Ускоренная ацетилгидролаза фактора активации тромбоцитов

Ускоренная ацетилгидролаза фактора активации тромбоцитов

Реферат

 

Изобретение относится к медицине, в частности к гематологии. Сущность его состоит в том, что обеспечивает последовательности очищенных и выделенных полинуклеотидов, кодирующие ацетилгидролазу фактора активации тромбоцитов человеческой плазмы. Описаны также материалы и способы рекомбинантного получения продуктов ацетилгидролазы фактора активации тромбоцитов, которые предназначены для регулирования патологических воспалительных явлений. Технический результат - расширение арсенала способов и средств для борьбы с воспалительными заболеваниями. 11 с. и 5 з.п. ф-лы., 11 табл., 13 ил.

Область изобретения Настоящее изобретение относится в основном к ацетилгидролазе фактора активации тромбоцитов, а более точно к новым выделенным и изолированным полинуклеотидам, кодирующим ацетилгидролазу фактора активации тромбоцитов к ацетилгидролазным продуктам, кодированным полинуклеотидами, к материалам и методам для рекомбинантного получения ацетилгидролазных продуктов и к материалу антител, специфичных в отношении ацетилгидролазы фактора активации тромбоцитов.

Уровень техники Фактор активации тромбоцитов (PAF) - биологически активный фосфолипид, синтезированный различными видами клеток. In vivo (в биологических опытах) и при нормальных концентрациях от 10^-10 до 10^-9 М, PAF активизирует клетки-мишени, такие как тромбоциты и нейтрофилы, посредством связывания специфических G соединенных протеиновых поверхностных рецепторов клеток. [Venable et at. , J.Lipid Res., 34: 691-701 (1993)]. PAF имеет структуру 1-O-алкил-2-ацетил-sn-глицеро-3-фосфохолина. Для оптимальной биологической активности sn-1 положение глицеринового каркаса PAF должно быть связано эфиром с жирными спиртами и положение sn-3 должно иметь фосфохолин в составе головной группы.

Функции PAF являются нормальными физиологическими процессами (напр. при воспалениях, гемостазе и родах) и протекают при патологических воспалительных процессах (напр. при астме, анафилаксии, при септических шоках и артритах) [Venable et al. , supra, и Lindsberg et al., Ann. Neurol., 30: 117-129 (1991)] . Вероятность использования PAF в ответной патологической реакции обеспечивает быстрый ответ, позволяющий модулировать активность PAF, и основное направление этого ответа приводит к антагонистической активности PAF, которая вредит взаимодействию PAF с поверхностными рецепторами клеток. Смотри, например, Heueref et al., Clin, Exp. Allergy, 22: 980-983 (1992).

Синтез и секреция PAF так же, как и его деградация и очистка, должны тщательно регулироваться. Для достижения того, чтобы патологическая воспалительная реакция PAF стала результатом несоответствия механизма регулирования PAF, обеспечивающей чрезмерное усиление процесса получения неподходящего продукта или недостаточной деградации, альтернативное решение предполагает моделирование активности PAF, включающей имитацию или усиление естественного процесса, в результате которого может возникать воспаление. Макрофаги [Stafforini et al., J.Biоl. Сhem., 265(17): 9682-9687 (1990)], гепатоциты и человеческая гепатомная линия клеток HepG2 [Satoh et al., Jclin. Invest., 87: 476-7-481 (1991) и Tarbet et al., J. Biоl. Сhеm., 266(25): 16667-16673)] , как это сообщалось для случая увеличения активности ферментов, PAF ацетилгидролаза (PAF-AH), приводит к инактивации PAF. Кроме того, увеличивая инактивацию PAF, PAF-AH также приводит к инактивации активности фрагментированных при окислении фосфолипидов, таких как продукты активации последовательности арахидоновой кислоты, которые участвуют в процессах воспаления. См. Stremler et al., J.Biol. Chem., 266(17): 11095-11103 (1991). Инактивация PAF посредством PAF-AH осуществляется первоначально посредством гидролиза PAF sn-2 ацетиловой группы и PAF-AH метаболизма окислительно-фрагментированных фосфолипидов посредством удаления sn-2 ацильных групп. Были определены два типа PAF-АН: в форме цитоплазмы, обнаруженной в клетках различных видов и в тканях, таких как клетки эндотелия и эритроциты, и внеклеточные формы, найденные в плазме и сыворотке крови. PAF-AH из плазмы не гидролизует неповрежденные фосфолипиды кроме PAF, и этот субстрат специфически позволяет ферментам циркулировать in vivo в полностью активном состоянии без противоположного эффекта. PAF-AH из плазмы позволяет объяснить полную деградацию PAF в человеческой крови ex vivo [Stafforini et at., J. Biоl. Chem., 262(9): 4223-4230 (1987)].

