Способ извлечения белка из молочной сыворотки

Способ извлечения белка из молочной сыворотки

Реферат

 

Изобретение относится к способам извлечения белка из молочной сыворотки и может быть использовано в молочной, пищевой промышленности, микробиологической и медицинской отраслях промышленности. Молочную сыворотку обезжиривают, осветляют и охлаждают. После охлаждения молочную сыворотку предварительно пропускают через последовательно расположенные слои гелевого сильнокислотного катионита в Н-форме и гелевого сильноосновного анионита в ОН-форме или через смешанный слой указанных ионитов, а затем через активный сорбционный материал. В качестве активного сорбционного материала используют макропористые и макросетчатые промышленные сильнокислотные катиониты, через которые пропускают сыворотку при рН5 или макропористые или макросетчатые промышленные сильноосновные аниониты, через которые пропускают сыворотку при рН7. Способ позволяет удешевить процесс извлечения белка за счет использования более эффективных сорбционных материалов и повысить содержание чистых протеинов в получаемом концентрате. 2 з.п. ф-лы, 2 ил.

Изобретение относится к способам выделения из биологических растворов высококачественного белка и может быть использовано в молочной, пищевой промышленности, микробиологической и медицинской отраслях промышленности.

Известны способы выделения белка из биологических растворов, например молока, кислой (творожной) и сладкой (подсырной) молочной сыворотки ультрафильтрацией и диафильтрацией с последующим концентрированием и выделением сухого белкового препарата известными методами вакуумного выпаривания и сушки [1, 2].

Основным недостатком указанных способов является то, что получаемый белковый препарат содержит значительные количества молочного сахара - лактозы, что ограничивает ценность продукта и сферу его применения, в частности, для получения безлактозного и низколактозного молока.

Известен способ выделения белка из биологических растворов "Вистек", разработанный английской фирмой "Коч-Лайт" [4]. Для осуществления процесса сорбции белка используется специальная ионообменная целлюлоза, известная под названием "среда Вистек".

Основные недостатки: низкая емкость целлюлозных сорбентов, длительное время сорбции, регенерация белка осуществляется в статике, процесс не технологичен.

Наиболее близким к предложенному способу по технической сути и достигаемому результату является способ [3, 4], разработанный французской фирмой "Рон-Пуленк". По этому способу предварительно обезжиренная, освобожденная от механических примесей и охлажденная сладкая (подсырная) молочная сыворотка пропускается через слой специального адсорбента "Сферосил", где происходит селективное поглощение растворенного протеина (белка), а лактоза, минеральные соли и прочие вещества остаются в проходящем через слой фильтрате. Десорбция белка и получение его концентрированного раствора производится обработкой сорбента раствором соляной кислоты. Дальнейшее повышение концентрации белка и сушка проводятся известными промышленными методами.

Основными недостатками указанного способа являются его ограниченность по ассортименту перерабатываемых видов сыворотки, необходимость использования дорогого сорбционного материала и низкая степень концентрирования белка в получаемом концентрате, что приводит к высоким энергозатратам производства.

Задачами настоящего изобретения являются удешевление процесса за счет использования более эффективных сорбционных материалов и повышения содержания чистых протеинов в получаемом концентрате; расширение ассортимента перерабатываемых видов биологических растворов.

Поставленные задачи решаются тем, что в способе выделения белка из биологического раствора, включающем стадии обезжиривания, удаления механических примесей, охлаждения, пропускания через активный сорбционный материал и регенерации сорбционного материала, с получением концентрированного раствора протеинов, после стадии охлаждения биологический раствор, например сыворотку, предварительно пропускают через последовательно расположенные слои гелевого сильнокислотного катионита в Н-форме и гелевого сильноосновного анионита в ОН-форме или через смешанный слой указанных ионитов, а в качестве активного сорбционного материала используют макропористые или макросетчатые промышленные сильнокислотные катиониты или сильноосновные аниониты пищевого класса.

При использовании макропористых или макросетчатых катионитов в качестве активного сорбционного материала сыворотку предварительно пропускают через последовательно расположенные слои гелевого сильнокислотного катионита в Н-форме и гелевого сильноосновного анионита в ОН-форме или через смешанный слой указанных ионитов при объемном соотношении слоев ионитов 1:1 или больше по отношению к катиониту, а пропускание сыворотки через активный сорбционный материал ведут при 3,5рН4,5, а регенерацию сорбционного материала с получением концентрированного раствора протеинов осуществляют раствором бикарбоната натрия.

