Опосредованная рецепторами доставка генов с использованием векторов на основе бактериофагов

Опосредованная рецепторами доставка генов с использованием векторов на основе бактериофагов

Реферат

 

Изобретение относится к области медицинской генетики. Сущность изобретения составляют нитевидные фаговые частицы, имеющие на своей поверхности лиганд. Эти частицы используют для доставки к клеткам терапевтического гена. Лиганд является протеином, образованным при слиянии с фаговым капсидным протеином, ковалентно конъюгированным с фаговыми частицами. Технический результат: расширение арсенала средств генной терапии. 6 с. и 39 з.п.ф-лы, 9 ил., 1 табл.

Изобретение относится в общих чертах к доставке генов и более конкретно к получению и использованию модифицированных лигандами бактериофагов для доставки генов, которые изменяют фенотип, функции, генную экспрессию, или жизнеспособность клеток с терапевтическими целями.

Предпосылки изобретения В одном из подходов генная терапия предпринимает попытки делать клетки мишенью специфическим образом. Так терапевтический ген связывают каким-либо образом с направляющей молекулой для того, чтобы доставить ген в намеченную клетку или ткань. Современные методы обычно включают связывание направляющей молекулы, такой как лиганд или антитело, которое распознает интернализующий рецептор, либо с "голой" ДНК, либо с клеточным вирусом млекопитающего (например, аденовирусом), содержащим целевой ген. Если используют голую ДНК, ее следует конденсировать in vitro в компактную геометрическую форму для проникновения в клетку. Для нейтрализации заряда на ДНК и конденсации ее в тороидную структуру обычно используют поликатион, такой как полилизин. Однако такой процесс конденсации не совсем понятен, и его трудно контролировать, что делает приготовление гомогенных генных терапевтических лекарств крайне проблематичным.

Напротив, вирусы млекопитающих могут упаковывать ДНК в однородные частицы, но из-за их сложности они представляют сложности с точки зрения генетической манипуляции и получение вирусных частиц для доставки генов является дорогостоящей и длительной процедурой. Бактериофаги предлагают привлекательную альтернативу в качестве природного способа конденсации и упаковки терапевтических ДНК и благодаря их простоте они достаточно легко подвергаются генетическим манипуляциям (при сохранении функций). Более того, так как бактериофаг представляет чрезвычайно простой объект, крупномасштабное получение векторов на основе фагов для доставки генов окажется гораздо проще и дешевле, нежели получение, например, вирусных векторов млекопитающих.

Бактериофаг, такой как лямбда и нитевидный фаг, иногда использовали при попытках перенести ДНК в клетки млекопитающих. Вообще было обнаружено, что трансдукция лямбда является относительно редким актом и экспрессия репортерного гена слаба. В попытке повысить эффективность трансдукции были использованы способы, использующие фосфат кальция или липосомы (которые специфически не направлены на рецептор клеточной поверхности) используют в связи с лямбда. Перенос гена наблюдали за счет лямбда фага, используя соосаждение с фосфатом кальция (Ishiura, M. et al., Mol. Cell. Biol., 2:607-616, 1982), или за счет нитевидного фага, используя DEAE-декстран или липополиамин (Yokoyama-Kobayashi и Kato, Biochem. Biophys. Res. Comm. 192:935-939, 1993; Yokoyama-Kobayashi и Kato, Anal. Biochem. 223:130-134, 1994). Однако эти способы введения ДНК в клетки млекопитающих не практичны для применения в генной терапии, так как эффективность трансфекции имеет тенденцию быть слабой, неспецифичной, и такая трансфекция не только сложна, но и непредсказуема в отношении типа клеток. Необходимы более надежные средства для нацеливания векторов на специфические клетки (или рецепторы) и обеспечение гарантий степени терапевтической полезности доставки генов и их экспрессии, если бактериофаги необходимо оформить в векторы, пригодные для терапевтических применений.

Попытки направить нитевидный фаг к клеткам, используя слияние циклического RGD пептида и протеина оболочки фага или слияния пептид-оболочковый протеин имели ограниченный успех. Хотя фаги были нацелены и интернализованы, экспрессия гена фага не ожидалась и не была отмечена (Hart et al., J. Biol. Chem. 269:12468-12474, 1994; Barry et al., Nature Med. 2:299-305, 1996). Хотя обычно понятно, что RGD пептидная последовательность, используемая Hart с сотр. связывается с интегринами, Hart описывает осуществляемый за счет RGD захват фага как процесс, аналогичный захвату фагоцитом бактерии за счет протеина инвазина (RGD протеина); аденовирусы используют связывание RGD-инвазин в связи со связыванием лиганд-рецептор для интернализации. Поэтому неясно, что связывание RGD-интегрин облегчает проникновение пептида или слияние протеина за счет рецепторов опосредствованного эндосомального механизма, который, как было показано, обеспечивает превосходные результаты.

