Способ профилактики или лечения эстрогензависимых заболеваний и расстройств

Способ профилактики или лечения эстрогензависимых заболеваний и расстройств

Реферат

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для лечения эстрогензависимых злокачественных опухолей. Способ представляет собой введение указанному млекопитающему профилактически или терапевтически эффективного количества соединения формулы 1. Предложенный способ позволяет повысить эффективность лечения за счет преодоления резистентности злокачественной опухоли применением антиэстрогенных препаратов 2 с. и 11 з.п.ф-лы, 19 ил.

Настоящая заявка испрашивает приоритет по заявке на предварительный патент 60/055881, содержание которой целиком включено в данную заявку в качестве ссылки.

Настоящее изобретение было отчасти выполнено за счет финансирования системой Федеральных медицинских институтов США, грант за NCI P50 СА68438. В связи с этим правительство США может обладать определенными правами на настоящее изобретение.

Область техники Настоящее изобретение в целом относится к лечению эстрогензависимых заболеваний и расстройств, и, в частности, к способу лечения эстрогензависимых злокачественных опухолей, конкретно рака молочной железы, с применением антиэстрогеновых средств.

Предпосылки Рецептор эстрогена человека (ER) является членом суперсемейства ядерных рецепторов транскрипционных факторов (Evans, 1988, Science, 240, 889-895). В отсутствие гормона рецептор остается в ядрах клеток-мишеней в транскрипционно неактивном состоянии. По связыванию своего лиганда ER претерпевает конформационное изменение, сопряженное с каскадом процессов, которые в конечном счете приводят к его связыванию со специфическими регуляторными сегментами генов-мишеней (O'Malley et al., 1991, Hormone Res., 47, 1-26). Конкретная регуляция транскрипции зависит от конкретной клетки и промотора ДНК-связывающего рецептора (Тоrа et а1., 1989, Cell, 59, 477-487; Tasset et al., 1990, Cell, 62, 1177-1187; McDonnell et al., 1995, Mol. Endocrinol., 9, 659-669; Tzukerman et al., 1994, Mol. Endocrinol., 8, 21-30). В этом смысле ясно, что физиологический антагонист активности ER - эстрадиол - проявляет свою биологическую активность в половой скелетной и сердечно-сосудистой системах организма (Clark & Peck, eds., 1979, "Female Sex Steroids: Receptors and Functions", Monographs Endocrinol., Springer-Verlag, New York; Chow et al. , 1992, J. Clin Invest., 89, 74-78; Eaker et al., 1993, Circulation, 88, 1999-2009).

Помимо указанных типов активностей было подтверждено функционирование эстрогена в качестве митогенного фактора в большинстве ER-позитивных клетках опухолей молочной железы. Следовательно, способы лечения, основанные на применении антиэстрогеновых средств, т.е. синтетических соединений, противоположных по действию эстрогену, должны быть клинически эффективными с точки зрения излечения или подавления прогрессирования заболевания (Jordan & Murphy, 1990, Endocrine Rev. , 11, 578-610; Parker, 1993, Breast Cancer Res. Treatment, 26, 131-137). Применение таких синтетических модуляторов активности ER и раскрытие механизма (механизмов) их действия позволит пролить свет на механизмы активности самого ER.

Одно из наиболее изученных в этом отношении соединений - тамоксифен (Jordan & Murphy, 1990, Endocrine Rev., 11, 578-610). Это соединение функционирует в качестве антагониста в большинстве ER-позитивных опухолей молочной железы, но при этом проявляет парадоксальную агонистическую активность в костной ткани и сердечно-сосудистой системе, а также неполную агонистическую активность в матке (Kedar et al., 1994, Lancet, 343, 1318-1321; Love et al. , 1992, New England J. Med., 326, 852-856; Love et al., 1991, Ann. Intern. Med. , 115, 860-864). Следовательно, активность агониста/антагониста, присущая комплексу ER-тамоксифен, зависит от типа клеток. Это принципиальное наблюдение входит в видимое противоречие с долговременными моделями, свидетельствующими, что ER существуют только в клетках, находящихся в активном или неактивном состоянии (С1ark & Peck, eds., 1979, "Female Sex Steroids: Receptors and Functions", Monographs Endocrinol., Springer-Verlag, New York). Напротив, это указывает на то, что действующие по связыванию с одним и тем же рецептором разные лиганды могут проявлять различные биологические эффекты в клетках различного типа. Установление механизма такой избирательности, по-видимому, позволит объяснить некоторые процессы, такие как возникновение резистентности к тамоксифену, выявляемую в большинстве ER-позитивных случаев рака молочной железы, при которых наблюдаются аномальные параметры сигнального пути ER (Tonetti & Jordan, 1995, Anti-Cancer Drugs, 6, 498-507).

