Иммунологический анализ человеческого медуллазина и диагностика рассеянного склероза с его помощью

Иммунологический анализ человеческого медуллазина и диагностика рассеянного склероза с его помощью

Реферат

 

Изобретение относится к области медицины, в частности к иммунологии. Способ обеспечивает высокую точность иммунологического измерения содержания человеческого медуллазина в крови и диагностики рассеянного склероза. Осуществляют этапы (а) и (b), при этом этап (а) является этапом разрушения лейкоцитов в образце крови водными жидкостями (i) и (ii) или смесью водных жидкостей (i) и (ii), где (i) - водная жидкость, имеющая осмотическое давление 250 мОсм/кг Н₂О или менее, или водная жидкость, имеющая осмотическое давление 310 мОсм/кг Н₂О или более; (ii) - водная жидкость, включающая гемолизат; этап (b) иммунологическое определение количества человеческого медуллазина, высвобожденного в указанный образец крови из лейкоцитов, разрушенных на этапе (а), с помощью антитела против человеческого медуллазина. С помощью описанного выше способа осуществляется диагностика рассеянного склероза. 2 с. и 16 з.п.ф-лы, 5 табл., 5 ил.

Настоящее изобретение относится к способу иммунологического измерения человеческого медуллазина в крови и способу диагностики рассеянного склероза с его помощью. Более подробно оно относится к способу иммунологического измерения человеческого медуллазина в крови, включающему этап предварительной обработки образца крови с целью точного определения содержания медуллазина в гранулоцитах крови, и к способу диагностики рассеянного склероза с использованием содержания медуллазина в крови.

ОПИСАНИЕ ПРЕДШЕСТВУЮЩЕГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ Медуллазин, который является разновидностью сериновой протеиназы, встречается в гранулоцитах и т.п., и как полагают, играет важную роль в защитном механизме, включая проявление воспаления, в частности, хронического воспаления. Количество медуллазина в гранулоцитах повышается на стадии прогрессирования ряда хронических воспалительных заболеваний и нормализуется в стадии ремиссии. Однако у пациентов, страдающих рассеянным склерозом, было отмечено, что количество медуллазина заметно возрастает за несколько дней до начала прогрессирования заболевания и нормализуется до наступления ремиссии. Для рассеянного склероза характерно локальное демиелинизирующее повреждение в белом веществе центральной нервной системы и глиоз. Это тяжелое хроническое воспалительное заболевание, которое прогрессирует с повторяющимися ремиссиями и обострениями и во многих случаях приводит к смерти через 10-15 лет. Причина рассеянного склероза все еще недостаточно ясна, но полагают, что это заболевание является разновидностью аутоиммунной болезни, при которой аутоантитела атакуют нервную ткань после стимуляции иммунной системы вирусом или бактерией. Диагностика этой болезни достаточно сложна и в настоящее время осуществляется с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ) или других подобных методов. Однако такой способ, как МРТ, требует наличия весьма громоздкого оборудования и высококвалифицированных специалистов для работы с ним, а также является дорогостоящим. Помимо этого способ анализа костно-мозговой жидкости связан с причинением пациенту значительной боли.

В свете этих обстоятельств в настоящее время разрабатывается простой диагностический способ, посредством которого может быть осуществлена диагностика заболевания, понимание состояния заболевания и прогностическая оценка. В результате было проведено исследование, посвященное способам измерения активности медуллазина в гранулоцитах крови, и в совокупности с разработкой способа иммунологического измерения, посредством которого эту активность можно легко измерить, предложена возможность диагностики рассеянного склероза по содержанию медуллазина в гранулоцитах крови. Например, для иммунологического определения медуллазина в крови был предложен способ измерения медуллазина с использованием поликлонального антитела (Y. AOKI et al.. Enzyme immunoassay of medullasin in peripheral blood, Clin. Chim. Acta, 15; 178(2), 193-204 (1988)).

Тем не менее наблюдался феномен, при котором, если измерение проводилось после разбавления образца крови водной средой при осуществлении способа иммунологического измерения медуллазина человека осуществлялось без обработки с целью полного вытеснения медуллазина, имеющегося в гранулоците, из этого гранулоцита, то воспроизводимость измеренных величин была плохой, что приводило к колебаниям измеренных величин. Соответственно имеется потребность в разработке способа иммунологического измерения количества человеческого медуллазина в крови с хорошей воспроизводимостью результатов.

