Icam-4 и его диагностическое использование

Icam-4 и его диагностическое использование

Реферат

 

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике нейропатологий с помощью нового полипептида, обозначенного как ICAM-4. Сущность изобретения включает способ диагностики, заключающийся в получении жесткой пробы от индивидуума, контактировании этой пробы с антителом, иммунореактивным к ICAM-4, количественной оценке уровня связывания ICAM-4 антитела и его сравнения по отношению к контролю. Преимущество изобретения заключается в ускорении метода диагностики нейропатологии. 9 з.п.ф-лы, 6 табл.

Настоящая заявка является частичным продолжением заявки на патент США рег. 08/656984, поданной 6 июня 1996 и находящейся в настоящее время на рассмотрении, и частичным продолжением заявки на патент США рег. 08/481130, поданной 7 июня 1995 и находящейся в настоящее время на рассмотрении, которая является частичным продолжением заявки на патент США рег. 08/245295, поданной 18 мая 1994 и находящейся в настоящее время на рассмотрении, которая в свою очередь является частичным продолжением заявки на патент США рег. 08/102852, поданной 5 августа 1993 и в настоящее время отозванной, которая является частичным продолжением заявки на патент США рег. 08/009266, поданной 22 января 1993 и в настоящее время отозванной, которая является частичным продолжением заявки на патент США рег. 07/894061, поданной 5 июня 1992 и в настоящее время отозванной, которая является частичным продолжением заявки на патент США рег. 07/889724, поданной 26 мая 1992 и в настоящее время отозванной, которая является частичным продолжением одновременно рассматриваемой заявки на патент США рег. 07/827689, поданной 27 января 1992 и в настоящее время отозванной.

Область, к которой относится изобретение В общих чертах настоящее изобретение относится к молекулам клеточной адгезии, а более конкретно к клонированию и экпрессии ДНК, кодирующей не известный до настоящего времени полипептид, обозначенный "ICAM-4", который обладает структурным сходством с молекулами межклеточной адгезии ICAM-1, ICAM-2 и ICAM-R.

Предпосылки создания изобретения Исследования, проводимые в последнее десятилетие, пролили свет на молекулярные события, сопутствующие межклеточным взаимодействиям в организме, а особенно на те события, которые вызывают миграцию и активацию клеток иммунной системы, при этом совсем недавно было выявлено, что они обеспечивают развитие и нормальную физиологическую функцию клеток нервной системы. См, в основном, работу Springer, Nature, 346: 425-434 (1990), относящуюся к клеткам иммунной системы, и работы Yoshihara et al., Neurosci. Res. 10: 83-105 (1991) и Sonderegger & Rathjien, J.Cell.Biol., 119: 1387-1394 (1992), относящиеся к клеткам нервной системы. Белки клеточной поверхности, а особенно так называемые молекулы клеточной адгезии ("CAMs") являются, соответственно, объектами фармацевтических исследований и разработок, целью которых является проникновение в процессы экстравазации лейкоцитов в места воспаления и миграции лейкоцитов в различные ткани-мишени, а также дифференцировку нейронов и образование сложной нервной сети. Выделение и характеризация молекул клеточной адгезии, клонирование и экпрессия ДНК-последовательностей, кодирующих эти молекулы, и получение терапевтических и диагностических агентов, влияющих на воспалительные процессы и развитие функции нервной системы, были также объектом многочисленных заявок США и иностранных патентных заявок. См. Edwards, Current Opinion in Therapeutic Patents, 1(11): 1617-1630 (1991), и в частности, опубликованные "патентные документы", цитируемые в настоящей заявке.

Из работ, предшествующих настоящей заявке, особый интерес представляет предварительная идентификация и характеризация некоторых медиаторов событий клеточной адгезии, "лейкоинтегринов", LFA-1, МАС-1, и gp 150,95 (обозначенных в номенклатуре WHO CD18/CD11a, CD18/CD11b, и CD18/CD11c, соответственно), которые образуют подсемейство гетеродимерных белков клеточной поверхности, "интегринов", присутствующих на В-лимфоцитах, Т-лимфоцитах, моноцитах и гранулоцитах. См. например, Таблицу 1 Springer, см. выше, на стр. 429. Представляют также интерес и другие одноцепочечные адгезивные молекулы (CAMs), участвующие в активации, адгезии, подвижности лейкоцитов и т.п., которые являются событиями, сопровождающими воспалительный процесс. Например, в настоящее время предполагается, что перед экстравазацией лейкоцитов, которая характеризует воспалительные процессы, происходит активация интегринов, конститутивно экспрессированных на лецкоцитах, с последующим прочным взаимодействием лиганд/рецептор между интегринами (например, LFA-1), и одной или обеих из двух различных молекул клеточной адгезии (ICAMs), обозначенных IСАМ-1 и ICAM-2, которые экспрессируются на поверхности эндотелиальных клеток кровеносных сосудов и на других лейкоцитах.