С применением тестирования in vitro был определен вероятный механизм избирательно агонистической или антагонистической активности тамоксифена (Тоrа et al. , 1989, Cell, 59, 477-487; Tasset et al., 1990, Cell, 62, 1177-1187; McDonnell et al., 1995, Mol. Endocrinol., 9, 659-669; Tzukerman et al. , 1994, Mol. Endocrinol., 8, 21-30). Важным является то, что была выявлена индукция тамоксифеном изменения конформации ER, которое отличается от такового, индуцируемого эстрадиолом (McDonnell et al., 1995, Mol. Endocrinol. , 9, 659-669; Beekman et a1., 1993, Mol. Endocrinol., 7, 1266-1274). Более того, определение аминокислотных последовательностей в составе ER, необходимых для активации транскрипции, указывает на то, как конкретные комплексы "лиганд-рецептор" дифференцированно распознаются клеточными факторами контроля за транскрипционной активностью. Конкретно было установлено, что ER включает два активационных домена - AF-1 (фактор активаторной функции 1) и AF-2, которые обеспечивают его взаимодействие с контролирующей транскрипцию системой. Относительный вклад этих доменов AF в общую активность ER оказывается неодинаковым в разных клетках (Тоrа et al., 1989, Cell, 59, 477-487; McDonnell et al., 1995, Mol. Endocrinol., 9, 659-669; Tzukerman et al. , 1994, Mol. Endocrinol., 8, 21-30). Для эстрадиола было установлено функционирование в качестве агониста по отношению и к AF-1, и к AF-2: это проявляется в том, что он обусловливает максимальный уровень активности независимо от того, какой из доменов AF является доминантным в конкретной клеточной среде. С другой стороны, тамоксифен функционирует в качестве антагониста домена AF-2, подавляя активность рецептора ER в клетках, в которых AF-2 необходим или является доминантным активаторным фактором (Тоrа et al., 1989, Cell, 59, 477-487; McDonnell et al., 1995, Mol. Endocrinol., 9, 659-669; Tzukerman et al., 1994. Mol. Endocrinol., 8, 21-305. С другой стороны, тамоксифен активен как агонист тогда, когда только AF-1 является необходимым (McDonnell et al. , 1995. Mol. Endocrinol., 9, 659-669; Tzukerman et al., 1994, Mol. Endocrinol., 8, 21-30). Следовательно, основываясь на параметрах относительной активности системы AF-1/AF-2, было идентифицировано четыре кинетически дифференцированных группы ER-модуляторов: полные агонисты (например, эстрадиол), два разных типа частичных агонистов, представленные тамоксифеном и ралоксифеном, и полные антагонисты, представителем которых является препарат ICI182780 (McDonnell et al., 1995, Mol. Endocrinol., 9, 659-669; Tzukerman et al., 1994, Mol. Endocrinol., 8, 21-30). Эти данные позволяют объяснить наблюдаемые различия в проявлениях биологической активности некоторых модуляторов ER, исходя из кинетических параметров (т.е. различий в механизмах реакций), и указывают на то, что механизмы, в соответствии с которыми рецептор ER действует в различных тканях, неодинаковы. Интересно, что проявляемая модуляторами ER, такими как эстроген и тамоксифен, агонистическая активность в подобных системах in vitro отражает их активность в половых путях интактных животных. Эта корреляция, однако, не распространяется на костную ткань, где и эстрадиол и тамоксифен, и ралоксифен, которые проявляют различную степень агонистической активности в отношении системы AF-1/AF-2, эффективно предотвращают уменьшение массы костной ткани у модельных крыс после овариэктомии. Следовательно, за исключением являющихся стероидами полных антиэстрогенов (таких как ICI182780), все известные типы модуляторов ER, по- видимому, защищают уменьшение массы костной ткани у человека и в родственных животных моделях, в то время как они характеризуются различной степенью эстрогенподобной активности в других тканях (Chow et al., 1992, J. Clin. Invest., 89, 74-78; Love et al., 1992, New England J. Med., 326, 852-856; Draper et al., 1993, "Biochemical markers of bone and lipid metabolism in healthy postmenopausal women". In Proc. 4th Intern. Symp. Osteoporosis & Consensus Develop. Conf., С. Christiansen & B. Biis (eds.), Handelstrykkeriet, Aalborg; Wagner et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 8739-8744; Black et al., 1994, J. Clin. Invest., 93, 63-69).

Сущность изобретения Настоящее изобретение основывается на идентификации модуляторов ER, которые по кинетическим параметрам отличаются от таких модуляторов, каким является тамоксифен. Эти модуляторы находят свое применение в лечении различных эстрогензависимых заболеваний и расстройств, включая рак молочной железы. Эти модуляторы особенно важны в лечении случаев рака молочной железы, которые характеризуются резистентностью к тамоксифену, возникшей de novо, или становятся резистентными в процессе лечения.

