Слитый полипептид или его соль, экспрессирующий вектор и фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения ige-опосредованных болезней

Слитый полипептид или его соль, экспрессирующий вектор и фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения ige-опосредованных болезней

Реферат

 

Изобретение относится к генетической инженерии. Слитый полипептид или его соль включает, по крайней мере, один IgЕ-связывающий домен с, по крайней мере, одним компонентом сывороточного альбумина (HSA). IgE-связывающий домен является IgЕ^R или пре-IgЕ^R. Аминокислотная последовательность приведена в описании. Экспрессирующий вектор содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый полипептид. Фармацевтическая композиция содержит слитый полипептид или его соль в эффективном количестве и фармацевтически приемлемые носители или разбавители. Изобретение позволяет получить фармкомпозицию для лечения опосредованных IgE аллергических заболеваний и связанных с ними нарушений, таких как атопический дерматит, атопическая астма и хроническая крапивница. 3 с. и 3 з.п.ф-лы, 15 ил.

Область техники изобретения Изобретение относится к слитым полипептидам. В частности, оно относится к слитым полипептидам, содержащим IgE-связывающий домен и компонент человеческого сывороточного альбумина (HSA), и их солям. Изобретение также относится к полинуклеотидам и функционально эквивалентным по физиологической активности полипептидам, которые являются промежуточными продуктами при получении таких слитых полипептидов, их соответствующим рекомбинантным векторам экспрессии, соответствующим прокариотическим и эукариотическим системам экспрессии и способам синтеза слитых полипептидов.

Предпосылки создания изобретения Взаимодействие между иммуноглобулином Е (IgE) и его рецепторами играет определенную роль в защите от паразитарных инфекций у людей (М. Сарrоn и A. Capron, Science, 264 [1994] 1876-1877). Однако в промышленно развитых странах, в которых санитарно-гигиенические условия превосходят таковые в менее развитых странах, случаи паразитарных инфекций являются более редкими, чем нарушение системы IgE в результате перепроизводства IgE в ответ на аллергены окружающей среды, которые вызывают аллергии и другие болезненные состояния, опосредованные IgE или IgE-рецептором.

IgE представляет собой первичное антитело, участвующее в инициации непосредственной аллергической реакции, и является основным компонентом в поддержании поздней фазы ответа. IgE синтезируется в В-лимфоцитах и проявляет свои действия после связывания с рецептором, обладающим высокой аффинностью к IgE, т.е. FcRI, который обнаружен на поверхности клеток-эффекторов аллергии, таких как тучные клетки, базофилы и эозинофилы. IgE также обладает индуцирующими функциями благодаря связыванию с его рецептором на антигенпрезентирующих клетках, таких, как клетки Лангерганса, В-клетки и моноциты (G. C. Mudde и др., Allergy, 50 [1995] 193-199).

Аллергическая реакция или состояние проявляется, когда молекулы IgE связываются с поверхностью клеток-эффекторов аллергии через IgE-рецептор, т. е. FcRI, и становятся перекрестно сшитыми с аллергеном, вызывая тем самым сигнал инициации дегрануляции цитоплазматических гранул в клетках, сопровождаемый выделением медиаторов аллергии, таких как гистамин, серотонин, простагландины и цитокины, и последующий локальный отек ткани и увеличение количества воспаленных клеток. Иными словами, стимуляция аллергии и связанные с ней состояния обусловлены взаимодействием IgE-рецептора, FcRI, с находящимися в кровотоке аутоантителами к FcRI.

FcRI обычно существует в виде тетрамера, включающего -,- и две -цепи (т. е. "субъединицы"), хотя на моноцитах и клетках Лангерганса -cубъединица отсутствует.

Было установлено, что IgE-связывающий сайт FcRI полностью находится внутри его -субъединицы (обозначен как FcRI) (J. Hakimi и др., J. Biol. Chem. , 265 [1990] 22079-22081; U. Blank и др., J. Biol. Chem. 266 [1991] 2639-2646). Установлено далее, что рекомбинантные "knockout"-мыши, у которых генетическим путем удалена вся -субъединица, не способны поддерживать аллергическую реакцию при контрольном заражении аллергеном (D. Dombrowicz и др., Cell, 75 [1993] 969-976).

