Пептид, обладающий иммунорегуляторным свойством, и его композиция

Патент 2210382

Авторы

Классы МПК

Реферат

Изобретение относится к области медицины, в частности к новым биологически активным веществам. Пептид формулы H-Tyr-X-Y-Glu-OH, где Х - Gln и/или Glu, Y - Cys (acm) и/или Cys, и его композиция обладают не только иммуносупрессивным свойством, но и способностью индуцировать супрессорную активность мононуклеарных клеток периферической крови человека. Изобретение позволяет получить новый синтетический пептид и композицию, обладающие расширенными функциональными возможностями и простотой получения. 2 н. и 1 з.п.ф-лы.

Изобретение относится к области медицины, в частности к новым биологически активным веществам (БАВ), обладающим иммунорегуляторными свойствами, и может быть использовано в практической медицине, ветеринарии, а также в экспериментальной биохимии.

Известен пептид, обладающий иммуносупрессивным свойством, формулы H-A-D-Tyr-Y (см. патент РФ 2123859, кл. А 61 К 38/04, от 06.05.96 г.).

Однако известный пептид обладает ограниченными функциональными возможностями, в частности лишь иммуносупрессивным свойством и не способен стимулировать супрессорную активность мононуклеарных клеток.

Кроме того, получение известного пептида отличается относительной сложностью.

По технической сущности наиболее близким к заявляемому пептиду является кополимер-1 (Коп-1), выпускаемый фирмой TEVA под названием "Копаксон" (см. Монографию авторов Е.И. Гусев, Т.Л. Демина и А.Н. Бойко "Рассеянный склероз", Москва, 1997 г., с.317).

Этот пептид обладает более широкими функциональными возможностями, однако получение его отличается значительной сложностью из-за высокого молекулярного веса, что удорожает его производство.

Известна фармацевтическая композиция, применяемая для лечения рассеянного склероза путем нейтрализации антимиелиновых антител (см. патент РФ 2121850, кл. А 61 К 38/10 от 22.10.91 г.).

Однако известная композиция не обладает иммунорегуляторными свойствами.

Техническим результатом является разработка нового синтетического пептида и его композиции, обладающих расширенными функциональными возможностями и простотой получения.

Для решения этой технической задачи предлагается пептид, обладающий иммунорегуляторным свойством, со следующей формулой Н-Туr-X-Y-Glu-OH, где Х - Gln и/или Glu, Y - Cys(acm) и/или Cys, a также композиция, обладающая иммунорегуляторным свойством, включающая по крайней мере два пептида, формулы H-Tyr-X-Y-Glu-ОН, где Х - Gln и/или Glu, Y - Cys(acm) и/или Cys, причем пептиды взяты в равных долях.

Сущность изобретения заключается в том, что использование разных типов пептида с вышеуказанной формулой или соответствующей композиции, включающей смесь таких пептидов, позволяет обеспечить расширенные функциональные возможности воздействия на мононуклеарные клетки.

Кроме того, невысокий молекулярный вес предлагаемого пептида и его композиции определяет простоту его изготовления.

Сравнениe предлагаемого способа с ближайшим аналогом позволяет утверждать о соответствии критерию "новизна", а отсутствие в аналогах отличительных признаков говорит о соответствии критерию "изобретательский уровень".

Предварительные испытания позволяют утверждать о возможности широкого промышленного производства и использования в медицине.

Получение заявляемого пептида и его композиции может быть осуществлено известными способами пептидного синтеза.

Пептиды согласно настоящему изобретению могут быть получены в соответствии с обычными и хорошо известными методами синтеза полипептидов. Для синтеза использовали активированные аминокислоты с защищенными функциональными группами (фирмы: Sigma, Merk).

Синтез пептида осуществляли на твердой фазе. Применяя стиролдивинилбензольную смолу, к которой по типу образования бензилового эфира присоединяли глутаминовую кислоту, используя N-СВZ-1-глутамат-N-гидроксисукцинимид эфир, с последующим снятием CBZ-группы и обработкой соединения N-t-BOC-S-ацетамидометил-1-цистеином в присутствии дициклогексил карбодиимида в диоксане, с последующим отмыванием твердофазного полимера, удалением ВОС-защитной группы и образовавшейся дициклогексил карбокси-мочевины.

Далее к твердофазному полимеру добавляли N-CBZ-1-глутамин--N-гидроксисукцинимид эфир, и на конечном этапе, после удаления CBZ-защитной группы, обрабатывали N-t-ВОС-1-тирозин-N-гидроксисукцинимид эфиром. После удаления ВОС защитной группы проводили отщепление образовавшегося пептида путем щелочного гидролиза.

Пептид перекристаллизовывали и лиофилизировали. Присутствие и последовательность аминокислот, а также чистоту пептида проверяли методом тонкослойной хроматографии, используя как цельный пептид, так и продукты его частичного и полного гидролиза. Полученный пептид первого типа соответствовал формуле: H-Tyr-Gln-Cys(acm)-Glu-ОН, где асm-ацетамидометил, защитная группа для серы цистеина, которую мы не снимали, так как она спонтанно легко удаляется в условиях организма и в клеточных культурах, в результате чего действующим началом является пептид с формулой H-Tyr-Gln-Cys-Glu-ОН.