В то время как цитоплазматические формы PAF-AH плазмы имеют идентичные специфические свойства субстрата, PAF-AH из плазмы имеет биохимические характеристики, которые отличают ее от других PAF-AH из цитоплазмы и также других свойств липаз. В частности PAF-AH из плазмы, ассоциированная с липопротеиновыми частицами, подавляется диизопропилфторфосфатом, не подвержен воздействию ионов кальция, относительно нечувствителен к протеолизу и имеет среднюю молекулярную массу порядка 43000 Да. Смотри Stafforini et al. (1987), supra. В той же самой статье Stafforini et al. приводят описание процедуры для частичного выделения PAF-AH из плазмы человека и смеси аминокислот материала плазмы, полученного с использованием этой процедуры. Цитоплазматический PAF-AH был получен выделением эритроцитов, как это описано в работе Stafforini et al., J. Biol. Chem., 268(6): 3857-3865 (1993) и десяти концевых аминоостатков цитоплазматического PAF-AH, также описанного в этой статье. Hattori et al., J, Biol. Chem., 268(25): 18748-18753 (1993) описывает процесс выделения цитоплазматического PAF-AH из бычьего мозга. Последующая обработка первоначально полученных последовательностей нуклеотидов бычьего мозга цитоплазматического PAF-AH была опубликована в работе Hattori et al., J. Biol. Chem 269(237); 23150-23155 (1994). 5 января 1995 г., спустя три месяца после выхода указанной работы нуклеотидная последовательность для липопротеина ассоциированного фосфолипазой A₂ (Lp-PLA₂), была опубликована в Smithkline Beecham PLC Patent Cooperation Treaty (PCT) International Publication No. WO 95/00649. Нуклеотидная последовательность Lp-PLA₂ отличается одной позицией при сравнении с PAF-AH настоящего изобретения. Различие нуклеотидов (в соответствии с положением 1297 SEQ ID NO: 7) приводит к различию аминокислот ферментов, кодированных полинуклеотидами. Аминокислота в положении 379 SEQ ID NO: 8 является валином, в то время как аминокислота в соответствующем положении в Lp-PLA₂ является аланином. Кроме того, нуклеотидная последовательность PAF-AH в соответствии с настоящим изобретением включает 124 основания на 5' конце и двадцать оснований на 3' конце, которые не присутствуют в Lp-PLA₂ последовательности. Три месяца спустя, 10 апреля 1995 г., Lp-PLA₂ последовательность была депонирована в GenBank под No. U24577, который отличается на одиннадцать позиций по сравнению с нуклеотидной последовательностью PAF-AH настоящего изобретения. Различие нуклеотидов (соответствующих позициям 79, 81, 84, 85, 86, 121, 122, 904, 905, 911, 983 и 1327 SEQ ID NO: 7) приводит к различию в четырех аминокислотах между ферментами, закодированными полинуклеотидами. Аминокислоты на позициях 249, 250, 274 и 389 SEQ ID NO: 8 являются соответственно лизином, аспарагиновой кислотой, фенилаланином и лейцином, в то время как соответствующая аминокислота на соответствующем положении в GenBank последовательности являются изолейцином, аргинином, лейцином и серином.

Рекомбинантный продукт PAF-AH делает возможным использование экзогенного PAF-AH в подобных или усиленных нормальных процессах рассасывания воспаления in vivo. Введение PAF-AH обеспечивает физиологическое преимущество после введения PAF антагонистического рецептора, так как PAF-AH является продуктом, обычно входящим в состав плазмы. Итак, вследствие того, что PAF рецепторы являются антагонистами, которые относятся по своей структуре к PAF, подавляющим природу активной PAF-AH активности, желаемое превращение PAF и окислительное фрагментирование фосфолипидов оказывается предотвращенным. Подавление активности PAF-AH посредством рецептора антагонистического противодействия PAF соответственно блокирует RAF рецептор посредством антагониста. Смотри Stremler et at. , supra. Кроме того, в области острого воспаления, например, при наличии окислителей, происходит инактивация природных ферментов PAF-AH по сравнению с увеличением локального уровня PAF и PAF-подобных составов, которые взаимодействуют с экзогенно вводимым PAF рецептором, являющимся антагонистом для взаимодействия с PAF рецептором. Наоборот, обработка с использованием рекомбинантного PAF-AH увеличивает активность эндогенного PAF-AH и компенсирует любые инактивирующие эндогенные ферменты.

Итак, существует необходимость идентифицировать и выделить последовательность полинуклеотидов человеческой плазмы кодирующих PAF-AH, чтобы получить материалы и методики, полезные для производства рекомбинантной PAF-AH, и производить реагенты для определения PAF-AH в плазме.

Сущность изобретения Настоящее изобретение предусматривает получение выделенных и изолированных полинуклеотидов (т.е. DNA (ДНК) и RNA (РНК) как кодирующих, так и некодирующих участков, PAF-AH кодирующих PAF-AH человеческой плазмы или активных фрагментов этих ферментов. Предпочтительно DNA последовательность настоящего изобретения включает геномические и cDNA последовательности, а также полностью или частично химически синтезированные DNA последовательности. DNA последовательность кодирует PAF-AH, определена в SEQ ID NO: 7, и DNA последовательность, которая гибридизирует в некодированные цепи при строго определенных условиях или может быть гибридизирована, но для случая избыточности генетического кода, рассматривается в данном изобретении. Также целью этого изобретения является биологическое реплицирование (т.е. копирование изолированных DNA последовательностей, сделанных in vivo или in vitro) DNA последовательностей настоящего изобретения. Автономно реплицирующие рекомбинантные конструкции, такие как плазмида и вирусные DNA векторы, включающие PAF-AH последовательности и особенно векторы, где DNA, кодирующая PAF-AN, непосредственно связана экспрессией с эндогенной или экзогенной регулирующей DNA последовательностью, а также терминатор транскрипции, также рассматривается в данном изобретении.