При использовании макропористых или макросетчатых анионитов в качестве активного сорбционного материала сыворотку предварительно пропускают через последовательно расположенные слои гелевого сильнокислотного катионита в Н-форме и гелевого сильноосновного анионита в ОН-форме или через смешанный слой указанных ионитов при объемном соотношении слоев ионитов 2:1 или больше по отношению к аниониту, а пропускание сыворотки через активный сорбционный материал ведут при 7рН8,5.

На фиг. 1 представлена схема выделения белка из молочной сыворотки с использованием макропористых и макросетчатых катионитов.

На фиг. 2 представлена схема выделения белка из молочной сыворотки с использованием макропористых и макросетчатых анионитов.

При разработке настоящего способа исходили из нижеприведенной научно-технической информации, известной из литературы. Молочная сыворотка содержит следующие белковые компоненты: бета-лактоглобулин, альфа-лактальбумин, сывороточный альбумин, а также остатки казеионовых белков после переработки молока, а именно альфа-, бета-, каппа- и гамма-казеины (П.А. Ребиндер, И.Н. Влодавец. Проблемы физической химии молока - Ж. Молочная пром-сть, 1967. - 12. - C. 1). Основным белковым компонентом сыворотки является бета-лактоглобулин, имеющий молекулярную массу 35000 и диаметр макромолекулы в конформации, близкой к сферической - 50. Изоэлектрическая точка белка при рН= 5,4. Общее количество групп, содержащих протонируемый азот (имидазольных, гуанидиновых, а также альфа- и эпсилон-аминогрупп), равно 40. Число остатков лизина равно 28, аргинина - 6, гистидина - 4, тирозина - 4. Растворимость в чистой воде в изоэлектрической точке при 25^oС - 0,2 г/л по азоту (Р. Мартин. Введение в биофизическую химию, - М.: "Мир", - 196-430 с.) или 6 г/л самого белка. Растворимость резко повышается при добавлении в раствор неорганических солей, а также при подкислении или подщелачивании раствора.

Известно было, что при пропускании кислой или сладкой сыворотки через обычные гелевые ионообменные смолы белки проходят через слой ионита без взаимодействия с сорбентом, так как не могут проникать в сорбент из-за больших размеров. Например, при пропускании через последовательные слои катионита в Н⁺-форме и анионита в ОН^--форме, а также через смешанный слой указанных ионитов имеет место деминерализация раствора без изменения концентрации белков (Г.С. Родионова, Л.И. Водолазов. Современные методы переработки молочной сыворотки. - Молочная пром-сть. - 1993. - 2. - С.14). Известно было также, что нейтрализованные сывороточные белки (в области значений рН, близких к изоэлектрической точке) не сорбируются даже макропористыми анионитами (Л. С. Иванова, С. Л. Грабчак, Г.В. Кричесвская, Н.Н. Романовская. Переработка молочной сыворотки с помощью адсорбентов и ионообменников. -Молочная пром-сть. - 1993. - 2. - С.28). При этом следует иметь в виду, что макропористые иониты имеют размеры пор, многократно превышающие эффективный размер глобулы бета-лактоглобулина.

Настоящий способ отличается тем, что авторами впервые экспериментально была обнаружена эффективная сорбция сывороточного белка макропористыми и макроретикулярными ионитами в областях значений рН, на одну-три единицы удаленных от изоэлектрической точки. При этом в области пониженных значений 3,5рН4,5, когда имеет место протонирование и образование макрокатиона, сорбция наблюдается на макропористых и макросетчатых катионитах, а в области значений 7рН8,5, когда имеет место образование макроаниона, сорбция наблюдается на макропористых и макросетчатых анионитах. Авторами настоящего способа было также замечено, что предварительная деминерализация сыворотки многократно повышает сорбируемость белков.

Процесс на макропористых и макросетчатых высокоосновных катионитах осуществляется следующим образом.

Oбезжиренная и освобожденная от механической взвеси сыворотка (творожная или подсырная), охлажденная до температуры ниже 10^oС (для предотвращения быстрого микробного закисания), пропускается через последовательно расположенные слои катионита в Н-форме и анионита в ОН-форме или через смешанный слой указанных ионитов, взятых в объемном соотношении 1:1 или больше по отношению к катиониту, что обеспечивает выход деминерализованной (освобожденной от солей кальция и натрия) сыворотки, подкисленной до 3,5рН4,5. Последняя пропускается через макропористый или макросетчатый катионит в Na⁺-форме, в результате чего положительно заряженный белок сорбируется на катионите, а содержащаяся в сыворотке лактоза свободно проходит через слой сорбента. После отработки емкости слоя по белку проводится десорбция последнего и регенерация катионита пропусканием через слой раствора бикарбоната натрия. В результате такой обработки происходит перезарядка полиэлектролита и его эффективное вымывание из сорбента с одновременной подготовкой катионита в Na⁺-форме к следующему циклу сорбции.