FcRI представляет собой высоко гликозилированный полипептид с молекулярной массой приблизительно 60 кДа, включающий гидрофобный трансмембранный домен, а также гидрофильный внеклеточный ("экто-") и цитоплазматический домены, которые расположены на наружной поверхности клетки. Кроме того, IgE-связывающая способность FcRI обусловлена его внеклеточной областью (J. Hakimi и др. [1990] , см. выше; Leder и др., US 4962035). Представляется вероятным производство растворимой, секретируемой молекулы путем вырезания трансмембранной области и последовательностей, расположенных за ней по ходу транскрипции (С. Ra и др., Int. Immunol. 5 [1993] 47-54), причем полученная в результате этого укороченная последовательность, состоящая в основном из внеклеточного домена FcRI человека, обладает IgE-связывающей активностью in vitro и in vivo (M. Haak-Frendscho и др., Immunol. 151 [1993] 351-358 определили остатки аминокислот в положении 1-204 FcRI, слитые с укороченной тяжелой цепью С-области IgGl; С. Ra и др. [1993], см. выше, определили остатки 1-172 FcRI, соответствующие остаткам 26-197 последовательности, представленной в SEQ.ID.NO.1). Структурными особенностями этого фрагмента являются два потенциальных дисульфидных мостика и семь потенциальных сайтов гликозилирования (M. Haak-Frendscho и др. [1993], см. выше).

Таким образом, укороченные последовательности FcRI, состоящие в основном из внеклеточного домена, потенциально могут вводиться в качестве терапевтических агентов млекопитающему для связывания сывороточного IgE с целью предупреждения его связывания со своим высокоаффинным рецептором на клетках-эффекторах аллергии, а также для подавления биосинтеза de novo IgE в лимфоцитах человека (Y. Yanagihara и др., J. Clin. Invest. 94 [1994] 2162-2165).

Однако эффективное использование IgE-связывающего полипептида, такого как внеклеточный домен FcRI, для системного лечения аллергических нарушений у млекопитающих, опосредованных IgE или IgE-рецептором, было затруднено из-за его экстремально короткого времени существования in vivo вследствие быстрого клиренса из циркулирующей плазмы. Учитывая, что заболевания, опосредованные IgE или IgE-рецептором, составляют 10-20% от случаев обращения пациентов к врачу, эффективное лечение должно быть весьма ценным для пациентов, страдающих от таких заболеваний, и должно представлять собой важное достижение в клиническом лечении нарушений, опосредованных IgE или IgE-рецептором, таких как аллергия и связанные с аллергией состояния.

Таким образом, представляется важным получить IgE-связывающий полипептид, обладающий пролонгированной эффективной продолжительностью жизни в сыворотке и вследствие этого обладающий улучшенной клинической ценностью для лечения аллергии, в частности для системного лечения атонического дерматита, атонической астмы и хронической крапивницы, а также улучшенной активностью с точки зрения эффективного и относительно недорого способа лечения.

Краткое изложение сущности изобретения Согласно изобретению было установлено, что путем слияния IgE-связывающего домена и компонента человеческого сывороточного альбумина (HSA) могут быть получены слитые полипептиды, обладающие удлиненным временем полужизни в сыворотке по сравнению с одним IgE-связывающим доменом без потери IgE-связывающей активности, что приводит к образованию IgE-связывающих полипептидов, предложенных для применения в системном лечении аллергии и других, опосредованных IgE заболеваний. Системно введенный IgE-связывающий полипептид должен связываться с IgE сыворотки, а также с находящимися в кровотоке аутоантителами к IgE-рецептору, FcRI, препятствуя их связыванию со связанным с клеткой FcRI и тем самым препятствуя и/или ингибируя аллергическую реакцию и связанные с ней проявления.

Кроме того, было установлено, что при использовании слитых полипептидов по изобретению, включающих более одного IgE-связывающего домена на молекулу, могут быть достигнуты значительные улучшения IgE-связывающей активности. Например, было обнаружено, что "димерная" молекула по изобретению обладает значительно увеличенной IgE-связывающей активностью по сравнению с "мономером" по изобретению.

Понятие "димер" в контексте настоящего описания относится к слитому полипептиду по изобретению, несущему два IgE-связывающих домена. Понятие "мономер" относится к слитому полипептиду по изобретению, несущему один IgE-связывающий домен. Мономер или димер может быть сконструирован в виде слияния с одним или с множеством HSA-компонентов. Например, мономерный слитый полипептид по изобретению может включать IgE-связывающий домен, слитый либо на своем амино-, либо на карбоксильном конце с HSA-компонентом. В альтернативном варианте мономер может включать IgE-связывающий домен, слитый на своих обоих концах с HSA-компонентами. Димерный слитый полипептид по изобретению может включать, например, два IgE-связывающих домена, слитых через карбоксильный конец одного и аминоконец другого с подлежащим встраиванию HSA-компонентом. В альтернативном варианте димер может содержать в дополнение к его двум IgE-связывающим доменам множество HSA-компонентов.

Кроме того, было установлено, что димерная молекула по изобретению обладает неожиданно высокой активностью.