Объекты и преимущества настоящего изобретения будут ясны из нижеследующего описания.

Краткое описание чертежей Фигуры 1А и 1B. GW5638 является соединением, отличающимся по кинетическим параметрам от известных типов модуляторов ER. Промотор гена С3 человека (нуклеотиды [-1807]-[+58]), соединенный с геном-репортером, кодирующим люциферазу светляка, использовали для трансфекции клеток HepG2 наряду с экспрессирующей плазмидой, включающей (фиг.1А) ген рецептора эстрогена человека дикого типа (ERwt) или (фиг.1В) мутированный ген ER, в котором функция активаторного домена AF2 была нарушена (ER-TAF1), с последующим тестированием активации транскрипции в присутствии возрастающих концентраций модуляторов ER, так как это указано. Процесс трансфекции оптимизировали по параметрам эффективности и числу клеток с использованием одновременной трансфекции экспрессирующей плазмидой, включающей репортерный ген -галактозидазы. Нормализованный ответ получали путем соотнесения единиц индуцируемого света (активность люциферазы) к активности -галактозидазы, измеряемой в тесте на каталитическую активность. Эксперименты по трансфекции были проведены в трех повторностях. Показанные данные представляют обобщение по нескольким экспериментам, проведенным в сходных условиях.

Фигура 2А-2С. GW5638 и GW7604 препятствуют агонистической активности эстрадиола, частичной агонистической активности тамоксифена и инвертивной агонистической активности ICI182780. Фигура 2А. Способность GW5638 или GW7604 подавлять агонистическую активность эстрадиола-17 в концентрации 10^-8 М или частичную агонистическую активность, проявляемую тамоксифеном при концентрации 10^-8 М, оценивали в клетках HepG2, трансфицированных геном ERwt. Фигура 2В. Способность GW5638 или GW7604 подавлять агонистическую активность эстрадиола-17 в концентрации 10^-8 М или частичную агонистическую активность, проявляемую 4-ОН-тамоксифеном при концентрации 10^-8 М, оценивали в клетках HepG2, трансфицированных мутантным геном ER-TAF1 (McDonnell et al. , 1995, Mol. Endocrinol., 9, 659-669). Фигура 2С. И GW5638, и GW7604 способны подавлять инвертивную агонистическую активность ICI182780 (далее - ICI) по отношению к ER в связи с контролем активности промотора С3 при тестировании в клетках HepG2 при указанных концентрациях. Процесс трансфекции оптимизировали по параметрам эффективности и числу клеток с использованием одновременной трансфекции экспрессирующей плазмидой, включающей репортерный ген -галактозидазы. Нормализованный ответ получали путем соотнесения единиц индуцируемого света (активность люциферазы) к активности -галактозидазы, измеряемой в тесте на каталитическую активность. Показаны данные выборочных тестов, в которых трансфекцию проводили в трех повторностях. Обозначения ошибок соответствуют стандартному отклонению от среднего (s.e.m.).

Фигуры 3А и 3В. GW5638 защищает крыс после овариэктомии от уменьшения массы костной ткани. Фигура 3А. Влияние GW5638 на степень минерализации кости (СМК) в поясничном отделе позвоночника (позвонки L1-L4) измеряли методом двухуровневой рентгеновской абсорбциометрии. Достоверность различий по СМК между крысами OVX и подвергавшимися воздействию животными определяли с помощью теста Даннета (*Р0,005). Определены диапазоны величин СМК, выявленных у крыс, которым симулировали операцию по удалению яичников (закрашенные области), и OVX (незакрашенные области). Фигура 3В. Влияние GW5638 на СМК в проксимальном метафизе большеберцовой кости крыс OVX измеряли методом количественной компьютерной томографии (ККТ). Достоверность различий величин СМК между крысами OVX и опытными животными (обозначены звездочками) была определена с помощью теста Турки-Кремера (Р0,05).

Фигура 4. GW5638 подавляет вызванное овариэктомией (удалением яичников) повышение уровня сывороточного холестерина. Измерения содержания сывороточного холестерина были проведены в пробах крови, взятых у группы 90-дневных овариэктомизированных крыс, которым вводили либо эстрадиол, либо GW5638, как это указано. Каждая точка указывает на среднее значение сывороточного холестерина ( s. e.m.) для контрольных крыс OVX (n=7), обработанных эстрадиолом (n=7) и GW5638 (n=7), в соответствии с указанным. Звездочками отмечены группы, которые достоверно отличаются от контрольной группы. Определен размах значения уровня сывороточного холестерина у крыс линии OVX (незакрашенные области).

