Химерные флавивирусные вакцины

Химерные флавивирусные вакцины

Реферат

 

Изобретение относится к медицине и касается химерного живого инфекционного аттенуированного вируса, который применяется для создания химерных флавивирусных вакцин. Изобретение включает химерный живой инфекционный аттенуированный вирус, содержащий вирус желтой лихорадки, у которого нуклеотидная последовательность, кодирующая белок prМ-Е, делетирована, укорочена или мутирована таким образом, что функциональный белок prМ-Е не экспрессируется, но при этом в геном вируса желтой лихорадки интегрирована нуклеотидная последовательность, кодирующая белок prМ-Е второго, отличающегося, флавивируса таким образом, что белок prМ-Е второго флавивируса экспрессируется, а также молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую этот вирус. Преимущество изобретения заключается в создании химерных вирусов, которые могут применяться в качестве живых аттенуированных вакцин. 3 с. и 15 з.п. ф-лы, 7 ил., 6 табл.

Настоящее изобретение касается аттенуированных вирусов, применимых в качестве вакцин против заболеваний, вызываемых флавивирусами.

Некоторые представители семейства флавивирусов представляют реальную или потенциальную угрозу здоровью населения планеты в целом. Например, японский (или комариный) энцефалит является серьезной проблемой для здоровья населения, включая миллионы жителей Дальнего Востока, подвергающихся риску этого заболевания. Вирус лихорадки денге при частоте до 100 миллионов случаев первичной лихорадки денге и более 450 тысяч случаев геморрагической лихорадки денге в мире является одним из наиболее серьезных заболеваний человека, передаваемых членистоногими переносчиками. Другие флавивирусы также обусловливают ряд эндемичных заболеваний различной природы и способны завоевывать новые регионы вследствие изменений климатических условий, динамики популяций переносчиков и нарушений естественной среды, обусловливаемых деятельностью человека. Эти флавивирусы включают, например, вирус энцефалита Сент-Луиса, который вызывает спорадическое, но серьезное острое заболевание на среднем востоке, юго-востоке и западе США; вирус западного Нила, который вызывает лихорадочное состояние, сопровождающееся острым энцефалитом, которое широко распространено в Африке, на Среднем Востоке, в бывшем СССР и в части районов Европы; вирус энцефалита долины Мюррей, который обусловливает локальную нейропатологию, распространен в Австралии; и вирус клещевого энцефалита, который распространен на территории бывшего Советского Союза и в Восточной Европе, где распространены его переносчики - иксодовые клещи, - который вызывает тяжелую форму энцефалита в этом регионе.

Вирус гепатита С (HCV) является еще одним членом семейства флавивирусов: он характеризуется организацией генома и параметрами размножения, сходными, но не идентичными по сравнению с описанными выше флавивирусами. Вирус HCV по большей части передается по парентеральному типу, он обусловливает хронический гепатит, который может перерастать в цирроз печени и гепатоклеточную карциному, а в США является ведущей причиной таких поражений печени, которые определяют необходимость ортотопической трансплантации печени.

Семейство вирусов Flaviviridae обособлено от альфавирусов (таких как WEE, VEE, EEE, SFV и т.п.) и в настоящее время насчитывает три рода - собственно флавивирусы, пестивирусы и вирусы гепатита С. Полностью сформировавшиеся зрелые вирионы флавивирусов состоят из трех структурных белков - оболочечного (Е), капсидного (С) и мембранного (М), а также семи неструктурных белков (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B и NS5). У незрелых флавивирусов, обнаруживаемых в инфицированных клетках, выявлен премембранный белок (рrМ), который является предшественником белка М.

После связывания вирионов на рецепторах клеток-хозяев белок Е претерпевает необратимое конформационное преобразование под воздействием кислой среды эндосом, вследствие чего обусловливается связывание бислоя оболочки вириона и эндоцитозных пузырьков, в результате вирусный геном переходит в цитоплазму клетки-хозяина. Вирусы клещевого энцефалита (ТВЕ), содержащие рrМ, являются некомпетентными по такому связыванию: это определяет то, что протеолитическое расщепление предшественника рrМ является необходимым для появления компетентных по связыванию вирионов и обладающих полной инфекционностыо вирусов (Guirakhoo, et al., 1991, J. General Virol, 72, Pt. 2:333-338). Воздействием хлоридом аммония на поздних этапах вирусной репликации были получены вирусы энцефалита долины Мюррей (MVE), содержащие рrМ: было показано, что они некомпетентны по слиянию. При использовании специфичных по последовательности пептидов и моноклональных антител было показано, что пропептид рrМ взаимодействует с аминокислотами 200-327 в составе белка Е. Такое взаимодействие является необходимым для защиты белка Е от необратимой конформационной перестройки, определяемой процессом созревания в кислых пузырьках в экзоцитозном метаболическом механизме (Guirakhoo et al., 1992, Virology, 191:921-931).