Так, для случаев применения доставки генов были бы весьма выгодны способы и терапевтические агенты, которые просты для получения и осуществления цели, эффективны и направляются к специфическим клеткам. Аналогично были бы необходимы векторы, которые доставляют терапевтически полезные количества представляющих интерес генов при различных способах введения, включая пероральные способы. Удовлетворяя эти давние нужды, в настоящем изобретении предложены композиции и способы доставки генов с использованием бактериофага, который экспрессирует лиганд и несет представляющий интерес ген, а также обеспечивает другие связанные с этим преимущества.

Краткое содержание изобретения В одном из аспектов настоящего изобретения предложен способ доставки генов, включающий введение пациенту нитевидных фаговых частиц, представляющих лиганд на своей поверхности, где вектор внутри фага кодирует генный продукт под контролем промотора.

В родственных аспектах в изобретении предложены способы лечения опухолей, заболеваний клеток гладкой мускулатуры или ангиогенных заболеваний, включающие введение пациенту фармацевтической композиции, включающей физиологически приемлемый буфер и частицы нитевидного фага, представляющие лиганды на своих поверхностях, где геном фага кодирует терапевтический генный продукт под контролем промотора.

В предпочтительном варианте лигандом является полипептид, реакционноспособный с FGF рецептором и в наиболее предпочтительном варианте лигандом служит FGF-2. В других вариантах лигандом является антитело и предпочтительно одноцепочечное антитело.

Лиганд может быть генетически слит с протеином фагового капсида или химически конъюгирован для образования ковалентного присоединения или присоединения методом "сэндвича". Обычно капсидным протеином для генного слияния является ген III или ген VIII.

В предпочтительном варианте эндосомальный фрагмент ускользания включен в лиганд или другим способом представлен на поверхности фагов. Этот лиганд или фаг могут также включать далее последовательность ядерной локализации.

В другом предпочтительном варианте фаговым геномом является фагемид.

В предпочтительных вариантах терапевтический генный продукт выбирают из группы, состоящей из протеина, рибозима и антисмыслового олигонуклеотида, а в других вариантах терапевтический генный продукт является цитотоксическим агентом (например протеином, инактивирующим рибосому, таким как сапорин), или является антителом, которое связывается с HER2/neu.

В других аспектах в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, включающая физиологически приемлемый буфер и нитевидные фаговые частицы, представляющие лиганд на своих поверхностях, где фаговый геном кодирует терапевтический генный продукт под контролем промотора, и нитевидные фаговые частицы, представляющие лиганд на своей поверхности, где фаговый геном кодирует терапевтический генный продукт под контролем промотора.

Эти и другие аспекты настоящего изобретения станут очевидны со ссылкой на следующее подробное описание и прилагаемые чертежи. Кроме того, представленные далее различные ссылки, в которых более подробно описаны некоторые процедуры и композиции (например, плазмиды и т.д.), включены сюда полностью для ссылки.

Краткое описание чертежей Фиг. 1А и 1В схематически представляют фаговые векторы для трансдукции клеток млекопитающих. На фиг.1А представлен родительский фаговый вектор с дикого типа pIII оболочковым протеином. Основным вектором является М13 геном с геном устойчивости к ампициллину (Amp^R) и GFP экспрессионной кассетой, встроенной в интергенный участок между pIV и рII (MEGFP3). Вектор MEGFP3 содержит следующие элементы: ori-CMV, SV40 начало репликации и CMV промотор; EGFP, усиленный ген флуоресцирующего зеленым протеина; BGH, и последовательность полиаденилирования бычьего гормона роста. Фиг.1В представляет FGF-pIII слияние, представляющее фаг (MF2/1G3).

Фиг.2 представляет график, демонстрирующий количество клеток, экспрессирующих флуоресцирующий зеленым протеин, когда FGF-фаг инкубирует с клетками в присутствии повышенного количества свободных FGF.

Фиг.3А и 3В представляют графики, демонстрирующие экспрессию репортерных генов GFP (3А) и Gal (3B) в целевых клетках как функцию титра фага.

Фиг. 4А-4D являются графическим представлением, демонстрирующим специфичность нацеливания FGF2.

Фиг. 5 представляет график, демонстрирующий количество FGF позитивных клеток, образующихся после инкубирования структур полилизин+фаг или FGF-полилизин+фаг.