В соответствии с другим аспектом изобретения прокариотические (procariotic) или эукариотические (eucariotic) клетки-хозяева постоянно трансформируются DNA последовательностью в соответствии с изобретением, позволяя создать желаемую PAF-AH, экспрессируемую этими структурами. Продукты экспрессии PAF-AH клеткой-хозяином могут служить различным полезным целям. Такие клетки служат ценным источником иммуногенов для развития массы антител и особенно иммунореактивов с PAF-AH. Клетка-хозяин в соответствии с изобретением особенно полезна в методах для высокопроизводительных систем PAF-AH, где клетки развиваются в соответствующей культурной среде и требуемые полипептиды выделяются из клеток или из среды, в которой клетки развиваются с использованием, например, иммуноаффинной очистки.

Неиммунологический метод настоящего изобретения, позволяющий выделить PAF-AH из плазмы, предусматривает следующие этапы: (а) отделение частиц липопротеинов с низкой плотностью; (b) растворение этих липопротеиновых частиц с низкой плотностью в буфере, содержащем 10 мМ CHAPS для создания первого PAF-AH раствора ферментов; (с) помещение этого первого PAF-AH раствора ферментов на анионит DEAE в анионообменную колонку; (d) промывку указанного DEAE в анионообменной колонке с применением буфера с рН около 7,5 и содержащего 1мМ CHAPS; (e) элюирование PAF-AH фермента из указанного анианита DEAE в анионообменной колонке в виде фракции с использованием буфера с рН приблизительно 7,5, включающего градиент от 0 до 0,5 М NaCl; (f) получение фракций элюата из указанной DEAE в анионообменной колонке, имеющих активные ферменты PAF-АН; (g) концентрирование указанного состава активной фракции из DEAE в анионообменной колонке до 10 мМ CHAPS с целью создания второго раствора ферментов PAF-AH; (h) помещение указанного второго раствора ферментов PAF-АН в аффинную колонку с использованием аффинного лиганда голубого красителя; (i) элюирование фермента PAF-AH в указанной аффинной колонкe из аффинного лиганда, голубого красителя с применением буфера, содержащего 10 мМ CHAPS и chaotropic соли; (j) использование элюата из аффинного лиганда голубого красителя в аффинной колонне с Сu аффинным лигандом; (k) элюирование фермента PAF-AH в аффинной колонке из Сu аффинного лиганда с использованием буфера, содержащего 10 мМ CHAPS и имидазол; (I) воздействие на элюат из аффинной колонки с Сu аффинным лигандом в SDS-PAGE; и (m) выделение приблизительно 44 кДа фермента PAF-AH из SDS-полиакриламидного геля. Предпочтительно, чтобы буфер на стадии (b) представлял собой 25 мМ Tris-HCl, 10 мМ CHAPS, pH 7,5; буфер на стадии (а) содержал 25 мМ Tris-HCl, 1 мМ CHAPS; на стадии (h) предполагается использование колонки Blue Sepharose Fast Flow; буфер, используемый на стадии (i) содержит 25 мМ Tris-HCl, 10 мМ CHAPS, 0,5 М KSCN, pH 7,5; на стадии (j) предусматривается использование колонны Сu Chelating Sepharose; и буфер на стадии (k) содержит 25 мМ Tris-HCl, 10 мМ CHAPS, 0,5 М NaCl, 50 мМ имидазола при pH в пределах от 7,5 до 8,0.

Предлагаемый настоящим изобретением способ выделения ферментативноактивного PAF-AH из Е.соli, позволяющий получить PAF-AH, включает следующие этапы: (а) приготовление супернатанта центрифугированием из лизированной Е. соli с получением PAF-AH ферментов; (b) помещение этого центрифугированного супернатанта в аффинную колонку с аффинным лигандом голубого красителя; (с) элюирование фермента PAF-AH в этой аффинной колонке из аффинного лиганда голубого красителя, используя буфер, содержащий 10 мМ CHAPS и chaotropic соль; (d) помещение указанного элюата из аффинной колонки с аффинным лигандом голубого красителя в аффинную колонку с аффинным Сu лигандом; и (е) элюирование фермента PAF-AH в аффинной колонки из аффинного Сu лиганда с использованием буфера, содержащего 10 мМ CHAPS и имидазол. Предпочтительно, чтобы колонна на этапе (b), была Blue Sepharose Fast Flow; буфер на этапе (с) содержал 25 мМ Tris-HCl, 10 мМ CHAPS, 0,5 M KSCN, pH 7,5; колонка на этапе (d) была Сu Chelating Sepharose; и буфер на этапе (е) содержал 25 мМ Tris-HCl, 10 мМ СНАРS, 0,5 М NaCl, 100 мМ имидазола, pH 7,5.