Что касается вопроса о том, можно ли поставить диагноз рассеянного склероза на основе количества медуллазина в крови, то такое суждение требует проверки значительного количества клинических данных. Однако вплоть до настоящего времени этот вид данных не существует, и более того, трудно поставить точный диагноз из-за трудности получения точно измеренных величин медуллазина в гранулоцитах крови в силу большого разброса измеренных величин. Соответственно диагноз рассеянного склероза на основе количества медуллазина в крови был затруднен.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩЕСТВА ИЗОБРЕТЕНИЯ Соответственно авторы настоящего изобретения осуществили обширные исследования с целью решения описанной выше проблемы. В результате они установили, что человеческий медуллазин в крови можно точно измерить с хорошей воспроизводимостью путем иммунологического измерения человеческого медуллазина с помощью антител против человеческого медуллазина после полного разрушения лейкоцитов путем обработки образца крови водной жидкостью, включающей гемолизат, или водной жидкостью, имеющей специфическое осмотическое давление, отличающееся от осмотического давления человеческой крови.

Помимо этого после разработки указанного способа точного измерения человеческого медуллазина с хорошей воспроизводимостью результатов авторы настоящего изобретения заметили, что размеры и изменения измеренного содержания человеческого медуллазина в образце крови тесно связаны с началом рассеянного склероза, степенью его распространения в организме и т.п. Именно на основе этих открытий и было осуществлено настоящее изобретение.

Первая особенность настоящего изобретения относится к способу иммунологического измерения содержания человеческого медуллазина в крови, который характеризуется следующими этапами (а) и (b): (а) этап разрушения лейкоцитов в образце крови путем обработки указанного образца крови следующими водными жидкостями (i) или (ii) или смесью водных жидкостей (i) и (ii) (i) водная жидкость, имеющая осмотическое давление 250 мОсм/кгН₂О или менее, или водная жидкость, имеющая осмотическое давление 310 мОсм/кгН₂О или более; (ii) водная жидкость, включающая гемолизат; (b) иммунологическое измерение количества человеческого медуллазина, высвобожденного в образец крови из лейкоцитов, разрушенных на этапе (а), с помощью антитела против человеческого медуллазина.

Вторая особенность настоящего изобретения относится к способу диагностики рассеянного склероза, который характеризуется следующими этапами (а), (b) и (с): (а) этап разрушения лейкоцитов в образце крови путем обработки указанного образца крови следующими водными жидкостями (i) или (ii) или смесью водных жидкостей (i) и (ii) (i) водная жидкость, имеющая осмотическое давление 250 мОсм/кгН₂О или менее, или водная жидкость, имеющая осмотическое давление 310 мОсм/кгН₂О или более; (ii) водная жидкость, включающая гемолизат; (b) иммунологическое измерение количества человеческого медуллазина, высвобожденного в образец крови из лейкоцитов, разрушенных на этапе (а), с помощью антитела против человеческого медуллазина; (c) наблюдение за размерами и/или изменениями содержания человеческого медуллазина в крови, измеренного на этапе (b).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ Фигура 1 представляет собой калибровочную кривую для измерения человеческого медуллазина, построенную путем нанесения на график поглощения, измеренного путем иммуноферментного анализа, описанного в примере 2, как функции от концентрации антигена.

Фигура 2 представляет собой калибровочную кривую для измерения человеческого медуллазина, построенную путем нанесения на график поглощения, измеренного путем иммуноферментного анализа, описанного в примере 3, как функции от концентрации антигена.

Фигура 3 показывает значения человеческого медуллазина в образцах крови (мкг/10⁸ гранулоцитов), нанесенных на график отдельно для здоровых людей, пациентов, страдающих рассеянным склерозом, и пациентов, страдающих неврологическими заболеваниями невоспалительной природы.

Фигура 4 показывает значения человеческого медуллазина в образцах крови (мкг/10⁸ гранулоцитов), нанесенных на график отдельно для пациентов женского и мужского пола, страдающих рассеянным склерозом.