Фигура 5. GW5638 не проявляет ЕR-агонистической активности в матке у неполовозрелых крыс. Группе 21-дневных крысят перорально вводили либо только наполнитель, либо GW5638, либо тамоксифен в виде единственного фактора, либо GW5638 или тамоксифен в присутствие эстрадиола. Показанные данные соответствуют средним значениям ( s.e.m.). Обозначен диапазон измерений, проведенных у крыс, которым вводили эстрадиол (закрашенные области), и у симулятивно прооперированных животных (незакрашенные области).

Фигура 6. Влияние GW5638 на нативный вес матки у крыс с удаленными яичниками. Группе симулятивно прооперированных крыс или группе 90-дневных овариэктомизированных особей вводили в течение 28 дней либо только наполнитель, либо эстрадиол, либо GW5638. Полученные результаты приведены в виде средних значений нативного веса матки ( s.e.m.) для 7 особей каждой группы. Обозначены диапазоны измерений для симулятивно прооперированных крыс (закрашенные области) и животных OVX (незакрашенные области).

Фигуры 7A-7F. Влияние GW5638 на гистологические параметры матки у овариэктомизированных крыс. Дана сравнительная гистологическая картина (при небольшом увеличении) маток у 90-дневных крыс, которые были симулятивно прооперированы (фиг. 7А), которым проводили овариэктомию (фиг.7В), проводили овариэктомию и вводили эстрадиол (фиг.7С) или проводили овариэктомию и вводили GW5638 дозами 1 мкг/кг (фиг.7D), 3 мкг/кг (фиг.7Е) или 10 мкг/кг (фиг. 7F).

Фигуры 8A-8D. Влияние GW5638 на гистологические параметры матки у овариэктомизированных крыс. Дана сравнительная гистологическая картина маток у 90-дневных крыс, которые были симулятивно прооперированы (фиг.8А), которым проводили овариэктомию (фиг.8В), проводили овариэктомию и вводили эстрадиол (фиг. 8С) или проводили овариэктомию и вводили GW5638 дозой 10 мкг/кг (фиг. 8D). Микрофотографии сделаны при увеличении 150х и затем увеличены до окончательного увеличения 600х.

Фигура 9. Влияние противоэстрогеновой обработки на опухоль молочной железы MCF-7 у мышей линии "nude". День "0" указывает на начальный день обработки, имевший место через 2 недели после инокуляции опухоли, а статистический анализ показал, что каждая обработанная группа достоверно превосходит контроль (ANOVA: Р<0,5) при отсутствии достоверных различий между двумя наивысшими дозами GW5638 и тамоксифена.

Фигура 10. Анализ зависимости от дозы.

Фигура 11. Анализ LCC2.

Фигура 12. Активность GW5638 как антиэстрогена в клетках опухоли молочной железы MCF-7.

Фигуры 13А и 13В. Анализ влияния отдельных мутаций в ER на фармакологические параметры антиэстрогенов, показывающий существование дополнительной кинетической комплексности. фиг. 13А - ERwt (дикий тип). Фиг.13В - ER-TAF1 (мутантный вариант ER).

Фигуры 14А и 14В. Сравнительный анализ способности ряда антиэстрогеновых средств подавлять транскрипционную активность ER (фиг.14А) и ER (фиг.14В).

Фигуры 15А-15С. Анализ экспрессии ER методом иммунологического Вестерн-блоттинга в клетках-мишенях после обработки их агонистами или антагонистами. Фиг.15А - клетки MCF-7. Фиг.15В - клетки Ishikawa. Фиг.15С - клетки Ishikawa, трансфицированные плазмидой pRST7ER.

Фигуры 16А и 16В. Анализ методом иммунологического Вестерн-блоттинга эндогенной экспрессии ER в клетках MCF-7 после кратковременной обработки (фиг. 16А - 1 ч; фиг.16В - 4 ч) агонистами или антагонистами.

Фигуры 17А и 17В. Анализ методом иммунологического Вестерн-блоттинга эндогенной экспрессии ER в клетках Ishikawa после кратковременной обработки (фиг.17А - 1 ч; фиг.17В - 4 ч) агонистами или антагонистами.

Фигуры 18А-18С. Анализ методом иммунологического Вестерн-блоттинга экспрессии эндогенного ER в интактных клеток (фиг.18А), в ядрах (фиг.18В) и цитоплазме (фиг.18С) клеток Ishikawa после кратковременной обработки агонистами или антагонистами.

Фигуры 19А-19С. Влияние на стимулированную эстрогеном пролиферацию клеток линии MCF-7. Фиг.19А - ICI 182870. Фиг.19В - GW7604. Фиг.19С - 4-ОН-тамоксифен.