Другой метод, предлагаемый данным изобретением, предусматривает выделение активных ферментов PAF-AH из Е.cоli, обеспечивающий получение PAF-AH, включает следующие этапы: (а) подготовку центрифугированного супернатанта из лизированных Е.соli с получением фермента PAF-AH; (b) разбавление этого центрифугированного супернатанта в буфере с низким pH, содержащим 10 мМ CHAPS; (с) помещением этого разбавленного центрифугированного супернатанта в катионообменную колонку при равновесном уровне pH порядка 7,5; (d) элюирование фермента PAF-AH из указанной катионообменной колонки с использованием 1 М соли; (е) повышение pH указанного элюата, полученного из этой катионообменной колонки, и доведение концентрации соли в этом элюате до величины порядка 0,5 М соли; (f) помещение указанного подготовленного элюата, полученного из катионообменной колонки в аффинную колонку с аффинным лигандом голубого красителя; (g) элюирование фермента PAF-AH в указанной аффинной колонке из аффинного лиганда голубого красителя, с использованием буфера, содержащего приблизительно от 2 М до 3 М соли; и (h) диализ указанного элюата из аффинной колонки из аффинного лиганда голубого красителя, используя буфер, содержащий 0,1% Tween. Желательно, чтобы буфер на стадии (b) содержал 25 мМ MES, 10 мМ CHAPS, 10 мМ EDTA, pH 4,9; колонка на этапе (с) является колонкой S sepharose с равновесием на уровне 25 мМ MES, 10 мМ CHAPS, 1 мМ EDTA, 50 мМ NaCl, pH 5,5; PAF-AH элюируется на стадии (d) с использованием 1 мМ NaCl; pH элюата на стадии (е) доводится до pH 7,5, благодаря введению 2 М Tris основания; на стадии (f) предполагается использование sepharose колонки; буферная жидкость, используемая на стадии (g), содержит 25 мМ Tris, 10 мМ CHAPS, 3 M NaCl, 1 мМ EDTA, pH 7,5; и буфер на стадии (h) содержит 25 мМ Tris, 0,5 М NaCl, 0,1% Tween 80, pH 7,5.

Еще один способ, предусматриваемый данным изобретением, обеспечивающий возможность выделения активных ферментов PAF-AH из E.coli, включает следующие этапы: (а) приготовление E.coli экстракта, получаемого растворением супернатанта PAF-AH после лизиса в буфере, содержащем CHAPS; (b) разбавление указанного супернатанта и помещение его в анионообменную колонку, равновесную на уровне pH 8,0; (с) элюирование фермента PAF-AH из указанной анионообменной колонки; (d) использование этого элюата из анионообменной колонки в аффинной колонке с аффинным лигандом голубого красителя; (е) элюирование в аффинной колонке из аффинного лиганда голубого красителя с применением буфера, содержащего 3,0 М соли; (f) разбавление элюата с голубым красителем в соответствующем буфере для выполнения хроматографии с применением гидроксилапатита (гидроксифосфата); (g) выполнение гидроксилапатитовой хроматографии с использованием буфера (содержащего или не содержащего CHAPS) для промывки и элюирования; (h) разбавление указанного элюата гидроксилапатита до требуемой концентрации соли для проведения катионообменной хроматографии; (i) помещение указанного разбавленного элюата гидроксилапатита в катионообменную колонку с уровнем pH в диапазоне примерно от 6,0 до 7,0; (j) элюирование PAF-AH из указанной катионообменной колонки с использованием буфера соответствующего состава; (k) проведение процесса катионообменной хроматографии при пониженных температурах; и (l) составление рецептуры PAF-AH в жидкой или замороженной форме без применения CHAPS.

Желательно на стадии (а) иметь лизисовый буфер, содержащий 25 мМ Tris, 100 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 20 мМ CHAPS, pH 8,0; на стадии (b) разведение супернатанта для анионообменной хроматографии выполняется в соотношении 3-4 с применением 25 мМ Tris, 1 мМ EDTA, 10 мМ CHAPS, pH 8,0 и в этом процессе используется Q-Sepharose колонка с установившимся равновесием, достигаемым с использованием 25 мМ Tris, 1 мМ EDTA, 50 мМ NaCl, 10 мМ CHAPS, pH 8,0; на стадии (с) анионообменная колонка элюируется с применением 25 мМ Tris, 1 мМ EDTA, 350 мМ NaCl, 10 мМ CHAPS, pH 8,0; на стадии (d) элюат, полученный на стадии (с), используется непосредственно в аффинной колонке с аффинным лигандом голубого красителя; на стадии (е) колонка элюируется с использованием буфера, содержащего 3 М NaCl, 10 мМ CHAPS, 25 мМ Tris, pH 8,0; на стадии (f) разведение элюата голубого красителя для гидроксилапатитовой хроматографии осуществляется посредством разведения в 10 мМ фосфате натрия, 100 мМ CHAPS, pH 6,2; на стадии (g) гидроксилапатитовая хроматография проводится с использованием гидроксилапатитовой колонки с равновесием, достигнутым с применением 10 мМ фосфата калия, 100 мМ NaCl, 10 мМ CHAPS и элюирование производится с применением 50 мМ фосфата натрия, 100 мМ NaCl (с использованием или без применения этого соединения) 10 мМ CHAPS, pH 7,5; на стадии (h) разбавление указанного гидроксилапатитового элюата для катионообменной хроматографии осуществляется посредством введения в буфер, имеющий pH приблизительно от 6,0 до 7,0, содержащего фосфат натрия (с использованием или без применения CHAPS); на стадии (i) используется S Sepharose колонка в равновесном состоянии, достигаемом применением 50 мМ фосфата калия, (с применением или без использования) 10 мМ CHAPS, pH 6,8; на стадии (j) элюирование обеспечивается применением соответствующего состава буфера, такого как фосфат калия 50 мМ, 12,5 мМ аспарагиновой кислоты, 125 мМ NaCl, pH 7,5, содержащего 0,01% Tween-80; и на стадии (k) катионообменная хроматография осуществляется при 2-8^oС. Примеры соответствующих буферных составов для использования на этапе (l), который обеспечивают стабильность PAF-AH, включают 50 мМ фосфата калия, 12,5 мМ аспарагиновой кислоты, 125 мМ NaCl pH 7,4 (возможно, с добавлением или без добавления Tween-80, и или Pluronic F68) или 25 мМ фосфата калия в качестве буфера, содержащего (по крайней мере) 125 мМ NaCl, 25 мМ аргинина и 0,01% Tween-80 (с добавлением или без добавления Pluronic F68 в количестве около 0,1 и 0,5%).