Таким образом, изобретение относится к слитым полипептидам и их солям, включающим по крайней мере один IgE-связывающий домен, слитый по крайней мере с одним HSA-компонентом; предпочтительно к мономерным слитым полипептидам, в которых один IgE-связывающий домен слит с одним или с несколькими HSA-компонентами, или к многомерным слитым полипептидам, в которых два или несколько IgE-связывающих доменов слиты по крайней мере с одним HSA-компонентом; более предпочтительно к димерам, несущим два IgE-связывающих домена и по крайней мере один HSA-компонент.

Кроме того, изобретение относится к полинуклеотидам, являющимся промежуточными продуктами полипептидов.

Понятие "слитый" или "слияние" в контексте настоящего описания относится к полипептидам, в которых: (I) данный функционально активный домен (т.е. IgE-связывающий домен) связан на своем карбоксильном конце посредством ковалентной (предпочтительно пептидной, т.е. амидной) связи либо с аминоконцом другого функционально активного домена (т.е. HSA-компонента), либо с пептидом-линкером, который сам связан посредством ковалентной (предпочтительно пептидной) связи с аминоконцом другого функционально активного домена, и/или (II) данный функционально активный домен (т.е. IgE-связывающий домен) связан на своем аминоконце посредством ковалентной (предпочтительно пептидной, т. е. амидной) связи либо с карбоксильным концом другого функционально активного домена (т. е. HSA-компонента), либо с пептидом-линкером, который сам связан посредством ковалентной (предпочтительно пептидной) связи с карбоксильным концом другого функционально активного домена.

Аналогично этому понятие "слитый", когда оно используется в отношении полинуклеотидных промежуточных продуктов по изобретению, обозначает, что 3'-конец [или 5'-конец] нуклеотидной последовательности, кодирующей первый функционально активный домен, связан соответственно с 5'-концом [или 3'-концом] нуклеотидной последовательности, кодирующей второй функционально активный домен, либо посредством ковалентной связи, либо опосредованно с помощью нуклеотидного линкера, который сам ковалентно связан предпочтительно на своих концах с полинуклеотидом, кодирующим первый функционально активный домен, и с полинуклеотидом, кодирующим второй функционально активный домен.

Предпочтительно слитый полипептид или его соль представляет собой мономер или димер, причем в случае димера он включает два IgE-связывающих домена, слитых с HSA-компонентом, причем первый IgE-связывающий домен слит на своем карбоксильном конце с аминоконцом HSA-компонента, а второй IgE-связывающий домен слит на своем аминоконце с карбоксильным концом HSA-компонента.

Слитые полипептиды по изобретению также могут содержать дополнительные функционально активные домены в дополнение к IgE-связывающим доменам и HSA-компонентам, например полноразмерные или укороченные человеческие протеины (например, растворимые внеклеточные фрагменты), такие как цитокины, или аминоконцевой фрагмент урокиназы. Эти дополнительные функционально активные домены могут сами по себе служить в качестве линкерных пептидов, например, соединяя IgE-связывающий домен с другим IgE-связывающим доменом или с HSA-компонентом; альтернативно этому они могут быть локализованы еще где-либо в слитой молекуле, например на ее амино- или карбоксильном конце.

Примеры слитых полипептидов по изобретению могут быть представлены следующими формулами: R₁-L-R₂, (I) R₂-L-R₁, (II) R₁-L-R₂-L-R₁, (III) R₁-L-R₁-L-R₂, (IV) R₂-L-R₁-L-R₁, (V) где R₁ обозначает аминокислотную последовательность IgE-связывающего домена, R₂ обозначает аминокислотную последовательность HSA-компонента, L в каждом случае назависимо обозначает ковалентную (предпочтительно пептидную) связь или обозначает пептид-линкер, который связан посредством ковалентной (предпочтительно пептидной) связи с концом R₁ и/или R₂, причем вышеуказанные фрагменты молекул приведены в прямом направлении, т. е. их левый конец соответствует аминоконцу, а правый конец карбоксильному концу молекулы.

Было обнаружено, что уровни IgE-связывания являются высокими, когда слитый полипептид находится под управлением IgE-связывающего домена; это означает, что IgE-связывающий домен содержит N-концевую область зрелого слитого протеина (как в случае соединений формул I, III и IV, см. выше). Особенно предпочтительным является димер вышеприведенной формулы III, т.е. димер, в котором протеиновая область, которая управляет экспрессией, представляет собой область, входящую в IgE-связывающий домен, слитый на своем карбоксильном конце с аминоконцом HSA-компонента, который в свою очередь слит на своем карбоксильном конце с аминоконцом второго IgE-связывающего домена. Если существует более одного фрагмента R₁, или более одного фрагмента R₂, или более одного фрагмента L, эти фрагменты могут быть идентичны, но это условие не является обязательным.