Фиг. 6 представляет сканированное изображение результатов Вестернблоттинга, представляющего определение протеина слияния FGF2-pIII в протеиновых экстрактах из очищенного FGF2-фага (FGF2-MEGFP).

Фиг.7А и 7В представляют графики в виде прямоугольников определения FGF2 на FGF2-фаге методом ELISA. Фиг.7А представляет количество фагового протеина, определенное с использованием как пустого вектора MEGFP3, так и конструкции слияния FGF2 (FGF2-MEGFP). Фиг.7В представляет количество FGF2, определенное на фаге, содержащем конструкцию слияния.

Фиг. 8А и 8В представляют графики в виде прямоугольников, представляющие трансдукцию COS клеток FGF2-фагом.

Фиг. 9А и 9В представляют изображение, полученное с помощью флуоресцентной микроскопии, стабильных трансфектантов, экспрессирующих репортерный ген GFP.

Подробное описание изобретения Как было указано ранее, настоящее изобретение в основном относится к способам доставки терапевтических агентов к целевым клеткам и тканям сайт-специфическим образом и к конструкциям, пригодным для таких применений. Одним из применений раскрытого изобретения является терапия с использованием замещения или усиления гена. Проще говоря, описанные здесь векторы и способы можно использовать для лечения индивидуумов, ткани которых лишены способности продуцировать достаточные количества некоторых важных молекул и соединений, например необходимых ферментов. Другим применением настоящего изобретения является использование способности описанных здесь векторов нацеливать клетки с повышенной специфичностью, что делает такие векторы идеальными для лечения различных опухолей и других злокачественных образований.

Как здесь подробно описано, предпочтительные векторы для использования для целевой доставки терапевтических агентов включают нитевидные фаговые частицы, экспрессирующие один или более из предварительно отобранных лигандов на поверхности вирусных частиц независимо от способа каким прикреплены лиганды. Поэтому независимо от того, прикреплены ли лиганды за счет ковалентной связи, или за счет протеина слияния, целевые фаговые векторы настоящего изобретения способны доставить терапевтические нуклеотидные последовательности к целевым клеткам.

Нитевидные фаговые частицы являются особенно полезными векторами, как здесь раскрыто, частично из-за того, что они не имеют нативного тропизма у млекопитающих. Поэтому существует необходимость снятия нативного тропизма у фагового вектора для того, чтобы сделать его полезным для терапевтических применений, что необходимо для чаще используемых ретровирусных векторов. Векторы на основе фагов настоящего изобретения также обладают целым рядом преимуществ, включая, например, способность принимать крупные объекты; способность точно достигать специфические клеточные рецепторы, не повреждая здоровые клетки; и способность доставлять терапевтические нуклеотидные последовательности к ядрам целевых клеток, усиливая тем самым экспрессию терапевтических последовательностей в целевых клетках.

Вышеуказанные характеристики и другие, которые будут раскрыты более подробно далее, делают описываемые здесь векторы особенно привлекательными для применений в генной терапии, так как их легко можно сконструировать для упаковки, транспорта и доставки выбранных экспрессируемых генов в клетки, ткани или органы пациента, нуждающегося в лечении. Как было указано ранее, раскрытые здесь векторы и способы особенно подходят для лечения болезненных состояний, которые не поддаются более "обычному" терапевтическому лечению.

I. БАКТЕРИОФАГ А. Нитевидные бактериофаги Нитевидные фаги охватывают группу бактериофагов, которые способны инфицировать различные грам-отрицательные бактерии за счет взаимодействия с концом F пилуса. Хорошо известные нитевидные фаги включают М13, f1 и fd.

Геномы этих фагов представляют одноцепочечные ДНК, но реплицируются через двухцепочечную форму. Фаговые частицы собраны в бактериях и выделяются в среду. Так как бактерии продолжают расти и делиться, хотя и с меньшей скоростью, чем неинфицированные клетки, титры фагов достигают относительно высоких значений. Более того, на репликацию и сборку, по-видимому, не влияет размер генома. Благодаря своему строению и жизненному циклу нитевидные фаги стали ценным дополнением к арсеналу инструментов молекулярной биологии.