Подробное описание изобретения Настоящее изобретение относится к избирательным модуляторам рецепторов эстрогена, которые проявляют тканеспецифичную активность агонистов ЕR. Эти модуляторы по настоящему изобретению функционируют в качестве агонистов в костной ткани и в сердечно-сосудистой системе, но не в матке. Эти модуляторы отличаются по кинетическим параметрам, например, от тамоксифена и применимы в лечении опухолей, таких как опухоли молочной железы, в частности ER-позитивных вариантов рака молочной железы, характеризующихся возникшей de novo или приобретенной в ходе собственно лечения резистентности к различным модуляторам рецептора эстрогена, включая тамоксифен. Представляемые настоящим изобретением модуляторы также отличаются по кинетическим параметрам от ралоксифена, дролоксифена, идоксифена и ICI182780.

Предпочтительными модуляторами по настоящему изобретению являются производные трифенилэтилена, более предпочтительно соединения формулы I, определенные в патенте США 5681635, при том, что наиболее предпочтительными являются GW5638 и его производные, такие как GW7604. Эти соединения могут быть получены в соответствии с описанным в патенте США 5681835 и описанным Уилсоном с соавт. (Wilson et al., 1994, J. Med. Chem., 37, 1550). Эти модуляторы могут образовывать фармацевтически приемлемые соли с катионами, включая щелочные металлы, такие как натрий и калий, или щелочноземельные металлы, такие как кальций или магний.

Модуляторы по настоящему изобретению могут быть использованы в лечении и (или) профилактике ряда расстройств или состояний, таких как эстроген-стимулируемые злокачественные опухоли, включая рак матки, рак яичников, рак толстой кишки и рак молочной железы, сердечно-сосудистые заболевания (у мужчин и женщин), остеопороз (очаговая деминерализация костей) и артрит. Другие заболевания или состояния, в отношении которых (как для лечения, так и для профилактики) являются применимыми модуляторы по настоящему изобретению, включают рак предстательной железы, бесплодие (например, как фактор индукции овуляции), связанные с климаксом вазомоторные проявления (например, "горячие приливы"), вагинит, доброкачественные пролиферативные заболевания, включая эндометриоз и фиброму матки, сахарный диабет II типа, дегенерация желтого пятна, недержание мочи и болезнь Альцгеймера (познавательная способность). Далее соединения по настоящему изобретению могут быть использованы в качестве контрацептивов для женщин.

Как будет ясно из нижеследующих примеров, GW5638 и его производные являются модуляторами с уникальными кинетическими свойствами. Эти агенты, по-видимому, должны превосходить, например, тамоксифен в качестве исходных терапевтических средств и в качестве химиопрофилактических средств в отношении эстроген-стимулируемых злокачественных опухолей, в частности рака молочной железы, потому что они не обладают утеротрофной активностью. Данные средства обладают классической активностью в отношении ER и, следовательно, можно предположить, что они не будут обусловливать резистентность к себе в той же степени, что и существующие соединения. Более того, данные средства могут быть применены в лечении пациентов, которые характеризуются слабой реагируемостью на другие модуляторы рецептора эстрогенов, включая тамоксифен, идоксифен, ралоксифен и ICI182780, равно как и тех пациентов, которые сначала эффективно на них реагируют, а затем такая реагируемость исчезает. С точки зрения кинетической уникальности представляемых агентов можно ожидать, что их применение не приведет к негативным побочным эффектам, таким как глубокий тромбоз вен.

С учетом уникального механизма действия модуляторов по настоящему изобретению также представляется их использование в качестве компонента терапевтических композиций, в частности предназначенных для лечения рака молочной железы. В этом смысле модуляторы по настоящему изобретению могут быть использованы в сочетании с другим средством, обладающим антиэстрогеновой активностью, с лигандом ретиноевой кислоты или Х-рецептора ретиноевой кислоты, с антипрогестиновым средством, таким как RU486, с антиандрогеном, таким как касдекс или флутамид, с витамином D (или его метаболитами), с ингибитором фарнезилтрансферазы, с агонистом PPAR- или РРАR- или с ингибитором МАР-киназы.

Как указывалось выше, настоящее изобретение представляет использование заявленных модуляторов с целью профилактики, равно как и лечения идентифицированных заболеваний или симптомов. Необходимое для использования количество модулятора может варьироваться в зависимости от состояния (заболевания/расстройства), возраста и собственно состояния пациента и в конечном счете находится в ведении лечащего врача (или ветеринара в случае ветеринарного применения данных препаратов). В целом, однако, дозировки, применимые для лечения взрослого человека, обычно должны находиться в пределах от 0,001 мг/кг до примерно 100 мг/кг в день. Желательная дозировка может быть представлена в виде разовой дозы или в виде фракционированных доз, вводимых через определенные промежутки времени, например дважды, трижды, четырежды или более таких субдозировок в сутки.

