Способ применения zot или зонулина для ингибирования антиген-специфической пролиферации лимфоцитов

Способ применения zot или зонулина для ингибирования антиген-специфической пролиферации лимфоцитов

Реферат

 

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и касается ингибиции пролиферации лимфоцитов. Для этого используют Zot-токсин зоны плотных контактов, вырабатываемый V. cholerae, или зонулин - препарат белков млекопитающих, которые иммунологически или функционально близки Zot. Эффект ингибиции проявляется как в культуре клеток, обработанных антигеном, так и, предположительно, в условиях организма млекопитающего. Способ обеспечивает значительную ингибицию сенсибилизированных лимфоцитов за счет блокирования антигена. 4 с. и 12 з.п. ф-лы, 13 ил.

Изобретение относится к антиген-специфическим супрессирующим механизмам иммунного ответа, использующим Zot или зонулин. Конкретно, данное изобретение охватывает способ ингибирования опосредуемой антиген-представляющей клеткой антиген-специфической пролиферации лимфоцитов в зависимости от дозы введением эффективного количества Zot или зонулина.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ I. 3оны плотных контактов и актиновый цитоскелет Зоны плотных контактов (далее в данном описании "tj") или zonula occludens (далее в данном описании "ZO") являются одним из критериев абсорбирующих и секреторных эпителиальных тканей (Madara, J. Clin. Invest., 83:1089-1094 (1989) и Madara Textbook of Secretory Diarrhea Eds. Lebenthal et al., Chapter 11, pages 125-138 (1990). В качестве барьеров между апикальным и базолатеральным отделениями они селективно регулируют пассивную диффузию ионов и растворимых в воде веществ при трансклеточном транспорте (Gumbiner, Am. J. Physiol. , 253 (Cell Physiol. 22):C749-C758 (1987)). Этот барьер сохраняет любой градиент, вызванный активностью направлений, связанных с трансклеточным путем передачи (Diamond, Physiologist, 20:10-18 (1977)).

Существует множество свидетельств того, что ZO, рассматриваемые как статические структуры, в действительности являются динамическими и легко приспосабливаются ко множеству эволюционных (Magnuson et al., Dev. Biol., 67: 214-224 (1978); Revel et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 40: 443-455 (1976) и Schneeberger et al., J. Cell Sci., 32:307-324 (1978)), физиологических (Gilula et al., Dev. Biol., 50:142-168 (1976); Madara et al. , J. Membr. Biol., 100:149-164 (1987); Mazariegos et al., J. Cell Biol., 98: 1865-1877 (1984) и Sardet et al., J. Cell Biol., 80:96-117 (1979)), и патологических (Milks et al., J. Cell Biol., 103:2729-2738 (1986); Nash et al. , Lab. Invest. , 59: 531-537 (1988) и Shasby et al., Am. J. Physiol., 255 (Cell Phvsiol. 24): C731-C788 (1988)) условий. Регуляторные механизмы, которые лежат в основе этой адаптации, до сих пор еще не совсем понятны. Однако ясно, что в присутствии Са⁺⁺, скопление ZO есть результат клеточных взаимодействий, которые инициируют сложный каскад биохимических событий, приводящих, в конечном счете, к образованию и модуляции организованной сети ZO-элементов, структура которой была охарактеризована только частично (Diamond, Physiologist, 20:10-18 (1977)). Определялись возможные окклюдирующие нити трансмембранных белков (Furuse et al., J. Membr. Biol., 87:141-150 (1985)).