Подобно другим CAMs, охарактеризованным до настоящего времени [например, молекуле васкулярной адгезии (VCAM-1), описанным в РСТ WO 90/13300, опубликованной 15 ноября 1990; и молекуле клеточной адгезии эндотелиальных тромбоцитов (РЕСАМ-1), описанной в работе Newman et al., Science, 247: 1219-1222 (1991) и в РСТ WO91/10683, опубликованной 25 июля, 1991], IСАМ-1 и ICAM-2 являются структурно гомологичными другим членам суперсемейства генов иммуноглобулинов в той внеклеточной части, каждая из которых состоит из серии доменов, имеющих аналогичный карбоксиконцевой мотив. "Типичный" иммуноглобулинподобный домен содержит петлевую структуру, обычно "заякоренную" дисульфидной связью между двумя цистеинами на концах каждой петли. IСАМ-1 включает пять иммуноглобулинподобных доменов; ICAM-2, который отличается от IСАМ-1 по своему распределению в клетке, включает два таких домена; РЕСАМ-1 включает шесть доменов; a VCAM включает шесть или семь доменов в зависимости от вариантов сплайсинга, и т.п. Более того, обычно CAMs включают гидрофобную "трансмембранную" область, очевидно участвующую в ориентации молекулы на клеточной поверхности, и карбоксиконцевую "цитоплазматическую" область. Графические модели правильного расположения CAMs обычно показывают, что эта молекула заякорена в клеточной мембране в трансмембранной области цитоплазматическим "хвостом", простирающимся в цитоплазму клетки, и одним или несколькими иммуноглобулинподобными петлями, простирающимися кнаружи от клеточной поверхности.

Ряд нервных клеток экпрессирует на своей поверхности рецепторы с внеклеточными lg-подобными доменами, структурно схожими с ICAMs. Например, Yoshihara et al., см. выше. Помимо lg-подобных доменов, многие адгезивные молекулы нервной системы также содержат тандемно повторяющиеся фибронектинподобные последовательности во внеклеточном домене.

Был предложен ряд терапевтических применений молекул межклеточной адгезии, включая использование, основанное на предполагаемой способности IСАМ-1 связываться с риновирусом человека. Европейская патентная заявка 468257 А, опубликованная 29 января 1992, направлена, например, на разработку мультимерных конфигураций и форм IСАМ-1 (включая полноразмерные и усеченные молекулярные формы), которые, предположительно, обладают повышенной лиганд/рецепторсвязывающей активностью, особенно при связывании с вирусами, лимфоцитассоциированными антигенами и патогенами, такими как Plasmodium falciparum.

Аналогичным образом был предложен ряд применений для белков, иммунологически связывающихся с молекулами межклеточной адгезии. Заявка WO91/16928, опубликованная 14 ноября 1991, например, направлена на "очеловеченные" химерные антитела против IСАМ-1 и на их использование для лечения специфических и неспецифических воспалений, вирусных инфекций и астмы. В WO92/04034, опубликованной 19 марта 1992, описаны антитела против IСАМ-1 и их фрагменты, используемые для лечения эндотоксического шока. В заявке W092/06119, опубликованной 16 апреля 1992, описано ингибирование IСАМ-1-зависимого воспалительного ответа с использованием антиидиотипических антител против IСАМ-1.

Несмотря на фундаментальное представление о явлениях клеточной адгезии, которое было сформировано благодаря идентификации и характеризации белков внеклеточной алгезии, таких как IСАМ-1, и лимфоцитарные интерактивные интегрины, такие как LFA-1, картина этого явления далека от завершения. В основном, очевидно, что в воспалительных процессах и направленной миграции лимфоцитов по всему организму принимает участие множество других белков. Так, например, в заявке на патенты США рег. 07/827689, 07/889724, 07/894061 и 08/009266 и в соответствующей опубликованной заявке РСТ WO 93/14776 (опубликованной 5 августа 1993) описано клонирование и экспрессия белка, родственного ICAM, ICAM-R. Описание этих заявок вводится в настоящее описание посредством ссылки, а ДНК-последовательности и аминокислотные последовательности ICAM-R представлены в настоящем описании в SEQ ID No:4. Было обнаружено, что этот новый лиганд экспрессируется на лимфоцитах, моноцитах и гранулоцитах человека.