Также настоящее изобретение представляет фармацевтические композиции, содержащие определенный выше модулятор или фармацевтически приемлемую его соль, наряду с одним или большим числом фармацевтически приемлемых носителей и, что необязательно, других терапевтических и (или) профилактических компонентов, включая те, которые были описаны выше.

Препараты по настоящему изобретению могут быть введены стандартным путем с целью лечения диагностированных заболеваний или расстройств, например перорально, парентерально, сублингвально, трансдермально, ректально, путем ингаляции или путем трансбуккального введения. Для трансбуккального введения композиции может быть придана форма (например, ее стандартной дозе) таблетки или лепешки, приготовленных стандартными путями. Например, таблетки и капсулы для перорального введения могут содержать традиционные наполнители, такие как связывающие агенты, наполнители, смазывающие вещества, дезинтеграторы и смачивающие агенты. Таблетки могут быть покрыты в соответствии с приемами, хорошо известными в данной области.

С другой стороны, модуляторы по настоящему изобретению могут быть приготовлены в виде жидких препаратов для перорального введения, таких как водные или масляные суспензии, растворы, эмульсии, сиропы или эликсиры. Более того, препараты, содержащие данные модуляторы, могут быть выработаны в виде сухого продукта для последующей реконституции в воде или другом подходящем наполнителе непосредственно перед использованием. Такие жидкие препараты могут содержать стандартные добавки, такие как суспендирующие агенты, эмульсификаторы, консерванты и неводные наполнители.

Такие препараты также могут быть приготовлены в виде суппозиториев, например, таких, которые содержат обычные для суппозиториев основы, например масло какао или другие глицериды. Композиции для ингаляционного введения могут быть стандартным образом приготовлены в виде раствора, суспензии или эмульсии, которые могут быть введены в виде сухого порошка или в форме аэрозоля с использованием стандартного распылительного средства, такого как дихлордифторметан или трихлорфторметан. Типичные препараты для трансдермального введения содержат стандартные водные или неводные наполнители, такие как кремы, мази, лосьоны или пасты, или приготавливаются в форме медицинского пластыря, наклейки или пленки.

Кроме того, композиции по настоящему изобретению могут быть приготовлены для парентерального введения путем инъекций или непрерывных инфузий. Препараты для инъекций могут быть приготовлены в форме суспензий, растворов или эмульсий в масляных или водных наполнителях и могут содержать такие препаративные агенты, как суспендирующие, стабилизирующие и (или) диспергирующие агенты. С другой стороны, активный компонент может быть в форме порошка, предназначенного для разведения подходящим разбавителем (например, стерилизованной, не содержащей пирогенов водой) непосредственно перед применением.

Композиция в соответствии с настоящим изобретением также может быть приготовлена в виде препарата длительного высвобождения. Такие препараты долговременного действия могут быть введены путем имплантирования (например, подкожного или внутримышечного) или путем внутримышечной инъекции. Следовательно, модуляторы по настоящему изобретению могут быть объединены при приготовлении препарата с подходящими полимерными или гидрофобными материалами (например, в виде эмульсии с подходящем масле), ионообменными смолами или в виде, например, умеренно растворимых производных или умеренно растворимых солей.

Идентификация GW5638 и GW7604 в качестве агентов, отклоняющихся по своей активности от классических агонистов, указывает на то, что соединения, которые "активируют" ER (т.е. соединения, которые обусловливают высвобождение ER от генов белков теплового шока) и которые также не обусловливают деградации ER, могут быть использованы при лечении остеопороза. Установление отсутствия разделения остеопоротической и кардиопротективной активностей GW5638 и GW7604 указывает на то, что любое соединение, которое связывается с ER и характеризуется любой из этих активностей (остеопоротической или кардиопротективной), одновременно обладает и другой ("парной" ей) активностью.

Некоторые аспекты настоящего изобретения более подробно будут описаны в нижеследующих примерах, которые не являются в чем-либо ограничивающими настоящее изобретение.

ПРИМЕРЫ Нижеследующие подробности проведенных экспериментов приведены в конкретных примерах.

Биохимические препараты ДНК и модифицирующие ферменты были получены от фирм Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN), New Englands Biolabs (Beverly, MA) или Promega (Madison, WI). Основные лабораторные реагенты и экстрадиол-17 были закуплены в Sigma (St. Louis, МО). Препарат ICI182780 был безвозмездно предоставлен фирмой Zeneca Pharm. (Macclesfield, Великобритания). Ралоксифен был подарен фирмой Pfizer Pharm. (Groton, CT). 4-ОН-тамоксифен предоставлен фирмой Ligand Pharm. (San Diego, СА). Соединения GW5638 и GW76Q4 были получены в соответствии с ранее описанным (Wilson et al., 1994, J. Med. Chem., 37, 1550-1552). Антитело Н222 получено от Abbott Laboratories.