Предпочтительно слитые полипептиды по изобретению включают по крайней мере один растворимый секретируемый млекопитающим IgE-связывающий домен, слитый по крайней мере с одним HSA-компонентом, и их фармацевтически приемлемые соли.

Кроме того, изобретение относится к способу предупреждения и/или лечения нарушений, опосредованных IgE или IgE-рецептором, в частности аллергических реакций, таких как атопический дерматит, атопическая астма и хроническая крапивница, предусматривающему введение слитых полипептидов по изобретению или их фармацевтически приемлемых солей пациенту, нуждающемуся в таком лечении, а также изобретение относится к фармацевтическим композициям, включающим слитые полипептиды по изобретению или их фармацевтически приемлемые соли вместе по крайней мере с одним фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем.

Кроме того, изобретение относится к физиологически активным функциональным эквивалентам слитых полипептидов по изобретению, которые являются промежуточными продуктами при синтезе полипептидов, полинуклеотидам, которые являются промежуточными продуктами при получении слитых полипептидов или их физиологически активным функциональным эквивалентам, как они определены выше, олигонуклеотидным промежуточным продуктам, необходимым для их конструирования, пептидам, кодируемым такими олигонуклеотидами, рекомбинантным векторам для экспрессии слитых молекул, прокариотическим или эукариотическим (прежде всего относящимся к млекопитающим) системам экспрессии и способам получения с помощью таких систем экспрессии слитых полипептидов или их физиологически активных функциональных эквивалентов.

Описание последовательностей SEQ.ID.NO и относящихся к ним понятий SEQ. ID.NO.1: Аминокислотная последовательность доминантной формы полноразмерного нативного человеческого FcRI, включающая сигнальную последовательность Понятие "пре-IgE^R" относится к остаткам Met₁-Leu₂₀₄ последовательности SEQ. ID. NO. 1. Понятие "IgE^R" относится к зрелой форме пре-IgE, которая включает остатки Val₂₆-Leu₂₀₄ последовательности SEQ.ID.NO.1 (т.е. внеклеточного домена FcRI).

SEQ.ID.NO.2: Аминокислотная последовательность нативной формы препро-HSA (обозначенная в настоящем описании как "препро-HSA I"), включающая остатки Met₁-Leu₆₀₉ Доминантная форма зрелого нативного протеина (обозначенная в настоящем описании как "HSA I") представлена остатками Asp₂₅-Leu₆₀₉ последовательности SEQ.ID.NO.2.

Понятие "препро-HSA II" относится к усеченной на одну аминокислоту (Leu₆₀₉) на карбоксильном конце нативной последовательности и, следовательно, относится к остаткам Met₁-Gly₆₀₈ последовательности SEQ.ID.NO.2.

Зрелая форма препро-HSA II, обозначенная в настоящем описании как "HSA II", представлена остатками Asp₂₅-Leu₆₀₈ последовательности SEQ.ID.NO.2.

SEQ. ID. NO.3: Аминокислотная последовательность, кодируемая EcoRI-фрагментом плазмиды R-H-R/SK 50, полученной в примере 5, включает последовательность "пpe-IgE^R", представленную остатками 1-204; линкер AlaSer(Gly)₄Ser (обозначенный далее в настоящем описании как "L₁"), представленный остатками 205-211, последовательность HSA II, представленную остатками 212-795, линкер (Gly)₃Ser (обозначенный далее в настоящем описании как "L₂"), представленный остатками 796-799, и последовательность "IgE^R", представленную остатками 800-978.

Зрелый димерный слитый полипептид по изобретению, обозначенный в настоящем описании как "IgE^R-L₁-HSA II-L₂-IgE^R" или в альтернативном варианте как "IgE^R-HSA-IgER-димep", экспрессируемый клетками СНО согласно способу, описанному в примере 7, имеет аминокислотную последовательность Val₂₆-Leu₉₇₈ последовательности SEQ.ID.NO.3.

SEQ. ID. NO. 4: Нуклеотидная последовательность EcoRI-фрагмента плазмиды R-H-R/SK 50 из примера 5, включающая полинуклеотидную последовательность, кодирующую "пpe-IgE^R", в положениях 10-621, олигонуклеотид, кодирующий L₁, в положениях 622-642, полинуклеотид, кодирующий HSA II, в положениях 643-2394, олигонуклеотид, кодирующий L₂, в положениях 2395-2406, и полинуклеотид, кодирующий "IgE^R", в положениях 2407-2943, с двумя стоп-кодонами в положениях 2944-2949.

Сайты рестрикции на концах кодирующих фрагментов и в областях линкеров находятся в положениях 1-6, 622-627, 637-642, 2387-2393, 2401-2406 и 2950-2955. Последовательность Kozak представляет собой нуклеотидную последовательность в положениях 7-9.