Целесообразно предварительную обработку и деминерализацию сыворотки вести до значений рН в пределах 3,5рН4,5. При больших значениях рН (более близких к изоэлектрической точке) плотность положительного заряда на полиэлектролите невысокая, что затрудняет сорбцию белка на катионите. При меньших значениях рН молекула белка приобретает жесткую конформацию "вытянутой палочки", что также затрудняет проникновение в фазу ионита и взаимодействие с ним.

Процесс на макропористых и макросетчатых высокоосновных анионитах осуществляется следующим образом.

Обезжиренная и освобожденная от механической взвеси сыворотка (творожная или подсырная), охлажденная до температуры ниже 10^oС, пропускается через последовательно расположенные слои катионита в Н-форме и анионита в ОН-форме или через смешанный слой указанных ионитов, взятых в объемном соотношении 2: 1 или больше по отношению к аниониту, что обеспечивает выход деминерализованной (освобожденной от хлоридов и сульфатов) сыворотки, подщелоченной до 7рН8,5. Последняя пропускается через макропористый или макросетчатый анионит в Сl^--форме, в результате чего отрицательно заряженный белок сорбируется на анионите, а содержащаяся в сыворотке лактоза свободно проходит через слой сорбента. После отработки емкости слоя по белку проводится десорбция последнего и регенерация катионита пропусканием через слой раствора соляной кислоты. В результате такой обработки происходит перезарядка полиэлектролита и его эффективное вымывание из сорбента с одновременной подготовкой катионита в Сl^--форме к следующему циклу сорбции.

Целесообразно предварительную обработку и деминерализацию сыворотки вести до значений рН в пределах 7рН8,5. При меньших значениях рН (более близких к изоэлектрической точке) плотность отрицательного заряда на полиэлектролите невысокая, что затрудняет сорбцию белка на анионите. При больших значениях рН молекула белка приобретает жесткую конформацию, что также затрудняет проникновение в фазу анионита и взаимодействие с ним.

Во всех случаях целесообразно использование сильнокислотных катионитов и сильноосновных анионитов для стадий предподготовки сыворотки и сорбции белка, так как при использовании слабокислотных и слабоосновных ионитов ионы гидроксила и гидроксония будут более селективно сорбироваться по сравнению с низкомолекулярными электролитами на стадии предподготовки и по сравнению с полиэлектролитами на стадии сорбции белка.

В качестве гелевых сильнокислотных катионитов в H⁺-форме для предварительной обработки сыворотки наиболее целесообразно использовать иониты следующих промышленных марок: КУ-2 (Россия); Dowex-50, УрСоге (США); Purolite (Голландия); Wofatit, Lewatit (Германия) и др.

В качестве гелевых сильноосновных анионитов в ОH^--форме для предварительной обработки сыворотки наиболее целесообразно использовать иониты следующих промышленных марок: АВ-17, АМ-1 (Россия); Dowex-1, Dowex-2, Amberlite (США); Zerlite (Англия); Duolite (Франция) и др.

Примеры осуществления процесса.

В качестве макропористых и макросетчатых сильнокислотных катионитов для селективной сорбции протеинов из сыворотки наиболее целесообразно использовать иониты следующих промышленных марок: КУ-23 (Россия); Marathon (США); Purolite (Голландия) и др.

В качестве макропористых и макросетчатых сильноосновных анионитов для селективной сорбции протеинов из сыворотки наиболее целесообразно использовать иониты следующих промышленных марок: АВ-171, АМ-1П (Россия); Up Core (США); Purolite (Голландия) и др.

С точки зрения расходов реагентов (кислоты и щелочи) для регенерации сорбентов для предварительной обработки сыворотки использование слабокислой среды 3,5рН4,5 с выделением белка на макропористом или макросетчатом катионите наиболее целесообразно для переработки кислой сыворотки.

С точки зрения расходов реагентов (кислоты и щелочи) для регенерации сорбентов для предварительной обработки сыворотки использование слабоосновной среды 7рН8,5 с выделением белка на макропористом или макросетчатом анионите наиболее целесообразно для переработки сладкой сыворотки.