Фигура 5 показывает значения человеческого медуллазина в образцах крови (мкг/10⁸ гранулоцитов), нанесенных на график отдельно для пациентов различных возрастных групп, страдающих рассеянным склерозом.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ Далее в настоящем документе изобретение будет описано более подробно.

Предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения включают (1) и (2), ниже.

(1) Во-первых, создан способ иммунологического измерения содержания человеческого медуллазина в крови, включающий: (а) этап разрушения лейкоцитов в образце крови путем разбавления указанного образца крови следующими водными жидкостями (i) или (ii) или смесью водных жидкостей (i) и (ii) (i) водная жидкость, имеющая осмотическое давление 250 мОсм/кгН₂О или менее, или водная жидкость, имеющая осмотическое 310 мОсм/кгН₂О или более; (ii) водная жидкость, включающая гемолизат; (b) этап захвата человеческого медуллазина меченым иммунным комплексом путем контактирования образца крови, содержащего указанный человеческий медуллазин, высвобожденный из лейкоцитов, разрушенных на этапе (а), с антителом против человеческого медуллазина, иммобилизованным на нерастворимом носителе в присутствии меченого антитела против человеческого медуллазина, с образованием сендвич-комплекса путем реакций антиген-антитело; (c) этап измерения активности меченого материала в комплексе, полученном на этапе (b).

(2) Создан также способ диагностики рассеянного склероза, включающий: (a) этап разрушения лейкоцитов в образце крови путем разбавления указанного образца крови следующими водными жидкостями (i) или (ii) или смесью водных жидкостей (i) и (ii) (i) водная жидкость, имеющая осмотическое давление 250 мОсм/кгН₂О или менее, или водная жидкость, имеющая осмотическое давление 310 мОсм/кгН₂О или более; (ii) водная жидкость, включающая гемолизат; (b) этап захвата человеческого медуллазина меченым иммунным комплексом путем контактирования образца крови, содержащего указанный человеческий медуллазин, высвобожденный из лейкоцитов, разрушенных на этапе (а), с антителом против человеческого медуллазина, иммобилизованным на нерастворимом носителе в присутствии меченого антитела против человеческого медуллазина, с образованием сендвич-комплекса путем реакции антиген-антитело; (c) этап измерения активности меченого материала в комплексе, полученном на этапе (b); (d) этап наблюдения за размерами и/или изменениями содержания человеческого медуллазина в образце крови, полученного на основе значений для количества меченого материала, полученного на этапе (с); (e) диагностика начала рассеянного склероза и/или степени его распространения в организме по результатам наблюдения, полученным на этапе (d).

Основная часть человеческого медуллазина в образце крови, подлежащего измерению по настоящему изобретению, находится внутри гранулоцитов, которые являются одним из компонентов лейкоцитов, существующих в крови, и полное разрушение гранулоцитов для высвобождения всего медуллазина вовне по отношению к клеточной мембране перед проведением измерения является, таким образом, необходимым требованием для получения точных результатов измерения. Соответственно, если это требование не выполняется полностью, в результатах измерений будут большие колебания и могут быть получены только данные с плохой воспроизводимостью.

Механические способы, способы с использованием ультразвуковых волн и способы с использованием повторного замораживания и оттаивания можно использовать в качестве способов полного разрушения лейкоцитов в образце крови. Однако авторы настоящего изобретения после проведения обширных исследований установили, что данный способ является особенно эффективным в качестве практического способа, который позволяет получать измерения высокой точности и может выполняться относительно просто по сравнению с вышеупомянутыми способами, является следующий способ.

(1) Во-первых, способ обработки образца крови водной жидкостью, имеющей осмотическое давление, отличное от осмотического давления крови; (2) Во-вторых, способ обработки образца крови водной жидкостью, включающей гемолизат, который является фармацевтическим средством, с помощью которого клеточная мембрана гранулоцитов может быть разрушена при щадящих условиях.

Осмотическое давление крови человека находится в пределах приблизительно от 280 до 290 мОсм/кгН₂О, и поэтому трудно полностью разрушить гранулоциты в крови с использованием, например, водной жидкости, имеющей осмотическое давление от 250 до 310 мОсм/кгН₂О.

Соответственно полного разрушения гранулоцитов в крови человека можно добиться путем разбавления крови водной жидкостью, имеющей осмотическое давление менее 250 мОсм/кгН₂О или водной жидкостью, имеющей осмотическое давление более 310 мОсм/кгН₂О.