Дальнейшее развитие нитевидных фаговых систем привело к разработке клонирующих векторов, называемых фагемидами, которые объединяют отличительные особенности плазмид и фагов. Фагемиды содержат начало репликации и сигнал упаковки нитевидного фага так, же, как начало репликации плазмид. Обычно присутствуют также и другие элементы, применяемые для клонирования и/или экспрессии молекул чужеродной нуклеиновой кислоты. Такие элементы включают, без ограничения, селектируемые гены, сайт множественного клонирования, праймерные последовательности. Фагемиды могут быть реплицированы как и для других плазмид, и могут быть упакованы в фаговые частицы после освобождения хелперным нитевидным фагом. В том смысле, как здесь использован, термин "нитевидные фаговые частицы" относится к частицам, содержащим либо фаговый геном, либо фагемидный геном. Эти частицы могут содержать другие молекулы в добавление к нитевидным капсидным протеинам.

Нитевидные фаги были разработаны как системы для представления протеинов и пептидов на поверхности фаговых частиц. Путем встраивания молекул нуклеиновой кислоты в гены для фаговых капсидных протеинов получают протеины слияния, которые собраны в капсид (Smith, Science 228:1315, 1985; патент США 5223409). В результате чужеродный протеин или пептид оказывается на поверхности фаговой частицы. Способы и методики для представления фага хорошо известны специалистам (см. также Кау et al., Phage Display of Peptides и Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego, 1996).

В. Векторы Нитевидные фаговые векторы обычно подразделяют на две категории: фаговый геном и фагемиды. Каждый тип вектора можно использовать в контексте настоящего изобретения, предпочтительно использовать фаговые геномные векторы. Доступны многие такие коммерческие векторы. Например, можно использовать серии pEGFP векторов (Clontech; Palo Alto, СА), Ml3mp векторы (Pharmacia Biotech, Sweden), pCANTAB 5E (Pharmacia Biotech), pBluescript серии (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) и многие другие. Одним из наиболее подходящих коммерческих векторов является pEGFP-N1, который содержит флуоресцирующий зеленым протеин (GFP) под контролем CMV предраннего промотора. Эта плазмида включает также SV40 начало репликации для усиления генной экспрессии за счет обеспечения репликации плазмиды с большим числом копий в клетках, которые вырабатывают SV40 Т антиген.

Другие векторы разработаны учеными (см. например. Smith, в Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors и their Uses, Rodriquez и Denhardt, eds. , Butterworth, Boston, с. 61-84, 1988), или могут быть сконструированы с использованием стандартных способов (Sarabrook et al., Molecular Biology: A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing, NY, 1995) в соответствии с обсуждаемыми далее принципами.

Для использования в настоящем изобретении вектор, как минимум, должен принять кассету, содержащую промотор и терапевтический ген (трансген) в функциональной связи. Можно использовать любой промотор, который активен в клетках, которые необходимо трансфектировать. Этот вектор должен также содержать начало репликации фага и сигнал упаковки для сборки векторной ДНК с капсидными протеинами.

В конструкцию могут быть также включены другие элементы. В предпочтительных вариантах конструкция включает последовательность терминации транскрипции, включая последовательность полиаденилирования, сайты сплайсинга донора и акцептора и энхансер. Могут быть также использованы другие элементы, применимые для экспрессии и сохранения конструкции в клетках млекопитающих или в других эукариотных клетках (например, начало репликации). Так как эти конструкции удобно получать в бактериальных клетках, в них включают элементы, которые необходимы или усиливают размножение в бактериях. Такие элементы включают начало репликации, селектируемый маркер и т.п. (см. обсуждение далее).

Промотор, который контролирует экспрессию трансгена, должен быть активным или активируемым в целевой клетке. В рамках настоящего изобретения целевой клеткой может быть клетка млекопитающего, птицы, растения и т.п. Большая часть применений настоящего изобретения включает трансфекцию клеток млекопитающих, включая человека, собак, кошек, лошадей и т.п. Выбор промотора будет зависеть частично от типа целевой клетки и степени или типа необходимого контроля. Промоторы, которые являются подходящими в контексте настоящего изобретения, включают, но ими не ограничиваются, конститутивные, индуцируемые, ткане-специфические, специфические в отношении типа клеток, временно-специфические или событийно-специфические.

Примеры конститутивных или неспецифических промоторов включают SV40 ранний промотор (патент США 5118627), SV40 поздний промотор (патент США 5118627), CMV ранний генный промотор (патент США 5168062), промотор вируса бычьей папилломы, и промотор аденовируса. В добавлении к вирусным промоторам в контексте настоящего изобретения применимы также клеточные промоторы. В частности полезны клеточные промоторы для так называемых генов "домашнего хозяйства" (например, -актин). Вирусные промоторы обычно являются более сильными промоторами, нежели клеточные промоторы.