Особый интерес для настоящей заявки представляет тот факт, что была идентифицирована другая ICAM-подобная поверхностная молекула, которая, в отличие от любых известных молекул ICAM, имеет тканеспецифическую экспрессию. В работе Моri et al. , [Рrос. Natl. Acad. Sci. (USA) 84: 3921-3925 (1987)] сообщалось об идентификации специфичного для конечного мозга антигена головного мозга кролика, обладающего специфической иммунореактивностью с моноклональным антителом 271А6. Этот поверхностный антиген назван теленцефалином. В работе Imamura et al., [Neurosci. Letts. 119:118-121 (1990)] с использованием поликлонального антитела для оценки локализованной экспрессии, было высказано мнение, что экспрессия теленцефалина, при визуальном осмотре коры головного мозга кошек, обнаруживает изменения в слоях ткани, а также, что экспрессия рассматриваемого теленцефалина является функцией стадии развития. Затем, Oka et al., [Neuroscience 35:93-103 (1990)] сообщили о выделении теленцефалина с использованием моноклонального антитела 271А6. В этой публикации сообщается, что молекулярная масса этой поверхностной молекулы составляет около 500 кДа и что эта молекула состоит из четырех субъединиц, каждая из которых имеет нативную молекулярную массу 130 кДа и приблизительно 100 кДа после обработки N-гликаназой. Yoshihiro et al., [Neurosclence, Reserch Supplement 18, p.S83 (1994)] на 17-м Ежегодном заседании Японского общества по нейронаукам, проведенном 7-9 декабря 1993 в Нагое (Nagoya, Япония) и на 23-м Ежегодном заседании Общества по нейронаукам, проведенном 9 ноября 1993 в Вашингтоне D.C. [Society for Neuroscience Abstracts 19 (1-3) р.646 (1993)] сообщили кДНК-последовательность и аминокислотную последовательность для кроличьего теленцефалина. Сообщенная выведенная аминокислотная последовательность дает основание предположить, что 130 кДа-теленцефалин представляет собой интегральный мембранный белок с девятью внеклеточными иммуноглобулин(lg)-подобными доменами. Из этих доменов восемь дистальных доменов обнаружили гомологию с другими lg-подобными доменами ICAM. Те же самые сведения были сообщены Yoshihara et al., в Neuron 12: 543-553 (1994).

Таким образом очевидно, что специалистам необходимо продолжать поиск других белков, участвующих в межклеточных взаимодействиях в организме человека, а особенно необходимо получить информацию, которая может быть использована для специфической идентификации и характеризации таких белков с точки зрения их аминокислотной последовательности. Более того, такие молекулы, до определенной степени, могут служить основой для получения терапевтических и диагностических агентов, а главное, для выявления ДНК, кодирующих эти молекулы. Такая основополагающая информация должна обеспечить, inter alia, крупномасшабное продуцирование белков; идентификацию клеток, продуцирующих эти белки в природных условиях; и получение антител или новых специфически реагирующих с ними связывающих белков; и/или ингибирование реакций связывания лиганд/рецептор, в которых они участвуют.

Сущность изобретения В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к очищенным и выделенным полинуклеотидам (например, к ДНК-последовательностям, РНК-транскриптам и их антисмысловым олигонуклеотидам), кодирующим новый полипептид "IСАМ-4", а также их новые полипептидные варианты (включая их фрагменты и аналоги с делециями, заменами и добавлениями), обладающие одной или более биологическими активностями связывания лиганд/рецептор, и/или иммунологические свойства, специфичные для IСАМ-4. Биологические ICAM-4-специфические активности связывания лиганд/рецептор охватывают взаимодействия как внеклеточного, так и цитоплазматического IСАМ-4 с другими молекулами (например, в процессах межклеточной адгезии и/или передаче сигнала). Предпочтительные ДНК-последовательности настоящего изобретения включают геномные и кДНК-последовательности, а также полностью или частично химически синтезированные ДНК-последовательности. Рассматриваемый в настоящей заявке предпочтительный полинуклеотид представлен в SEQ ID No:1 и кодирует крысиный вид ICAM-4. Рассматриваются биологические реплики выделенных ДНК-последовательностей настоящего изобретения (то есть копии ДНК-последовательностей, полученные in vitro или in vivo). Также получены автономно реплицирующиеся рекомбнантные конструкции, такие как плазмидные и вирусные ДНК-векторы, включающие последовательности ICAM-4, а особенно векторы, где ДНК, кодирующая IСАМ-4 или вариант IСАМ-4, правильно соединена с эндогенной или экзогенной ДНК-последовательностью, регулирующей экспрессию.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения клетки-хозяева, особенно клетки одноклеточных хозяев, такие как прокариотические и эукариотические клетки, стабильно трансформируют ДНК-последовательности настоящего изобретения способом, обеспечивающим экспрессию в этих клетках нужных полипептидов.