Примеры осуществления процесса Пример 1. Свежевыделенную кислую (творожную) сыворотку объемом 1 л с начальным значением рН 4,8 и содержащую 6 г/л протеинов; 0,06 г-экв/л Са²⁺(1,2 г/л); 0,01 г-экв/л Mg²⁺ (0,12 г/л); 0,05 г-экв/л Na⁺ +K⁺ (~1,3 г/л), а также 48 г/л лактозы подвергают сепарации для отделения жиров до остаточной концентрации жирных веществ не более 0,5 г/л и казеиновой пыли. Обезжиренную очищенную сыворотку пропускают через картриджный фильтр с размером пор не более 20 мкм до остаточной концентрации взвешенных веществ не более 0,25 г/л. Далее очищенную и обезжиренную сыворотку охлаждают до температуры 5^oС и пропускают через две последовательно расположенные ионообменные колонки, в первой из которых находится 40 мл катионита КУ-2х8 в Н-форме (с полной обменной емкостью ПОЕ=2,1 мг-экв/мл слоя) и 40 мл анионита АВ-17х8 в ОН^- форме (ПОЕ=1,4 мг-экв/мл слоя). Высота слоя в колонках - по 30 см. Колонки снабжены рубашками для охлаждения, через которые циркулирует теплоноситель - вода, проходящая через холодильную установку. Скорость пропускания сыворотки 250 мл/ч. Полученную на выходе, частично деминерализованную сыворотку, с суммарной концентрацией солей кальция и магния не более 1х10^-3 г-экв/л и остаточной концентрацией солей натрия и калия не более 0,04 г-экв/л, имеющую показатель рН 3,75, пропускают через колонку, содержащую 40 мл макропористого катионита КУ-23 в Na⁺-форме. Высота слоя в колонке - 30 см. Колонка снабжена охлаждающей рубашкой. Скорость пропускания сыворотки - 250 мл/ч. Далее колонку промывают 100 мл дистиллированной воды и через нее пропускают 85 мл 0,33 н. раствора бикарбоната натрия (27,7 г/л МаНСО₃). При этом получают 85 мл раствора концентрата с рН 6,5 и с содержанием протеинов (определяемых селективно по поглощению фенольных групп аминокислотных остатков тирозина в сильнощелочной среде при длине волны 295 нм) более 65 г/л и практически не содержащего лактозу (определяемую по вращению плоскости поляризации в видимой области). Концентрат подвергают ультрафильтрации для получения 35% раствора протеинов и далее - распылительной сушке. Получают сухой продукт с содержанием белка более 95%.

Регенерацию отработанного катионита КУ-2х8 проводят пропусканием через соответствующую колонку 100 мл 2 н. раствора НСl и последующей промывкой колонки 100 мл дистиллированной водой.

Регенерацию отработанного анионита АВ-17х8 проводят пропусканием через соответствующую колонку 85 мл 2 н. раствора НаОН и последующей промывкой колонки 100 мл дистиллированной воды. Анионит готов к следующему циклу предподготовки сыворотки.

Все регенерационные и промывочные воды объединяют и получают 385 мл нейтрального сбросного раствора солей натрия, кальция и магния с общей минерализацией 50 г/л.

Пример 2. Проводят процесс в соответствии с примером 1, за исключением того, что вместо двух последовательных слоев катионита КУ-2х8 и анионита АВ-17х8 используют равновмерно смешанную композицию указанных ионитов в ионообменной колонке объемом 100 мл и высотой слоя 30 см. Получают на выходе частично деминерализованную сыворотку с суммарной концентрацией солей кальция и магния не более 1х10^-4 г-экв/л и остаточной концентрацией солей натрия и калия не более 0,03 г-экв/л и имеющую показатель рН 3,80. Регенерацию отработанных катионита и анионита проводят после предварительного разделения слоев в восходящем потоке дистиллированной воды.