Еще один способ, предлагаемый настоящим изобретением, предусматривает для выделения активных ферментов rPAF-AH в качестве продукта, получаемого из Е. соli, включает стадии: (а) приготовление экстракта Е.соli, который обеспечивает получение в качестве конечного продукта растворимого rPAF-AH супернатанта после лизиса в буферной жидкости, содержащей Triton Х-100, (b) разведение указанного супернатанта и использование его для иммобилизации металлического аффинитета обменной колонки в состоянии равновесии при рН около 8,0; (с) элюирование продукта rPAF-AH из указанного иммобилизированного металлического аффинитета обменной колонки с буферной жидкостью, содержащей имидазол; (d) доведение до требуемой концентрации соли и помещение этого элюата, полученного из указанного иммобилизированного металлического аффинитета обменной колонки, в гидрофобную интерактивную колонку (НIС#1); (е) элюирование указанного НIС#1 посредством уменьшения концентрации соли и/или увеличения концентрации детергента; (f) титрования указанного НIС#1 элюата до получения рН близкого к 6,4; (g) использование этого приготовленного НIС# 1 элюата в катионообменной колонке (СЕХ#1) с выравниванием рН до величины близкой к 6,4; (h) элюирование указанного СЕХ#1 с использованием концентрированного хлорида натрия; (i) доведение указанного СЕХ#1 элюата, содержащего хлорид натрия, до концентрации порядка 2,0 М; (j) помещение указанного приготовленного СЕХ#1 элюата в гидрофобную интерактивную колонку и использование примерно 2,0 М (НIС#2) в состоянии равновесия на уровне рН 8,0 и около 2,0 М с использованием хлорида натрия; (k) элюирование указанного Н1С#2 посредством снижения концентрации соли и/или увеличения концентрации детергента; (l) разведение указанного Н1С#2 элюата и доведение до величины рН на уровне порядка 6,0; (m) помещение приготовленного Н1С#2 элюата в катионообменную колонку (СЕХ#2) с выравниванием равновесного состояния на уровне рН 6,0; (n) элюирование rPAF-AH продукта из указанного СЕХ#2 с использованием соответствующего буфера.

Желательно, чтобы на стадии (а), рассмотренной выше, использовался лизис-буфер, содержащий 90 мМ TRIS, 0,125% Triton X-100, 0,6 М NaCl, pH 8,0, и лизис протекал в гомогенизаторе высокого давления; на стадии (b) супернатант разводится в равновесном буфере (20 мМ TRIS, 0,5 NaCl, 0,1 Triton X-100, pH 8,0), цинк-хелатная колонка (Chelating Sepharose Fast Flow, Pharmacia, Uppsala, Швеция) заправляется, приводится в состояние равновесия с использованием буфера, загружается разбавленным супернатантом и промывается 20 мМ TRIS, 0,5 М NaCl, 4 М мочевиной, 0,1% Triton X-100, pH 8,0, и производится последующая промывка 20 мМ TRIS, 0,5 М NaCl, 0,02% Triton X-100, pH 8,0; на этапе (с) элюирование производится с использованием 20 мМ Tris, 50 мМ имидазола, 0,02% Triton X-100, pH 8,0; на этапе (d) элюат соответствует 1 мМ EDTA и 2 М NaCl, Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (Pharmacia) приводится в состояние равновесия с использованием буфера (2,0 М NaCl, 25 мМ Tris, 0,02% Triton X-100, pH 8,0), загружается подготовленным элюатом из этапа (с) при комнатной температуре, промывается выравнивающим буфером и промывается с использованием 25 мМ NaPO₄, 0,02% Triton X-100, pH 6,5 при расходе 30 см/ч; на стадии (е) элюирование производится с применением 25 мМ NaPO₄, 3% Triton X-100, pH 6,5; на стадии (g) Macro-Prep High S колонка (Bio-Rad Labs, Richmond, CA) приводится в состояние равновесия с применением буфера (20 мМ NaPO₄, 0,02% Triton X-100, pH 6,4), загружается полученным на этапе (f) элюатом, промывается равновесным буфером и промывается 25 мМ Tris, 0,02% Triton X-100, pH 8; на этапе (h) элюирование производится с использованием 25 мМ Tris, 0,02% Triton X-100, 1,3 М NaCl, pH 8,0; на этапе (j) Bakerbond Wide Pore Hi-PropyI С₃ (Baker, Phillipsburg, NJ) приводится в состояние равновесия с применением выравнивающего буфера (2,0 М NaCl, 25 мМ Tris, 0,02% Triton Х-100, pH 8,0), загружается подготовленным на этапе (i) элюатом при комнатной температуре, промывается равновесным буферном и промывается 25 мМ Tris, 0,02% Triton X-100, pH 8,0 при 30 см/ч; на этапе (k) элюирование производится с использованием 10 мМ Tris, 3,0% Triton X-100, pH 8,0; на этапе (l) разведение производится в равновесном буфере (20 мМ сукцината, 0,1% PLURONIC F68, pH 6,0); на этапе (m) SP Sepharose Fast Flow (Pharmacia) колонка приводится в состояние равновесия с использованием равновесного буфера из этапа (l), загружается элюатом из этапа (I) и промывается равновесным буфером; и на этапе (n) элюэнт содержит 50 mm NaPO₄, 0,7 M NaCl, 0,1% PLURONIC F68, 0,02% TWEEN 80, pH 7,5.