Клетки-хозяева, экспрессирующие продукты IСАМ-4 и вариантов IСАМ-4, могут служить для различных целей. Учитывая то, что экспрессированные продукты "обнаруживаются" на поверхности клеток-хозяев, можно сказать, что эти клетки могут представлять собой ценный иммуноген для разработки антител, вступающих в специфические иммунные реакции с IСАМ-4 и вариантами IСАМ-4. Очевидно, что клетки-хозяева настоящего изобретения могут быть использованы в способах крупномасштабного продуцирования IСАМ-4 и вариантов IСАМ-4, где эти клетки выращивают в подходящей культуральной среде, и нужные полипептидные продукты выделяют из клеток и из среды, в которой эти клетки были культивированы.

Новые IСАМ-4 настоящего изобретения могут быть получены в виде изолятов из природных клеточных источников, но, наряду с продуктами ICAM-4-варианта, их, предпочтительно, продуцируют с помощью рекомбинантной техники, предусматривающей использование клеток настоящего изобретения. Рассматриваемая в настоящей заявке аминокислотная последовательность для полипептида IСАМ-4 представлена в SEQ ID No:2. Эти продукты могут быть получены полностью или частично в гликозилированной, частично или полностью в дегликозилированной или в негликозилированной форме в зависимости от клетки-хозяина, выбранной для рекомбинантного продуцирования, и/или от обработки после выделения. Варианты IСАМ-4 настоящего изобретения могут содержать водорастворимые или не растворимые в воде мономерные, мультимерные или циклические фрагменты IСАМ-4, которые включают все или часть одного или нескольких участков доменов, определенных выше и обладающих биологическими или иммунологическими свойствами IСАМ-4, включая, например, способность связываться с партнером связывания IСАМ-4 и/или ингибировать связывание IСАМ-4 с его природным партнером по связыванию. Варианты IСАМ-4 настоящего изобретения могут также содержать полипептидные аналоги, где одна или несколько специфических аминокислот делетированы или заменены: (1) без потери, а предпочтительно с усилением одной или нескольких биологических активностей или иммунологических свойств, специфичных для ICAM-4; или (2) без специфического повреждения конкретной функции связывания лиганд/рецептор. Рассматриваются также полипептиды-аналоги, включающие дополнительные аминокислотные (например, лизин или цистеин) остатки, которые способствуют образованию мультимера.

Настоящее изобретение также относится к антителам (например, моноклональным и поликлональным антителам, фрагментам антител, одноцепочечным антителам, химерным антителам, CDR-привитым антителам и т.п.) и к другим связывающим белкам (например, полипептидам и пептидам), которые являются специфичными для ICAM-4, или вариантов ICAM-4 (то есть не способными вступать в реакцию с молекулами межклеточной адгезии ICAM-1, ICAM-2 и ICAM-R, с которыми ICAM-4 имеет структурное сходство). Настоящее изобретение также относится к гибридомной клеточной линии, которая специфически секретирует моноклональные антитела настоящего изобретения. Предпочтительными гибридомами настоящего изобретения являются гибридомы, обозначенные 127А, 127Н, 173Е, 1791 и 179Н. Молекулы антител могут быть получены с использованием природных или рекомбинантных ICAM-4, или вариантов ICAM-4, или клеток, экспрессирующих такие продукты на своей поверхности. Связывающие белки настоящего изобретения, кроме того, могут быть использованы для характеризации структуры сайта связывания (например, эпитопов и/или восприимчивости связывающих свойств к модификациям в аминокислотной последовательности ICAM-4).

