Новые нуклеозиды, имеющие бициклическую сахарную группировку, и содержащие их олигонуклеотиды

Новые нуклеозиды, имеющие бициклическую сахарную группировку, и содержащие их олигонуклеотиды

Реферат

 

Изобретение относится к нуклеозидам формулы (I), имеющим бициклическую сахарную группировку, содержащую 2',4'-мостиковую связь, и олигонуклеотидам на их основе. Олигонуклеотиды по изобретению обладают высокой аффинностью по отношению к нуклеиновым кислотам-мишеням и могут найти применение в медицине. 3 с. и 1 з.п.ф-лы., 1 табл.

Область изобретения Областью изобретения являются нуклеозидные и олигонуклеотидные аналоги и способы их получения.

Предпосылки Нуклеозидные и олигонуклеотидные аналоги долгое время применяли в качестве фармацевтических ингредиентов против ряда вирусов и некоторых видов рака. В настоящее время целый ряд нуклеозидных и нуклеотидных аналогов находится в клинических испытаниях для лечения некоторых болезней.

В клетке нуклеозиды и нуклеотиды фосфорилируются или дополнительно фосфорилируются до соответствующих нуклеозидтрифосфатов. Нуклеозидтрифосфаты являются ингибиторами ДНК- или РНК-полимераз. Нуклеозидтрифосфаты также могут встраиваться в ДНК или РНК, что препятствует элонгации ДНК или РНК.

Активные нуклеозидные аналоги обычно быстро фосфорилируются в клетке-мишени. Соответствующие нуклеозидтрифосфаты имеют высокое сродство к каталитическим сайтам полимераз и конкурируют с природными нуклеозидтрифосфатами в качестве субстрата полимераз. Определенные нуклеозидные аналоги работают на нуклеозидном или монофосфатном уровне. Одна группа перспективных нуклеозидных аналогов представляет собой нуклеозиды с конформационно замкнутыми сахарными группировками. Сообщалось, что определенные конформационно замкнутые карбоциклические нуклеозидные аналоги продемонстрировали потенциальную активность против HCMV (человеческого цитомегаловируса), HSV (вируса простого герпеса) и EBV (вируса Эпштейна-Барра) (Siddiqui et al. Nucleosides Nucleotides 1996, 15, 235-250; Marquez et al. J. Med. Chem. 1996, 39, 3739-3747). Было описано, что конформационно замкнутый карбоциклический АZТ-5'-трифосфат (азидотимидин-5'-трифосфат) является эквипотентным ингибитором обратной транскриптазы HIV (вируса иммунодефицита человека) (Marquez et al. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 2780-2789). Были также получены другие нуклеозиды с бициклическими сахарными группировками, даже если у них не была обнаружена активность (Chao et al. Tetrahedron 1997, 53, 1957-1970; Okabe et al. Tetrahedron Lett. 1989, 30, 2203-2206, Hong, et al. Tetrahedron Lett. 1998, 39, 225-228).

Ожидают, что подходящие конформационно замкнутые нуклеозиды имеют положительное воздействие на антисмысловые олигонуклеотиды. В течение двух последних десятилетий олигонуклеотиды рассматривают и применяют в качестве потенциальных лекарств на основе антисмысловых олигонуклеотидов. Олигонуклеотиды способны образовывать двойную или тройную спираль с комплементарными ДНК или РНК и обладают способностью взаимодействовать со специфическими последовательностями в вирусном и раковом геноме. Специфическое связывание олигонуклеотидов с интересующими ДНК- или РНК-мишенями, по-видимому, инактивирует функцию, ассоциированную с ДНК или РНК, такую как репликация, транскрипция и трансляция. Вследствие этого можно прервать вирусные циклы или злокачественные процессы, не затрагивая нормальных клеточных циклов.

Поскольку природные олигонуклеотиды чувствительны к клеточным и внеклеточным нуклеазам, было предпринято много усилий в изучении олигонуклеотидных модификаций, особенно тех модификаций, которые направлены на повышение устойчивости к нуклеазам и аффинности связывания. Было показано, что олигонуклеотиды, содержащие определенные бициклические нуклеозиды, демонстрируют повышенную нуклеазную стабильность (Leumann et al. Bioorg. Med. Chem. Letts. 1995, 5, 1231-4; Altmann et al. Tetrahedron Lett. 1994, 35, 2331-2334, 7625-7628). Недавно были синтезированы и встроены в олигонуклеотиды 2'-O, 4'-С-метиленрибонуклеозиды, которые имеют замкнутую 3'-эндо-сахарную "складку". Гибридизационный анализ показывает, что конформационно замкнутые нуклеозиды могут существенно увеличить гибридизацию модифицированных олигонуклеотидов с комплементарными РНК и ДНК (Obika et al. Tetrahedron Lett. 1997, 38, 8735-8738; Koshkin et al. Tetrahedron 1998, 4, 3607-3630).

Существует необходимость в новых конформационно замкнутых нуклеозидах с бициклическими сахарными группировками. Такие новые нуклеозиды будут полезны для противовирусного, противоопухолевого и другого лечения. Кроме того, олигонуклеотиды, состоящие из этих новых модифицированных нуклеозидов, могут обладать желаемой стабильностью по отношению к клеточным нуклеазам и высокой аффинностью связывания с нуклеиновыми кислотами-мишенями. Поэтому эти олигонуклеотиды могут быть потенциально полезными для лечения и диагностики.