Ткане-специфические промоторы особенно подходят для экспрессии в эндотелиальных клетках. Используя один из этого класса промоторов, можно достичь дополнительной степени специфичности. Например, эндотелиально-специфические промоторы особенно полезны в отношении пролиферативных заболеваний, включающих эндотелиальные клетки. Примеры ткане-специфических или клетко-специфических промоторов включают промоторы, специфические в отношении лимфоидных и фибробластных клеток, специфические в отношении печени, почек, гепатоцит-специфические и т.п.

Можно также использовать индуцируемые промоторы. Эти промоторы включают MMTV LTR (РСТ WO 91/13160), индуцируемый дексаметазоном, металлотионеин, индуцируемый тяжелыми металлами, и промоторы с элементами, реагирующими на сАМР, промоторы, индуцируемые сАМР термошоком. Используя индуцируемые промоторы, в клетку можно доставить нуклеиновую кислоту, и она будет оставаться неактивной до добавления индуктора. Это позволяет осуществлять дальнейший контроль за временем продуцирования генного продукта.

Событийного типа специфические промоторы являются активными или усиливающими регуляцию только после этого события, такие как опухолегеничность, или инфицирование вирусом. HIV LTR является хорошо известным событийно-специфическим промотором. Этот промотор является неактивным, если только не присутствует tat генный продукт, что происходит после инфицирования вирусом. Некоторые событийного типа промоторы являются также ткане-специфическими.

Кроме того, можно использовать промоторы, которые согласованно регулируются с конкретным клеточным геном. Например, можно использовать промоторы генов, которые согласованно экспрессируются, когда экспрессируется конкретный FGF рецепторный ген. Затем нуклеиновая кислота будет транскрибирована, когда экспрессируется FGF рецептор, такой как FGFR1, а не тогда, когда экспрессируется FGFR2. Такой тип промотора особенно полезен, если известна схема FGF рецепторной экспрессии в конкретной ткани, так что специфические клетки в этой ткани могут быть убиты после транскрипции гена цитотоксического агента, причем не будут затронуты окружающие ткани.

Примеры промоторов, здесь обсуждающихся, включают промоторы для альфафетопротеина, альфа-актин, мио D, карциноэмбрионный антиген VEGF-рецептор (GenBank регистрационный Х89776); FGF рецептор; ТЕК или tie 2 (GenBank регистрационный L06139); tie (GenBank регистрационные Х60954; S89716); рецептор урокиназы (GenBank регистрационный S78532); Е- и Р-селектины (GenBank регистрационные М64485; L01874); VCAM-1 (GenBank регистрационный M92431): эндоглин (GenBank регистрационный HSENDOG): эндосиалин (Rettig et al., PNAS 89: 10832, 1992); альфа V-бета3 интегрин (Villa-Garcia et al., Blood 3:668, 1994; Donahue et al., BBA 1219:228, 1994); эндотелин-1 (GenBank регистрационные M25377; J04819; J05489); ICAM-3 (GenBank регистрационный S50015); E9 антиген (Wang et al., Int. J. Cancer 54:363, 1993); фактор von Willebrand (GenBank регистрационный HUMVWEI; HUMVWFA); CD44 (GenBank регистрационный HUMCD44B); CD40 (GenBank регистрационный HACD40L; HSCD405FR); сосудисто-эндотелиальный кадхерин (Martin-Padura et al., J.Pathol. 175:51, 1995); notch 4 (Uyttendaele et al., Development 122:2251, 1996), связанный с меланомой высокомолекулярный антиген; специфический антиген-1 простаты, пробазин, FGF рецептор, VEGF рецептор, erb B2; erb B3; erb B4; MUC-1; HSP-27; int-1; int-2, CEA, HBEGF рецептор; EGF рецептор; тирозиназа, MAGE, IL-2, IL-2 рецептор; фосфатаза простатовой кислоты, пробастин, специфический мембранный антиген простаты, альфа-кристаллин, EGFR, PDGF рецептор, рецептор интегрина, -актин, SM1 и SM2 тяжелые цепи миозина, калпонин-h1, SM22 альфа рецептор ангиотензина, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, тяжелая цепь иммуноглобулина, легкая цепь иммуноглобулина, CD4, и т.п. применимы в контексте настоящего изобретения.

В дополнении к промотору можно встроить репрессорные последовательности, негативные регуляторы или ткане-специфические сайленсеры для уменьшения неспецифической экспрессии цитоцидов или пролекарств. Множественные репрессорные элементы можно встроить в промоторный участок. Репрессия транскрипции не зависит от ориентации репрессорных элементов или расстояния от промотора. Одним из типов репрессорных последовательностей является изоляторная последовательность. Такие последовательности ингибируют транскрипцию (Dunaway et al. , Mol. Cell. Biol 17: 182-9, 1997; Gdula et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA PJ:9378-83, 1996, Chan et al., J. Virol 70:5312-28, 1996; Scott и Geyer. EMBOJ 14:6258-67, 1995; Kalos и Fournier, Mol. Cell. Biol 15:198-207, 1995; Chung et al., Cell 74:505-14, 1993) и будут подавлять фоновую транскрипцию.