Продукт PAF-АН может быть получен выделением из материала природных клеток или может быть синтезирован химическими методами, но образуется в результате процедуры рекомбинации, включающей прокариотические или эукариотические клетки-хозяина в соответствии с изобретением. Продукты PAF-AH частично или полностью характеризуются аминокислотными последовательностями в соответствии с SEQ ID NO: 8, как это и следовало предполагать. Специфические их особенности заключаются в том, что они являются фрагментами в которых недостает первых двенадцати N-концевых аминокислот PAF-AH взрослого человека аминокислотной последовательности, вошедшей в SEQ ID NO: 8, в частности имеющих Met₄₆, Ala₄₇ или Ala₄₈ SEQ ID NO:8, как первоначальные N-концевые аминокислоты. Также рассматриваемые компоненты является фрагментом, в котором недостает до тридцати С-концевых аминокислот аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8, в частности имеющих Ilе₄₂₉, и Leu₄₃₁, как С-концевой остаток. В дальнейшем рассматриваются варианты, являющиеся разновидностями PAF-AH или таких PAF-AH, которые имеют аминокислотную замену в последовательности SEQ ID No: 8 выбранную из групп, содержащих S 108 A, S 273 A, D 286 A, D 286 N, D 296 А, D 394 А, D 338 А, Н 351 А, Н 395 А, Н 399 А, С 67 S, С 229 S, C 291 S, С 334 S, С 407 S, D 286 А, D 286 N и D 304 А. Как указывалось выше, закодированные полинуклеотидами (включая DNA), фрагменты или варианты фрагментов, предусмотренные изобретением так же, как и методы получения рекомбинантнных таких фрагментов или их вариантов посредством выращивания клеток-хозяев, включают и такие как DNA. Ранее рассмотренные продукты PAF-AH включают прокариотические полипептидные продукты экспрессии кодированных DNA аминокислотных групп Met₄₆ посредством Asn₄₄₁ SEQ ID NO: 8, в форме rРН. 2, и прокариотический полипептидный продукт экспрессии закодированных DNA аминокислотных групп Met₄₆ посредством Ile₄₂₉ SEQ ID NO: 8, в форме rРН. 9. Оба этих продукта rРН.2 и rРН.9 обладают меньшей амино-концевой гетерогенностью, чем, например, соответствующий прокариотический продукт экспрессии закодированной DNA полностью развитой последовательности PAF-AH, предшествующий трансляции первоначального кодона. Более того, продукт гРН.9 показывает большую карбокси-концевую гомогенность (последовательность). Использование клеток-хозяев млекопитающих предусматривается для таких пост-трансляционных видоизменений (напр. миристоляции, гликозилирования, срезания, липидизации и тирозин, серии или треонин фосфоризации) которые могут быть необходимы для создания условий оптимальной биологической активности рекомбинантных продуктов экспрессии по изобретению. Продукты PAF-AH в соответствии с изобретением могут быть в форме полипептидов полной длины, фрагментов или их вариантов. Варианты могут включать аналоги PAF-AH, в которых одно или более соединений (напр. природно закодированных) аминокислот исключены или заменены, или в которых добавлены одна или более видов аминокислот: (1) без потери одной или более ферментационной активности или иммунологических характеристик, специфических для PAF-AH; или (2) со специфическим частичным нарушением биологической активности PAF-AH. Протеины или другие молекулы, которые связаны с PAF-AH, могут быть использованы для модуляции их активности.

