной скоростью размножения и позволяют осуществлять синтез в контролируемых условиях.

Известна морская бактерия (штамм 2-40), которая деградирует сложные полисахариды, в том числе и фукоидан [7]. Однако фукоидан-деградирующие свойства этой бактерии не изучены.

Известен штамм морской галофильной бактерии Flavobacierium sp., из которого выделены фукоидан-деградирующие ферменты [8]. С помощью этих ферментов установлены структуры фрагментов фукоидана одной из бурых водорослей, определен тип О-гликозидной связи между остатками маннозы, галактозы и глюкуроновой кислот. Однако этот штамм нам недоступен.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является штамм морской бактерии Vibrio sp. N 5 - обитательницы морского песка. Из биомассы этой бактерии выделены три эндо-фукоидан-гидролазы, которые гидролизуют фукоидан из бурой водоросли Kjelmaniella crassifolia до сульфатированных фукоолигосахаридов [9] . Уровень удельной фукоидан-гидролазной активности в экстракте согласно опубликованным данным не превышает 0,14 ед/мг белка. При этом для индукции фермента используется питательная среда, содержащая наряду с азотно-кислым аммонием, серно-кислым магнием, хлористым кальцием, фосфорно-кислым двузамещенным натрием, хлористым натрием и дрожжевым экстрактом дорогостоящий индуктор - фукоидан (5 г - 120 $).

Задача изобретения - выявление нового штамма морской бактерии, продуцирующего фукоидан-гидролазу, способного расти на простых питательных средах, и оптимизация питательной среды для его культивирования, позволяющей повысить выход фукоидан-гидролазы и снизить уровень активности сопутствующих гликозид-гидролаз, а также и себестоимость продукта.

Поставленная задача решена тем, что в лабораторных условиях была вызвана деградация таллома бурой водоросли Fucus evanescens микробным сообществом (водоросль собрана в б. Кратерная). Из этого микробного сообщества, деградировавшего таллом бурой водоросли Fucus evanescens, выделен штамм бактерий рода Pseudoalteromonas. Он отобран по способности синтезировать фукоидан-гидролазу. Штамму присвоен коллекционный номер КММ 3549T в Коллекции Морских Микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН (официальный акроним КММ и номер 644 во Всемирной федерации коллекций культур - WFCC). Штамм депонирован в Бельгийской коллекции микроорганизмов под номером LMG 19697.

Штамм выделен методом прямого высева из накопительной культуры на агаризованной среде следующего состава (г/л): пептон - 5,0; дрожжевой экстракт - 2,0; глюкоза - 1,0; К2НРO4 - 0,2; гидролизат казеина - 2,0; MgSO4 - 0,05; агар-агар - 20,0; дистиллированная вода - 500 мл, морская вода - 500 мл, рН среды 7,8, после пяти дней инкубации при 28oС.

Культуру хранят в пробирках под слоем минерального масла на полужидкой среде приведенного выше состава при температуре 10oС и в 30% растворе глицерина при температуре 80oС.

Штамм имеет следующие характеристики: Культурально-морфологические признаки Штамм КММ 3549Т образует на агаризованных средах круглые (5-8 мм) выпуклые слизистые прозрачные колонии с ровными краями. Клетки представляют собой подвижные небольшие (0,5-0,91,0-1,5 мкм) грамотрицательные палочки, имеющие аэробный тип метаболизма, способные расти при температуре от 4 до 37oС.

Физиолого-биохимические признаки Штамм КММ 3549Т оксидазо- и каталазоположителен, нуждается в ионах натрия для роста, характеризуется способностью гидролизовать ДНК, желатин, хитин, альгинат, казеин, твин-85 и отсутствием способности гидролизовать крахмал, агар, каррагинан. Не продуцирует сероводород, индол, ацетон. Ассимилирует D-галактозу, D-фруктозу, ацетат, пируват, фумарат, цитрат, мальтозу, сахарозу, мелибиозу, лактозу, сукцинат, маннит. Не усваивает маннозу, глюконат, глицерин, ксилозу, трегалозу и фукозу.

Хемотаксономические признаки Основные жирные кислоты представлены 15: 1(n-8) (5,0%), 16: 1(n-7) (45,6%), 16:0(15,1%), 18:l(n-7)(6,6%), 17:l(n-8)(8,2%).

На основании физиолого-биохимических и хемотаксономических признаков штамм КММ 3549T отнесен к бактериям рода Pseudoalteromonas.

Молекулярно-генетические признаки Состав Г+Ц оснований в ДНК составляет 43,3 mol%.

Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей 16S рРНК гена выявил 98,6-99,8% гомологии с 16S рРНК генами Pseudoalteromonas tetraodonis, Pseudoalteromonas espejiana, Pseudoalteromonas atlantica. Pseudoalteromonas carrageenovora.