Расщепление предшественника рrМ с образованием белка М происходит незадолго до выхода вирионов с участием фурино-подобной клеточной протеазы (Stadler et al., 1997, J. Virol, 71:8475-8481), что является необходимым для включения гемагглютинационной активности, фузогенной активности и инфекционности самих вирионов. Белок М отщепляется от своего полипептидного предшественника (рrМ) за консенсусной последовательностью R-X-R/K-R (где Х - произвольная аминокислота, К - лизин, R - аргинин) и включается в состав липидной вирусной оболочки вместе с белком Е.

Последовательности, по которым происходит процессинг, являются консервативными не только у флавивирусов, но также и в составе белков других, не близкородственных вирусов, таких как белки РЕ2 коронавирусов мышей, РЕ2 альфавирусов, НА вирусов гриппа и р160 ретровирусов. Расщепление полипептида-предшественника является существенным для инфекционности вируса, но не для образования его вирионов. Было показано, что в случае с вирусной химерой ТВЕ/денге-4 изменение сайта процессинга рrМ приводит к снижению нейровирулентности этой химеры (Pletnev et al., 1993, J. Virol. 67:4956-4963), что согласуется с более ранними данными о том, что эффективный процессинг предшественника рrМ является необходимым для проявления полной инфекционности (Guirakhoo et al., 1991, цит. выше; 1992, цит. выше; Heinz et al., 1994, Virology, 198:109-117). Антитела к полипептиду рrМ могут опосредовать проявление иммунитета, очевидно, благодаря нейтрализации выходящих вирионов, включающих непроцессированный рrМ. Сайт протеолитического расщепления белка РЕ2 вируса VEE (включает 4 аминокислоты) был делегирован с применением направленного мутагенеза у инфекционного клона (Smith et al., 1997, ASTMH Meet., Dec. 7-11). Делеционные мутанты реплицировались с высокой эффективностью, а белки РЕ2 инкорпорировались в состав вирионов. При анализе этого мутанта у нечеловекообразных обезьян и было показано проявление 100%-ной сероконверсии и проявление защищенности всех иммунизованных обезьян от летального исхода.

Изобретение представляет химерные живые инфекционные аттенуированные вирусы, которые включают: (a) первый вирус желтой лихорадки (например, штамма 17D), представляющий живой аттенуированный вакцинный вирус, в геноме которого нуклеотидная последовательность, кодирующая белок рrМ-Е либо делетирована, либо укорочена, либо мутирована таким образом, что функциональный белок рrМ-Е первого флавивируса не экспрессируется; и (b) интегрированная в геном первого флавивируса нуклеотидная последовательность, кодирующая вирусный оболочечный компонент (белки рrМ-Е) второго, отличающегося флавивируса, таким образом, что белок рrМ-Е второго флавивируса экспрессируется из состава измененного генома первого флавивируса.

Таким образом, химерный вирус включает гены и кодируемые продукты, необходимые для внутриклеточного размножения, относящиеся к первому флавивирусу, и гены и кодируемые продукты оболочки второго флавивируса. Следовательно, вирус, содержащий все антигенные детерминанты, ответственные за индукцию нейтрализующих антител, в результате заражения химерным вирусом, в этом случае будет генерировать антитела только в отношении второго флавивируса.

Предпочтительным живым вирусом, предназначенным для использования в качестве первого флавивируса в составе химеры по настоящему изобретению, является вирус желтой лихорадки. По крайней мере одна из известных вакцин использует такой живой ослабленный вирус: эта вакцина известна под маркой YF17D и используется для вакцинации человека уже более 50 лет. Вакцина YF17D охарактеризована в большом числе публикаций, включая материалы Смитберна с соавт. и Фристоуна (Smithburn et al., 1956, "Yellow Fever Vaccination", World Health Org., p. 238; Freestone, 1995, In "Vaccines", 2d ed., eds Plotkin et al. , W. B. Saunders, PA). Кроме того, вирус желтой лихорадки был изучен на генетическом уровне (Rice et al. , 1985, Science, 229:726-733), а также представлялась информация о соотношении генетических и фенотипических параметров (Marchevsky et al., 1995, Amer. J. Trop. Med. Hyg., 52:75-80).