Было идентифицировано шесть белков в цитоплазматической субмембранной бляшке, определяющей контакты мембран, но их функцию еще нужно установить (Diamond, см. выше). ZO-1 и ZO-2 существуют в виде гетеродимера (Gumbiner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:3460-3464 (1991)) в устойчивом к детергенту комплексе с неохарактеризованным белком 130 kD (ZO-3). Большинство исследований с помощью иммуноэлектронной микроскопии локализовали ZO-1 точно под мембранными контактами (Stevenson et al., Molec. Cell Biochem., 83: 129-145 (1988)). Два других белка, цингулин (Citi et al., Nature (London), 333: 272-275 (1988)) и антиген 7Н6 (Zhong et al., J. Cell Biol., 120:477-483 (1993)) локализованы дальше от мембраны и еще не клонировались. Rab 13, GTR-связывающий белок малого размера также был недавно локализован в области контактов (Zahraoui et al. , J. Cell Biol., 124:101-115 (1994)). Известны другие GTR-связывающие белки малого размера, регулирующие кортикальный цитоскелет, например, rho регулирует прикрепление актина к мембране при фокальных контактах (Ridley et al., Cell, 70:389-399 (1992)), а rас регулирует индуцированные фактором роста активные перемещения в мембране клетки (Ridley et al., Cell, 70:401-410 (1992)). По аналогии с известными функциями белков бляшек в лучше охарактеризованных контактах клеток, фокальных контактах (Guan et al., Nature, 358:690-692 (1992)) и плотных соединениях (при прилипании) (Tsukita et al., J. Cell Biol., 123:1049-1053 (1993)), была высказана гипотеза, что белки бляшек, ассоциированных с tj (tj-ассоциированных бляшек), участвуют в передаче сигналов через клеточную мембрану в обоих направлениях и в регуляции связей с кортикальным актиновым цитоскелетом.

Для того чтобы выдержать различные физиологические испытания, которым подвергается эпителий, ZO должны быть способны на быстрые и координированные реакции, которые требуют наличия комплексной регуляторной системы. Точная характеристика механизмов сборки и регуляции ZO в настоящее время является целью активного исследования.

Сейчас имеется масса свидетельств того, что структурные и функциональные связи tj существуют между актиновым цитоскелетом и tj-комплексом и всасывающими клетками (Gumbiner et al., см. выше; Madara et al., см. выше и Drenchahn et al. , J. Cell Biol., 107:1037-1048 (1988)). Актиновый цитоскелет состоит из сложной сети микрофиламентов, точная геометрия которой регулируется большим числом актин-связующих белков. Примером того, как состояние фосфорилирования актин-связующего белка может регулировать связывание цитоскелета с клеточной плазматической мембраной, является миристоилированный богатый аланином субстрат С-киназы (далее в настоящем описании "MARCKS"). MARCKS представляет собой субстрат специфичной протеинкиназы С (далее в настоящем описании "РКС"), который ассоциирован с цитоплазматической поверхностью плазматической мембраны (Aderem, Elsevier Sci. Pub. (UK), pages 438-443 (1992)). В своей нефосфорилированной форме MARCKS образует поперечные сшивки с актином мембраны. Т.е., по-видимому, актиновая сеть, ассоциированная с мембраной с помощью MARCKS, является относительно жесткой (Hartwig et al. , Nature, 356:618-622 (1992)). Активированная РКС фосфорилирует MARCKS, который высвобождается из мембраны (Rosen et al., J. Exp. Med. , 172: 1211-1215 (1990) и Thelen et al., Nature, 351:320-322 (1991)). Актин, связанный с MARCKS, по-видимому, пространственно отделен от мембраны и более пластичен. Когда MARCKS дефосфорилируется, он возвращается в мембрану, где снова образует поперечные сшивки с актином (Hartwig et al., см. выше и Thelen et al., см. выше). Эти данные говорят о том, что F-актиновая сеть может быть перестроена в процессе РКС-зависимого фосфорилирования, в котором участвуют актин-связывающие белки (MARCKS является одним из них).

II. Токсины зоны плотных контактов (Zonula Occludens) ("Zot") и зонулин Большинство возможных вакцин Vibrio cholerae, созданных делетированием гена ctxA, кодирующего холерный энтеротоксин (СТ), способны вызывать мощный гуморальный иммунный ответ, но у более половины вакцинированных наблюдается слабая диарея (Levine et al., Infect. Immun., 56(1):161-167 (1988)). Учитывая важность того, что диарея возникает в отсутствие СТ, было высказано предположение, что V. cholerae продуцирует другие энтеротоксигенные факторы, которые все еще присутствуют в штаммах делетированной сtxA-последовательности (Levine et al., см. выше). В результате был обнаружен второй токсин, токсин зоны плотных контактов (далее в настоящем описании "Zot"), вырабатываемый V. cholerae, который "вносит вклад" в остаточную диарею (Fasano et al. , Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 8:5242-5246 (1991)). Ген zot локализован как непосредственно прилегающий к генам ctx. Высокий процент совпадений гена zot с генами ctx в штаммах V. cholerae (Johnson et al., J. Clin. Microb., 31/3: 732-733 (1993) и Karasawa et al., FEBS Microbiology Letters, 106:143-146 (1993)) говорит о синергистической роли zot в обезвоживающей диарее, типичной для холеры. Недавно ген zot также был идентифицирован в других возбудителях кишечных заболеваний (Tschape, 2nd Asian-Pacific Symposium on Typhoid fever and other Salmonellosis, 47(Abstr.) (1994)).