Эксперименты по ДНК-ДНК гибридизации штамма КММ 3549T с филогенетически близкими типовыми штаммами показали 50,0% гомологии со штаммом Р. tetraodonis IAM 14160T, 38% с Р. espejiana IAM 13640T, 54% с Р. atlantica IAM 12927T и 48% с Р. carrageenova IAM 12662T, что позволило идентифицировать штамм КММ 3549 как новый вид [10] - Pseudoalteromonas issachenkonii.

Первоначально культивирование штамма КММ 3549T проводят на стандартной среде следующего состава (г/л): пептон - 5,0; дрожжевой экстракт - 2,0; гидролизат казеина - 2,0; MgSO4 - 0,05; агар-агар - 20,0; фукоидан - 1,0; морская вода - 1000 мл, рН 7,8.

Посевной материал Pseudoalteromonas issachenkonii КММ 3549T выращивают в колбах емкостью 100 мл, содержащих 50 мл ферментационной среды, в течение 20-24 часов при температуре 20-25oС на качалке со скоростью вращения 150 об/мин, до получения плотности 109 клеток/мл. Полученным посевным материалом засевают колбы емкостью 1000 мл, содержащие 500 мл ферментационной среды того же состава. Ферментацию проводят в течение 20 часов при температуре 20-25oС на качалке со скоростью вращения 120 об/мин.

Приготовление экстрактов бактерий для тестирования гликозид-гидролазных активностей.

После культивирования в 500 мл жидкой среды с фукоиданом в течение 24 часов при 25oС клетки (1 г сырого веса) собирают центрифугированием в течение 30 минут при 5000 оборотов в минуту при 4oC, суспендируют в 10 мл 0,01М фосфатного буфера, рН 7,2 и разрушают ультразвуком (20 кГц). Полученный гомогенат центрифугируют при 15000 об/мин в течение 20 минут. Супернатант используют как сырой клеточный экстракт фермента.

Активности гликаназ сырого экстракта тестируют, используя фукоидан бурой морской водоросли Fucus evanescens [11], ламинаран из бурой водоросли Laminaria cichorioides [12], пустулан из лишайника Umbellicaria russica [13]. Альгиновую кислоту и агар (Serva, США) используют как субстраты для определения активности альгиназы и агаразы. Действие фермента регистрируют калориметрическим методом Нельсона [14] по появлению восстанавливающих cахаров - продуктов гидролиза перечисленных выше полисахаридов. Количество белка измеряют по методу Лоури с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта [15]. Удельную активность гликаназ выражают как количество фермента, освобождающее 1 мкмоль восстанавливающих сахаров за 1 час на 1 мг белка.

Активности гликозидаз тестируют с помощью р-нитрофенильных производных соответствующих моносахаридов (Sigma, США) в 0,01М фосфатном буфере, рН 7,2 при 20oС. Реакционная смесь состоит из 0,05 мл сырого экстракта и 0,2 мл р-нитрофенил гликозида (1 мг/мл в 0,01М фосфатном буфере, рН 7,2). Реакцию останавливают добавлением 1,25 мл 1М Nа2СО3. Удельную активность гликозидаз определяют как количество фермента, под действием которого образуется 1 мкмоль р-нитрофенола в мин на 1 мг белка.

Активность гликаназ и гликозидаз из клеточного экстракта Pseudoalteromonas issachenkonii KMM 3549Т показана в табл. 1. Экстракт биомассы этих бактерий содержит высокоактивные ламинариназу, альгиназу, менее активные пустуланазу и фукоидан-гидролазу. Каррагинаназа и агараза не обнаружены. Кроме того, в клеточном экстракте Pseudoalteromonas issachenkonii KMM 3549 найдены гликозидазы, которые катализируют гидролиз, главным образом, -О-гликозидных связей (-галактозидаза, -глюкозидаза, -ксилозидаза и N-ацетил--D-глюкозаминидаза). Гликозидазы, которые катализируют гидролиз -О-гликозидных связей (-галактозидаза, N-aцeтил--D-гaлaктoзaминидaзa, -маннозидаза, -фукозидаза), не обнаружены.

Для выявления условий оптимального роста культуры и накопления гликозид-гидролазных активностей в среде выращивание штамма Р. issachenkonii KMM 3549Т проводят на питательных средах различного состава. Опыты проводят в колбах на термостатируемой качалке (170 об/мин) при температуре 28oС в течение 20 часов. Каждая колба содержит 100 мл питательной среды и равное количество (5%) посевного материала. Все опыты проводят в одинаковых условиях в двух повторностях.

Питательные среды содержат в качестве источника азота пептон, дрожжевой экстракт как компонент, содержащий необходимые факторы роста, поли- или моносахариды как источники углерода и энергии и морскую воду.

Первоначально проводят оптимизацию состава питательной среды для штамма Р. issachenkonii KMM 3549Т по основным компонентам. Как видно из табл. 2, из шести вариантов только две модификации среды, включающие пептон и глюкозу или только пептон, оказывают положительное влияние на синтез фукоидан-гидролазы. Присутствие в питательной среде одного дрожжевого экстракта приводит к относительно слабому росту бактерий и отсутствию фукоидан-гидролазной активности. На среде, содержащей пептон и дрожжевой экстракт, и на среде, содержащей пептон, дрожжевой экстракт и глюкозу, наблюдается интенсивный рост бактерий, превышающий таковой на среде с пептоном в 3 раза, но фукоидан-гидролазная активность при этом отсутствует. Анализ результатов первой серии экспериментов позволяет предположить, что для синтеза фукоидан-гидролазы значимым является только пептон, присутствие дрожжевого экстракта и глюкозы несущественно.