Культуры клеток и тесты с одновременной трансфекцией Клетки HepG2 поддерживались в модифицированной культуральной среде Игла (MEM) (Life Technologies, Grand Island, NY) с добавлением 10%-ной плодной телячьей сыворотки (Life Technologies). Клетки высевали в 24-луночные планшеты (покрытые желатином) за 24 ч до трансфекции. ДНК вносили в клетки с помощью липофектиновой технологии (Life Technologies). Вкратце, трансфекция была проведена в трех повторностях с использованием 3 мкг общего количества ДНК. Для стандартной трансфекции 500 нг pCMV-Gal (нормализующий вектор с -галактозидазным геном), 1500 нг репортерного вектора (вариатив) и 1000 нг рецепторного вектора pRST7-hER (Dana et al. , 1994, Mol. Endocrinol, 8, 1193-1207) использовали в каждой повторности. Инкубацию клеток с липофектином предваряли 3-часовым периодом, в течение которого культуральную среду удаляли, клетки промывали фосфатно-солевым буфером и затем индуцировали подходящим гормоном, разведенным в свободной от фенолового красного среде, содержащей 10% обработанного угольной пылью CS (Cyclone Inc.). Инкубацию с гормоном продолжали в течение 48 ч, после чего клетки лизировали и тестировали на люциферазную и (3-галактозидазную активность в соответствии с ранее описанным (Norris et al., 1995, J. Biol. Chem., 270, 22777-22782).

Анализ утеротрофной активности неполовозрелых крыс 21-дневные самки крыс линии Sprague-Dawley (весом 30-35 г) были получены из Harlan или Taconic Laboratories. Животных случайным образом распределяли по 5 особей в экспериментальные группы, и для каждой такой группы определяли показатель средней массы тела. Вес определяли ежедневно в течение проводимого эксперимента. GW5638 и тамоксифен готовили как раствор в 100%-ном этиловом спирте в виде базового 10-кратного раствора и хранили на холоде (-70^oС) до дня непосредственного использования. В день введения препарат разводили в 0,5%-ной метилцеллюлозе, вязкость которой при 2% составила 400 сП при 25^oС (т.е. 0,4 нс/м²) Sigma, St. Louis, МО). Пероральная дозировка с помощью пищевого зонда рассчитывалась, исходя из общего объема 10 мл/кг веса тела. Эстрадиол (Sigma, St. Louis, МО) готовили в кунжутовом масле, размешивали с помощью стеклянного гомогенизатора (в растворенном виде, либо в суспензии), разделяли на аликвоты и замораживали при -70^oС до применения. Дозировки для подкожного введения рассчитывали, исходя из общего количества 2 мл/кг веса тела. Скармливание (GW5638) или инъецирование (эстрадиол) животных осуществляли на протяжении 3 дней. На 4-й день животных умерщвляли путем углекислотной асфиксии, измеряли массу тела, выделяли матку, подсушивали ее промоканием и взвешивали. Данные представляли как соотношение веса матки и веса тела.

Анализ степени минерализации костей Подготовка животных. Крыс линии Sprague-Dawley в возрасте 90 дней обездвиживали с помощью изофторана (4% - индукция анестезии, 2% - ее поддержание), подвергали овариэктомии (OVX) или оперировали симулятивно (выполняли одинаковые манипуляции за исключением удаления яичников) с последующим распределением случайным образом по группам (n=7), а затем проводили обработку с 1-го по 28-й день после операции путем перорального введения только наполнителя, эстрадиола или GW5638 в 0,5%-ной метилцеллюлозе. Животных умерщвляли путем углекислотной асфиксии, определяли вес тела, удаляли и взвешивали матку. Матку, влагалище и ткань молочной железы фиксировали в забуференном (рН 7) 10%-ном формалине. Пробы для гистологического анализа брали из средней части каждого из рогов матки. Тканевые образцы заливали в парафин, окрашивали гематоксилином и эозином и анализировали под микроскопом. Выделяли поясничные позвонки, а также левую и правую большеберцовые кости. Определяли общий уровень холестерина в крови (Roche Вiomed. Laboratories).