Кроме того, этим изобретением предусматриваются материалы антител (напр. моноклональные и поликлональные антитела, антитела с единой цепью, химерные антитела, CDR-привитые антитела и др. подобные им) и другие связанные протеины, специфические для PAF-AH. Специфическими примерами связанных протеинов в соответствии с изобретением являются моноклональные антитела, получаемые посредством гибридов 90G11D и 90F2D, которые были депонированы в Американской коллекции типовых культур (АТСС), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 30 сентября 1994 г. и были соответственно определены как Accession Nos. HB 11724 и НВ 11725. Другим примером связанных протеинов в соответствии с изобретением являются моноклональные антитела, получаемые посредством гибридомы 134А, которая была депонирована в АТТС 1 июня 1995 г. и определена как Accession No. HB 11900, Протеины или другие молекулы (напр. липиды или малые молекулы), которые специфически связаны с PAF-AH, могут быть идентифицированы в плазме, используя PAF-AH, изолированный от плазмы, рекомбинантный PAF-AH, PAF-AH варианты или клетки, такие как продукты экспрессии. В то же время связанные протеины оказываются полезными в составе материала для иммобилизации так же, как и для выделения PAF-AH, и полезны при определении или оценке содержания PAF-AH в средах или образцах тканей посредством известных иммунологических процедур. Возможно также использование антиидиотипических антител, характерных для PAF-AH-специфических субстанций антител.

Предметом патентования является также научное значение информационного вклада, достигнутого при открытии DNA и аминокислотной последовательности в соответствии с настоящим изобретением. Как один из многочисленных примеров, знание последовательности c-DNA для PAF-AH делает возможным выделение DNA / DNA гибридизации геномической последовательности DNA, кодирующей PAF-AH, и специфической экспрессии регулируемых последовательностей PAF-AH, таких как стимуляторы, операторы и др. DNA / DNA процедуры гибридизации выполняется с DNA последовательностями настоящего изобретения при условиях строгого соблюдения норм, в частности процесса, позволяющего выделять кодирующую DNA аллельного варианта PAF-AH, других структурных элементов протеинов одного или более биохимических и/или иммунологических свойств PAF-AH, и соединений гомологов протеинов PAF-AH, не свойственных организму человека. Информационная последовательность DNA, принятая в данном изобретении, также делает возможным развитие посредством рекомбинирования гомологов или "выбивания" рекомбинантных DNA [см. напр. Kapecchi, Science, 244: 1288-1292 (1989)] грызунов, при котором затруднено определение функционального фермента PAF-AH, или которое определяет вариант PAF-AH фермента. Полинуклеотиды в соответствии с изобретением, когда они соответственно маркированы, используются для исследования гибридизации с целью определения способности клеток к синтезу PAF-AH. Полинуклеотиды в соответствии с изобретением могут также служить основой диагностических методик, используемых для идентификации генетического изменения (генетических изменений) в локус PAF-AH, который лежит в основе болезненного состояния или состояний. Кроме того, с использованием настоящего изобретения возможно использование этих нечувствительных полинуклеотидов для регулирования экспрессии PAF-AH с применением этих клеток, которые обычно осуществляют этот процесс.

Далее рассматриваются результаты введения PAF-AH, приготовленного в соответствии с изобретением, в организм млекопитающего, особенно человека, с целью улучшения условий патологических воспалений. Основываясь на условиях патологического воспаления, связанного с применением PAF-AH, было обнаружено, что введение PAF-AH служит признаком, например, при лечении астмы [Miwa et al., J. Clin. Invest., 82; 1983-1991 (1988); Hsieh et al., J. Allergy Clin. Immunol. , 91: 650-657 (1993); и Yamashita et al., Allergy, 49: 60-63 (1994)] , анафилаксии (Venable et al., supra], шоков [Venable et al., supra] , перфузионных нарушений и ишемии центральной нервной системы [Lindsberg et al., (1991), supra], вызванных антигенами артритов [Zarco et al., Clin. Exp. Immunol., 88: 318-323 (1992)], атерогенезиса [Handley et al. , Drug Dev. Res., 7: 361-375 (1986)], заболевания Крона [Denizot et al., Degestive Disease and Science, 37(3): 432-437 (1992)], ишемического некроза кишечника / некрозного энтероколита [Denizot et al., supra и Caplan et al., Acta Paediatr., Suppl. 396: 11-17 (1994)], язвенных колитов (Denizot et al., supra), ишемического шока [Satoh et al., Stroke, 23: 1090-1092 (1992)], ишемических повреждений мозга [Lindsberg et al. , Stroke, 21: 1452-1457 (1990) и Lindsberg et al., (1991) supra], соматического волчаночного эритематоза [Matsuzaki et al., Clinica Chimica Acta, 210: 139-144 (1992)], острого панкреатита [Kald et al., Pancreas, 8(4): 440-442 (1993)], септицемии (Kald e tal. , supra), острого постстрептококкового гломерулонефрита [Mezzano et al. , J. Am. Soc. Nephrol., 4: 235-242 (1993), легочного отека, наступающего после IL-2 терапии [Rabinovici et al. , J. Сlin. Invest., 89: 1669-1673 (1992)] , аллергических воспалений [Watanabe et al., Br. J.Pharmacol., 111: 123-130 (1994)], ишемической почечной недостаточности [Grino et al., Annals of Internal Medicine, 121(5): 345-347 (1994); отклонениях при родах [Hoffman et al., Am. J. Obstet. Gynecol., 162(2): 525-528 (1990) и Maki et al., Proc. Natl. Sci. USA, 85: 728-732 (1988)]; синдрома респираторного недомогания у взрослых [Rabinovici et al. , J. Appl. Physiol., 74(4): 1791-1802 (1993); Matsumoto et al., Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 19 509-515 (1992); и Rodriguez-Roisin et al., J. CHn. Invest., 93: 188-194 (1994)]. Здесь также рассматривается использование препарата PAF-AH для воздействия на инфекцию вируса человеческого иммунодефицита (HIV) центральной нервной системы. "Воздействие", как описывается здесь, включает как профилактику, так и терапевтическое лечение.