Краткое изложение сущности изобретения Описаны конформационно замкнутые бициклические сахарные нуклеозиды, которые имеют общую геометрическую форму, а также способы получения конформационно замкнутых бициклических сахарных нуклеозидов. Предложены нуклеозиды, имеющие бициклические сахарные группировки, и олигонуклеозиды, имеющие следующую формулу: где X, Y и Z независимо выбраны из группы О, S, CH₂, NR, С=O, С=СН₂ или ничего, где R выбран из группы, содержащей водород, алкил, алкенил, алкинил, ацил; R₁ выбран из группы, содержащей аденин, цитозин, гуанин, гипоксантин, урацил, тимин, гетероциклы, Н, ОСН₃, ОАс (Ac - ацетил), галоген, сульфонат; R₂, R₃ независимо выбраны из группы Н, ОН, DMTO (DMT - диметокситритил), TBDMSO (TBDMS - трет-бутилдиметилсилил), BnO (Bn - бензил), ТНРО (ТНР - тетрагидропиранил), АсО, BzO (Bz - бензоил), OP(NiPr₂)O(CH₂)₂CN (iPr - изопропил), ОРО₃Н, РО₃Н, дифосфата, трифосфата, R₂ и R₃ вместе могут образовывать PhCHO₂ (Ph - фенил), TIPDSO₂ (TIPDS -тетраизопропилдисилил) или DTBSO₂ (DTBS - ди(трет-бутил)силил).

Предполагается, что описанные здесь новые нуклеозиды будут полезными для противовирусного, противоопухолевого и другого лечения. Олигонуклеотиды, состоящие из этих модифицированных нуклеозидов, имеют желаемую физиологическую стабильность и аффинность связывания, что делает их полезными для лечения и диагностики.

Детальное описание Предложены конформационно замкнутые нуклеозиды, которые имеют 3'-эндо-сахарную "складку", а также способы их получения. Способы получения ранее описанных бициклических нуклеозидных аналогов нельзя применять к новым нуклеозидным аналогам, описанным здесь. Описанные здесь аналоги получены в результате удачного связывания между С2' и С4' положениями рибозы в нуклеозидных аналогах.

Используемая здесь аббревиатура "Ас" относится к ацетилу; аббревиатура "Вn" относится бензилу; аббревиатура "Bz" относится к бензоилу; аббревиатура "DMT" относится к диметокситритилу; аббревиатура "ТНР" относится к тетрагидропиранилу; аббревиатура "TBDMS" относится к тpeт-бутилдиметилсилилу; аббревиатура "TIPDS" относится к тетраизопропилдисилилу и аббревиатура "DTBS" относится к ди(трет-бутил)силилу.

Синтез производных рибофуранозы с 2,4-мостиковой связью 1--Метиларабиноза 1, полученная в соответствии с опубликованной методикой (Tejima et al. J. Org. Chem. 1963, 28, 2999-3003), была защищена 1,1,3,3, -тетраизопропилдисилоксанилом (TIPS) при O3 и O5, с получением соединения 2, которое преобразовывали в кетон 3 посредством обработки смесью DMSO/DCC/TFA (диметилсульфоксид/дициклогексилкарбодиимид/трифторуксусная кислота). Последующая реакция Виттига и отщепление TIPS давали алкен 4 с очень хорошим выходом. Соединение 4 было защищено трет-бутилдиметилсилилом (TBS) при O5 и бензилом (Вn) при O3 с получением 5. Гидроборирование 5 осуществляли с помощью 9-BBN (9-борабицикло[3.3.1]нонана), получая исключительно 2-дезокси-2-гидроксиметилпроизводное 6 с очень высоким выходом. 2-Дезокси-2-гидроксиметилпроизводное 6 подвергали тритилированию с помощью 4,4'-O-диметокситритила (DMT) хлорида и отщеплению TBS с помощью тетрабутиламмония фторида (TBAF) с получением 7.

Соединение 7 окисляли, получая альдегид 8, который подвергали обработке формальдегидом и гидроксидом натрия с получением 4-гидроксиметилпроизводного 9 с высоким выходом. Мезилирование 9 и последующее отщепление DMT давали 10. Циклизация, проведенная с NaH в THF (тетрагидрофуране), и последующее удаление мезила давали бициклический сахар 11. Обработка соединения 11 уксусным ангидридом в присутствии DMAP (диметиламинопиридина) дает 12, тогда как обработка смесью уксусный ангидрид/уксусная кислота в присутствии серной кислоты дает 13, где ацетокси при С1 имеет обращенную ориентацию (1-) по сравнению с метокси в 11.

Синтез бициклонуклеозидов с 2',4'-мостиковой связью Бициклонуклеозиды, имеющие сахарную группировку с 2',4'-мостиковой связью, синтезировали из продуктов конденсации силилированных нуклеозидных оснований и бициклических сахаров, как показано ниже. Конденсация 13 с бис(триметилсилил)тимином давала продукт 14, представляющий собой -аномер с высоким выходом. Путем обработки 14 с помощью ВСl₃ одновременно отщепляли ацетил и бензил, с получением бициклического -тимидина 15.

Конденсация 13 с 6-хлор-9-триметилсилилпурином давала смесь - и -пуриновых нуклеозидов 16 и 17 (отношение : от 1:1 до 2:3), которые можно разделить путем хроматографии.

Обработка 17 и 16 аммиаком в метаноле с последующим гидрогенолизом давала аналоги аденозина 18 и 19 соответственно. Гидрогенолиз требовал большого количества каталитического материала, а также длительного времени реакции вследствие повышенного стерического препятствия из-за наличия сахарной группировки. Обработка 17 и 16 меркаптоэтанолом в присутствии метилата натрия с последующим гидрогенолизом дает аналоги инозина 20 и 21 соответственно.

18, X = NH₂; 19, X = NH₂; 20, X = OH; 21, X = OH.

Конденсация 13 с силилированным N²-ацетилгуанином дает производное -гуанозина 22 в виде основного продукта (30%), небольшое количество -изомера и N⁷-связанные продукты. Обработка производного -гуанозина аммиаком в метаноле с последующим гидрогенолизом давала бициклический -гуанозин 23.