Предпочтительными флавивирусами для использования в качестве второго флавивируса в химерах по настоящему изобретению, соответственно, являющиеся источниками иммунизующего антигена, являются вирус японского энцефалита (JE), вирус лихорадки денге (DEN, например, любой из типов денге 1-4), вирус энцефалита долины Мюррей (MVE), вирус энцефалита Сент-Луиса (SLE), вирус лихорадки западного Нила (WN), вирус клещевого энцефалита (ТВЕ) и вирус гепатита С (HCV). Кроме того, флавивирусами, пригодными для использования в качестве второго флавивируса, являются вирус Куньинь, вирус центрально-европейского энцефалита, вирус весенне-летнего клещевого энцефалита, вирус повассанской лихорадки, вирус киасанурской лесной болезни и вирус омской геморрагической лихорадки. У предпочтительного химерного вируса по настоящему изобретению последовательность, кодирующая белок рrМ-Е второго флавивируса, используется для замещения последовательности, кодирующей белок рrМ-Е, в составе генома первого живого вируса желтой лихорадки. У предпочтительного химерного вируса последовательность, кодирующая белок рrМ-Е, является производной от ослабленного вирусного штамма, такого как вакцинный штамм. Также, как это будет описание далее, область рrМ в составе такого белка может нести мутацию, которая предотвращает процессинг с образованием зрелого мембранного белка.

Также настоящее изобретение представляет способы предотвращения или лечения флавивирусной инфекции у млекопитающих, таких как человек, путем введения химерного флавивируса по настоящему изобретению этому млекопитающему, использование химерных флавивирусов по настоящему изобретению при приготовлении лекарственных препаратов, предназначенных для профилактики и лечения флавивирусных инфекций, молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих химерные флавивирусы по настоящему изобретению, и способы производства химерных флавивирусов по настоящему изобретению.

Изобретение имеет ряд преимуществ. Например, благодаря тому что химерные вирусы по настоящему изобретению являются живыми и способными к размножению, они могут быть использованы для формирования долговременного иммунитета. Поскольку эти вирусы включают в геноме репликационные гены аттенуированного вируса (например, вируса желтой лихорадки штамма 17D), то химерный вирус аттенуирован до такой степени, которая делает его безопасным при использовании в отношении человека.

Другие параметры и преимущества настоящего изобретения будут ясны из нижеследующего подробного описания, чертежей и формулы изобретения.

Фиг. 1 схематически представляет этапы генетических манипуляций, которые были осуществлены с целью конструирования химерного вируса по настоящему изобретению, включающего вирус желтой лихорадки и вирус японского энцефалита (YF/JE).

Фиг. 2 показывает кривые роста химерных вирусов YF/JE по настоящему изобретению в клеточных культурах, пригодных для получения человеческой вакцины.

Фиг. 3 - график, показывающий сравнение роста вирусов RMS (Research Master Seed, YF/JE SA₁₄-14-2) и YF-Vax в клетках линии MRC-5.

Фиг.4 - график и таблица, показывающие результаты анализа нейровирулентности химерного вируса YF/JE по настоящему изобретению, проведенного на мышах.

Фиг.5 является схематическим представлением двухплазмидной системы, предназначенной для создания химерного вируса YF/DEN-2. По сути, эта стратегия соответствует той стратегии, которая описана в связи с созданием химерного вируса YF/JE.

Фиг. 6 является схематическим представлением структуры модифицированных клонов YF, сконструированных по делетированию части белка NS1 и (или) экспрессии чужеродных белков под контролем собственного сайта входа в рибосому (IRES). Фигура показывает только часть E/NS1 генома вируса. Стоп-кодон внедрен в участок, кодирующий С-конец оболочечного белка Е. Трансляция по направлению вниз инициируется в пределах межгенной открытой рамки считывания (ORF) действием фактора IRES-1, тем самым определяя экспрессию чужеродных белков (например, белков Е1 и (или) Е2 вируса HCV). Второй фактор IRES (IRES-2) контролирует инициацию трансляции неструктурного сегмента вируса желтой лихорадки, с которого экспрессируются плотно упакованные укороченные белки NS1 (например, NSldel-1, NSldel-2 или NSldel-3). Размер делеции в составе NS1 обратно пропорционален размеру ORF, соединенной с IRES-1.

Фиг.7 - график, показывающий ответ по нейтрализации антител у мышей, иммунизованных химерной вакциной YF/JE SA₁₄-14-2.

Настоящее изобретение представляет химерные флавивирусы, которые могут быть использованы в вакцинации против флавивирусных инфекций. Конструирование и анализ химерных флавивирусов по настоящему изобретению, таких как химер, состоящих из вируса желтой лихорадки и вируса японского энцефалита (JE), вируса лихорадки денге 1-4 (DEN 1-4), вируса энцефалита долины Мюррей (MVE), вируса энцефалита Сент-Луиса (SLE), вируса лихорадки западного Нила (WN), вируса клещевого энцефалита (ТВЕ) и вируса гепатита С (HCV) осуществляли следующим образом.