Негативные регуляторные элементы были охарактеризованы в промоторных участках ряда различных генов. Функции репрессорных элементов как репрессоров транскрипции в отсутствии факторов, таких как стероиды, подобны NSE в промоторном участке гена овальбумина (Haecker et al., Mol. Endocrinology 9: 1113-1126, 1995). Эти негативные регуляторные элементы связывают специфические протеиновые комплексы из фаллопиевых труб, ни один из которых не чувствителен к стероидам. Три различные элемента расположены в промоторе гена овальбумина. Олигонуклеотиды, соответствующие участку этих элементов, подавляют вирусную транскрипцию ТК репортера. Один из сайленсерных элементов разделяет идентичность последовательности с сайленсерами в других генах (TCTCTCCNA).

Репрессорные элементы были также идентифицированы в промоторном участке гена коллагена II. Исследования задержки в геле показали, что ядерные факторы из HeLa клеток связываются специфически с ДНК фрагментами, содержащими сайленсерный участок, тогда как экстракты ядер хондроцитов не демонстрируют какой-либо связывающей активности (Savanger et al., J.Biol. Chem. 265 (12): 6669-6674, 1990). Было также показано, что репрессорные элементы регулируют транскрипцию в гене карбамоил-фосфат синтетазы (Goping et al., Nucleic Acid Research 23(10): 1717-1721, 1995). Этот ген экспрессируется только в двух различных типах клеток, гепатоцитах и эпителиальных клетках слизистой оболочки кишечника. Негативные регуляторные участки были также идентифицированы в промоторном участке гена холинацетил-трансферазы, промоторе альбумина (Нu et al. , J.Cell Growth Differ. 3(9):577-588, 1992), промоторе гена фосфоглицерат-киназы (PGK-2) (Misuno et al., Gene 119(2):293-297, 1992), и в гене 6-фосфофрукто-2-киназа/фруктозо-2,6-бисфосфатазы, где негативный регуляторный элемент ингибирует транскрипцию в непеченочных клеточных линиях (Lemaigre et al., Mol. Cell Biol. 11(2):1099-1106). Кроме того, был идентифицирован негативный регуляторный элемент Тsе-1 в ряде печень-специфических генов, включая тирозинамино-трансферазу (ТАТ). Экспрессия ТАТ гена специфична и индуцируется как глюкокортикоидными, так и сАМР сигнальными путями. Было показано, что сАМР реагирующий элемент (CRE) является мишенью для репрессии за счет Тsе-1 гепатоцит-специфических элементов (Boshart et al., Cell 61(5):905-916, 1990).

В предпочтительных вариантах элементы, которые усиливают экспрессию целевого продукта, включены в конструкцию. Такие элементы включают внутренние рибосомные связывающие сайты (IRES; Wang и Siddiqui, Curr. Top. Microbiol. Iminunol 203: 99, 1995; Ehrenfeid и Semler, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 203:65, 1995; Rees et al., Biotechniques 20:102, 1996, Sugimoto et al., Biotechnology 12: 694, 1994). IRES повышает эффективность трансляции. Другие последовательности также могут усилить экспрессию. Для некоторых генов, последовательности, особенно с 5' конца, ингибируют транскрипцию и/или трансляцию. Эти последовательности обычно являются палиндромами, которые могут образовывать структуры в виде шпилек. Любые такие последовательности в нуклеиновой кислоте, которую необходимо доставить, обычно исключают. Уровни экспрессии продуктов транскрипции или трансляции анализируют для подтверждения или определения того, какие последовательности влияют на экспрессию. Уровни транскрипции можно определить любым известным способом, включая Нозернблоттинг гибридизацию, защиту РНКазы с помощью зонда и т.п. Уровни протеинов можно определить любым известным способом, включая ELISA.

В предпочтительных вариантах фаг имеет начало репликации, подходящий для трансфектированных клеток. Можно использовать системы репликации вирусов, такие как EBV ori и ENBA ген, SV40 ori и Т антиген, или BPV ori. Другие системы репликации млекопитающих могут быть взаимозаменяемы. А также гены репликации могут привести к большому числу копий. Экспрессия терапевтических генов из фагового генома может быть усилена за счет увеличения числа копий генома фага. В одном из способов используют SV40 начало репликации в присутствии SV40 Т антигена, для того чтобы вызвать получение нескольких сотен тысяч копий. Ген Т антигена может уже присутствовать в клетках, интродуцированный отдельно или индуцированный в геноме фага под транскрипционным контролем подходящего клеточного промотора. Можно также использовать другие системы репликации вирусов для увеличения числа копий, такие как начало EBV и EBNA.