Связывающие белки могут быть использованы в свою очередь для иммунизации, а также для очистки полипептидов настоящего изобретения и идентификации клеток, имеющих эти полипептиды на своей поверхности. Очевидно также, что они могут быть использованы в модуляции (то есть блокировании, ингибировании или стимуляции) биологической активности связывания лиганд/рецептор, включая ICAM-4, а особенно тех эффекторных функций ICAM-4, которые участвуют в специфических и неспецифических иммунных системных ответах. Рассматриваются также антиидиотипические антитела, специфичные к молекулам антител против ICAM-4, и использование этих антиидиотипических антител для модуляции иммунного ответа. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам выявления нейропатологии у индивидуумов, включающих стадии: а) получения жидкой пробы от индивидуума; b) контактирования этой пробы с антителом, являющимся специфически иммунореактивным для ICAM-4; с) количественной оценки уровня связывания ICAM-4/антитела в пробе; и d) сравнения уровня связывания ICAM-4/антитела в пробе с уровнем связывания ICAM-4/антитела у индивидуумов (контроли), о которых известно, что они не имеют нейропатологии. Анализы на детекцию и количественную оценку IСАМ-4 на клеточных поверхностях и в физиологической жидкости организма, таких как сыворотка или цереброспинальная жидкость, могут включать, например, одно антитело или множество антител в анализе формата типа "сэндвича". При детекции IСАМ-4 в физиологической жидкости организма антитела настоящего изобретения также могут быть использованы для оценки наличия нейропатологии, которая может коррелировать с повышенными уровнями IСАМ-4 в кровотоке. Такими нейропатологиями являются, но не ограничиваются ими, церебральная ишемия (т.е. шок), вызванная различными заболеваниями, включая, например, тромбоз, эмболию, церебральную геморрагию, вызванную аневризмой сосуда, вазоспазм и т.п. Количественная оценка циркулирующего IСАМ-4 позволяет также дифференцировать различные формы эпилепсии и, кроме того, позволяет определить стадии прогрессирования СПИД'а. Другими нейродегенеративными расстройствами, для диагностики которых могут быть использованы измерения циркулирующих IСАМ-4, являются различные формы болезни Альцгеймера и другие корковые деменции (такие как болезнь Пика, болезнь диффузных корковых телец Леви и дегенерация лобной доли) субкорковая деменция (включая болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона и прогрессирующее поражение надъядерной зоны), ряд первичных психических расстройств (таких как депрессия, шизофрения и психоз), а также приобретенная деменция, вызванная, например, инфекциями, васкулитами и алиментарными расстройствами (например, недостаточной функцией щитовидной железы, дефицитом витамина В12), сосудистыми расстройствами (обширным инфарктом, лакунарным состоянием, болезнью Бинсвангера), токсическим энцефалитом (например, воздействием моноокиси углерода, тяжелых металлов или другими промышленными загрязнениями) и опухолями.

Научное значение информации, получаемой благодаря определению ДНК и аминокислотных последовательностей, является очевидным. В качестве одного ряда примеров можно указать тот факт, что знание последовательности кДНК для ICAM-4 дает возможность путем ДНК/ДНК-гибридизации выделить геномные последовательности ДНК, кодирующие ICAM-4, и конкретно определить регуляторные последовательности, контролирующие экспрессию ICAM-4, такие как промоторы, операторы и т.п. Предполагается, что процессы ДНК/ДНК-гибридизации, осуществляемые с использованием ДНК-последовательностей настоящего изобретения в строгих условиях, являются теми процессами, которые позволяют выделить ДНК, кодирующие аллельные варианты ICAM-4, другие структурно родственные белки, имеющие одно или несколько общих биологических и/или иммунологических свойств, характерных для ICAM-4, и белки, гомологичные ICAM-4 от других видов. ДНК настоящего изобретения могут быть использованы в анализе методом ДНК/ДНК-гибридизации для выявления способности клеток синтезировать ICAM-4. Настоящее изобретение также относится к антисмысловым полинуклеотидам, подходящим для регуляции экспрессии ICAM-4 в тех клетках, которые обычно экспрессируют IСАМ-4. В качестве второго ряда примеров можно отметить, что знание ДНК и аминокислотных последовательностей IСАМ-4 дает возможность генерировать рекомбинантными методами варианты IСАМ-4, такие как гибридные слитые белки (называемые иногда "иммуноадгезионными"), характеризующиеся присутствием последовательностей белка IСАМ-4 и константных участков тяжелой цепи иммуноглобулина и/или шарнирных областей. См., Capon et al., Nature, 337: 525-531 (1989); Ashkenazi et al, , P.N.A.S (USA), 88: 10535-10539 (1991); и РСТ WO 89/02922, опубликованной 6 апреля 1989. Слитые белки вариантов ICAM-4 могут также включать, например, выбранные внеклеточные домены ICAM-4 и части других молекул клеточной адгезии.

ДНК настоящего изобретения также позволяет идентифицировать нетранслируемые ДНК-последовательности, которые специфически стимулируют экспрессию полинуклеотидов, правильно соединенных с промоторными областями. Идентификация и использование таких промоторных последовательностей являются особенно предпочтительными в случаях, например, переноса генов, когда может потребоваться специфическая экспрессия гетерологичных генов в ограниченных условиях среды окружающей нервной ткани. В настоящем изобретении также рассматриваются векторы, содержащие промоторы настоящего изобретения, а также химерные генные конструкции, которые включают промотор настоящего изобретения, правильно соединеннный с гетерологичной полинуклеотидной последовательностью и с сигналом терминации транскрипции.