Водные жидкости такого рода, которые можно использовать, включают чистую воду, которая может включать водорастворимые органические растворители, и водные растворы и буферные растворы, которые представляют собой водные жидкости, имеющие крайне высокую концентрацию или крайне низкую концентрацию растворенного вещества, состоящего из водорастворимого вещества, такого как соли неорганических кислот, соли органических кислот, сахара, сахарные спирты, аминокислоты и белки, которые имеют осмотическое давление, которое может полностью разрушить гранулоциты. Конкретно, хлорид натрия, фосфаты натрия и т.п. являются предпочтительными солями неорганических кислот, а ацетат натрия, цитрат натрия и т. п. являются предпочтительными солями органических кислот. Помимо этого глюкоза, сорбит и т.п. являются предпочтительными сахарами и сахарными спиртами. Водные растворы, имеющие крайне высокую концентрацию описанного выше растворенного вещества, содержат 0,05 мол.% или более, предпочтительно 0,1 мол.% или более растворенного вещества, в то время как водные растворы, имеющие крайне низкую концентрацию описанного выше растворенного вещества, содержат 0,005 мол.% или менее, предпочтительно 0,001 мол.% или менее. Количество используемой водной жидкости превышает в 50-100000 раз количество образца крови по объему, предпочтительно в 100-10000 раз и особенно предпочтительно в 500-2000 раз.

Помимо этого способ обработки образца крови водной средой, включающей упомянутый выше гемолизат, также является предпочтительным. Катионные поверхностно-активные вещества, такие как соли высших жирных кислот, алкиларилсульфонаты, алкилсульфонаты и алкильные эфиры сульфоновой кислоты; анионные поверхностно-активные вещества, такие как соли алкилпиридиния, соли алкилтриметиламмония и алкилполиокси-этиленамины; неионные поверхностно-активные вещества, такие как алкилфенильные эфиры полиоксиэтилена, алкильные эфиры полиоксиэтилена и эфиры жирных кислот и полиоксиэтиленсорбитана; амфотерные поверхностно-активные вещества, такие как алкилбетаины; натуральные поверхностно-активные вещества, такие как сапонин, лецитин и холевая кислота; и биологические компоненты, такие как комплементы и змеиный яд, пчелиный яд и фермент, такой как протеиназа, представляют собой неограничивающие конкретные примеры гемолизатов. Эти гемолизаты можно использовать в форме водной жидкости, имеющей от 0,0001 до 10 весовых процентов, предпочтительно от 0,001 до 5 вес.% и особенно предпочтительно от 0,005 до 1 вес.%. Эта водная жидкая среда может, например, представлять собой воду или смешанную среду, включающую волу и водорастворимый органический растворитель. Количество используемой водной жидкости превышает в 50-100000 раз, предпочтительно в 100-10000 раз и особенно предпочтительно в 500-2000 раз количество образца крови по объему.

Иммунологический способ измерения человеческого медуллазина выполняется на разбавленном водной жидкостью образце крови, полученном путем обработки образца крови описанной выше водной жидкостью (i) или водной жидкостью (ii), в котором гранулоциты полностью разрушены. Этот способ включает стадию иммунной реакции, во время которой образец для измерения контактирует с антителом против человеческого медуллазина в присутствии меченого антигена или антитела для захвата человеческого медуллазина в виде меченого иммунного комплекса посредством реакции антиген-антитело; и стадию обнаружения, во время которой полученный таким способом иммунный комплекс измеряется с помощью меченого материала, имеющегося в его молекуле. Для реакции антиген-антитело во время стадии иммунной реакции можно использовать любой способ.

Неограничивающие примеры способов, которые можно использовать, включают: (1) сендвич-способ, при котором меченое антитело взаимодействует с антигеном в образце крови, предназначенном для измерения, после его захвата антителом, иммобилизованным на нерастворимом носителе; (2) способ двух антител, при котором используется антитело животного происхождения, отличающееся от антитела, иммобилизованного на нерастворимом носителе при сендвич-способе, при котором второе антитело, меченное относительно этого антитела, далее взаимодействует с образовавшимся сендвич-комплексом; (3) конкурентный способ, при котором антиген образца крови, предназначенного для измерения, взаимодействует с антителом, иммобилизованным на нерастворимом носителе, в присутствии антигена, меченного ферментом пероксидазой; (4) способ агглютинации-преципитации, при котором образец крови, включающий антиген, предназначенный для измерения, обрабатывается меченым антителом, которое взаимодействует с ним специфичным образом, вызывая агглютинацию-преципитацию, а затем выявляется меченый материал в иммунном комплексе, отделенном посредством сепарации на центрифуге; и (5) биотин-авидиновый способ, при котором меченый авидин взаимодействует с антителом, меченным биотином.