Пример 3. Свежевыделенную сладкую (подсырную) сыворотку объемом 1 л с начальным значением рН 6,4 и содержащую 6,2 г/л протеинов, 0,11 г-экв/л Сl^-(3,9 г/л), 0,01 г-экв/л SO₄ ^2- (0,5 г/л), а также 60 г/л лактозы подвергают сепарации для отделения жиров до остаточной концентрации жирных веществ не более 0,5 г/л и казеиновой пыли. Обезжиренную сыворотку пропускают по аналогии с примером 1 через картриджный фильтр с размером пор не более 20 мкм до остаточной концентрации взвешенных веществ не более 0,25 г/л. Далее очищенную и обезжиренную сыворотку охлаждают до температуры ^oС и пропускают через две последовательно расположенные ионообменные колонки, в первой из которых находится 30 мл катионита КУ-2х8 в Н⁺-форме (с полной обменной емкостью ПОЕ= 2,1 мг-экв/мл слоя) и 60 мл анионита АВ-17х8 в ОН^--форме (ПОЕ=1,4 мг-экв/мл слоя). Высота слоя в колонках - по 25 см и 40 см соответственно. Полученную на выходе, частично деминерализованную, сывортку, не содержащую сульфатов, с концентрацией хлоридов 0,03 г-экв/л и имеющую показатель рН 7,5, пропускают через колонку, содержащую 50 мл макропористого анионита АВ-171 в Сl^--форме. Высота слоя в колонке - 35 см. Скорость пропускания сыворотки - 250 мл/ч. Далее колонку промывают 100 мл дистиллированной воды и через нее пропускают 100 мл 0,3 н. раствора НСl. При этом получают 100 мл раствора концентрата с рН 3,5 и с содержанием протеинов более 60 г/л, практически не содержащего лактозу. Концентрат подвергают дальнейшей переработке в соответствии с примером 1.

Регенерацию отработанного катионита КУ-2х8 проводят пропусканием через соответствующую колонку 800 мл 2 н. раствора НСl с последующей промывкой колонки 100 мл дистиллированной воды.

Регенерацию отработанного анионита АВ-17х8 проводят пропусканием через соответствующую колонку 120 мл 2 н. раствора NaOH с последующей промывкой колонки 100 мл дистиллированной воды. Анионит готов к следующему циклу предподготовки сыворотки.

Все регенерационные и промывочные воды объединяют и получают 400 мл нейтрального сбросного раствора солей натрия, кальция и магния с общей минерализацией 45 г/л.

Источники информации 1. Ю.Н. Кузьмин, В.А. Лялин, Б.М. Двинский. "Применение мембранных методов в молочной промышленности". ЦНИИТЭИмясомолапром. 1980 - 37 с; с 24-32.

2. В.А. Лялин. "Ультрафильтрационные установки для продовольственных отраслей". Пищевая и перерабатывающая промышленность, 7, 1985, с.28-33.

3.Palmer D.E. "Recupero Delle proteine Dell industria alimentare tramite scambio tonico" "Inquinamento" Hali 1982, том 24, 3 (с.99, 101, 103, 105, 107, 109, 1116, 113).

4. А.Г. Храмцов "Молочная сыворотка". Москва. ВО "Агропромиздат", 1990 - 240 с; с 77-81.

Формула изобретения

1. Способ выделения белка из молочной сыворотки, включающий стадии обезжиривания, осветления, охлаждения, пропускания через активный сорбционный материал и регенерации сорбционного материала с получением концентрированного раствора протеинов, отличающийся тем, что после стадии охлаждения молочную сыворотку предварительно пропускают через последовательно расположенные слои гелевого сильнокислотного катионита в Н-форме и гелевого сильноосновного анионита в ОН-форме или через смешанный слой указанных ионитов, в качестве активного сорбционного материала используют макропористые или макросетчатые промышленные сильнокислотные катиониты пищевого класса, через которые пропускают сыворотку при рН5, или макропористые или макросетчатые промышленные сильноосновные аниониты пищевого класса, через которые пропускают сыворотку при рН7.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при использовании макропористых или макросетчатых катионитов в качестве активного сорбционного материала творожную (кислую) сыворотку предварительно пропускают через последовательно расположенные слои гелевого сильнокислотного катионита в Н-форме и гелевого сильноосновного анионита в ОН-форме или через смешанный слой указанных ионитов при объемном соотношении слоев ионитов 1: 1 или больше по отношению к катиониту, пропускание сыворотки через активный сорбционный материал ведут при 3,5рН5, а регенерацию сорбционного материала с получением концентрированного раствора протеинов осуществляют раствором бикарбоната натрия.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при использовании макропористых или макросетчатых анионитов в качестве активного сорбционного материала подсырную (сладкую) сыворотку предварительно пропускают через последовательно расположенные слои гелевого сильнокислотного катионита в Н-форме и гелевого сильноосновного анионита в ОН-форме или через смешанный слой указанных ионитов при объемном соотношении слоев ионитов 2: 1 или больше по отношению к аниониту, а пропускание сыворотки через активный сорбционный материал ведут при 7рН 8,5.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2