Флавивирусные белки получали путем трансляции единственной длинной открытой рамки (кодирующей, например, структурные белки - капсидный (С), предшественник мембранного (рr-М) и оболочечный (Е), а также неструктурные белки) и затем путем серии посттрансляционных процессинговых этапов протеолитического расщепления. Химерные флавивирусы по настоящему изобретению, как это обсуждалось выше, характеризуются замещением последовательностей, кодирующих белки рr-М и Е одного флавивируса, последовательностями, кодирующими белки рr-М и Е другого флавивируса. Таким образом, создание таких химерных флавивирусов включает формирование новых комбинаций капсидных и премембранных белков, с одной стороны, и оболочечных и неструктурных белков (NS1), с другой стороны, происходящих от двух разных флавивирусов. Расщепление между участками каждой из этих двух групп белков (С и рr-М, с одной стороны, и Е и NS1) происходит в ходе естественного протеолитического процессинга флавивирусных белков и нуждается в наличии сигнальных последовательностей, фланкирующих данное соединение сайтов расщепления.

Предпочтительно, чтобы в составе химерных флавивирусов по настоящему изобретению вирусные сигнальные последовательности обеспечивали химерам существенную стабильность на таком уровне, чтобы точное по месту расщепление белков между сегментами С/рr-М и E/NS1 было эффективным. Эти сигнальные последовательности, поддерживающие химеры, описаны ниже. С другой стороны, любая из многочисленных известных сигнальных последовательностей может быть использована при конструировании так, чтобы в составе химер соединять последовательности, кодирующие белки С и рr-М или Е и NS1 (см., например, von Heijne, 1983, Eur. J. Biochem., 133:17-21; von Heijne, 1985, J. Mol. Biol., 184: 99-105), или, например, используя известные регуляторные последовательности, специалист в данной области техники может сконструировать дополнительные сигнальные последовательности, которые могут быть использованы в химерах по настоящему изобретению. Обычно, например, сигнальная последовательность должна включать в качестве своего последнего остатка аминокислоту с небольшой незаряженной боковой цепью, такую как аланин, глицин, серин, цистеин, треонин или глутамин. Другие требования, предъявляемые к сигнальным последовательностям, хорошо известны в данной области техники (см., например, von Heijne, 1983, цит. выше; von Heijne, 1985, цит. выше). Также сигнальные последовательности любого вируса, входящего в состав химеры, могут быть сохранены полностью или сохранены в той степени, которая обеспечит точное расщепление.

Конструирование матриц кДНК для создания химерного вируса YF/JE Получение полноразмерных матриц кДНК для химер YF/JE по настоящему изобретению, описанное ниже, основано на стратегии, сходной с той, которую ранее использовали разработчики процесса регенерации YF17D из материала кДНК при молекулярно-генетическом изучении процесса размножения вируса желтой лихорадки. Эта стратегия описана, например, Несторовичем с соавт. (Nestorowicz et al., 1994, Virology, 199:114-123).

Вкратце, получение химеры YF/JE по настоящему изобретению включает следующее. Геномные последовательности вируса желтой лихорадки встраивают в состав двух плазмид (YF5'3'IV и YFM5.2), которые кодируют последовательности YF от нуклеотидов 1-2276 и 8279-10861 (YF5'3'IV) и от 1373-8704 (YFM5.2) (Rice et al., 1989, New Biologist, 1:285-296). Полноразмерные матрицы кДНК получают путем лигирования подходящих рестрикционных фрагментов, полученных на материале этих плазмид. Данный способ является наиболее пригодным с точки зрения обеспечения стабильной экспрессии последовательностей YF и получения РНК-транскриптов, обладающих высоким уровней специфической инфекционности.

Стратегия заявителей, использовавшаяся ими при конструировании химер, включает замещение последовательностей вируса YF в составе плазмид YF5'3'IV и YFM5.2 соответствующими последовательностями из генома JE от начала белка рrМ (478-й нуклеотид; 128-я аминокислота) через сайт расщепления E/NS1 (2452-й нуклеотид; 817-я аминокислота). В дополнение к клонированию кДНК JE были необходимы некоторые этапы, обеспечивающие встраивание или уничтожение рестрикционных сайтов в состав последовательностей и YF, и JE, нужных для осуществления лигирования in vitro. Структура матрицы, предназначенной для регенерирования химерного вируса YF(C)/JE (рrМ-Е), показана на фиг.4. С применением сходной стратегии была сконструирована вторая химера, кодирующая полный структурный компонент (С-рrМ-Е) вируса японского энцефалита.