Ранее при испытании на слизистой оболочке подвздошной кишки кролика было найдено, что Zot повышает проницаемость кишечника за счет модуляции структуры межклеточных зон плотных контактов (Fasano et al., см. выше). Было обнаружено, что вследствие модификации перицеллюлярного пути интестинальная слизистая оболочка становится более проницаемой. Также было найдено, что Zot не влияет на одновременный активный транспорт Na⁺-глюкозы, не цитотоксичен и не может полностью уничтожить трансэпителиальную устойчивость (Fasano et al. , см. выше).

Позднее было обнаружено, что Zot способен обратимо открывать зоны плотных контактов в интестиальной слизистой оболочке и, следовательно, Zot при одновременном введении с терапевтическим агентом может осуществлять интестиальную доставку терапевтического агента, если применяется в составе пероральной лечебной дозы для интестиальной доставки лекарственного вещества (WO 96/37196, Патенты США 5827534 и 5665389). Также было найдено, что Zot способен обратимо открывать зоны плотных контактов в слизистой оболочке носа и, следовательно, Zot при совместном введении с терапевтическим агентом может повышать всасывание терапевтического агента через нос (WO 98/30211 и Патент США 5908825).

В Патентах США 5864014 и 5912323 рецепторы Zot из СаСо2-клеток, тканей сердца, кишечника и мозга были идентифицированы и выделены. Рецепторы Zot представляют собой первую стадию перицеллюлярного (околоклеточного) транспорта, участвующего в регуляции эпителиальной интестинальной и назальной проницаемости.

В Патенте США 5945510 были идентифицированы и очищены белки млекопитающих, которые иммунологически и функционально близки Zot и которые функционируют как физиологический модулятор зоны плотных контактов у млекопитающих. Эти белки млекопитающих, названные "зонулин", применимы для повышения всасывания терапевтических агентов при прохождении через зоны плотных контактов интестиальной и назальной слизистой оболочки, а также через зоны плотных контактов гематоэнцефалического барьера. Эти белки дополнительно характеризуются способностью связываться с рецепторами Zot.

В находящейся на рассмотрении патентной Заявке США 09/127815, поданной 3 августа 1998 г., озаглавленной "Пептидные антагонисты зонулина и способы их использования", были идентифицированы пептидные антагонисты зонулина. Указанные пептидные антагонисты связываются с рецептором Zot, однако не функционируют таким образом, чтобы модулировать открытие зон плотных контактов у млекопитающих. Пептидные антагонисты конкурентно ингибируют связывание Zot и зонулина с рецептором Zot, подавляя тем самым способность Zot и зонулина физиологически модулировать открытие зон плотных контактов млекопитающих.

III. Антиген-представляюшие (презентирующие) клетки и иммунные реакции Подробно иммунные реакции и иммуномодуляция обсуждаются в главе 10 "Recent Advances in Immunology", Sztein et al., New Generation of Vaccines, pages 99-125.

Один из первичных механизмов защиты от инфицирующих агентов включает специфический или приобретенный (искусственный) иммунитет. В противоположность врожденному иммунитету эффекторные механизмы приобретенного иммунитета, которые включают, среди прочих, антитела, цитотоксические лимфоциты (далее в настоящем описании "CTL"), вырабатываемые Т-лимфоцитами цитокины (такие как IFN-g, IL-4 и т.д.), инициируются после экспозиции с антигенами или инфицирующими агентами, и интенсивность (т.е. иммунного ответа) возрастает при последующей экспозиции со специфическими антигенами. Эта способность "вспоминать" предшествующие экспозиции с антигенами и быстро отвечать более интенсивными иммунологическими эффекторными реакциями (иммунологическая память) составляет основу иммунопрофилактической иммунизации (вакцинации) против возбудителей инфекции. Основные виды клеток, участвующих в специфическом иммунном ответе, представляют собой Т- и В-лимфоциты.