Как описано выше, реакции конденсации давали либо исключительно -нуклеозид, либо смесь - и -нуклеозидов без предпочтения для -аномеров. Для того чтобы увеличить отношение -нуклеозидов, были изучены различные условия конденсации. Температура оказывала незначительный эффект на отношение - и -аномеров. Однако реагент сочетания и функциональная группа при С1 сахара действительно оказывали существенные эффекты на отношение - и -нуклеозидов.

Конденсация 12 с бис- либо три(триметилсилил)пиримидинами в присутствии хлорида олова (IV) давала -нуклеозиды в виде основных продуктов с хорошим выходом. Так, реакция 12 с силилированным тимином давала производное тимидина 24 с отношением :, приблизительно равным 4:1. Конденсация 12 с силилированным урацилом и N⁴-бензоилцитозином давала соответствующие нуклеозиды 25 и 26 соответственно, с отношением :, приблизительно равным 9:1 в обеих реакциях. Обработка 24-26 трихлоридом бора давала пиримидиновые бициклонуклеозиды 27-29 соответственно. В случае производного цитидина бензоильную группу 29 удаляли путем обработки аммиаком с получением 30. Альтернативный путь (не показан) получения 30 начинали от 28, которое ацетилировали при O3' и O5' с последующим взаимодействием с триазолом и последующей обработкой аммиаком. В этом случае 30 получали с невысоким выходом.

24, X = OH, Y = Me; 25, X = OH, Y = H; 26, X = NHBz, Y = H; 27, X = OH, Y = Me; 28, X = OH, Y = H; 29, X = NHBz, Y = H; 30, X = NH₂, Y = H.

Также была исследована конденсация 12 с силилированными пуринами вместе с хлоридом олова (IV) в качестве реагента сочетания. В отличие от реакций с пиримидинами конденсация силилированного 6-хлорпурина с 12 давала не только - и -нуклеозиды 16 и 17, но также и N⁷-связанный продукт (не показано). Аналогично конденсация силилированного N²-ацетилгуанина с 12 давала смесь трех продуктов, представляющую собой N⁷-связанный -нуклеозид 31 (42%), желаемый -нуклеозид 32 (10%) и -нуклеозид 22 (6%). Однако при нагревании с силилированным N²-ацетилгуанином в присутствии триметилсилилтрифлата N⁷-связанный продукт 31 частично превращался в N⁹-связанные - и -бициклонуклеозиды 22 (~ 22%) и 32 (~25%). Выделенный 32 подвергали таким же обработкам, как и 22, с получением бициклического -гуанозина 33.

Стереохимические распределения производного 2,6-диоксабицикло[3,2,1] октана 11 и бициклонуклеозидов, образованных при конденсации бициклических сахаров с силилированными нуклеозидными основаниями, можно определить с помощью NОЕ (ядерного эффекта Оверхаузера), протонного ЯМР. Как показано с помощью указанной модели, жесткая кольцевая система диоксабицикло[3,2,1] октана заставляет протоны (Н1' и Н2') при С1' и С2' -бициклонуклеозидов становиться почти параллельно, тогда как Н1' и Н2' в -бициклонуклеозидах направлены в противоположные стороны. Например, угол закручивания Н1'-С1'-С2'-Н2' бициклического -тимидина 15 после геометрической оптимизации равен 37^o, и в соответствии с этим определили константу взаимодействия 3,9 Гц в протонном ЯМР. Угол закручивания Н1'-С1'-С2'-Н2' в бициклическом -тимидине 27 равен 96^o после геометрической оптимизации, и как ожидалось, не было обнаружено связывания между Н1' и Н2'. Действительно протон при С1' во всех измеренных -бициклонуклеозидах представлен в виде единичного пика. В противоположность этому у всех измеренных -бициклонуклеозидов протон при С1' представлен в виде дублета с константой взаимодействия, приблизительно равной 4,0 Гц.

Стереохимические распределения бициклонуклеозидов далее были подтверждены с помощью рентгеноструктурной кристаллографии бициклических тимидинов 15 и 27. Кольцо рибозы сахарной группировки диоксабицикло[3,2,1]октана в обоих соединениях принимает вид типичной С3'-эндо-сахарной "складки", тогда как шестичленное кольцо в сахарной группировке принимает форму "кресла". Тиминовое основание в обоих соединениях имеет противоположную ориентацию.

Синтез фосфорамидитов бициклонуклеозидов с 2,4-мостиковой связью Бициклический -тимидин 27, бициклический -N⁴-бензоилцитидин 29 и бициклический -N⁴-ацетилцитидин 29 были защищены с помощью DMT и затем преобразованы в соответствующие фосфорамидиты соответственно. Из-за стерического препятствия требовалось более длительное время реакции.

34, X = OH, Y = Me; 35, X = NMAc, Y = H; 36, X = NHBz, Y = H; 37, X = OH, Y = Me; 38, X = NHAc, Y = H; 39, X = NHBz, Y = H.

ПРИМЕРЫ Способы синтеза, которые были использованы для получения описанных соединений, можно также использовать для синтеза других заявленных соединений. Настоящее изобретение включает в себя, но не ограничивается этим, соединения, полученные в следующих примерах. Номера в скобках, указанные после названий соединений в примерах, соответствуют номерам структур в разделе детального описания.