Молекулярное клонирование структурного компонента вируса JE Клоны аутотентичных генов, кодирующих структурные белки вируса японского энцефалита, были получены на материале штамма JE SA₁₄-14-2 (живой аттенуированный вакцинный штамм вируса JE), потому что биологические характеристики и молекулярные параметры этого штамма хорошо изучены (см., например, Eckels et al. , 1988, Vaccine, 6:513-518; вирусный штамм JE SA₁₄-14-2 доступен из Центра по контролю за заболеваниями в Форт-Коллинзе, Колорадо и из Арбовирусного исследовательского центра Йельского университета, Нью-Хейвен, Коннектикут, США, которые являются официальными в США референсными центрами изучения арбовирусов Всемирной организации здравоохранения). Был получен вирусный штамм JE SA₁₄-14-2, находящийся на культивационом уровне PDK-5: его пересеивали в клетки LLC-MK₂ с целью получения большого количества вируса, необходимого для клонирования кДНК. Использованная заявителями стратегия включала клонирование структурного сегмента в двух частях, которые перекрываются по рестрикционному сайту Nhel (1125-й нуклеотид генома JE), который затем может быть использован для осуществления лигирования in vitro.

Пулы РНК экстрагировали из монослойных культур инфицированных клеток LLC-MK₂ и синтез первой цепи антисмысловой кДНК проводили с использованием обратной транскриптазы с антисмысловым праймером (нуклеотиды 2456-2471 нуклеотидной последовательности генома JE), несущего сгруппированные рестрикционные сайты XbaI и NarI, необходимые, соответственно, для клонирования сначала в состав вектора pBluescript-II KS(+) и затем в состав плазмиды YFM5.2 (NarI). После синтеза первой цепи кДНК проводили амплификацию с помощью ПЦР последовательности JE в нуклеотидах 1108-2471, используя те же антисмысловой праймер и смысловой праймер (нуклеотиды 1108-1130 нуклеотидной последовательности генома JE), включающие сгруппированные рестрикционные сайты XbaI и NsiI, необходимые для клонирования в составе, соответственно, pBluescript и YFM5.2 (NarI). Последовательности JE были верифицированы путем рестрикционного расщепления и прямого нуклеотидного секвенирования. Нуклеотидная последовательность генома JE в нуклеотидах 1-1130 была получена с помощью ПЦР-амплификации кДНК негативной цепи JE с использованием антисмыслового праймера, соответствующего нуклеотидам 1116-1130 генома JE, и смыслового праймера, соответствующего нуклеотидам 1-18 генома JE: оба они содержат сайты рестрикции EcoRI. Полученные ПЦР-фрагменты клонировали в состав pBluescript, а последовательности JE верифицировали путем прямого нуклеотидного секвенирования. Все указанное вместе представляет клонирование последовательности генома JE в нуклеотидах 1-2471 (аминокислоты 1-792).

Конструирование производных вариантов YF5'3'IV/JE и YFM5.2/JE Для включения С-концевой части оболочечного белка JE в сайт расщепления YF E/NS1, уникальный рестрикционный сайт Narl был внесен с состав плазмиды YFM5.2, с использованием олигонуклеотид-направляемого мутагенеза сигнальной последовательности в пределах сайта расщепления E/NS1 (нуклеотиды YF 2447-2452; аминокислоты 816-817) с получением YFM5.2 (NarI). Транскрипты, считанные с таких матриц, несущих такое изменение, тестировали по их инфекционности: они проявили специфическую инфекционность, сходную с родительскими матрицами (приблизительно 100 бляшкообразующих единиц на 250 нг транскриgта). Последовательность JE в нуклеотидах 1108-2471 была субклонирована из состава нескольких независимо полученных ПЦР-клонов pBluescript/JE в состав плазмиды YFM5.2 (NarI) с использованием уникальных рестрикционных сайтов NsiI и NarI. Клоны YF5'3'IV/JE, включающие 5'-нетранслируемый сегмент вируса желтой лихорадки (нуклеотиды 1-118), соседствующий с участком кодирования prM-E JE, были получены с помощью ПЦР-амплификации.

Для получения последовательностей, включающих соединение капсидного кода YF и белка prM JE, антисмысловой праймер, охватывающий этот сегмент, был использован наряду со смысловым праймером, соответствующим нуклеотидам 6625-6639 в составе YF5'3'IV, с целью формирования ПЦР-фрагментов, которые затем использовали в качестве антисмысловых праймеров для ПЦР в сочетании со смысловыми праймерами, комплементарными последовательности вектора pBluescript, расположенными выше сайта рестрикции EcoRI, с целью амплификации последовательности JE (кодируемой в обратной ориентации в составе вектора pBluescript) от 477-го нуклеотида (N-конец белка prM) через имеющийся внутри сайт рестрикции NheI до 1125-го нуклеотида. Получаемые в результате ПНР-фрагменты встраивали в плазмиду YF5'3'IV с использованием рестрикционных сайтов NotI и EcoRI. Эта конструкция включает промотор SP6, предваряющий 5'-нетранслируемый сегмент YF, и далее такую последовательность: коды YF (С) JE (рrМ-Е), также включая рестрикционный сайт NheI (1125-й нуклеотид JE), необходимый для лигирования in vitro.