В других предпочтительных вариантах пептиды или другие фрагменты, которые позволяют или стимулируют "ускользание" векторов (и любой молекулы, к ним присоединенной или в них заключенной) из эндосомы, включены и экспрессированы на поверхности бактериофага. Такие "другие фрагменты" включают молекулы, которые сами не являются пептидами, но которые обладают способностью разрушать эндосомальные мембраны, тем самым облегчая "ускользание" вектора и молекул, которые в противном случае имитируют эндосомальные свойства "ускользания" описанных здесь пептидных последовательностей (см. например, опубликованную РСТ публикацию WO 96/10038 и Wagner et al., PNAS 89:7934-7938, 1992, раскрытие которых включено сюда в качестве ссылки).

Пептидные последовательности, которые придают способность "ускользания" из эндосомы, наиболее предпочтительны. Такие последовательности хорошо известны и могут быть легко слиты ковалентно или генетически с оболочковым протеином, таким как ген III или ген VIII нитевидного фага. Хотя слияние одной или более из пептидных последовательностей с оболочковым протеином описывается здесь как предпочтительный вариант, следует понимать, что другие способы присоединения (и другие фрагменты кроме пептидов) могут быть использованы, как здесь раскрыто.

Так, пример двоякого представления нитевидного фага представляет лиганд (например, FGF) как слияние с геном III и эндосомальный пептид ускользания, слитый с геном VIII. Локализации лиганды и последовательностей ускользания являются взаимозаменяемыми и более того, могут находиться в одном и том же слитом протеине. Последовательности ускользания, которые пригодны, включают, без ограничений, следующие примеры последовательностей: пептид экзотоксина Pseudomonas (Donnelley, J. J., et al., PNAS. 90, 3530-3534, 1993); пептиды гриппа, такие как НА пептид и пептиды, из него полученные, такие как пептид FP13; слитогенный пептид Sendal Virus; слитогенная последовательность из HIV gр1 протеина; Paradaxin слитогенный пептид; и Melittin слитогенный пептид (см. опубликованную РСТ публикацию WO 96/41606, раскрытие которой включено сюда в качестве ссылки). Примерами двух других эндосоморазрушающих пептидов, иногда называемых слитогенными пептидами, являются: GLFEAIEGFIENGWEGMIDGGGC (SEQ. ID 1) и GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYGC (SEQ. ID 2).

Другие пептиды, пригодные для разрушения эндосом, можно определить с помощью различных общих характеристик. Например, эндосоморазрушающие пептиды обычно имеют длину в 25-30 остатков, содержат чередующиеся гидрофобные домены и кислотные домены, и при низких значениях рН (например, рН 5) образуют амфифатические -спирали. Эндосоморазрушающий пептид может присутствовать в виде единичной копии или в виде множества копий как с N-, так и с С-конца лиганда.

Пептиды ускользания можно также отобрать, используя стратегию молекулярной эволюции. Короче, в одном из подходов конструируют библиотеку случайных пептидов в протеине гена VIII фагового вектора, у которого имеется лиганд, который слит с геном III и который несет детектируемый (например, GFP) или селектируемый маркер (например, устойчивости к лекарству). Клетки млекопитающих инфицируют этой библиотекой и клетки отбирают по выявляемому маркеру. Клетки, которые имеют наиболее эффективную эндосомальную последовательность ускользания, должны отличаться наивысшей экспрессией или наибольшей устойчивостью. Множество циклов селекции можно осуществить для уменьшения сложности генов, кодирующих выделенные пептиды. Гены пептидов выделяют, конструируют в фаговые векторы.

Кроме того, или в качестве альтернативы, мембраноразрушающие пептиды можно включить в комплексы. Так например, как известно, аденовирусы усиливают разрушение эндосом. Не содержащие вирусов протеины, такие как гемагглютинин НА-2 вируса гриппа, также разрушают эндосомы и могут быть использованы в настоящем изобретении. Другие протеины можно протестировать в анализах, раскрытых здесь, с целью обнаружения специфических эндосоморазрушающих агентов, которые увеличивают доставку генов. Обычно эти протеины и пептиды являются амфифатичными (см. Wagner et al., Adv. Drug Del. Rev. 14:113-135, 1994).