Пример 1 Получение 1---метил-3,5-O-(1,1,3,3-тетраизопропил-1,3-дисилоксандиил)-D-рибофуранозы (2) Метиларабинозу получали в соответствии с опубликованной процедурой (Tejima S., Fletcher Jr. H. G. J. Org. Chem. 1963, 28, 2999-3003) и отделяли от ее -аномера (второстепенный продукт) с использованием хроматографии на диоксиде кремния. К перемешиваемому раствору -метиларабинозы (19,27 г, 119,9 ммоль) в безводном пиридине (200 мл) при 0^oС добавили 1,3-дихлор-1,1,3,3-тетраизопропилдисилоксан (38,4 мл, 119,9 ммоль). Полученный раствор перемешивали при ^oС в течение 1 часа и затем при комнатной температуре в течение 1,5 часов. Раствор охладили до 0^oС и добавили воду (20 мл). Смесь перемешивали в течение 10 минут и разбавили с помощью ЕtOАс. Водный слой экстрагировали с помощью ЕtOАс. Объединенный органический слой высушивали (Na₂SO₄) и концентрировали до сухого состояния. Хроматография на диоксиде кремния с использованием 15%-ного ЕtOАс в гексанах дала 42,7 г (88%) указанного в заголовке соединения в виде бесцветного сиропа.

Пример 2 Получение 2-С,2-O-дидегидро--метил-3,5-O-(1,1,3,3-тетраизопропил-1,3-дисилоксандиил)-O-рибофуранозы (3) К перемешиваемому раствору 1--метил-3,5-O-(1,1,3,3-тетраизопропил-1,3-дисилоксан-диил)-D-рибофуранозы (42,6 г, 104,9 ммоль) и DCC (43,4 г, 209,8 ммоль) в безводном DMSO (250 мл) и эфире (100 мл) при 0^oС в атмосфере аргона добавили раствор трифторуксусной кислоты (4,04 мл, 52,5 ммоль) и пиридина (8,44 мл, 105 ммоль) в DMSO (30 мл). Полученную реакционную смесь нагревали до комнатной температуры, перемешивали в течение 5 часов и затем охлаждали до 0^oС. Добавили щавелевую кислоту (21,3 г, 236 ммоль) в метаноле (60 мл) с последующим добавлением воды (30 мл). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа и осадок отфильтровали и тщательно промыли гексанами. Далее фильтрат разбавили гексанами, пятикратно промывали водой, высушивали (Na₂SO₄) и концентрировали до сухого состояния. Хроматография на диоксиде кремния с использованием 2%-ного МеОН в метиленхлорид-гексановой смеси (1:2) дала 37,6 г (89%) указанного в заголовке соединения в виде бесцветного сиропа.

¹H-ЯМР (CDCl₃): 1,00-1,12 (m, 28H, TIPDS), 3,47 (s, 3Н, ОСН₃), 4,05-4,19 (m, 3Н, Н4, Н5а, Н5b), 4,51 (dd, J=9,3 Гц, 1,5 Гц, 1Н, Н3), 4,89 (t, J= 1,5 Гц, 1Н, Н1).

Пример 3 Получение 2-дезокси-2-метилен-1--метил-3,5-O-(1,1,3,3-тетраизопропил-1,3-дисилоксандиил)-D-рибофуранозы К перемешиваемой суспензии метилтрифенилфосфония бромида (21,5 г, 60,1 ммоль) в безводном эфире (1380 мл) при комнатной температуре в атмосфере аргона добавили раствор трет-пентаоксида натрия (5,97 г, 54,0 ммоль) в безводном бензоле (50 мл). Полученную светло-желтую смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 6 часов и охлаждали до -10^oС, затем добавили раствор 2-С, 2-О-дидегидро--метил-3,5-О-(1,1,3,3-тетраизопропил-1,3-дисилоксандиил)-D-рибофуранозы (12,1 г, 30,1 ммоль) в эфире (35 мл). Реакционную смесь перемешивали при -10^oС в течение 1 часа, дважды промывали солевым раствором, высушивали (Na₂SO₄) и концентрировали. Хроматография на диоксиде кремния с использованием 5%-ного ЕtOАс в гексанах дала 11,0 г (91%) указанного в заголовке соединения в виде бесцветного сиропа.

¹H-ЯМР (CDCl₃): 1,00-1,12 (m, 28H, TIPDS), 3,45 (s, 3Н, ОСН₃), 3,73 (dt, J=9,0 Гц, 3,0 Гц, 1Н, Н4), 4,02, 4,03 (2s, 2H, Н5), 4,62 (dt, J=9,0 Гц, 2,7 Гц, 1Н, Н3), 5,27 (m, 1Н, Н1), 5,32-5,36 (m, 2H, Н2').

Пример 4 Получение 2-дезокси-2-метилен-1--метил-D-рибофуранозы (4) К перемешиваемому раствору 2-дезокси-2-метилен-1--метил-3,5-O-(1,1,3,3-тетраизо-пропил-1,3-дисилоксандиил)-D-рибофуранозы (35,0 г, 87,1 ммоль) в THF (200 мл) добавили 1,0 M TBAF в THF (180 мл). Полученный раствор выдерживали при комнатной температуре в течение 1 часа. THF выпаривали, а остаток подвергали хроматографии на диоксиде кремния с использованием 10%-ного ЕtOН в метиленхлориде с получением 14,6 г (88%) указанного в заголовке соединения в виде сиропа.

