Штамм candida albicans № 253, используемый для получения антигена
Патент 2209243
Авторы
Классы МПК
Штамм candida albicans № 253, используемый для получения антигена
Реферат
Изобретение относится к микологии. Штамм Candida albicans 253 используется для получения антигенов, применяемых при приготовлении диагностических и лечебных препаратов против кандидозов сельскохозяйственных животных и птиц. Штамм обладает высокими иммуногенными свойствами, высокой спорообразующей способностью и является условно патогенным. 2 табл.
Изобретение относится к микробиологии, в частности к микологии, и может быть использовано для получения антигенов, применяемых при приготовлении диагностических и иммуногенных препаратов против кандидоза сельскохозяйственных животных и птицы.
Максимальное получение антигенов прямо пропорционально продуктивности штамма по ряду признаков, главным из которых является интенсивность спорообразования. Указанный признак, а также отсутствие токсигенности и выраженные иммуногенные свойства определяют целесообразность использования штамма для производства дагностикумов и конструирования вакцинных препаратов. Известно использование штамма Candida albicans для получения антигенов (см. а.с. СССР 1827632 по кл. G 01 N 33/53, опуб. 15.07.93 г.). Однако данный штамм продуцирует антигены, способные изменять скорость оседания эритроцитов (СОЭ), и используется только при диагностических исследованиях. Наиболее близким к заявляемому является штамм Candida albicans HKM 9656, депонированный в "Немецкой Коллекции Микроорганизмов", используемый для получения антигена - полисахарида (см. заявка РФ 98104502 по кл. С 12 Р 21/00, опуб. 20.02.2000 г.). Однако данный штамм предназначен для получения антигена, проявляющего только антиаллергическую активность при лечении млекопитающих. Изобретение направлено на решение задачи создания нового штамма - Candida albicans 253, обладающего высокой спорообразующей активностью, отсутствием патогенности, токсигенности и наличием иммуногенных свойств. Штамм Candida albicans 253 выделен в Саратовской области от теленка 22-дневного возраста, депонирован во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и кормов (ВГНКИ), хранится в Саратовской НИВС. Штамм Candida albicans 253 характеризуется следующими признаками Морфологические признаки Культура представлена овальными (2:1) или почти круглыми клетками с хорошо заметными вакуолями с небольшими ядрами. Культуральные признаки. На агаре Сабуро через 48 ч культивирования при температуре 28oС образуются выпуклые белые колонии с небольшим кремовым оттенком сметанообразной консистенции с гладкой блестящей поверхностью и ровными краями. На 5 сутки культивирования поверхность колонии гладкая, матовая, с кремовым оттенком, края слегка волнистые. При культивировании на жидких питательных средах через 48 ч при 28oС заметно помутнение бульона и образование компактного осадка. Ферментативные свойства Ферментативная активность проявляется на полужидкой среде Гисса: с глюкозой - образованием кислоты и газа; с мальтозой - также кислоты и газа; с сахарозой - только кислоты; с лактозой активность не проявляется. Видовое определение штамма проводят по способу Е.В.Себрякова в сответствии с а.с. СССР 1104153 (опуб. 23.07.84 г.). В качестве индикатора используют метиловый красный, а перед добавлением индикатора проводят пересев и дополнительное культивирование в течение 4-6 ч в среде, содержащей сахарозу и резазурин, а в качестве показателя дифференциации оценку проводят по изменению окраски культуральной жидкости. Происходит изменение цвета среды с резазурином из сине-фиолетового в малиновый в течение 4-6 ч и появление желтой окраски культуральной жидкости после добавления метилового красного. Антигенные свойства Штамм Candida albicans 253 продуцирует комплекс белков, полисахаридов и липидов, находящихся в клетке микроорганизма. Чувствительность к антибиоткам: зона задержки роста штамма леворином составляет 32 мм, нистатином - 45 мм. Ауксотрофность отсутствует. Вирулентные свойства При введении культуры белым мышам внутривенно и внутрибрюшинно в дозе 1109 спор/мл в объеме 0,5 мл, морским свинкам - внутрисердечно в дозе 3109 спор/мл в объеме 2,0 мл гибели животных не отмечается. Внутримышечное введение культуры штамма кроликам в дозе 3109 спор/мл и объеме 5 мл вызывает местную гиперемию с небольшим отеком прилежащих тканей, проходящую через 48 - 96 ч. Изменений в общем состоянии животных при этом не отмечается. Штамм относится к III группе патогенности - условно патогенный. Штамм Candida albicans 253 поддерживается методом периодических пересевов на искусственных питательных средах по признаку спообразования и культурально-морфологическим свойствам. В работе со штаммом мутагены не использовались. Пассажирования на животных не требуется. Штамм Candida albicans 253 хранят на агаре Сабуро в течение не более 30 сут, с последующим пересевом вначале на бульон Сабуро для получения двухсуточной культуры, а затем на агар Сабуро. Оптимальный способ хранения штамма - в ампулах в лиофилизированном состоянии при температуре 4oС до 1 года. Способ, условия и состав среды для размножения штамма - бульон и агар Сабуро. Культивирование осуществляется при температуре 28-32oС. Пример 1 Штамм Candida albicans 253 культивируют на питательных средах: Сабуро, Городковой или разработанной Саратовской НИВС по патенту РФ 2111245, опуб. 20.05.98 г., содержащей, мас.%: глюкозу 4-5; пептон 0,95 - 1,05; агар 3,5 - 3,6; сыворотку крови крупного рогатого скота 9-11; солевой раствор Хенкса - остальное. Спорообразование штамма испытано методом подсчета клеток в камере Горяева с использованием фазоконтрастного устройства по формуле: (а 4000 1000) : в = х, где а - число сосчитанных клеток; в - число малых квадратов камеры. Результаты спорообразования штамма 253 С. albicans на твердых питательных средах представлены в таблице 1. Пример 2 Штамм Candida albicans 253 культивируют при температуре 28oС в течение 6 суток на питательной среде, разработанной Саратовской НИВС по патенту РФ 2111245, состав которой описан в примере 1. Затем методом последовательных 12-кратных замораживаний (-20oС) и оттаиваний (+20oС) культуры разрушают клеточную стенку Candida. Фильтрованием через мембрану "Владипор" 3 освобождаются от целых клеток и цитоплазматических мембран. Полученный фильтрат подвергают обезвреживанию раствором формалина 0,4%-ной концентрации и добавляют масляный адъювант в соотношении 5 ч. антигена и 1 ч. адъюванта. Полученным антигеном иммунизировали лабораторных животных. В последующем их подвергали заражению вирулентным штаммом Candida albicans. В качестве контроля использовали неиммунизированных животных. Результаты иммунизации представлены в таблице 2. Таким образом, предлагаемый штамм Candida albicans 253 обладает высокой спорообразующей способностью, а продуцируемые штаммом антигены обладают достаточными иммуногенными свойствами.Формула изобретения
Штамм Candida albicans 253, коллекция ВГНКИ, используемый для получения антигена.РИСУНКИ
Рисунок 1, Рисунок 2