Информация о ДНК-последовательности и об аминокислотных последовательностях, полученная с помощью настоящего изобретения, также дает возможность проводить систематические анализы структуры и функции IСАМ-4 и выявить те молекулы, с которыми этот белок взаимодействует на внеклеточном и внутриклеточном уровнях. Идиотипы моноклональных антител против IСАМ-4 настоящего изобретения являются репрезентативными для таких молекул и могут имитировать природные связывающие белки (пептиды и полипептиды), посредством которых модулируется внутриклеточная и внеклеточная активность IСАМ-4 или посредством которых IСАМ-4 модулирует внутриклеточные и внеклеточные события. Альтернативно они могут представлять новый класс модуляторов активности IСАМ-4. Антиидиотипические антитела в свою очередь могут представлять новый класс биологически активных эквивалентов ICAM-4. In vitro-анализ для идентификации антител и других соединений, которые модулируют активность IСАМ-4, может предусматривать, например, иммобилизацию ICAM-4 или природного лиганда, с которым связывается ICAM-4, детектируемое мечение неиммобилизованного партнера связывания, инкубирование партнеров связывания вместе и определение влияния тестируемого соединения на количество связанной метки, где уменьшение количества связанной метки в присутствии тестируемого соединения по сравнению с количеством связанной метки в отсутствие тестируемого соединения указывает на то, что тестируемый агент является ингибитором связывания ICAM-4.

Информация о ДНК-последовательности, представленная в настоящем изобретении, дает возможность разработать стратегии гомологичной рекомбинации или стратегии "нокаута" [см., например, Kapecchi, Science, 244: 1288-1292 (1989)] для грызунов, которые не экспрессируют функциональный белок ICAM-4 или которые экспрессируют вариантный белок ICAM-4. Такие грызуны могут быть использованы в качестве моделей для исследования активности ICAM-4 или модуляторов ICAM-4 in vivo.

Подробное описание изобретения Описание родственной заявки на патент США рег. 08/102852, поданной 5 августа 1993, вводится в настоящее описание посредством ссылки. Примеры этой заявки направлены, inter alia, на получение и конструирование олигонуклеотидных зондов для PCR-амплификации ICAM- ДНК; использование этих зондов для амплификации человеческого геномного фрагмента, который гомологичен ДНК, кодирующим IСАМ-1 и ICAM-2, но отличается от этих ДНК; скрининг кДНК-библиотеки с использованием этого геномного фрагмента в целях выделения дополнительных ICAM-R-кодирующих последовательностей; скрининг кДНК-библиотек для выделения полноразмерной кДНК-последовательности, кодирующей ICAM-R; характеризацию данных о ДНК и аминокислотных последовательностях для ICAM-R, особенно последовательностей, родственных IСАМ-1 и ICAM-2; продуцирование клеток-хозяев млекопитающих, экспрессирующих ICAM-R; оценку критериев участия ICAM-R в событиях клеточной адгезии, включая СD18-зависимый и СD18-независимый пути метаболизма; ингибирование клеточной адгезии с ICAM-R пептидами, происходящими от ICAM-R; экспрессию вариантов ICAM-R; получение и характеризацию антител против ICAM-R и его фрагментов; картирование эпитопов ICAM-R, распознаваемых моноклональными антителами против ICAM-R; анализ распределения и биохимическую характеризацию ICAM-R и РНК, кодирующей ICAM-R; оценку ICAM-R на гомотипическую межклеточную адгезию и иммунную активацию/пролиферацию клеток; характеризацию моноклональных антител против ICAM-R; оценку дифференциального фосфорилирования и цитоскелетных ассоциаций цитоплазматического домена ICAM-R. Описана также идентификация ДНК, кодирующей IСАМ грызунов, которая, как считалось, является крысиным гомологом человеческого ICAM-R, и использование этой ДНК для конструирования и экспрессии ДНК, кодирующей слитые белки глутатион-S-трансферазы. Более подробное описание идентификации этой ДНК грызунов можно найти в родственной заявке (США рег. 08/102852) в Примере 6, и это описание изложено в настоящей заявке в Примере 1. По мере идентификации все больших частей ICAM-кодирующей последовательности грызунов стало очевидным, что ДНК ICAM грызунов не кодирует крысиный гомолог человеческого ICAM-R, а фактически кодирует новый полипептид ICAM, который в настоящем описании назван ICAM-4. Для выявления событий, которые привели к идентификации ICAM-4, ниже подробно описана хронология этих событий.

Сначала была идентифицирована геномная последовательность ICAM-4 грызунов, которая кодирует область, гомологичную домену 2 (в настоящем описании SEQ ID No:3, а в заявке США рег. 08/102852 SEQ ID No:23) человеческого ICAM-R (в настоящем описании SEQ ID No:4). Затем была также идентифицирована перекрывающаяся геномная ДНК (в настоящем описании SEQ ID No:5, а в заявке США рег. 08/102852, SEQ ID No:26), кодирующая область домена 2 SEQ ID No:3, и последовательность для IСАМ-1. С использованием SEQ ID No:3 в качестве зонда была идентифицирована кДНК селезенки грызунов (в настоящем описании SEQ ID No:6, а в заявке США рег. 08/102852, SEQ ID No:25), кодирующая домены 2-5, а также пятый домен, который ранее не наблюдался как домен ICAM. В это же самое время было установлено, что только что идентифицированные ДНКs грызунов кодируют гомолог грызунов для человеческого ICAM-R, однако сравнение первичных последовательностей 3'областей этих ДНКs с ДНК других ICAM оказалось достаточно трудным.