Н - начало пептида; Туr - аминокислотный остаток тирозина; Gln - аминокислотный остаток глутамина; Cys - аминокислотный остаток цистеина, Glu - глутаминовая кислота (глутамат) или ее остаток, ОН - конец пептида.

Для синтеза пептида второго типа с формулой H-Tyr-Glu-Cys(acm)-Glu-OH использовали тот же принцип с заменой на соответствующем этапе добавления N-CBZ-l-глутамин-N-гидроксисукцинимид эфира на N-СВZ-глутамат--N-гидроксисукцинимид эфир. Все реактивы и активированные аминокислоты с защищенными группами были фирменными (Sigma, Merk).

Обрабатывая пептиды с вышеуказанными формулами в присутствии ионов ртути снимают ацетоамидометильную группу, освобождая SH группу цистеина. При этом получают пептиды 3 и 4-го типов с формулой без (асm).

При получении композиции по п.2 и 3 формулы смешивают первый тип пептида со вторым типом пептида в равных долях.

Биологическая активность заявляемого пептида определялась следующим образом.

Пример 1.

1. Исследовали действие 1-ого типа пептида H-Tyr-X-Y-Glu-OH, где Х - Gln, Y - Cys(acm) на пролиферативную активность мононуклеарных клеток периферической крови, выделенных по методу Boyum 1969 г.

Диапазон используемых доз составляет 0,03 мкг/мл - 3,00 мкг/мл.

Результаты показали, что данный пептид подавляет пролиферативную активность мононуклеарных клеток периферической крови, вызванных фитогемагглютинином (ФГА).

2. Исследовали влияние пептида на способность индуцировать суппрессорную активность мононуклеарных клеток периферической крови.

На первом этапе получают суспензию МНК методом седиментации клеток в одноступенчатом градиенте фиколл-уротрасте (метод Boyum).

Периферическую кровь берут у донора путем венопункции в одно и тоже время и помещают в пробирки с раствором гепарина из расчета 1 мл крови - 20-30 ед. гепарина. Далее кровь разводят раствором Хенкса в соотношении 1:2 без Са⁺⁺ и Mg⁺⁺ и наслаивают на градиент фиколл-уротраст (плотность 1,078).

Затем проводят центрифугирование в режиме 400 g в течение 30 мин. Взвесь МНК из интерфазы переносят в центрифужную пробирку, добавляют раствор Хенкса без Са⁺⁺ и Mg⁺⁺ и производят 3 последовательных центрифугирования по 10 мин для отмывания клеток от раствора фиколл-уротраст. После 3-го центрифугирования осадок МНК ресуспензируют в 1 мл среды 199 и подсчитывают количество мононуклеарных клеток с помощью камеры Горяева.

На втором этапе МНК делят на две равные части, первую из которых культивируют без активатора супрессоров, вторую - с активатором супрессоров, в качестве которого используют исследуемый пептид.

МНК культивируют в пеницилиновых флаконах, закрытых резиновыми пробками 14,5 при температуре 37^oС. Среда культивирования RPM1-1640 с добавлением 20% сыворотки IV АВ группы крови и глютамина 300 мг.

В каждом флаконе культивируют 5х10⁶ клеток в 2,0 мл полной среды. В культуре для индукции супрессоров добавляют пептид в дозах 0,03-3,00 мкг/мл.

Культивирование клеток осуществляют 48 ч. После этого МНК отмывают от среды культивирования и осуществляют блокировку пролиферации путем обработки митомицином С - 40 мкг/мл в течение 30 мин при 37^oС. Затем отмывают средой 199 с 5% сыворотки IV АВ (охлажденной) трижды. Осадок клеток ресуспензируют, подсчитывают количество ядросодержащих клеток, определяют процент жизнеспособности клеток с помощью 0,1%-ного трипанового синего раствора и разводят до необходимой концентрации. При этом все операции делают раздельно с контрольными клетками и со стимулированными пептидом, а для отмывания клеток используют силиконированную посуду.

На следующем этапе в каждую часть контрольных и стимулированных пептидом лимфоцитов добавляют свежевыделенные лимфоциты, стимулированные фитогемагглютинином (ФГА), которые служат отвечающими тест-клетками в равных соотношениях (0,5х10⁶: 0,5х10⁶ клеток/мл) для получения тест-культур. Культивирование их проводят в течение 72 ч. После этого с помощью Н³ - тимидина оценивают пролиферацию тест-культур и о величине супрессии судят по степени снижения пролиферации в них. Индекс супрессии (ИС) определяют по формуле: На основании показаний индекса супрессии установлено, что данный пептид в дозах 0,03 мкг/мл - 3,00 мкг/мл индуцирует супрессорную активность мононуклеарных клеток периферической крови.

Пример 2.