Конструирование YFM5.2 и YF5'3'IV, включающих рестрикционные сайты, необходимые для лигирования in vitro С целью использования рестрикционного сайта NheI в пределах последовательности, кодирующей оболочечный белок JE, в качестве сайта лигирования in vitro, избыточный сайт NheI в составе плазмиды YFM5.2 (5459-й нуклеотид) был удален. Это обеспечивалось несмысловой мутацией последовательности YF по нуклеотиду 5461 (Т-->С: аминокислотный смысл - аланин, 1820-я аминокислота). Этот сайт включали в состав YFM5.2 путем лигирования подходящих рестрикционных фрагментов, а в состав YFM5.3(NarI)/JE вносили путем замены фрагмента NsiI/NarI, кодирующего химерную последовательность YF/JE.

Для создания уникального 3'-рестрикционного сайта, предназначенного для лигирования in vitro, сайт BspEl был сформирован так, чтобы располагаться ниже сайта AatII, в норме используемого для создания полноразмерных матриц на материале плазмид YF5'3'IV и YFM5.2. (В последовательности, кодирующей структурные компоненты вируса JE, присутствуют множественные рестрикционные сайты AatII, что не позволяет использовать их для целей лигирования in vitro). Сайт рестрикции BspEl создавали путем несмыслового мутирования 8581-го нуклеотида YF (A-->С: аминокислотный смысл - серин, 2860-я аминокислота) и вносили в состав YFM5.2 путем замены подходящих рестрикционных фрагментов. Уникальный рестрикционный сайт вносили в состав YFM5.2/JE путем замены фрагмента XbaI/SphI, а в состав плазмиды YF5'3'IV/JE(рrМ-Е) путем 3-компонентного лигирования подходящих рестрикционных фрагментов, происходящих из этих исходных плазмид и из производной плазмиды YFM5.2 (BspI) с делетированной последовательностью YF, находящейся между сайтами EcoRI в нуклеотидах 1 и 6912.

Обмен кДНК JE-Nakayama в состав химерных плазмид YF/JE Из-за неочевидности того, способен ли правильно функционировать полученный с помощью ПЦР структурный сегмент JE SA₁₄-14-2 в контексте последовательностей химерного вируса, заявители использовали кДНК клона, представляющего штамм Nakayama вируса японского энцефалита, который был детально исследован в экспериментах по экспрессии и по его способности индуцировать выработку иммунитета к нему (см., например, McIda et al., 1987, Virology, 158:348-360; штамм JE-Nakayama доступен из Центра по контролю за заболеваниями в Форт-Коллинзе, Колорадо и из Арбовирусного исследовательского центра Йельского университета, Нью-Хейвен, Коннектикут, США). кДНК JE-Nakayama встраивали в состав химерных плазмид YF/JE с использованием имеющихся рестрикционных сайтов (HindIII к PvuII и BpmI к MunI) с целью замещения полного участка, кодирующего рrМ-Е в составе двухплазмидной системы, за исключением единственной аминокислоты в 49-м положении (серин), которую оставляли интактной с целью использования рестрикционного сайта NheI для лигирования in vitro. Полный сегмент JE в клоне Nakayama был секвенирован с целью проверки аутентичности замещающей кДНК (табл. 2).

Создание полноразмерных матриц кДНК, РНК-трансфекция и получение инфекционных вирусов Процедуры создания полноразмерных кДНК-матриц в принципе соответствуют тому, что описано Райсом с соавт. (Rice et al., 1989, New Biologist, 1: 285-296) (см. фиг.1). В случае химерных матриц плазмиды YF5'3'IV/JE(рrМ-Е) и YFM5.2/JE расщепляют рестриктазами NheI/BspEI и лигирование in vitro проводят с использованием 50 нг очищенных фрагментов в присутствие ДНК-лигазы фага Т4. Продукты лигирования линеаризуют с помощью XhoI для обеспечения свободной транскрипции. Транкрипты с промотора SP6 синтезируют с использованием 50 нг очищенной матрицы (количественный контроль осуществляют включением меченного ³H-УТФ) и целостность РНК проверяют с использованием электрофореза в неденатурирующем агарозном геле. Выход колеблется в пределах 5-10 мкг РНК на 1 реакцию при использовании данной процедуры, причем большинство материала представлено полноразмерными транскриптами. Трансфекцию РНК-транскриптов в присутствие катионных липосом осуществляют так, как это описано Райсом с соавт. (цит. выше) для YF17D. В исходных экспериментах были использованы клетки LLC-MK₂ для трансфекции и количественного определения вируса, на материале которых заявители определяли пригодность этих клеток для размножения вируса и бляшкообразования тестированием родительских штаммов YF и JE. В табл. 1 показаны типичные результаты трансфекционных экспериментов с использованием липофектина (Gibco/BRL) в качестве трансфекционного носителя. Также клеточные линии Vero были использованы для получения инфекционных популяций вирусов, оценки меченых белков и нейтрализационных тестов.