В-лимфоциты или В-клетки образуются в костном мозге и являются предшественниками секретирующих антитела клеток (плазматических клеток). В-клетки распознают антигены (белки, углеводы или простые химические группы) с помощью иммуноглобулиновых рецепторов на клеточной мембране (Fearon et al., Science, 272: 50-53 (1996); Zeigler-Heitbroak et al., Immunol. Today, 14: 121-152 (1993) и Banchereau et al., Adv. Immunol., 52:125-262 (1992)). После стимулирования антигеном они клонально размножаются и переключают экспрессию антительного изотипа (например, IgM на IgG, IgE или IgA) под влиянием цитокинов, вырабатываемых Т-клетками, макрофагами и другими видами клеток. Генерируются соматически мутированные высокоаффинные В-клетки и отбираются антигеном в и вокруг зародышевых центров, которые образуются в лимфатических узлах, солезенке, пейеровых бляшках и более беспорядочных лимфатических агрегациях периферической лимфоидной системы (Banchereau et al., (1996), см. выше; Сlark et al., Ann. Rev. Immunol., 9:97-127 (1991) и MacLennan et al., Immunol. Today, 14:29-34 (1993)). Они являются основой В-клеточной памяти.

Т-лимфоциты или Т-клетки, в отличие от В-клеток, распознают пептиды из белковых антигенов, которые присутствуют на поверхности антиген-представляющих клеток (далее в настоящем описании "АРС") в виде конъюгатов с молекулами класса I и класса II главного комплекса гистосовместимости (МНС). Клоны Т-лимфоцитов, экспрессирующие Т-клеточные рецепторы (далее в настоящем описании "TCR") соответствующей аффинности, "запускаются" антигеном для пролиферации и эволюции в эффекторные клетки (Fearon, 91996), см. выше; Sprent et al. , Cell, 76:315-322 (1994) и Hendrick et al., Germain, Fundamental Immunology, 3rd ed., pages 629-676 (1993)). После элиминирования инфицирующего агента антиген-специфические клоны оставляют в качестве Т-клеток памяти те клетки, которые, после соответствующей экспозиции с антигеном ("облучения"), дают более мощный, более быстрый и иногда качественно отличный специфический иммунный ответ.

Существует две основные популяции Т-клеток, одна из которых экспрессирует молекулы CD4, а вторая - молекулы CD8. CD4 и CD8 являются гликопротеинами Т-клеточной поверхности, которые служат в качестве важных вспомогательных веществ (корецепторы) во время презентации антигена, связываясь с МНС-молекулами класса II и класса I, соответственно (Hendrick et al., см. выше (1993)). То есть, молекулы CD4 и CD8 играют значительную роль в стабилизации взаимодействий Т-клеток и АРС, инициированных специфическим связыванием TCR-комплекса с антигенными пептидами, ассоциированными с МНС-молекулами. Соответственно, молекулы CD4 и CD8, первоначально используемые в качестве маркеров для идентификации популяций Т-клеток с различными функциональными характеристиками, играют главную роль при класс II МНС-рестриктированной и класс I MHC-рестриктированной активации Т-клеток. Клетки CD4+ (Т-хелперная, или Th) в основном участвуют в воспалительных реакциях и способствуют продуцированию антител В-клетками, тогда как CD8+ (Т-цитотоксическая, или Те) составляют большинство CTL, первоначально участвующих в класс I МНС-рестриктированном киллинге клеток-мишеней, инфицированных патогенными организмами, включая бактерии, вирусы и паразиты (Sztein et al., J. Immunol. , 155: 3987-3993 (1995); Kaufman, Ann. Rev. Immunol., 11:129-163 (1993) и Immunol. Today, 9:168-174 (1988); Townsend et al., Cell, 44:959-968 (1986); Malik et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:3300-3304 (1991); Sedegah et al. , J. Immunol., 149:966-971 (1992) и Shearer et al. Immunol. Today, 17: 21-24 (1996)).