Точковые мутации, отличающиеся от консенсусной нуклеотидной последовательности HSA, находятся в положениях 804, 1239, 1290, 1446, 1815, 2064 и 2079. Поскольку точковые мутации находятся в незначимом положении, они не оказывают влияния на аминокислотную последовательность.

SEQ.ID.NO.5: Нуклеотидная последовательность доминантной формы нативного препро-HSA, соответствующая фиг.12 и аминокислотной последовательности SEQ. ID.NO.2 SEQ. ID.NO.6: Нуклеотидная последовательность доминантной формы полноразмерного нативного человеческого FcRI. включающая сигнальную последовательность и соответствующая фиг.13 и аминокислотной последовательности SEQ. ID.NO.1 Описание чертежей На приложенных чертежах указанные молекулы находятся в прямом положении, т. е. левый конец соответствует аминоконцу (или 5'-концу), а правый конец соответствует карбоксильному концу (или 3'-концу).

Фиг. 1А-В: Период полужизни в сыворотке мышей: Изменение во времени (10-800 мин после инъекции) концентрации (в пикомолях протеина на мл сыворотки) in vivo (А) свободного протеина HSA I и (Б) IgE^R-протеина (обозначенного как "свободная альфа-цепь") и IgE^R-L₁-HSA II-L₂-IgE^R-димерного слитого полипептида (обозначенного как "IgE^R-HSA-IgE^R-димep"), полученного из СНО-клеток, как описано в примере 7.

(В) Период полужизни в сыворотке свободного HSA I по фиг.1А в сравнении с периодом полужизни димерного слитого полипептида ("IgE^R-HSA-IgE^R") по фиг. 1Б путем нормирования на 1 по отношению к концентрациям в сыворотке через 10 мин после инъекции.

Фиг. 2: Экстравазация, являющаяся результатом пассивной кожной реакции анафилаксии у мышей, которым вводят внутривенно серийные разведения (10, 50 или 500 мкг/кг) полипептида IgE^R-L₁-HSA II-L₂-IgE^R ("IgE^R-HSA-IgE^R-димер"), полученного согласно примеру 7 (контрольная группа получала концентрацию 0 мкг/мл); площадь в мм²; интервалы 5, 15 и 30 мин до сенсибилизации с помощью внутрикожной инъекции антителом в виде моноклонального мышиного IgE к динитрофенилу (ДНФ) и последующего контрольного заражения раствором ДНФ-бычий сывороточный альбумин, содержащим 1% красителя Эванса голубого.

Фиг.3: Схематическое изображение трех слитых полипептидов по изобретению (два мономера и один димер), также приведены полипептиды-линкеры: I. Мономеры (1) Мономер с лидирующим HSA, содержащий HSA II (обозначенный на чертежах как "HSA"), слитый через L₂ ("GGGS") с IgE^R. Нуклеотиды, кодирующие остатки Leu₆₀₇Gly₆₀₈ HSA II, как установлено, содержат уникальный сайт MstII, а нуклеотиды, кодирующие остатки GlySer L₂, содержат сайт BamHI (кодируемые аминокислоты подчеркнуты).

(2) Мономер с лидирующим IgE-связывающим доменом, содержащий IgE^R, слитый на своем карбоксильном конце через L₁ (т. е. "ASGGGGS") с HSA II (обозначен на чертеже как "HSA"). Олигонуклеотид, кодирующий L₁, содержит сайт NheI и BamHI соответственно (кодируемые аминокислоты AlaSer и GlySer L₁ подчеркнуты).

II. Димер Димер с лидирующим IgE-связывающим доменом, содержащий первый IgE^R, слитый на своем карбоксильном конце через L₁ с аминоконцом HSA II (обозначен на чертеже как "HSA"), карбоксильный конец которого слит со вторым IgE^R через L₂, с сайтами рестрикции в кодирующем полинуклеотиде, как описано выше для мономера.

Фиг. 4: ПЦР-праймеры для укорачивания полноразмерной кДНК человеческого FcRI (обозначена далее как кДНК IgE-рецептора) с получением ДНК, кодирующей: (I) IgE^R [сайт BamHI добавлен к 5'-концу кодирующей цепи для FcRI с помощью олигонуклеотида 18, а стоп-кодон и сайты EcoRI и SalI добавлены к 3'-концу некодирующей цепи с помощью олигонуклеотида 19], (II) npe-IgE^R [олигонуклеотид 20, добавляющий сайты SstI, EcoRI и Kozak к 5'-концу цепи, кодирующей FcRI, олигонуклеотид 31, добавляющий сайты NotI и NheI (и удаляющий второй сайт NheI) в некодирующей цепи FcRI], (III) npe-IgE^R [олигонуклеотиды 20 и 19, применяемые в соответствии с описанным выше]: (А) "конструкция с лидирующим HSA": субклонирование (I) (т.е. IgE^R), указанного выше, в векторе SK с получением клона рЕК1 клонирующего вектора ТА, использованного для конструирования мономера с лидирующим HSA II, (Б) "конструкция с лидирующим IgER": субклонирование (II) (т.е. пре-IgE^R) в векторе SK с получением конструкции IgER/TA 1, применяемой для получения мономера с лидирующим IgE^R, (В) "только IgER": субклонирование (III) (т.е. пре-IgE^R) в векторе SK с получением конструкции IgE^R/Fl/TA 34, применяемой для экспрессии зрелого IgE^R, который используется в качестве стандарта.