В случае использования нерастворимого носителя в способе иммунологического измерения человеческого медуллазина по настоящему изобретению примеры такого нерастворимого носителя включают полимерные соединения, такие как полистирол, полиэтилен, полипропилен, полиэфир, полиакрилонитрил, фтористые смолы, декстран с поперечными связями и полисахариды, а также стекло, металлы, магнитные частицы и их комбинации. Нерастворимый носитель может, например, использоваться в различных формах, таких как лотки, шарики, волокна, бруски, диски, сосуды, ячейки, микропланшеты и пробирки. Для закрепления антигенов или антител на таких нерастворимых носителях можно использовать любой способ. Например, можно использовать способы физической адсорбции, способы ковалентного связывания и способы ионного связывания.

В способе иммунологического измерения человеческого медуллазина по настоящему изобретению можно использовать антитела любого класса иммуноглобулинов, но предпочтительным является использование антител класса IgG. Возможно использование как моноклональных антител, так и поликлональных антител, но предпочтительными являются моноклональные антитела. Они могут использоваться, например, в форме полного антитела или в форме фрагментов, таких как F(ab')₂ и Fab. Эти антитела можно получать из различных источников, но предпочтительным является использование антител, полученных от мышей, крыс, кроликов, коров, коз, цыплят и т.п.

Далее, предпочтительно использовать ферменты, флюоресцентные вещества, люминесцентные вещества и радиоактивные вещества и т.п. в качестве метки для измерения на стадии обнаружения меченого иммунного комплекса человеческого медуллазина, захваченного таким способом. Неограничивающие примеры включают ферменты, такие как пероксидаза, щелочная фосфатаза и -D-галактозидаза; флюоресцентные вещества, такие как изоцианат флюоросцеина и фикобилипротеины; люминесцентные вещества, такие как люминолы, диоксетаны и соли акридиния; и радиоактивные вещества, такие как ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹¹¹In и ^99mТc.

В случае если в качестве метки используется фермент, для измерения его активности используется субстрат и при необходимости окрашивающий агент, флюоресцентный агент или люминесцентный агент. В случае если в качестве фермента используется пероксидаза, в качестве субстрата может использоваться пероксид водорода и т.п., в качестве окрашивающего агента - аммониевая соль 2,2'-азиноди[3-этилбензотиазолинсульфоновая кислоты] (ABTS), 5-аминосалициловая кислота, о-фенилендиамин, 4-аминоантипирин, 3,3',5,5'-тетраметилбензидин и т.п., в качестве флюоресцентного агента - 4-гидроксифенилуксусная кислота, 3-(4-гидроксифенил)пропионовая кислота и т.п., и в качестве люминесцентного агента - люминолы, люцигениновые заряженные транспортные комплексы (например, см. международную публикацию WO 00/09626). Помимо этого в случае, если в качестве фермента используется щелочная фосфатаза, в качестве субстрата может использоваться 4-нитрофенилфосфат, 4-метилумбеллиферилфосфат, кортизол-21-фосфат и т. п.; в случае если в качестве фермента используется -D-галактозидаза, в качестве субстрата может использоваться 2-нитрофенил--D-галактозид, 4-метилумбеллиферил--D-галактозид, 3-(2'-спироадамантан)-4-метокси-4(3"--D-галактозилоксифенил)-1,2-диоксетан (AMPGD) и т.п.

Предпочтительным поликлональным антителом, которое можно использовать в способе иммунологического измерения человеческого медуллазина по настоящему изобретению, является материал, выделенный в качестве антительного компонента из антикровяной сыворотки против медуллазина человека, полученной путем иммунизации животного согласно обычному способу с использованием человеческого медуллаэина в качестве антигена. Например, предпочтительно используются козьи поликлональные антитела против человеческого медуллазина и кроличьи поликлональные антитела против человеческого медуллазина. Моноклональные антитела, которые могут использоваться в настоящем изобретении, и способ их получения подробно описаны в открытой патентной заявке Японии 151085/1999.