Для успешной антиген-специфической активации Т-клеток, приводящей к экспансии и дифференцировке Т-клеток (или пролиферации лимфоцитов), нужен первый сигнал, обеспечиваемый взаимодействием TCR на поверхности Т-клеток с МНС-антигенными комплексами на АРС, и второй, комплементарный, сигнал, предоставляемый растворимыми факторами, такими как IL-2, или связыванием CD28 (костимулятора) с представителями семейства В7 (например, CD80 (В7-1) или CD86 (В7-2)) на АРС (Lenschow, Ann. Rev. Immunol., 14:233-258 (1996) и Linsley et al. , Ann. Rev. Immunol., 11:191-212 (1993)). Изучение CD28/B7 костимуляторного пути и других "липких" молекул, которые помогают стабилизировать взаимодействия Т-се11-АРС (и которые, по-видимому, играют решающую роль в холинге лимфоцитов), является одной из ключевых областей, в которой в последние годы сделаны значительные успехи.

Презентация антигенов Т-клетками участвует в ряде внутриклеточных событий, включая образование антигенных пептидных фрагментов, связывание этих пептидов с МНС-молекулами с образованием устойчивых комплексов пептид-МНС и транспорт этих комплексов к поверхности клетки, где их могут распознать TCR на поверхности Т-клеток. Накоплены свидетельства существования двух основных путей процессирования и презентации антигенов ("классические пути"). Один из этих путей, "цитозольный путь", преимущественно используется для презентации пептидов, продуцируемых эндогенно в АРС, таких как вирусные белки, опухолевые антигены и аутологичные пептиды, ассоциированные с МНС-молекулами класса I (Hendrick et al., см. выше и Germain, см. выше (1993)). Презентация большого числа аутологичных пептидов, закомплексованных с класс I МНС-молекулами, является результатом неспособности АРС дифференцировать аутологичные и неаутологичные. В нормальных условиях большинство Т-клеток, отобранных для распознавания аутологичных пептидов, элиминирует во время дифференцировки Т-клеток или активно ингибируются (негативно регулируются) и, следовательно, не могут активироваться комплексами аутологичный пептид- класса I MHC. Второй "классический путь" процессирования и презентации антигена, "эндосомный путь", который преимущественно используется для презентации растворимых (экзогенных) чужеродных антигенов, связанных с МНС-молекулами класса II, включает захват антигена с помощью АРС или за счет связывания со специфическим рецептором или улавливания в жидкой фазе за счет макропиноцитоза (Lanzavecchia, Curr. Opin. Immunol., 8:348-354 (1996)). Стимуляция Т-клеток с помощью TCR была показана на 200-600 комплексах пептид/МНС для случая нуклеопротеинов гриппа (Falk et al. , Semin. Immunol., 5:81-94 (1993)). В большинстве иммунных реакций антигенные эпитопы, связанные с молекулами МНС класса I, стимулируют активацию СD8+СТL-иммунных ответов, тогда как антигенные фрагменты (эпитопы) из растворимых белков, закомплексованных с МНС-молекулами класса II, распознаются CD4+Th-клетками. Эти открытия представляют собой один из важнейших за последние несколько лет вкладов в механизмы, участвующие на ранних стадиях иммунной активации, и являются основополагающими для создания успешных вакцин.