Известны описания патологических исследований, выполненных на животных. Например, модели исследований астмы и ринита на мышах описаны в примере 16 этой работы; модель артритов кролика описана в работе Zarco at al., supra; опыты с крысами при ишемических некрозах кишечника / некрозных энтероколитах описаны в работе Furukawa et al., Ped. Res., 34, (2): 237-241 (1993) и Caplan et al., supra; опыты паралича у кролика описаны в исследованиях Lindsberg et al. , (1990), supra; эксперименты с волчанкой у мыши описаны в работе Matsuzaki et al., supra; исследования острого панкреатита у крыс описаны у Kald et al., supra: модель легочного отека у крысы после IL-2 терапии описана у Rabinovici et al., supra; модель аллергического воспаления у крысы приводится у Watanabe et al., supra); модель почечного аллотрансплантата собаки описана в работе Watson et al., Transplantation, 56(4): 1047-1049 (1993); и модель синдрома острого респираторного заболевания у крысы и морской свинки соответственно описана в исследовании Rabinovici et al., supra, и LeIlouch-Tubiana, Am. Rev. Respir. Dis, 137: 948-954 (1988).

Специфической особенностью изобретения является состав PAF-AH используемый при лечении млекопитающих, чувствительных или страдающих от патологических условий введения PAF-AH, включая введение PAF-AH млекопитающим в количестве, достаточном для увеличения эндогенной активности PAF-AH и для инактивации патологического действия PAF-AH у млекопитающих.

Предусмотренный настоящим изобретением терапевтический/фармацевтический состав включает продукты PAF-AH и физиологически приемлимые растворы или носители и может также включать другие компоненты, обладающие противовоспалительным эффектом. Приводимая количественная дозировка достаточна для увеличения эндогенной активности PAF-AH и для инактивации патологического действия PAF. Определение дозы приводится в Remmington's Pharmaceutical Sciences, 18 издание, Mack Publishing Co., Taston, PA (1990). Дозировка изменяется в пределах от 0,1 до почти 1000 мг PAF-AH/кг веса тела. Терапевтический состав в соответствии с изобретением может допускать изменения в соответствии с патологическими условиями применения. Например, посредством внутривенного введения, подкожно, соматически, суппозиторно и/или через легкие.

Для патологических условий легких может быть рекомендовано внутрилегочное введение PAF-AH. Предполагается, что использование внутрилегочного введения доз может осуществляться с применением различных устройств для введения, включая, например, распылители, дозирующий ингалятор и ингалятор порошков, которые имеют общее назначение. Введение различных протеинов в легкие и систему кровообращения путем ингаляции аэрозольных форм описано в Adjei et al., Pharm. Res., 7(6): 565-569 (1990) [лейпролид ацетат]; Braquet et al., J. Cardio. Pharm., 13 (Supp. 5) s. 143-146 (1989) (эндотелин-1); Hubbard et al. , Annals of Internal Medicine, III (3), 206-212 (1989) (1- антитрипсин); Smith et al., J. Clin. Invest., 84: 1145-1146 (1989) (-1-протеиназа ингибитор); Debs et al. , J. lmmunol., 140: 3482-3484 (1993) (рекомбинантный гамма-интерферона и фактор альфа некрозного новообразования); Patent Cooperation Treaty (PCT) International Publication No. WO 94/20069, опубликовано 15 сентября 1994 г. (рекомбинант пегелированных гранулоцитарных лейкоцитов колоний фактора стимуляции).

Детальное описание чертежей Множество других аспектов и особенностей настоящего изобретения будут ясны на основании последующего детального его описания в соответствии с чертежами, приводимыми ниже: Фиг. 1 - фотография PVDF мембраны, содержащей выделенную из человеческой плазмы PAF-AH.

Фиг. 2 - диаграмма, показывающая активность ферментов рекомбинантного PAF-AH из человеческой плазмы.

Фиг. 3 - схематическая диаграмма, иллюстрирующая изображение фрагментов рекомбинантного PAF-AH и их каталитическую активность.

Фиг.4 представляет результаты масс-спектрометрического анализа рекомбинантного продукта PAF-AH, rРН.2.

Фиг.5 представляет результаты масс-спектрометрического анализа рекомбинантного продукта PAF-AH, rРН.9.

Фиг. 6 - диаграмма, иллюстрирующая блокирование отека лап у крыс, вызванного RAF, при локальном введении рекомбинантного PAF-AH в соответствии с настоящим изобретением.

Фиг. 7 - диаграмма, иллюстрирующая блокирование отека лап у крыс, вызванного RAF, при внутривенном введении PAF-AH.

Фиг. 8 - диаграмма, показывающая, что PAF-AH блокирует вызывающий PAF отек, но не устраняет отека, вызванного зимосан-А.

Фиг. 9А и 9В представляют результаты ответной реакции в зависимости от дозы а