А именно, моноклональное антитело против человеческого медуллазина, которое может использоваться в способе иммунологического измерения человеческого медуллазина по настоящему изобретению, получали путем культивирования гибридом в культуральной среде; эти гибридомы получали путем слияния клеток миеломы и клеток-продуцентов антител, выделенных от животного, иммунизированного человеческим медуллазином, экстрагированным из гранулоцитов, которые выделили из крови здорового индивидуума, и путем выделения моноклонального антитела из культуры или путем интраперитонеального введения гибридом животному, пролиферации гибридом в асцитической жидкости и выделения моноклонального антитела из асцитической жидкости.

Гибридомы, вырабатывающие моноклональное антитело против человеческого медуллазина, могут быть получены с помощью способа клеточного слияния. То есть нужные гибридомы, вырабатывающие моноклональное антитело, могут быть получены путем выделения клеток-продуцентов антител от животного, иммунизированного человеческим медуллазином, слияния этих клеток-продуцентов антител с миеломными клетками, селективной пролиферации полученных гибридом, скрининга гибридом, вырабатывающих антитела, из полученных гибридом и клонирования отобранных гибридом.

Примеры описанных клеток-продуцентов антител включают клетки селезенки, клетки лимфатических узлов, В-лимфоциты и т.п., которые получают от животного, иммунизированного человеческим медуллазином, или клетками или композициями, содержащими человеческий медуллазина. Примерами животных, которых можно иммунизировать, являются мыши, крысы, кролики, козы, овцы и лошади. Иммунизацию можно осуществлять, например, посредством подкожного, внутримышечного или интраперитонеального введения человеческого медуллазина животному в дозе приблизительно от 1 мкг до 1 мг 1-2 раза в месяц в 1-6 месяцев. Сбор клеток-продуцентов антител можно осуществлять через 2-4 дня после заключительной иммунизации.

Миеломные клетки можно получить от мышей, крыс и т.п. Предпочтительно получать клетки-продуценты антител и миеломные клетки от одного вида животного.

Для слияния клеток можно использовать любой способ без ограничений. Например, оно может быть выполнено путем смешивания клеток-продуцентов антител и миеломных клеток в такой среде, как модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM), в присутствии ускорителя слияния, такого как полиэтиленгликоль.

После слияния клеток гибридомы можно подвергать селекции путем разведения клеток соответствующим образом средой DMEM и т.п., центрифугирования, суспендирования преципитата в селекционной среде, такой как среда HAT, и культивирования в ней клеток. Гибридомы-продуценты антител затем подвергают скринингу с помощью иммуноферментного анализа с использованием культурального супернатанта и отобранную гибридому культивируют способом лимитирующих разведении с получением гибридомы, вырабатывающей моноклональное антитело против человеческого медуллазина.

Моноклональное антитело можно получить путем культивирования полученной описанным способом гибридомы-продуцента антител в подходящей культуральной среде или в организме животного, и путем выделения моноклонального антитела из культуры. Для того чтобы получить большие количества моноклонального антитела, предпочтительным является способ, при котором гибридомы вводят интраперитонеально животному того же вида, что и донор миеломных клеток; моноклональное антитело накапливается в асцитической жидкости, и впоследствии моноклональное антитело выделяют из асцитической жидкости.

Выделение моноклонального антитела из культуры или из асцитической жидкости можно осуществлять с помощью анионообменной хроматографии или хроматографии на колонке с белком A, G и т.п. или путем фракционирования с сульфатом аммония, которое обычно используют для очистки IgG.

Полученные таким способом моноклональные антитела против человеческого медуллазина существуют в виде четырех типов, обозначаемых 3F03, 3G03, 2Е04 и 1G12 в соответствии с типом гибридом, которые использовались для их получения. Каждое из этих моноклинальных антител относится к классу иммуноглобулинов IgG и подклассу IgG1, и каждое антитело специфично взаимодействует с человеческим медуллазином, который является соответствующим им антигеном. Соответственно описанные выше моноклональные антитела против человеческого медуллазина являются пригодными для способа иммунологического измерения человеческого медуллазина по настоящему изобретению.