Как указано выше, существуют два "классических" пути процессирования и презентации антигена. Путь МНС класса I обычно наиболее применим для процессирования клеточных белков, присутствующих в большинстве, если не во всех участках клетки, включая цитозоль, ядро и митохондрии (Falk et al., см. выше (1993)), для распознавания с помощью CD8+CTL. Путь МНС класса II преимущественно использует для процессирования и презентации экзогенных антигенов, таких как белки, продуцируемые внеклеточными бактериями и другими инфекционными (болезнетворными) микроорганизмами, которые могут быть представлены СD4+Тh-клетками. Молекулы МНС класса I и класса II связывают пептидные антигены за счет использования поверхностных "рецепторов" или "связывающих карманов". Однако способ процессирования и получения антигена в этих двух случаях резко отличается. Антигены класса I процессируют и получают "цитозольным путем". Конкретно, пептиды, синтезированные внутриклеточно, распадаются на малые фрагменты белков, которые затем проходят через мембрану эндоплазматического ретикулума (ER). Внутри ER антигенные фрагменты связываются с МНС-молекулами класса I, образуя комплекс, который затем переносится в аппарат Гольджи и, наконец, к клеточной поверхности, где они распознаются TCR, передающими сигнал антиген-специфической CTL-экспансии и дифференцировки, первой стадии иммунного ответа. Антигены класса II, с другой стороны процессируют и получаются "эндосомным путем". Конкретно, нативные антигены захватываются циркулирующими АРС, при этом антиген связывается со специфическим или неспецифическим рецептором. Затем антиген интернализуется АРС по механизму опосредуемого рецепторами эндоцитоза или пиноцитоза. Интернализованный антиген затем локализуется в эндосоме, мембрано-связанной везикуле, участвующей во внутриклеточном транспорте и распаде антигена. Фрагменты расщепленного пептида затем связываются с молекулами МНС класса II, образуя комплекс, который переносится через аппарат Гольджи, эндосомное отделение и к поверхности клетки, чтобы их могли распознать TCR, опять же передающие сигнал антиген-специфической Th-клеточной экспансии и дифференцировки.

АРС играют жизненно важную роль в выработке иммунного ответа. Для презентации процессированных антигенов CTL класс I-ограниченным образом, АРС должны экспрессировать МНС-молекулы класса I и иметь (возможность) способность экспрессировать на клеточной поверхности эндогенно продуцированные белки, закомплексованные с МНС-молекулами класса I. Почти все клетки, эндогенно продуцирующие вирусные, паразитные или бактериальные белки или опухолевые антигены, которые получают доступ к цитозоли, могут работать как АРС. Для презентации процессированных антигенов Th-клеткам класс II-ограниченным образом, АРС должны уметь распознавать антиген и связываться с ним с помощью (через посредство) специфических и неспецифических рецепторов конкретного антигена. Клетки, которые наиболее эфективно презентируют (представляют) антигены Th-лимфоцитам, так называемые профессиональные АРС, включают дендритные клетки (DC), макрофаги, В-лимфоциты, клетки Лангерганса и, в некоторых случаях (примерах), эндотелиальные клетки человека (Lanzavecchia, см. выше (1996)).

Полагают, что DC, которые образуются в костном мозге, являются наиболее эффективными АРС для презентации растворимых антигенов. DC захватывают антигены на периферии и мигрируют в селезенку или лимфатические узлы, где они эффективно активируют Тh-клетки, особенно "необученные" Т-клетки (Lanzavecchia, см. выше (1996) и Peters et al., Immunol. Today, 17:273-278 (1996)). Несколько уникальных особенностей позволяют DC функционировать так эффективно в качестве антиген-презентирующей клетки. А именно: они способны интернализовать растворимые антигены по нескольким механизмам, включая конститутивный макропиноцитоз, интернализацию комплексов антиген-антитело путем CD32-рецепторного связывания и интернализацию маннозилированных или фукозилированных антигенов путем маннозо-рецепторного связывания. Это позволяет DC испытать (проверить) большие количества жидкости за короткое время, аккумулируя их в лизосомном отделении, содержащей МНС-молекулы класса II и протеазы. DC также конститутивно экспрессируют ряд костимуляторов и других адгезивов, которые позитивно регулируются (активируются) провоспалительными цитокинами, такими как IL-1a, IL-1b и TNF-a, с помощью этого повышается их способность функционировать как АРС для класса II МНС-ограниченных Th-иммунных реакций.

Макрофаги и другие мононуклеарные фагоциты являются, возможно, наиболее эффективными АРС для антигенов из наиболее болезнетворных микроорганизмов, иных нежели вирусы, вследствие их способности фагоцитировать большие частицы, такие как бактерии и паразиты. В типичных условиях фаготированные микрорганизмы затем уничтожаются в фаголизосомах и расщепляются, приводя к образованию антигенных фрагментов, способных связываться с класс II МНС-молекулами для презентации Тh-клеток. Другие важные механизмы, с помощью которых макрофаги могут служить в качестве эффективных АРС, включают их способность интернализовать антигены путем связывания комплексов антиген-антитело с CD16-, CD32- и CD64-peцeптopaми. Макрофаги также интернализуют вирусные белки комплемента через рецепторы С3 и других Су-компонентов и путем стимуляции факторами роста, с помощью макропиноцитоза. Кроме того, макрофаги экспрессируют рецепторы маннозы и являются главным источником провоспалительных цитокинов, включая IL-1a, IL-1b, IL-6, IL-8, IL-12, TNF-a и TNF-b, которые вызывают мощную иммунорегуляторную активность при Т-клеточных иммунных реакциях (Sztein et al., см. выше (1997)).