Двойными звездочками обозначены два стоп-кодона.

Фиг. 5: Пары ПЦР-праймеров для укорачивания полноразмерной кДНК человеческого препро-HSA I с получением кДНК, кодирующей: (I) препро-HSA II, слитый на карбоксильном конце с L₂ [олигонуклеотид 24, добавляющий сайты SpeI, EcoRI и последовательность Kozak к 5'-концу кодирующей цепи, олигонуклеотиды 28 и 29, добавляющие линкер, кодирующий сайты MstII и HindIII на 3'-конце HSA II], (II) L₁, слитый с 5'-концом HSA II [олигонуклеотид 26, добавляющий сайты NotI, NheI, линкер и BamHI к кодирующей цепи, олигонуклеотид 27, содержащий сайт NcoI в некодирующей цепи], (III) препро-HSA I [олигонуклеотид 24, применяемый в соответствии с описанным выше, и олигонуклеотид 25, добавляющий стоп-кодон, сайты EcoRI и HindIII к 3'-концу некодирующей цепи]: (А) "конструкция с лидирующим HSA": субклонирование (I) в векторе SK с получением рЕК7, использованного для конструирования мономера с лидирующим HSA II, (Б) "конструкция с лидирующим IgER": субклонирование (II) в векторе SK, с получением конструкции HSA/SK 5, применяемой для получения мономера с лидирующим IgE^R, (В) "только HSA": субклонирование (III) в векторе SK с получением конструкции HSA/SK 17, кодирующей зрелый протеин нативного человеческого сывороточного альбумина (т.е. HSA I), который используется в качестве стандарта.

Фиг. 6: Олигонуклеотиды 1-10, 12, 16, 17, 22 и 30 для секвенирования человеческого сывороточного альбумина (HSA). применяемые для секвенирования материалов, клонированных в ТА и полученных после связывания с IgE-связывающими фрагментами.

Фиг. 7: Олигонуклеотиды 11, 13 и 23 для секвенирования IgE-рецептора, применяемые для секвенирования фрагментов, клонированных в ТА и полученных после связывания с HSA-компонентом.

Фиг.8: (А) Олигонуклеотиды 14 и 15 для введения мутаций в человеческий сывороточный альбумин; (Б) ПЦР- и линкерные олигонуклеотиды 18-20, 24-29 и 31 для конструирования слитых полипептидов.

Фиг. 9: Конструирование вектора HSA-IgER/SK 49, включающего полинуклеотид, кодирующий препро-HSA II (обозначен на чертеже как "HSA"), слитый на 3'-конце через олигонуклеотид, кодирующий линкер L₂ (представленный на фиг.9 "GGG"), с 5'-концом полинуклеотида, кодирующего IgE (обозначен на чертеже как "IgER"), путем лигирования BamHI,SalI-фрагмента вектора рЕК1 с BamHI,SalI-фрагментом рЕК7.

Фиг. 10: Конструирование вектора IgER-HSA/SK 1, включающего полинуклеотид, кодирующий пре-IgE^R (обозначен на чертеже как "IgER"), слитый на 3'-конце через олигонуклеотид, кодирующий линкер L₁ (представленный как "GGG"), с 5'-концом полинуклеотида, кодирующего HSA II ("HSA"), путем лигирования SstI, NheI-фрагмента IgER/TA 1 с SstI-NheI фрагментом HSA/SK 5.

Фиг.11: Конструирование вектора HSA-IgER Pst Sal/SK 37, включающего полинуклеотид, кодирующий HSA II (обозначен на чертеже как "HSA3"), слитый на 3'-конце через олигонуклеотид, кодирующий линкер L₂ (не показан), с 5'-концом полинуклеотида, кодирующего IgE^R (обозначен на чертеже как "IgER"), путем лигирования PstI, SalI-фрагмента HSA-IgER/SK 49 с вектором SK. Также показано конструирование вектора R-H-R/SK 50, включающего полинуклеотид, кодирующий пре-IgE^R (обозначен на чертеже как "IgER"), слитый на 3'-конце через олигонуклеотид, кодирующий линкер L₁ (не показан), с 5'-концом полинуклеотида, кодирующего HSA II ("HSA"), который в свою очередь слит через олигонуклеотид, кодирующий L₂ (не показан), с полинуклеотидом, кодирующим IgE^R ("IgER"). Вектор получают лигированием РstI,КрnI-фрагмента вектора HSA-IgER Pst Sal/SK 37 с PstI, KpnI-фрагментом вектора IgER-HSA/SK l.