Далее, способ диагностики рассеянного склероза по настоящему изобретению включает диагностику начала рассеянного склероза и/или степени его распространения в организме на основании размеров и/или изменений значения содержания человеческого медуллазина в образце крови, полученного с помощью описанного выше иммунологического измерения человеческого медуллазина. Конкретно, можно использовать способ, при котором количество человеческого медуллазина в 10⁸ гранулоцитов рассчитывается по измеренной концентрации человеческого медуллазина в образце крови и измеренному количеству гранулоцитов в том же самом образце крови, и о начале рассеянного склероза судят на основании сравнения размера этого значения с пограничной величиной (средняя величина для здорового индивидуума + 2СО (стандартное отклонение)), или об изменении степени этого заболевания от времени судят на основании сравнения изменений значения с течением времени.

Из 112 пациентов, страдающих рассеянным склерозом, у которых диагноз был выставлен этим способом, 85 были положительными по значению медуллазина не менее пограничной величины, что составило высокий положительный процент 75,8%. Напротив, из 80 пациентов, страдающих различными неврологическими заболеваниями невоспалительной природы, количество положительных по значению медуллазина не менее пограничной величины было равно 13, что составило низкий положительный процент 16,3%. Таким образом, наблюдалось, что способ диагностики рассеянного склероза по настоящему изобретению по значению человеческого медуллазина в крови представляет собой диагностический способ чрезвычайно высокой надежности. Помимо этого процент нормальных индивидуумов (иными словами, здоровых людей), у которых значение медуллазина было бы положительным, составил 0% (см. таблицу 5 и фигуру 3). Было также установлено, что уровень значения медуллазина у пациентов с рассеянным склерозом не отличается у мужчин и женщин (см. фигуру 4) и не отличается в зависимости от возраста (см фигуру 5).

ПРИМЕРЫ Далее настоящее изобретение будет описано более конкретно посредством примеров и ссылочных примеров. Настоящее изобретение ни в коей мере не ограничивается этими примерами. Проценты, которые приводятся в примерах, являются весовыми процентами.

Ссылочный пример 1 Получение очищенного человеческого медуллаэина Четыреста миллилитров крови нормального индивидуума и 6% раствор декстрана (молекулярная масса 200000-300000) в физиологическом растворе смешивали в соотношении кровь : водный раствор декстрана = 2:1 и полученную смесь слегка перемешивали стеклянной палочкой, после чего ее оставляли стоять при 4-8^oС в течение приблизительно 1 часа. Выпавшие в осадок эритроциты удаляли и полученную надоса-дочную жидкость центрифугировали при 15000 об/мин, после чего собирали осадок для получения лейкоцитов. Для того чтобы получить лейкоциты, добавляли экстрагирующий буфер, содержащий 1 мМ динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) и 1 мМ п-ртуть-хлорбензойной кислоты (РСМВ) в 1 М калиево-фосфатном буфере (РКВ) с рН 7,0, и полученную смесь инкубировали при перемешивании при 37^oС в течение 20 минут. Затем на полученную смесь воздействовали ультразвуком в течение 15 секунд для полного разрушения клеток, после чего ее инкубировали при 37^oС в течение 20 минут и центрифугировали при 4^oС на 12000 об/мин в течение 10 минут. Надосадочную жидкость собирали и диализировали против дистиллированной воды. Выпавший в осадок остаток подвергали описанным выше операциям несколько раз для осуществления экстракции. Полученную экстрагированную жидкость помещали на гелевую колонку с СМ-сефарозой, уравновешенную 50 мМ РКВ (рН 6,0) и колонку промывали тем же буфером. Адсорбированные вещества затем элюировали 1 М РКВ (рН 6,0) и элюированный раствор диализировали против дистиллированной воды в течение ночи для удаления соли, после чего концентрировали полученный раствор с помощью мембраны из коллодиона с получением 1,5 мг очищенного человеческого медуллазина.