Пример 5 Получение 3-O-бензил-5-O-(трет-бутилдиметилсилил)-2-дезокси-2-метилен-1--метил-D-рибофуранозы (5) Раствор 2-дезокси-2-метилен-1--метил-D-рибофуранозы (13,7 г, 85,5 ммоль) и TBDMS-CI (13,5 г, 89,6 ммоль) в безводном пиридине (130 мл) выдерживали при комнатной температуре в течение 15 часов. После охлаждения до 0^oС и добавления воды (2 мл) полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа, концентрировали до половины объема, разбавляли ЕtOАс, промывали солевым раствором, высушивали (Na₂SO₄) и концентрировали до сухого состояния. Тщательно высушенный сырой продукт растворили в THF (70 мл) и добавили к перемешиваемой смеси NaH (60% в минеральном масле, 5,6 г, 140 ммоль) в THF (350 мл) при 0^oС. После перемешивания при комнатной температуре в течение 40 минут добавили бензилбромид (10,75 мл, 90,5 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 4 часов и охладили до 0^oС с последующим медленным добавлением воды (2 мл) и затем 10%-ного АсОН в воде до достижения рН, равного 7. Смесь разбавляли ЕtOАс, промывали солевым раствором, затем разбавленным бикарбонатом натрия, высушивали (Na₂SO₄) и концентрировали до сухого состояния. Хроматография на диоксиде кремния с использованием 0-10%-ного ЕtOАс в гексанах дала 23,8 г (76%) указанного в заголовке соединения в виде бесцветной жидкости.

¹H-ЯМР (CDCl₃): 0,01 (s, 3Н, SiCН₃), 0,02 (s, 3Н, SiCH₃), 0,85 (s, 9H, t-Bu), 3,41 (s, 3Н, ОСН₃), 3,60-3,72 (m, 2Н, Н5а, H5b), 4,20 (dd, J=8,7 Гц, 4,5 Гц, 1Н, Н3), 4,57, 4,66 (АВ, J=12,0 Гц, 2Н, Bn), 5,22 (t, J=1,2 Гц, 1Н, Н1), 5,38 (t, J=1,5 Гц, 1Н, Н2а'), 5,43 (m, J=1,2 Гц, 1Н, H2b'), 7,23-7,37 (m, 5H, Bn).

Аналитически рассчитано для C₂₀H₃₂O₄Si,%: С 65,89; Н 8,85.

Обнаружено,%: С 65,92; Н 9,22.

Пример 6 Получение 3-O-бензил-5-O-(трет-бутилдиметилсилил)-2-дезокси-2-гидроксиметил-1--метил-О-рибофуранозы (6) К перемешиваемому раствору 3-О-бензил-5-О-(трет-бутилдиметилсилил)-2-дезокси-2-метилен-1--метил-D-рибофуранозы (5,28 г, 14,50 ммоль) в атмосфере аргона добавили 9-BBN (0,5 М в THF, 87 мл). Полученный раствор перемешивали при температуре окружающей среды в течение 1 часа, затем при 40^oС в течение ночи, охлаждали до комнатной температуры, а затем перенесли в колбу, содержащую тетрагидрат пербората натрия (13,39 г, 87 ммоль) в воде (85 мл) и этанол (85 мл). Полученную смесь интенсивно перемешивали при 50^oС в течение 4 часов, охладили до 0^oС, нейтрализовали с помощью АсОН до рН 8 и сконцентрировали до небольшого объема. Оставшийся объем разбавили водой (20 мл) и трижды экстрагировали метиленхлоридом. Объединенный органический слой дважды промывали солевым раствором, высушивали (Na₂SO₄) и концентрировали до сухого состояния. Хроматография на диоксиде кремния с использованием смеси ЕtOАс-гексаны (1: 2) дала 5,17 г (93%) указанного в заголовке соединения в виде бесцветного сиропа.

¹H-ЯМР (CDCl₃): 0,03 (s, 6H, SiCН₃), 0,87 (s, 9H, трет-бутил), 2,34-2,43 (m, 1H, Н2), 3,39 (s, 3Н, ОСН₃), 3,48 (dd, J=10,5 Гц, 6,0 Гц, 1Н, Н5а), 3,60 (dd, J= 10,5 Гц, 3,6 Гц, 1H, H5b), 3,88 (d, J=7,2 Гц, 2Н, Н2'), 3,98 (dd, J=7,2 Гц, 2,7 Гц, 1H, Н3), 4,17 (m, 1H, Н4), 4,44, 4,66 (AB, J=12,3 Гц, 2Н, Bn), 4,95 (d, J=5,4 Гц, 1H, Н1), 7,23-7,36 (m, 5H, Bn).

Аналитически рассчитано для С₂₀Н₃₄O₅Si,%: С 62,79; Н 8,96.

Обнаружено,%: С 62,92; Н 9,21.

Пример 7 Получение 3-O-бензил-2-дезокси-2-(4,4'-диметокситритилоксиметил)-1--метил-D-рибофуранозы (7) Раствор 3-O-бензил-5-O-(трет-бутилдиметилсилил)-2-дезокси-2-гидроксиметил-1--метил-D-рибофуранозы (6,60 г, 17,28 ммоль) и DMT-CI (7,03 г, 20,74 ммоль) в безводном пиридине (50 мл) выдерживали при комнатной температуре в течение ночи и реакцию резко остановили посредством добавления воды (8 мл). Полученный раствор выдерживали в течение 10 минут и затем разбавили с помощью ЕtOАс, трижды промывали солевым раствором, высушивали (Na₂SO₄) и концентрировали с получением сырого продукта 9, который растворили в THF (52 мл). Добавили TBAF (1,0 М в THF, 26 мл) и полученный раствор выдерживали при комнатной температуре в течение 30 минут. THF выпаривали, а остаток подвергали хроматографии на диоксиде кремния с использованием смеси ЕtOАс-гексаны (1: 1), получили указанное в заголовке соединение в виде белой пены.

¹H-ЯМР (CDCl₃): 2,33-2,42 (m, 1H, Н2), 3,26-3,63 (m, 7H, Н5а, H5b, H2a', H2b', ОСН₃), 3,79 (d, J=1,2 Гц, 6Н, ДМТ), 3,91 (dd, J=7,5 Гц, 2,4 Гц, 1H, Н3), 4,13 (m, 1H, H4), 4,41, 4,50 (AB, J=12,9 Гц, 2Н, Bn), 5,05 (d, J= 5,1 Гц, 1H, Н1), 6,78-6,85 (m, 4H, DMT), 7,14-7,47 (m, 14H, Bn, DMT).