Последующее выделение 1 т.п.о. - кДНК-клона из библиотеки крысиной селезенки и амплификация RT-PCR-фрагмента, показала, что часть кДНК и геномного клонов не была секвенирована. Другой продукт RT-PCR-амплификации (SEQ ID No: 7) подтвердил это упущение. Было установлено, что фрагмент 177 п.о. был вырезан из геномного и кДНК-клонов путем EcoRI-гидролиза клонов и выделения этих последовательностей из фага для исследования ДНК путем секвенирования. Повторный анализ SEQ ID No:5 и 6 с рассмотрением этих других последовательностей позволил идентифицировать более точные и полные последовательности для первоначально выявленных геномных и кДНК-клонов, которые в их исправленной форме представлены в данном описании как SEQ ID No:8 и 9.

Для идентификации полной кодирующей последовательности для ICAM-4 была выделена кДНК головного мозга крысы (SEQ ID No:10) и была определена 5'-концевая последовательность путем быстрой 5'-амплификации концов кДНК (5'-RACE); продукт амплификации представлен в SEQ ID No:11. Суммарная информация, полученная для RT-PCR-клона (SEQ ID No:7), кДНК головного мозга (SEQ ID No: 10) и продукта RACE-амплификации (SEQ ID No:11), позволила идентифицировать полную кодирующую последовательность для ICAM-4(SEQ ID No:1).

Настоящее изобретение проиллюстрировано нижеследующими примерами. Более конкретно, в Примере 1 описано клонирование неполной ДНК ICAM-4. В Примере 2 описан Нозерн-блот-анализ транскрипции ICAM-4 грызуна. В Примере 3 описано выделение полноразмерной кДНК ICAM-4 грызуна. Пример 4 относится к in situ-гибридизации ICAM-4 в ткани головного мозга. В Примере 5 описано продуцирование слитых белков ICAM-4 в прокариотах. В примере 6 описано продуцирование моноклональных антител, специфичных для гибридных белков "крысиный ICAM-4/GST". В Примере 7 описана экспрессия растворимых белков крысиных ICAM-4 в бакуловирусной экспрессирующей системе. В Примере 8 описано продуцирование моноклональных антител, специфичных для крысиного ICAM-4, экспрессированного в бакуловирусной системе. В Примере 9 описан иммуноцитохимический анализ экспрессии крысиного ICAM-4. В Примере 10 описано клонирование геномной ДНК, кодирующей ICAM-4 человека. В Примере 11 описано клонирование кДНК, кодирующей ICAM-4 человека. В Примере 12 описан Нозерн-блот-анализ экспрессии ICAM-4 человека. В примере 13 описано продуцирование гибридных белков "ICAM-4 человека/GST". В Примере 14 описано продуцирование моноклональных антител, иммуноспецифичных для ICAM-4 человека. В Примере 15 описана разработка анализа методом "захвата" для определения концентрации растворимого ICAM-4 в индивидуальной жидкости. В примере 16 описан метод анализа методом захвата, используемый для оценки концентрации ICAM-4 в сыворотве пациентов с инсультом. Пример 17 относится к оценке транскрипции ICAM-4 в крысиной модели эпилепсии. В Примере-18 описано измерение концентрации циркулирующего ICAM-4 для оценки различных нейродегенеративных расстройств. В Примере 19 описано клонирование промоторной области для ICAM-4 человека.

ПРИМЕР 1 Клонирование ДНК для IСАМ крысы А. Выделение геномной ДНК для домена 2 IСАМ крысы Крысиную геномную библиотеку, сконструированную в EMBL3, скринировали [³²Р]-меченным зондом, генерированным с помощью PCR из ДНК, кодирующей домен 2 IСАМ-3 человека. Последовательность этого зонда представлена в SEQ ID No: 12. Бляшки библиотеки переносили на найлоновые мембраны Hybond N+ (Amersham, Arlington Heights, IL). Скринирование всех ДНК и геномных библиотек осуществляли в соответствии со стандартными протоколами. Предварительную гибридизацию и гибридизацию проводили в растворе 40-50% формамида, 5х Денхардта, 5Х SSPE и 1,0% ДСН при 42^oС. Зонды ([³²P]-меченные) добавляли в раствор для гибридизации в концентрации 10⁵-10⁶ об/мин/мл. После проведения гибридизации в течение 16-18 часов найлоновые мембраны интенсивно промывали при комнатной температуре в 2Х SSPE с 0,1% ДСН, а затем экспонировали с рентгеновской пленкой в течение ночи при -80^oС. Для получения клонального фага позитивные бляшки подвергали одному или нескольким циклам гибридизации. ДНК, полученную из лизата позитивных клонов, субклонировали в pBS+ и секвенировали.