Ссылочный пример 2 Получение моноклонального антитела против человеческого медуллазина (1) Получение гибридом путем слияния клеток-продуцентов антител и миеломных клеток Человеческий медуллазин, экстрагированный из человеческих гранулоцитов и очищенный в ссылочном примере 1, эмульгировали в полном адъюванте Фрейнда и вводили подкожно мышам BALB/C в возрасте 7 недель в дозе 50 мкг на мышь. Через 4 недели мышей дополнительно иммунизировали тем же способом, что и при первой иммунизации. Через семь дней после дополнительной иммунизации было подтверждено возрастание уровня антител в крови. Спустя 7 дней в качестве последней иммунизации интраперитонеально вводили антиген в дозе 50 мкг на мышь. С другой стороны, клетки мышиной миеломы P3-X63-Ag8-U1 (P3U1) пассировали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM), содержавшей 20% фетальной бычьей сыворотки. Через три дня после последней иммунизации слитые селезеночные клетки у мышей собирали и с клетками P3U1 с использованием полиэтиленгликоля 4000 помещали в лунки 96-луночного микротитрационного планшета. После операции слияния клеток среду заменяли на DMEM, содержавшую 100 мкМ гипоксантина, 0,4 мкМ аминоптерина, и 16 мкМ тимидина (среда HAT), и гибридомы селезеночных клеток и миеломных клеток получали посредством селективной культуры в течение 2-3 недель.

(2) Скрининг гибридом-продуцентов антител против человеческого медуллазина Титры антител в культуральных жидкостях гибридом определяли посредством ELISA (твердофазного иммуноферментного анализа), осуществляя, таким образом, скрининг. А именно, человеческий медуллазин адсорбировали на стенках микротитрационного планшета для ELISA и стенки блокировали 2% раствором бычьего сывороточного альбумина (BSA) в 10 мМ физиологическом растворе с фосфатным буфером (PBS) (рН 7,4). Пятьдесят микролитров культуральной жидкости гибридом добавляли в каждую лунку и оставляли стоять в течение 1 часа. После удаления гибридомной культуры промывали лунки. 100 мкл 2 мкг/мл раствора в каждую лунку добавляли меченное пероксидазой антимышиное IgG-Fc антитело козы в PBS, полученную смесь оставляли стоять для протекания реакции на 1 час при 37^oС. После удаления раствора меченного ферментом антитела и промывания лунок добавляли 200 мкл 0,1 М раствора фосфат нитратного буфера (рН 4,6), содержавшего 0,05% ABTS и 0,0034% пероксида водорода, для получения окрашивания, что позволяло производить отбор гибридом-продуцентов антител против человеческого медуллазина.

(3) Клонирование клеток-продуцентов антител и получение моноклональных антител Каждую культуру гибридом-продуцентов антител против человеческого медуллазина подвергали клонированию способом лимитирующих разведении, в результате чего в конечном итоге получили 4 вида моноклональных гибридом. Эти гибридомы по отдельности вводили интраперитонеально мышам BALB/C, которые предварительно получали пристан, и гибридомы выращивали до получения асцитической жидкости, содержащей моноклональное антитело. Затем к полученным асцитическим жидкостям добавляли 50% насыщенный раствор сульфата аммония для осаждения антитела. Преципитат отделяли и растворяли в PBS. Полученный раствор диализировали против 50 мМ раствора буфера трис-хлористоводородная кислота (рН 7,3), содержавшего 3 М NaCl. Затем его помещали на колонку CL4B с А-сефарозой и белком (имеется в продаже от компании Pharmacia). Адсорбированное антитело элюировали 0,1 М раствором буфера глицин-НСl (рН 5,0) и элюированный раствор нейтрализовали, после чего антитело очищали с получением моноклонального антитела 4 видов, 3F03, 3G03, 2Е04 и 1G12.

(4) Свойства моноклональных антител Вестерн-блоттинг Антиген, соответствующим моноклональным антителам, иммобилизовывали с помощью метода вестерн-блоттинга.

Сначала медуллазин из человеческих гранулоцитов подвергали электрофорезу в SDS-полиакриламидном геле. Белок переносился из блока геля на листок нитроцеллюлозы в течение 2 часов при градиенте напряжения 7 В/см с использованием раствора, содержавшего 25 мМ трис(гидроксиметил)-аминометан, 192 мМ глицин и 20% метанол, добавленные в электролитный буферный раствор. Затем каждую дорожку на листке нитроцеллюлозы отрезали и один из листков подверга