В дальнейшем исследуют влияние различных концентраций пептона на синтез фукоидан-гидролазы, ламинариназы, альгиназы и N-ацетил--D-глюкозаминидазы (табл. 3). Согласно полученным результатам значимой для синтеза фукоидан-гидролазы является концентрация пептона, равная 2,5 г/л. Максимальная удельная активность альгиназы наблюдается при концентрации пептона 1 г/л. Влияние различных концентраций пептона на синтез N-ацетил--D-глюкозаминидазы практически отсутствует. Увеличение концентрации пептона до 10 г/л приводит к интенсивному росту бактерий, но не к увеличению уровня гликозид-гидролазных активностей.

Результаты следующей серии экспериментов содержат данные по влиянию фукозы, ксилозы, рамнозы и галактозы как моносахаридных фрагментов фукоиданов на синтез гликозид-гидролаз (табл. 4). Более высокая активность фукоидан-гидролазы достигается при использовании ксилозы и галактозы. Однако в присутствии галактозы заметно повышается активность и сопутствующих гликозид-гидролаз.

Варьирование концентрации ксилозы в четвертой серии экспериментов (табл. 5) показывает, что удельная активность фукоидан-гидролазы становится максимальной при концентрации ксилозы 5 г/л. Высокая концентрация ксилозы (10 г/л) в питательной среде ингибирует рост бактерий.

Эксперименты по оптимизации питательной среды с использованием полисахаридов - фукоидана, ламинарана, альгината, агарозы и каррагинана - показывают, что агароза и каррагинан ингибируют синтез фукоидан-гидролазы (табл. 6). Фукоидан слабо индуцирует синтез фукоидан-гидролазы, но является положительным фактором для синтеза N-ацетил--D-глюкозаминидазы. Положительным фактором для продукции фукоидан-гидролазы является присутствие как ламинарана, так и альгината, но добавление в среду как ламинарана, так и альгината увеличивает удельную активность ламинариназы, большое содержание которой не желательно при проведении процедуры очистки фукоидан-гидролазы. Единственным ферментом, на синтез которого не влияет присутствие полисахаридов-индукторов, оказалась альгиназа.

Важно отметить, что эксперименты по оптимизации питательной среды с использованием полисахаридов показывают, что нецелесообразно включать полисахариды в качестве источника углерода в состав питательных сред, так как активность фукоидан-гидролазы в этом случае, так же как и других гликозид-гидролаз, весьма низка.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Культивирование штамма Pseudoalteromonas issachenkonii KMM 3549T проводят на среде следующего состава (г/л): пептон - 2,5; ксилоза - 1,0; морская вода - до 1 л, рН 7,8. Выращивание бактерий, получение клеточных экстрактов и определение гликозидазных активностей в этом и последующих примерах выполняют так же, как описано выше (табл. 7).

Пример 2. Культивирование штамма Pseudoalteromonas issachenkonii KMM 3549T проводят на среде следующего состава (г/л): пептон - 2,5; ксилоза - 5,0; морская вода - до 1 л, рН 7,8.

Пример 3. Культивирование штамма Pseudoalteromonas issachenkonii KMM 3549T проводят на среде следующего состава (г/л): пептон - 5,0; ксилоза - 1,0; морская вода - до 1 л, рН 7,8.

Пример 4. Культивирование штамма Pseudoalteromonas issachenkonii KMM 3549T проводят на среде следующего состава (г/л): пептон - 5,0; ксилоза - 5,0; морская вода - до 1 л, рН 7,8.

Таким образом, варьируя состав питательной среды, можно регулировать синтез фукоидан-гидролазы, ламинариназы и N-ацетил--D-глюкозаминидазы. Использование предлагаемого штамма Pseudoalteromonas issachenkonii KMM 3549T и среды для его культивирования позволяет существенно упростить процесс получения фукоидан-гидролазы и снизить себестоимость получаемых продуктов, а также позволяет увеличить удельную активность фукоидан-гидролазы в 3 раза.

Формула изобретения

1. Штамм Pseudoalteromonas issachenkonii KMM 3549T - продуцент фукоидан-гидролазы.

2. Питательная среда для культивирования продуцента фукоидан-гидролазы, содержащая источники азота, углерода и энергии, источник ростовых веществ, отличающаяся тем, что она содержит в качестве источника азота пептон, в качестве источника углерода и энергии - ксилозу, в качестве источника ростовых веществ - морскую воду при следующем соотношении компонентов, г/л: Пептон - 2,5-5,0 Ксилоза - 1,0-5,0 Морская вода - До 1 лс

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6