Аналитически рассчитано для С₃₅Н₃₈О₇,%: С 73,66; Н 6,71.

Обнаружено,%: С 73,57; Н 6,76.

Пример 8 Получение 3-O-бензил-2-дезокси-2-(4,4'-диметокситритилоксиметил)-5-С, 5-О-дидегидро-1--метил-D-рибофуранозы (8) К перемешиваемому раствору 3-O-бензил-2-дезокси-2-(4,4'-диметокситритилоксиметил)-1--метил-D-рибофуранозы (9,18 г, 16,16 ммоль) и DCC (10,0 г, 48,49 ммоль) в безводном DMSO (60 мл) при 10^oС добавили раствор трифторуксусной кислоты (0,622 мл, 8,08 ммоль) и пиридин (1,95 мл, 24,24 ммоль) в DMSO (15 мл). Полученную реакционную смесь перемешивали при 10^oС в течение 1 часа, при комнатной температуре в течение 6 часов и затем охлаждали до 0^oС. После добавления воды (8 мл) смесь перемешивали в течение ночи и разбавили с помощью ЕtOАс. Осадок отфильтровали и тщательно промыли с помощью ЕtOАс. Объединенный фильтрат промывали солевым раствором пять раз, высушивали (Na₂SO₄) и концентрировали до сухого состояния. Хроматография на диоксиде кремния с использованием смеси ЕtOАс-гексаны (1:1) дала 8,26 г (90%) указанного в заголовке соединения в виде белой пены.

Пример 9 Получение 3-O-бензил-2-дезокси-2-(4,4'-диметокситритилоксиметил)-4-С-гидроксиметил-1--метил-D-рибофуранозы (9) К перемешиваемому раствору 3-O-бензил-2-дезокси-2-(4,4'-диметокситритилоксиметил)-5-С, 5-O-дидегидро-1--метил-D-рибофуранозы (8,0 г, 14,08 ммоль) и формальдегида (37% в воде, 85 мл) в диоксане (420 мл) при 0^oС добавляли по каплям водный раствор NaOH (2,0 М, 210 мл) в течение 15 минут. Полученный мутный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 2 дней до получения прозрачного раствора. После охлаждения до 0^oС раствор нейтрализовали 10%-ной уксусной кислотой до рН 8, сконцентрировали до малого объема, разбавили водой (100 мл) и трижды экстрагировали метиленхлоридом. Объединенный органический слой промывали солевым раствором, высушивали (Na₂SO₄) и концентрировали до сухого состояния. Хроматография на диоксиде кремния с использованием 4-5%-ного этанола в метиленхлориде дала 8,11 г (94%) указанного в заголовке соединения в виде белой пены.

¹H-ЯМР (CDCl₃): 2,46-2,57 (m, 1H, Н2), 3,23-3,73 (m, 9H, Н5, Н4', Н2', ОСН₃), 3,79 (d, J=1,8 Гц, 6Н, DMT), 4,14 (d, J=6,9 Гц, 1H, Н3), 4,43, 4,47 (АВ, J= 12 Гц, 2Н, Bn), 4,97 (d, J=4,8 Гц, 1H, Н1), 6,77-6,85 (m, 4H, DMT), 7,11-7,46 (m, 14H, Bn, DMT).

Пример 10 Получение 3-O-бензил-2-дезокси-2-гидроксиметил-5-O-мезил-4-мезилоксиметил-1--метил-D-рибофуранозы (10) К перемешиваемому раствору 3-O-бензил-2-дезокси-2-(4,4'-диметокситритилоксиметил)-4-С-гидроксиметил-1--метил-D-рибофуранозы (7,80 г, 13,0 ммоль) в безводном пиридине (60 мл) при 0^oС в атмосфере аргона добавляли по каплям метансульфонилхлорид (3,03 мл, 39 ммоль). Полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 45 минут, затем охладили и разбавили путем добавления воды (5 мл). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут, разбавили с помощью ЕtOАс, трижды промывали солевым раствором, высушивали (Na₂SO₄) и концентрировали, с получением сырого продукта в виде белой пены, который растворили в смеси АсОН-вода (80:20, 400 мл). Полученный раствор выдерживали при комнатной температуре в течение 2 часов и разбавили водой (200 мл), затем сконцентрировали до приблизительно одной четверти от исходного объема. Добавили воду (100 мл) и сконцентрировали смесь до сухого состояния. Хроматография на диоксиде кремния смесью ЕtOАс-гексаны (от 3:1 до 1:0) дала 5,32 г (90%) указанного в заголовке соединения в виде полутвердого вещества.

¹H-ЯМР (CDCl₃): 2,43-2,54 (m, 1Н, Н2), 3,01 (s, 3Н, OMs), 3,03 (s, 3H, OMs), 3,41 (s, 3H, ОСН₃), 3,81 (d, J=4,8 Гц, 2Н, Н2'), 4,01, 4,04 (АВ, J= 10,5 Гц, 2Н, Н4'), 4,21 (d, J=7,5 Гц, 1Н, Н3), 4,30, 4,50 (АВ, J=1,8 Гц, 2Н, Н5), 4,56, 4,63 (АВ, J=12,0 Гц, 2Н, Вn), 4,99 (d, J=5,1 Гц, 1Н, Н1), 7,30-7,42 (m, 5H, Вn).

Аналитически рассчитано для C₁₇H₂₇O₁₀S₂,%: С 44,82; Н 5,97. Обнаружено, %: С 44,68; Н 6,00.