Двухуровневая рентгеновская абсорбциометрия (DEXA). Для анализа методом DEXA использовали денситометр костей Hologic QDR-2000, оснащенный высокоинформативным программным пакетом. По умолчанию длина полосы сканирования, ее ширина, интервал и разрешение были установлены на величинах 2, 0,75, 0,01 и 0,005 дюймов соответственно. Денситометр калибровали ежедневно с использованием гидроксиапатитовой позвонковой платформы. Выделенные большеберцовые кости помещали в слой воды в 1 см так, чтобы большеберцовая и малоберцовая кости располагались в нем горизонтально. Для прижизненного тестирования крыс обездвиживали с помощью изофторана и помещали в положении "на спине" так, чтобы позвоночник оказывался параллельным длинной оси столика денситометра. Головку сканера закрепляли в положении, параллельном длинной оси столика, и проводили сканирование большеберцовой кости до места ее соединения с бедренной костью. Представляющий интерес участок большеберцовой кости анализировали с подключением программы субсегментного тестирования, фокусируя сканер на участке шириной 2 мм в 3 ми дистальнее участка нарастания.

Периферическая количественная компьютерная томография (PQCT). Компьютерную томографию проводили на установке PQCT (ХСТ-960А, Norland). Сегменты по четыре-пять миллиметров сканировали при размере воксела (объемный элемент изображения), равном Е (0,148 мм), и при шаге 0,5 мм. Сегмент размером 3-5 мм, дистальный по отношении к участку нарастания, был проанализирован с использованием режима "contmode, 2/peelmode, 5/cortmode". Были получены данные замеров по степени общей, трабекулярной и кортикальной минерализации костей. Вырезанные большеберцовые кости помещали в слой воды в 1 см таким образом, чтобы большеберцовая и малоберцовая кости располагались горизонтально, что обеспечивало гарантию вертикального сканирования костей. Крыс обездвиживали изофтораном и головку сканера располагали таким образом, чтобы изображения мест сочленения большеберцовой и бедренной костей, а также большеберцовой и малоберцовой костей могли быть точно визуализованы и использованы в качестве маркеров при проведении компьютерной томографии.

Пример 1 Идентификация новых модуляторов ER Была разработана серия тестов in vitro, с помощью которых модуляторы ER были классифицированы в четыре кинетически дифференцированные группы (Tzukerman et al. , 1994, Mol. Endocrinol, 8, 21-30). Конкретно был разработан тест с печеночными (гепатокарциномными) клетками HepG2, в котором способность соединения регулировать транскрипционную активность промотора (С3) гена 3-го компонента комплемента, связывающегося с эстрогеном, оценивали в присутствие либо ER дикого типа (ERwt), либо мутантного рецептора (ER-TAF1), в котором функции домена AF-2 были искусственно нарушены. С использованием этих тестов явилось возможным сформировать "фингерпринты" известных модуляторов ER (McDonnell et al., 1995, Mol. Endocrino1, 9, 659-669). Хотя данные тесты не воспроизводят с полной точностью нативную среду, характерную для ER in vivo, анализ соединений в данных тестах является вполне достаточным для разделения их по группам, каждая из которых проявляет уникальный набор активностей in vivo.

Была синтезирована серия трифенилэтиленовых производных лигандов ER (Willson et а1., 1994, J. Med. Chem., 37, 1550-1552). Предварительный анализ этих соединений in vivo показал, что относительные активности этих соединений в костной ткани и в матке не являются идентичными, что, по-видимому, отражает возможные кинетические различия (Willson et al., 1994, J. Med. Chem. , 37, 1550-1552). Затем слепой анализ этих соединений был проведен в отношении рецептора дикого типа в клетках HepG2 по промотору С3, в котором было установлено, что все соединения (за исключением двух из них) по кинетическим параметрам не отличались от тамоксифена. Однако еще два соединения - GW5638 и GW7604 - продемонстрировали в существенной степени отличающиеся параметры в данной системе по сравнению с другими лигандами ER, а это явилось обоснованием для проведения дальнейших анализов. Интересно, что эти соединения по своей структуре идентичны друг другу, за исключением того, что GW7604 является 4-гидроксилированным вариантом GW5638 (табл.1). С использованием теста in vitro на конкурентное с изотопно помеченным лигандом связывание для обоих этих соединений было показано проявление высокого уровня аффинности по взаимодействий с ER. Конкретно GW5638 и GW7604 характеризовались значениями Ki 50,4 нМ (5,4) и 15,5 нм (1,4) соответственно. В тех же самых условиях эстрадиол-17, как было показано, характеризуется величиной Ki на уровне 6,3 нМ (0,4). Хотя метаболизм GW5638 не был изучен, вероятным является то, что он конвертируется в характеризующееся большей аффинностью соединение GW7604 in vivo согласно тому же механизму, по какому тамоксифен конвертируется в метаболит 4-ОН-тамоксифен, характеризующийся большей аффинностью (Jordan et al., 1977, J. Endocrinol, 75, 305-316). Сравнение агонистической активности этих соединений по отношению к представителям каждой из четырех идентифицированных групп ЕR-лигандов показано на фиг.1А. В данном тесте т