Фиг.12: Нуклеотидная последовательность человеческого сывороточного альбумина и аминокислотная последовательность, соответствующие SEQ.ID.NO.2 и SEQ.ID.NO.5.

Фиг. 13: Нуклеотидная последовательность IgE^R и аминокислотная последовательность, соответствующие SEQ.ID.NO.1 и SEQ.ID.NO.6.

Фиг.14: Нуклеотидная и аминокислотная последовательности EcoRI-фрагмента вектора R-H-R/SK 50, соответствующие последовательностям SEQ.ID.NO.3 и SEQ. ID. NO. 4, кодирующим димерный слитый протеин R1-HSA-R1. Последовательность HSA обозначена курсивом. Линкерные последовательности обозначены маленькими буквами. Точковые мутации, отличающиеся от консенсусной нуклеотидной последовательности HSA, приведены жирным шрифтом маленькими буквами. Поскольку точковые мутации находятся в незначимом положении, они не оказывают влияния на аминокислотную последовательность. Сайты рестрикции на концах фрагментов и в линкерной области подчеркнуты.

Фиг. 15: Данные ДСН-ПААГ-электрофореза очищенного зрелого слитого полипептида из примера 7.

Общее количество, внесенное в гель: 8 мкг (полоса 1), 6 мкг (полоса 2), 4 мкг (полоса 3) и 2 мкг (полоса 4); стандарты молекулярной массы: 97,4, 66,2, 45; 31, 21,5 и 14,4 кДа (полоса 5).

Подробное описание изобретения Изобретение относится к слитым полипептидам и их солям, включающим по крайней мере один IgE-связывающий домен, слитый по крайней мере с одним компонентом HSA.

Понятие "IgE-связывающий домен" относится к аминокислотной последовательности, обладающей способностью связываться или каким-либо иным образом взаимодействовать с IgE млекопитающего, например с IgE человека, таким образом, чтобы препятствовать связыванию IgE со своим рецептором, FcRI.

кДНК и установленная аминокислотная последовательность человеческого FcRI являются известными (J. Kochan и др., Nucleic Acids Research 16 [1988] 3584; Leder и др., US 4962035). FcRI человека кодирует NH₂-концевой сигнальный пептид [аминокислотные остатки (включая первый Met) Met₁-Ala₂₅], два иммуноглобулинподобных внеклеточных домена (остатки Val₂₆-Leu₂₀₄), гидрофобную трансмембранную область (Gin₂₀₅-Ile₂₂₄) и гидрофильный цитоплазматический хвост (остатки Ser₂₂₅-Asn₂₅₇) (относительно SEQ.ID.NO.1). Сигнальный пептид отщепляется во время внутриклеточного процессинга. Полноразмерная аминокислотная последовательность доминантной формы нативного человеческого FcRI включена в настоящее описание в виде SEQ.ID.NO.1.

"IgE^R" в контексте настоящего описания относится к аминокислотной последовательности Val₂₆-Leu₂₀₄ последовательности SEQ.ID.NO.1 (кодирующей внеклеточный домен), а понятие "пpe-IgE^R" относится к остаткам Met₁-Leu₂₀₄ последовательности SEQ.ID.NO.1 (кодирующей сигнальную последовательность, расположенную против хода транскрипции от внеклеточного домена).

IgE-связывающий домен представляет собой, например, аминокислотную последовательность, обладающую по крайней мере 80%-ной, более предпочтительно по крайней мере 85%-ной, еще более предпочтительно по крайней мере 95%-ной или наиболее предпочтительно по крайней мере 99%-ной гомологией с IgE^R, как она определена выше (гомологию рассчитывают как % идентичности между нативной последовательностью и измененной последовательностью в зависимости от общей длины последовательности нативной молекулы после линеаризации последовательностей и при необходимости введения брешей для достижения максимального процента идентичности последовательностей).

В подгруппе слитых полипептидов по изобретению компонент IgE-связывающего домена представляет собой (Ха) где (Ха) обозначает: (а) IgE^R или (б) встречающийся в естественных условиях аллель IgE, или (в) укороченную на карбоксильном конце на 1-12 (например, на 1-10, 1-7 или 1-4) аминокислот последовательность (а) или (б), (г) вариант (а), (б) или (в).