Секвенирование нуклеотидной последовательности химерных кДНК-матриц Для идентификации точных последовательностей оболочечного белка штамма SA₁₄-14-2 и Nakayama проводили анализ нуклеотидной последовательности плазмид, включающих химерную кДНК YF/JE, в отношении клонов JE-сегмента. Различия между нуклеотидными последовательностями у этих конструкций в сравнении с опубликованными последовательностями (McAda et al., цит. выше) показаны в табл. 2.

Структурная и биологическая характеристика химерных вирусов YF/JE Геномная структура химерных вирусов YF/JE, полученных в экспериментах по трансфекции, была проверена с использованием метода полимеразной цепной реакции с ревертированием в отношении вирусной РНК, выделенной из монослоев инфицированных клеток. Эти эксперименты проводят с целью предотвращения вероятности того, что популяции вирусов были загрязнены в ходе процедуры трансфекции. Для этих экспериментов вирусы первого пассажа были использованы для инициирования цикла заражения с целью предотвращения любых артефактов, которые могут быть вызваны присутствием остаточной трансфицированной вирусной РНК. Общие пулы РНК, экстрагированные из клеток, инфицированных химерами либо YF/JE(prM-E)-SA₁₄-14-2 либо YF/JE(prM-E)-Nakayama, подвергали ПЦР с ревертированием, используя специфичные для YF и JE праймеры, которые позволяют выделять весь структурный сегмент в виде двух ПЦР-продуктов длиной примерно 1000 нуклеотидов. Эти продукты затем анализировали путем рестриктазного расщепления по предполагаемым сайтам, имеющимся в составе последовательностей JE штаммов SA₁₄-4-14-2 и Nakayama и обеспечивающим дифференцирование этих вирусов. С использованием такого подхода была продемонстрирована химерная природа вирусной РНК, а для выделенных вирусов было подтверждено наличие соответствующих рестрикционных сайтов. Затем была верифицирована реальная граница С-рrМ, которая оказалась интактной на уровне данной последовательности - было применено секвенирование участка соединения в составе химеры YF/JE С-рrМ.

Присутствие оболочечного белка JE в этих двух химерах было проверено с помощью иммунопреципитации антисывороткой, специфичной в отношении JE, и в нейтрализационном тесте по проявлению бляшек с использованием антисывороток, специфичных в отношении YF и JE. Иммунопреципитация ³⁵S-меченых экстрактов клеток LLC-MK₂, инфицированных данными химерами, с использованием моноклонального антитела к белку Е вируса JE, показала, что оболочечный белок Е вируса JE может быть выделен в виде белка с молекулярной массой 55 кДа, в то время как та же антисыворотка не способна иммунопреципитировать какой-либо белок из состава клеток, инфицированных вирусом желтой лихорадки. Обе гипериммунные сыворотки к YF и JE проявили перекрестную реактивность по отношению к двум оболочечным белкам, однако при этом в ряде повторностей воспроизводится размерная дифференцированность двух белков: у вируса YF - 53 кДа, негликозилирован; у вируса JE 55 кДа, гликозилирован. Использование моноклональных антител к YF в условиях иммунопреципитации оказалось неэффективным: следовательно, специфичность зависела в данном анализе от моноклональных антител к JE. Нейтрализационный тест по снижению числа бляшек (PRNT) был осуществлен в отношении химерных вирусов и "чистых" вирусов YF и JE SA₁₄-14-2 с использованием гипериммунной асцитной жидкости (АТСС), специфичной в отношении YF и JE, и очищенного иммуноглобулина-G, специфичного в отношении YF (моноклональное антитело 2 Е10). Для этих антисывороток были выявлены существенные различия в их титре, необходимом для 50%-снижения числа бляшек при тестировании химер в сравнении с контрольными ("чистыми") вирусами по данному эксперименту (табл. 3). Таким образом, необходимые для нейтрализации эпитопы экспрессируются инфекционными химерными вирусами YF/JE.