Другой последовательностью, которую можно включить в вектор, является последовательность, которая облегчает доставку протеинов в ядро. Для усиления экспрессии предпочтительно, чтобы терапевтическая нуклеотидная последовательность была направлена в ядро. Эти так называемая ядерная транслокация или ядерные локализующие последовательности (NLS) обычно содержат много положительно заряженных аминокислот. Так как карбоксильные концы протеина гена VIII нитевидных фагов уже несут на себе положительный заряд, увеличение заряда и вероятность ядерного переноса можно увеличить путем слияния известных NLS последовательностей клеток млекопитающих с протеином гена VIII. NLS слияние с оболочковыми протеинами нитевидных фагов могут быть замещены. NLS можно слить с капсидным протеином, отлично от слияния лиганд/капсид.

Примеры NLS последовательностей включают те, которые напоминают короткие основные NLS SV40 Т антигена, состоящие из двух частей NLS нуклеоплазмина; рибонуклеопротеиновую последовательность A1; маленькую ядерную рибонуклеопротеиновую последовательность UA1 и протеин вируса-1 Tax Т-лимфоцита человека. Другие полезные NLS последовательности включают NLS HIV матричного протеина и компоненты ядерной транслокации importain/hSRPI и Ran/TC4; консенсусную последовательность КХХ (K/R), фланкированную Pro или А1а; последовательность ядерной транслокации нуклеоплазмина; или NLS из antennapedia (см. WO 96/41606).

В некоторых случаях пептиды, конденсирующие нуклеиновую кислоту, связаны с неосновными последовательностями ядерной локализации, функция которых состоит в транспорте нуклеопротеина. Примеры таких последовательностей включают нуклеопротеин гриппа и протеин HIV MA. Другие полезные NLS включают hnRNP A1 протеин, протеин, который транспортирует комплексы рибонуклеопротеинов. Другой полезный NLS включен в пептиды, такие как NBC1 и NBC2, функция которых состоит в конденсации нуклеиновой кислоты (см. WO 96/41606). Таким образом, в настоящем изобретении предложено использование указанных выше последовательностей, а также и других, раскрытых здесь.

Библиотеку последовательностей случайных пептидов можно скринировать в поисках новых последовательностей, которые стимулируют ядерную транслокацию. Короче, в одном из таких способов библиотеку случайных пептидных генов гибридизуют с генами нитевидных фагов VIII, VII и IX и скринируют в поисках эффективной ядерной транслокации, анализируя инфицированные клетки в отношении экспрессии репортерного гена или осуществляя селекцию с помощью лекарств.

Могут быть включены дополнительные факторы, которые усиливают экспрессию трансгена. Такие факторы можно идентифицировать способом, в котором последовательности сливают с протеинами оболочки фага и осуществляют селекцию фага на основании эффективной экспрессии репортерного гена. Известные ДНК репарационные ферменты или полимеразы из клеток млекопитающих, или одноцепочечные ДНК вирусы представляют собой возможные последовательности.

Конструируют фаг, который представляет лиганд как результат слияния с фаговым оболочковым протеином, таким образом, чтобы они содержали соответствующие кодирующие участки. Обычно для нитевидных фагов используют гены III и VIII. Другие капсидные протеины могут служить заменой. Методики для встраивания кодирующей лиганд последовательности в ген фага хорошо известны (см. например, Sambrook et al., выше; Ausubel et al., выше).

В некоторых вариантах размножение или стабильное сохранение такой конструкции может оказаться желательным, или может быть необходимым для достижения достаточного количества или достаточной концентрации генного продукта для эффективной генной терапии. Примеры реплицирующих и стабильных источников репликации эукариотного происхождения известны.

II. ЛИГАНДЫ В том смысле, как здесь использован, термин "лиганд" относится к любому пептиду, полипептиду, протеину или не протеину, такому, как пептидомиметин, который способен связываться с молекулой на поверхности клетки и интернализоваться. Интернализация по эндосомальному пути является предпочтительным способом проникновения. В том смысле, как здесь использован, термин "связываться с рецептором" относится к способности лиганда специфически распознавать и детектируемо связываться с рецептором, о чем свидетельствуют стандартные in vitro анализы.

В контексте настоящего изобретения лиганд конъюгирован с протеином бактериофага либо как протеин слияния, либо за счет химической конъюгации, и используется для доставки объекта с нуклеиновой кислотой (т.е. терапевтического гена) в клетку. Известно множество молекул, которые связываются со специфическим рецептором и интернализуются обычно за счет эндосом. Другими молекулам могут служить антитела и производные антител. Кроме того, предложены способы селе