Под понятием "вариант" понимают: - последовательность (а), (б) или (в), модифицированную с помощью одной или нескольких делеций (которые отличаются от последовательностей, укороченных на карбоксильном конце) в общей сложности до 10 (например, 1-7 или 1-5) аминокислот, - инсерции в общей сложности до 10 аминокислот (например, 1-5), которые встроены внутрь аминокислотной последовательности, или в общей сложности до 100 аминокислот, которые присоединены к любому ее концу, или - консервативные замещения в общей сложности до 15 (например, 1-5) аминокислот.

IgE-связывающий домен предпочтительно представляет собой (Хb) где (Хb) обозначает: (а) IgE^R, (б) укороченную на карбоксильном конце на 1-7 аминокислот последовательность IgE^R, (в) вариант (а) или (б).

Еще более предпочтительно IgE-связывающий домен представляет собой (Хс) где (Хс) обозначает: (а) IgE^R, (б) укороченную на карбоксильном конце на 1-7 аминокислот последовательность IgE (например, последовательность Val₂₆-Ala₁₉₇ относительно SEQ.ID. NO.1).

Наиболее предпочтительно IgE-связывающий домен представляет собой IgE^R.

Предпочтительно любую гомологичную, укороченную последовательность или вариант получают методом рекомбинантной ДНК в качестве "секретируемого" полипептида, а именно зрелая последовательность пептида, кодирующего IgE-связывающий домен, может секретироваться из клетки-хозяина, в которой он (или его форма-предшественник, такая как преформа) синтезируется из полинуклеотида.

Вторая основная составляющая рекомбинантных слитых полипептидов по изобретению представляет собой человеческий сывороточный альбумин (HSA), компонент, который является наиболее широко распространенным в плазме протеином, на долю которого приходится 60 мас.% относительно всего содержания протеинов в плазме. Молекула человеческого сывороточного альбумина состоит из одной негликозилированной полипептидной цепи, состоящей из 585 аминокислот с молекулярной массой 66,5 кДа. Характерной особенностью альбумина является сложная структура его дисульфидного мостика (F.F. Clerc и др., J. Chromatogr. 662 [1994] 245-259). Человеческий сывороточный альбумин широко распространен в организме, в частности в компартментах кишечника и крови, где он в основном присутствует как наиболее широко распространенный протеин сыворотки, поддерживая осмотическое давление и объем плазмы. Кроме того, он медленно выводится печенью, а время его полужизни в организме человека in vivo составляет 14-20 дней (Т.A. Waldmann "Albumin Structure, Function and Uses", Pergamon Press [1977] 255-275). Человеческий сывороточный альбумин не обладает ферментативной или иммунологической функцией. Он является естественным носителем, участвующим в эндогенном транспорте и доставке различных природных, а также терапевтических молекул (Н. Lu и др., FEBS Lett. 356 [1994] 56-59; WO 93/15199; ЕР 648499; P. Yeh и др., PNAS USA 89 [1992] 1904-1908; ЕР 413622).

Человеческие клетки синтезируют сывороточный альбумин первоначально в форме препро-полипептида. Сигнальная последовательность из 18 аминокислот (включая первый Met) удаляется, когда протеин проходит через полость эндоплазматического ретикулума, но при этом еще сохраняется 6 аминокислот на N-конце (наиболее часто Arg-Gly-Val-Phe-Arg-Arg), которые затем подвергаются протеолитическому отщеплению во время или сразу после транспорта через секреторный аппарат.

Хорошо известно, что человеческий сывороточный альбумин является полиморфным (D. C. Carter и J.X. Но, Adv. Prot. Chem. 45 [1994] 153-203). Например, альбумин Наскапи имеет Lys₃₇₂ вместо Glu₃₇₂, проальбумин Кристчерча имеет измененную про-последовательность, т.е. Glu₂₄ вместо Arg₂₄ (Lattа и др., US 5100784).

Полная аминокислотная последовательность доминантной формы встречающегося в естественных условиях протеина, обозначенная в настоящем описании как "препро-HSA I", известна (A. Dugaiczyk и др., PNAS USA 79 [1982] 71-75) (SEQ. ID. NO. 2). Доминантная форма зрелого протеина ("HSA I") представлена Asp₂₅-Leu₆₀₉ последовательности SEQ.ID.NO.2.

HSA-носитель слитого полипептида по изобретению может иметь аминокислотную последовательность, обладающую по крайней мере 80%-ной, более предпочтительно по крайней мере 85%-ной, еще более предпочтительно по крайней мере 95%-ной и наиболее предпочтительно по крайней мере 99%-ной гомологией с остатками 25-609 SEQ. ID. NO. 2 (т.е. HSA I) (гомологию рассчитывают как % идентичности между нативной последовательностью и измененной последовательностью в зависимости от общей длины последовательности нативной мол