Параметры роста в клеточной культуре Способность химер к росту была исследована по количественным параметрам в линиях клеток, происходящих как от приматов, так и от комаров. На фиг.2 показаны кумулятивные кривые роста химер в клетках линии LLC-MK₂ после множественного заражения с низкой плотностью (0,5 бляшкообразующей единицы на клетку). В этом эксперименте для сравнения были использованы вирусы YF5.2IV (клонированный дериват) и JE SA₁₄-14-2 (неклонированный). Оба химерных вируса достигали максимального выхода вирусов на уровне, приблизительно на 1 логарифм выше, чем выход любого из родительских вирусов. В случае с химерой YF/JE SA₁₄-14-2 пик выхода вируса был отмечен на 12 часов позднее, чем тот же показатель у химеры YF/JE Nakayama (соответственно, 50 и 38 часов). Химера YF/JE Nakayama проявляла существенно больший цитопатический эффект в сравнении с химерой YF/JE SA₁₄-14-2 в той же клеточной линии. Сходный эксперимент был проведен с клетками С 6/36 при множественном заражении с низкой плотностью (0,5 бляшкообразующей единицы на 1 клетку). На фиг.2 также показана динамика роста вирусов в этой линии клеток беспозвоночного. Сходные уровни выхода вирусов были отмечены во все моменты тестирования в данном эксперименте, что дополнительно подтверждает заключение о том, что у химерных вирусов эффективность размножения нисколько не нарушена.

Сравнение динамики роста RMS (YF/JE SA₁₄-14-2) и вакцины YF17D в клетках MRC-5 Эксперимент был проведен с целью оценки способности предполагаемой вакцины размножаться в клеточной линии, приемлемой для вакцин, предназначенных для человека. Коммерческая вакцина против желтой лихорадки YF17D (YF-Vax) была получена от Connaught Laboratories, Swiftwater, PA. Клетки MRC-5 (диплодные клетки эмбриональных легких человека) были приобретены в АТСС (171-CCL, Batch F-14308: 18-й пассаж): их выращивали в культуральной среде ЕМЕМ с добавлением 2 мМ L-глутамина, солевого раствора Эрла, вносимого для доведения до 1,5 г/л по бикарбонату натрия, 0,1 мМ заменимых аминокислот и 10% фетальной сыворотки телят.

Для сравнения кинетики роста RMS (Research Master Seed, YF/JE SA₁₄-14-2) и YF-Vax клетки выращивали до 90%-ной конфлюэнтности и проводили их заражение RMS или YF-Vax с плотностью (MOI) 0,1 б.о.е. С учетом того, что клетки MRC-5 обычно растут медленно, эти клетки выдерживали после инфицирования в течение 10 дней. Образцы замораживали на 7-10 дней и их инфекционность определяли в тесте на формирование бляшек с использованием клеток Vero.

Вакцина YF-Vax и химера YF/JE вырастали в клетках MRC-5 до умеренных титров (фиг.3). Пиковый титр составил примерно 4,7 log₁₀ б.о.е. для YF-Vax (он достигался на 2-й день), а для RMS был ненамного ниже - 4,5 log₁₀ б.о.е. на 6-й день.

Тестирование нейровирулентности у нормальных взрослых мышей Свойства вирулентности химеры YF/JE SA₁₄-14-2 были проанализированы с использованием молодых взрослых мышей: применена интрацеребральная инокуляция. Группы по 10 мышей (самцы и самки линии ICR в возрасте 4 недель - по 5 особей каждого пола в каждой группе) были инокулированы 10 тысячами бляшкообразующими единицами химеры YF/JE SA₁₄-14-2, YF5.2IV или JE SA₁₄-14-2 и наблюдали ежедневно в течение 3 недель. Результаты этих экспериментов проиллюстрированы на фиг.4. Мыши, зараженные родительским штаммом YF5.2IV, погибали спустя примерно одну неделю после заражения. Смертность или признаки заболевания не были обнаружены у мышей, зараженных штаммом японского энцефалита JE SA₁₄-14-2 или химерой. Инокуляты, использовавшиеся в этих экспериментах, были оттитрованы в момент заражения, а подгруппы выживающих мышей тестировали на присутствие нейтрализующих антител, что было необходимо для подтверждения того, что заражение имело место. При сравнении тестированных особей отмечено, что титры антител против JE SA₁₄-14-2 были сходными с таковыми, которые были выявлены у животных, которые были заражены либо этим штаммом, либо химерным вирусом.

Результаты дополнительных экспериментов, связанных с изучением нейровирулентности химеры YF/JE SA₁₄-14-2 в отношении мышей, проиллюстрированы в табл. 4. В этих экспериментах все мыши, зараженные вирусом желтой лихорадки YF5.2.IV, погибли в течение 7-8 дней. Напротив, ни одна из мышей, зараженных химерным вирусом YF/JE SA₁₄-14-2, не погибла в течение двух недель после заражения.

Результаты экспериментов, посвященных изучению нейровирулентности и патогенности химер YF/JE, проиллюстрированы в табл. 5. В этих экспериментах химерные вирусы использовались для заражения 3-недельных мышей при дозах, варьировавшихся от 10 тысяч до 1 миллиона бляшкообразующих единиц при их внутри