Пример 11 Получение (1S, 3S,4R,8S)-8-бензилокси-1-гидроксиметил-3-метокси-2,6-диоксабицикло[3,2,1]октана (11) К перемешиваемой смеси NaH (60% в минеральном масле, 1,83 г, 22,90 ммоль) в безводном THF (200 мл) добавили раствор 3-O-бензил-2-дезокси-2-гидроксиметил-5-O-мезил-4-мезилоксиметил-1--метил-D-рибофуранозы (5,20 г, 11,45 ммоль) в THF (30 мл). Полученную реакционную смесь перемешивали при 55^oС в течение 42 часов и реакцию резко остановили путем добавления воды при 0^oС. THF выпаривали и затем добавили водный NaOH (0,5 M, 250 мл). Полученную смесь нагревали с обратным холодильником в течение 24 часов, затем охладили до 0^oС, нейтрализовали разбавленной хлорной кислотой до рН 8, экстрагировали метиленхлоридом четыре раза. Объединенный органический слой высушивали (Na₂SO₄) и концентрировали до сухого состояния. Хроматография на диоксиде кремния с использованием смеси ЕtOАс-гексаны (от 2:1 до 1:0) дала 3,16 г (98%) указанного в заголовке соединения в виде бесцветного сиропа.

¹H-ЯМР (CDCl₃): 2,32 (m, 1H, Н2), 3,41 (d, J=11,4 Гц, 1Н, Н4а'), 3,46-3,60 (m, 2Н, 5H, Н5, ОСН₃), 3,91 (d, J=11,1 Гц, 1H, Н4b'), 3,92 (dd, J= 10,8 Гц, 2,4 Гц, 1H, Н2а'), 4,01 (d, J=5,4 Гц, 1H, Н3), 4,04 (d, J=10,5 Гц, 1H, H2b'), 4,58, 4,64 (АВ, J= 12,0 Гц, Вn), 5,07 (d, J=3,9 Гц, 1H, Н1), 7,28-7,40 (m, 5H, Вn).

Пример 12 Получение (1R, 3S,4R,8S)-1-ацетоксиметил-8-бензилокси-3-метокси-2,6-диоксабицикло[3,2,1]октана (12) Раствор (1S, 3S,4R,8S)-8-бензилокси-1-гидроксиметил-3-метокси-2,6-диоксабицикло[3,2,1] октана (1,60 г, 5,71 ммоль), уксусный ангидрид (1,08 мл, 11,42 ммоль) и DMAP (2,09 г, 17,13 ммоль) в безводном метиленхлориде (10 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов, затем охладили до ^oС и разбавили метанолом (4 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут, разбавили метиленхлоридом, промывали солевым раствором и затем 10%-ным NaHCO₃, высушивали (Na₂SO₄) и концентрировали до сухого состояния. Хроматография на диоксиде кремния с использованием смеси этилацетат-гексаны (1:1) дала 1,82 г (99%) указанного в заголовке соединения в виде бесцветного сиропа.

¹H-ЯМР (CDCl₃): 2,02 (s, 3H, ОАс), 2,33 (m, 1H, Н2), 3,50 (d, J=10,8 Гц, 1Н, Н4а'), 3,57 (s, 3H, ОСН₃), 3,86-4,04 (m, 5Н, Н2а', H2b', Н3, H4b', Н5а), 4,14 (d, J=12,0 Гц, 1H, H5b), 4,50, 4,64 (АВ, J=12,0 Гц, 1H, Bn), 5,09 (d, J=3,9 Гц, 1H, Н1), 7,29-7,42 (m, 5H, Bn), Аналитически рассчитано для C₁₇H₂₂O₆,%: С 63,34; Н 6,88. Обнаружено,%: С 63,41; Н 6,94.

Пример 13 Получение (1R, 3S, 4R,8S)-3-ацетокси-1-ацетоксиметил-8-бензилокси-2,6-диоксабицикло[3,2,1]октана (13) К перемешиваемому раствору (1S,3S,4R,8S)-8-бензилокси-1-гидроксиметил-3-метокси-2,6-диоксабицикло[3,2,1] октана (600 мг, 2,14 ммоль) в смеси уксусной кислоты (6 мл) и уксусного ангидрида (0,6 мл) при ^oС добавляли по каплям концентрированную серную кислоту (57 мкл, 1,07 ммоль). Полученную реакционную смесь перемешивали при 0^oС в течение 10 минут и затем при комнатной температуре в течение 2 часов. После охлаждения до 0^oС раствор разбавили с помощью ЕtOАс, трижды промывали солевым раствором и затем 10%-ным бикарбонатом натрия, высушивали (Na₂SO₄) и концентрировали до сухого состояния. Хроматография на диоксиде кремния с использованием смеси ЕtOАс-гексаны (2:3) дала 696 мг (93%) указанного в заголовке соединения (-аномера) и 31 мг (3%) -аномера, оба в виде бесцветного сиропа. -Аномер затвердевал после выдерживания при комнатной температуре в течение нескольких дней, т.пл. 55-58^oС.

¹H-ЯМР (CDCl₃): 2,03 (s, 3Н, ОАс), 2,08 (s, 3Н, ОАс), 2,36-2,39 (m, 1H, Н2), 3,49 (d, J=10,8 Гц, Н4а'), 3,73 (d, J=11,1 Гц, 2,7 Гц, 1H, Н2а'), 3,89 (d, J=11,1 Гц, 1H, H4b'), 4,01 (d, J=11,1 Гц, 1H, H2b'), 4,03 (d, J=9,3 Гц, 1H, Н5а), 4,14 (d, J=5,1 Гц, 1H, Н3), 4,55 (d, J=9,6 Гц, 1H, H5b), 4,55, 4,64 (AB, J=11,7 Гц, 2Н, Вn), 6,39 (s, 1H, Н1), 7,29-7,42 (m, 5H, Вn).