При исследовании 2-ого типа пептида H-Tyr-X-Y-Glu-OH, где Х - Glu, Y - Cys(acm), повторили действия п.1 и п.2 примера 1.

В результате получили, что данный пептид также подавляет пролиферативную активность мононуклеарных клеток периферической крови, вызванных ФГА, и индуцирует супрессорную активность мононуклеарных клеток периферической крови при использовании в дозах 0,03 мкг/мл - 3,00 мкг/мл.

Пример 3.

При исследовании 3-го типа пептида H-Tyr-X-Y-Glu-OH, где Х - Gln, Y - Cys, повторили действия п.1 и п.2 примера 1.

Пример 4.

При исследовании 4-го типа пептида H-Tyr-X-Y-Glu-OH, где Х - Glu, Y - Cys, повторили действия п.1 и п.2 примера 1.

Пример 5.

При исследовании действия композиции из двух пептидов с формулами H-Tyr-Gln-Cys(acm)-Glu-OH и H-Tyr-Glu-Cys(acm)-Glu-OH, взятых в равных долях, повторили действия п.1 и п.2 примера 1.

В результате получили, что данная композиция подавляет пролиферативную активность мононуклеарных клеток периферической крови, вызванных ФГА, и индуцирует супрессорную активность мононуклеарных клеток периферической крови при использовании в дозах 0,03 мкг/мл - 3,00 мкг/мл.

Причем для варианта с композицией эффект подавления пролиферации несколько усиливается, а индукция супрессоров увеличивается.

Пример 6.

При исследовании действия композиции из двух пептидов с формулами H-Tyr-Gln-Cys-Glu-OH и H-Tyr-Glu-Cys-Glu-OH, взятых в равных долях, повторили действия п.1 и п.2 примера 1.

В результате получили, что данная смесь также подавляет пролиферативную активность мононуклеарных клеток периферической крови, вызванных ФГА, и индуцирует супрессорную активность мононуклеарных клеток периферической крови при использовании в дозах 0,03 мкг/мл - 3,00 мкг/мл.

Причем эффект подавления пролиферации также усиливается, а индукция супрессоров увеличивается по сравнению с примерами 1-4.

Пример 7.

При исследовании действия композиции из двух пептидов с формулами H-Tyr-Gln-Cys(acm)-Glu-OH и H-Tyr-Glu-Cys-Glu-OH, взятых в равных долях, повторили действия п.1 и п.2 примера 1.

Пример 8.

При исследовании действия композиции из двух пептидов с формулами H-Tyr-Gln-Cys-Glu-OH и H-Tyr-Glu-Cys(acm)-Glu-OH, взятых в равных долях, повторили действия п.1 и п.2 примера 1.

Пример 9.

При исследовании действия композиции из четырех пептидов с формулами H-Tyr-Gln-Cys(acm)-Glu-OH и H-Tyr-Glu-Cys(acm)-Glu-OH H-Tyr-Gln-Cys-Glu-OH и H-Tyr-Glu-Cys-Glu-OH, взятых в равных соотношениях, повторили действия п.1 и п.2 примера 1.

Однако преимуществ перед композициями по примерам 5-8 обнаружено не было.

Кроме того, проводились испытания для различных типов пептидов, которые брали не в равных соотношениях, однако преимуществ также не было обнаружено.

Таким образом, все типы заявляемого синтетического пептида и его композиции подтвердили способность подавлять пролиферативную активность и индуцировать супрессорную активность мононуклеарных клеток периферической крови человека. Следует отметить значительную простоту получения всех типов пептидов и их композиции.

С целью изучения безопасности пептида и его композиции проводили изучение их острой токсичности. Изучение острой токсичности проводили в соответствии с "Руководством по доклиническому изучению новых фармакологических средств", Москва, 2000 г. Результаты исследования показали, что при внутрибрюшинном введении 1000 кратной дозы пептида или его композиции не оказывалось острого токсичного действия и при этих дозах оказалось невозможным достигнуть его LD₅₀. Таким образом, новый биологически активный пептид и его композиция не являются токсичными.

Согласно настоящему изобретению типы нового пептида формулы H-Tyr-X-Y-Glu-OH, где Х - Glu и/или Gln, Y - Cys и/или Cys(acm), и его композиции обладают биологической активностью, описанной в примерах, и могут найти применение в медицине и биологии.

Хотя приведенное выше изобретение было описано довольно подробно для иллюстрации, для среднего специалиста в данной области будет вполне понятно, в свете описания этого изобретения, что могут быть сделаны определенные изменения и модификации изобретения без отхода от идеи или сферы действия предлагаемой формулы изобретения.

Формула изобретения

1. Пептид, обладающий иммунорегуляторным свойством, формулы H-Tyr-X-Y-Glu-OH, где Х - Gln и/или Glu, Y - Cys (acm) и/или Cys.

2. Композиция, обладающая иммунорегуляторным свойством, включающая по крайней мере два пептида формулы п. 1.

3. Композиция по п. 2, отличающаяся тем, что пептиды взяты в равных долях.