Первый геномный клон, кодирующий домен 2 крысиного IСАМ, идентифицировали на установление его гомологичности по отношению к участкам домена 2 в других членах семейства IСАМ (см., например, Таблицу 1 заявки на патент США рег. 08/102852), который все же отличается от ранее установленных нуклеотидных последовательностей для крысиного ICAM-1 [Kita, et al., Biochem. Biophys. Acta 1131: 108-110 (1992)] или мышиного ICAM-2 [Xu et al., J. Immunol. 149; 2560-2565 (1992)]. Последовательности нуклеиновой кислоты и выведенные аминокислотные последовательности для этого клона описаны в одновременно рассматриваемых заявках, родственных настоящей заявке, как соответствующие вариантные формы крысиного ICAM-R, и были представлены как SEQ ID No:23 и 24, соответственно, в заявке США 08/102/852. В данной заявке эти же самые последовательности представлены в SEQ ID No:3 и 13, соответственно.

Второй перекрывающийся клон был также идентифицирован с использованием тех же зондов и оценен на присутствие в нем последовательности домена 2 ICAM SEQ ID No:3 и 5'-ДНК, кодирующей, по крайней мере, часть крысиного ICAM-1. Нуклеиновокислотная последовательность для этого клона представлена в одновременно рассматриваемой родственной заявке как SEQ ID No:26, а в настоящей заявке она представлена как SEQ ID No:5. Этот второй клон указывает на то, что фрагмент гена ICAM первого клона и ген, кодирующий крысиный ICAM-1, расположены на той же самой крысиной хромосоме на расстоянии друг от друга в 5 т.п.о.

В. Выделение кДНК для ICAM крысы Для идентификации более полной белок-кодирующей последовательности для полипептида IСАМ [³²Р]-меченную ДНК, кодирующую последовательность домена 2 из крысиного геномного клона, идентифицированного в разделе A (SEQ ID No:3, см. выше), использовали для скрининга ряда библиотек кДНК от различных типов клеток крысы и мыши, включая макрофаг (Clontech, Palo Alto, CA), лимфоцит периферической крови (PBL)(Clontech), Т-клетки (сконструированные на месте) и селезенку (Clontech) крысы, и PBL (Clontech), Т-клетки (сконструированные на месте) и В клетки (сконструированные на месте) мыши.

Единичный клон был идентифицирован в библиотеке кДНК селезенки крысы (Clontech), которая содержала пять lg-подобных доменов, четыре из которых были гомологичны доменам 2-5 как в IСАМ-1, так и в ICAM-R. Более того, этот клон включал 3'ДНК, кодирующую очевидный пятый lg-подобный домен, который до этого не был идентифицирован в каком-либо другом полипептиде ICAM. Кроме того, этот клон содержал необычную 3'последовательность, которая позднее была определена как неполный интрон (обсуждаемый ниже), локализованный между доменами 4 и 5, что дает основание предположить, что этот клон является продуктом незрелого или неправильно сплайсированного транскрипта. Присутствие этого уникального домена и определение того, что 3' область не имеет точного сходства с другими известными ICAM, наводит на мысль о том, что эта относящаяся к ICAM ДНК возможно кодирует новый крысиный полипептид ICAM. Нуклеиновокислотная последовательность для этого клона представлена в заявке, родственной настоящей заявке, как SEQ ID No:25; а в настоящей заявке нуклеиновокислотная последовательность для этого клона кДНК селезенки представлена в SEQ ID No:6.

С. поворотный анализ кДНК и геномной кДНК крысы Согласно заявке на патент США рег. 08/102852, поданной 5 августа 1993 г. , было определено, что в неполном клоне кДНК селезенки крысы (SEQ ID No:25 в родственной заявке и SEQ ID No:6 в настоящей заявке) и в геномном клоне печени крысы (SEQ ID No:26 в родственной заявке, и SEQ ID No:5 в настоящей заявке) отсутствует внутренний EcoRI-фрагмент в 177 п.о, который являлся частью каждого из этих клонов, но был утерян при осуществлении стадии субклонирования, когда вставки библиотеки были удалены из вектора путем EcoRI-гидролиза и лигированы в секвенирующий вектор. Тот факт, что кДНК и геномные клоны могут терять кодирующий фрагмент, стал очевидным после сравнения первичной геномной последовательности и кДНК-последовательности крысы с различными продуктами RT-PCR-амплификаци, включая SEQ ID No:7, которая обнаруживает брешь в крысиной последовательности.

Последующее выделение и сравнение первичных последовательностей кДНК из библиотеки селезенки с испо