Аналитически рассчитано для C₁₈H₂₂O₇,%: С 61,70; Н 6,33.

Обнаружено,%: С 61,74; Н 6,46.

Пример 14 Получение (1R, 3S, 4R,8S)-1-ацетоксиметил-8-бензилокси-3-(тимин-1-ил)-2,6-диоксабицикло[3,2,1]октана (14) Смесь тимина (189 мг, 1,5 ммоль) и безводного сульфата аммония (15 мг) в HMDS (6 мл) нагревали с обратным холодильником в течение ночи. После удаления HMDS осадок выпаривали совместно с безводным м-ксилолом, высушивали под вакуумом в течение 30 минут и растворяли в растворе (1R,3S,4R,8S)-3-ацетокси-1-ацетоксиметил-8-бензилокси-2,6-диоксабицикло[3,2,1]октана (306 мг, 0,87 ммоль) в 1,2-дихлорэтане (5 мл). К этому перемешиваемому раствору в атмосфере аргона добавляли по каплям триметилсилилтрифлат (0,38 мл) в 1,2-дихлорэтане (2 мл). Полученный раствор нагревали с обратным холодильником в течение 2 часов, затем охладили до 0^oС, разбавили хлороформом и нейтрализовали 10%-ным NаНСО₃ (10 мл). Органический слой отделяли, а водный слой дважды экстрагировали хлороформом. Объединенный органический слой высушивали (Na₂SO₄) и концентрировали до сухого состояния. Кристаллизация из EtOAc-CH₂Cl₂ дала указанное в заголовке соединение (303 мг, 83%) в виде бесцветного твердого вещества, т.пл. 198-200^oС.

¹H-ЯМР (CDCl₃): 1,94 (d, J=1,2 Гц, 1H, АrСН₃), 2,04 (s, 3Н, ОАс), 2,93 (m, 1H, H2'), 3,50 (dd, J=11,8 Гц, 2,1 Гц, 1H, Н2а''), 3,59 (d, J=11,4 Гц, 1H, Н4а''), 4,016 (d, J=11,7 Гц, 1H, H4b''), 4,022 (d, J=12,6 Гц, 1H, Н5а'), 4,09 (d, J=12,0 Гц, 1H, H2b''), 4,11 (d, J=4,5 Гц, 1H, Н3'), 4,27 (d, J=12,6 Гц, 1H, H5b'), 4,53, 4,70 (AB, J=11,7 Гц, 2Н, Вn), 5,88 (d, J=3,6 Гц, 1H, Н1'), 7,30-7,42 (m, 5H, Вn), 7,74 (d, J=1,5 Гц, 1H, Н6), 8,79 (s, 1H, NH).

Аналитически рассчитано для C₂₁H₂₄N₂O₇,%: С 60,57; Н 5,81; N 6,73.

Обнаружено,%: С 60,55; Н 5,84; N 6,69.

Пример 15 Получение (1S,3S,4R,8S)-8-гидрокси-1-гидроксиметил-3-(тимин-1-ил)-2,6-диоксабицикло[3,2,1]октана (15) К раствору (1R,3S,4R,8S)-1-ацетоксиметил-8-бензилокси-3-(тимин-1-ил)-2,6-диоксабицикло[3,2,1] октана в безводном метиленхлориде (3 мл) при 10^oС добавили трихлорид бора (1,0 М в CH₂Cl₂, 6 мл). Полученную реакционную смесь перемешивали при температуре от 15^oС до комнатной температуры в течение ночи и затем охладили до 0^oС. Добавляли по каплям метанол (1,5 мл) и полученную смесь перемешивали при 0^oС в течение 15 минут с последующим добавлением триэтиламина (2 мл). Растворитель выпаривали, а осадок тщательно экстрагировали теплым ацетоном. Ацетоновый раствор высушивали (Na₂SO₄) и концентрировали до сухого состояния. Хроматография на диоксиде кремния с использованием 10%-ного метанола в хлороформе дала 99 мг соединения 20 в виде белой пены. Кристаллизация из ацетона дала 95 мг (93%) указанного в заголовке соединения в виде бесцветного твердого вещества, т.пл. 225-226^oС.

¹H-ЯМР (DMSO-d₆): 1,76 (d, J=0,9 Гц, 1Н, АrСН₃), 2,45 (m, 1Н, Н2'), 3,25 (dd, J=11,4 Гц, 2,1 Гц, 1Н, Н2а''), 3,32-3,52 (m, 2H, Н5'), 3,53 (d, J= 11,4 Гц, 1Н, Н4а''), 3,72 (d, J=11,1 Гц, 1Н, H4b''), 3,93 (d, J=11,1 Гц, 1Н, H2b''), 4,16 (m, 1H, H3'), 4,84 (t, J=6,0 Гц, 1H, ОН), 5,74 (d, J=4,2 Гц, 1H, Н1'), 5,84 (d, J=3,9 Гц, 1Н, ОН), 7,76 (d, J=1,2 Гц, 1H, Н6), 11,32 (s, 1H, NH).

MS: m/z 285 (МН⁺).

Аналитически рассчитано для C₁₂H₁₆N₂O₆,%: С 50,70; Н 5,67; N 9,85.

Обнаружено,%: С 50,85; Н 5,68; N 9,75.

Пример 16 Получение (1R,3R,4R,8S)-1-ацетоксиметил-8-бензилокси-3-(6-хлорпурин-9-ил)-2,6-диоксабицикло[3,2,1] октана (17) и (1R,3S,4R,8S)-1-ацетоксиметил-8-бензилокси-3-(6-хлорпурин-9-ил)-2,6-диоксабицикло[3,2,1]октана (16) Смесь 6-хло