В-лимфоциты являются очень эффективными АРС для растворимых антигенов для презентации Th-клеткам. Это в большой степени основано на их способности связывать и интернализовать специфичные растворимые антигены очень эффективно за счет комплекса В-клеточных рецепторов (BCR), состоящего из специфичного мембранного иммуноглобулина (mIg) и гетеродимера Iga (CD79a)-Igb (CD79b) (Falk et al., см. выше (1993)).

Клетки Лангерганса (LC), образованные из предшественников костного мозга, рассматриваются как единственные клетки в эпидермии с АРС-способностью. LC мигрируют из эпидермиса через лимфатические протоки в региональные лимфатические узлы, где они эволюционируют в DC. Интересно, что LC экспрессируют CD1, неклассическую МНС-молекулу, способную презентировать Т-клеткам, ограниченным образом, небелковые антигены, такие как микробные липидные и гликолипидные антигены.

Изобретение по данному описанию сфокусировано на антеген-специфических супрессирующих механизмах АРС-опосредуемых иммунных ответов. Изобретение порождено открытием рецептора макрофагальной поверхности, с которым Zot связывается специфическим и "насыщаемым" образом. Настоящее изобретение описывает способ применения Zot или зонулина в качестве антиген-специфических иммунорегуляторов и в качестве иммунотерапевтических средств. А именно, как Zot, так и зонулин ингибируют АРС-опосредуемую антиген-специфическую пролиферацию лимфоцитов в зависимости от дозы, не влияя на ответы, вызываемые митогеном. Эти супрессирующие механизмы иммунного ответа, по меньшей мере, частично, связаны с пониженным поглощением антигена.

Имеющиеся в настоящее время модуляторы иммунного ответа, такие как циклоспорин и стероидные соединения, оказывают общий эффект на антигенную и митогенную стимуляции иммунной системы (Reed et al., J. Immunol., 137:150-154 (1986)). Раскрываемое в данном описании изобретение имеет преимущество, делая возможной негативную регуляцию (супрессорный механизм) иммунных ответов на (конкретный) отдельный антиген, не вызывая негативных побочных эффектов, таких как повышенная чувствительность к инфекции и общая иммунная супрессия, типичные для иммуномодуляторов предыдущего уровня данной области техники.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ Целью данного изобретения является предоставить способ негативной регуляции иммунного ответа хозяина-животного на некоторые антигены, посредством этого облегчая иммунотерапию. Конкретно, предметом данного изобретения является ингибирование (подавление) способности антиген-презентирующих клеток (АРС) процессировать и презентировать антигены лимфоцитам, с помощью этого подавляя пролиферацию лимфоцитов и последующие реакции иммунной системы в ответ на определенные антигены.

Еще одной целью данного изобретения является обеспечение лечения животных, пораженных аутоиммунным или иммунопатологическим заболеванием или расстройством, таким как рассеянный склероз, ревматоидный артрит, инсулинозависимый сахарный диабет, глютеновая болезнь, синдром Шегрена, системный волчий эритематоз, аутоиммунный тироидит, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, гемолитическая анемия, базедова болезнь, аддисонова болезнь, аутоиммунный орхит, пернициозная анемия, васкулит, аутоиммунные коагулопатии, тяжелая миастения (myasthenia gravis), полиневрит, пузырчатка, ревмокардит, полимиозит, дерматомиозит и склеродермия, введением эффективного количества родственного Zot иммунорегулятора. В альтернативном варианте изобретения лечение животного, пораженного аутоиммунным (аутоаллергическим) и иммунопатологическим заболеванием или расстройством, может включать прием эффективного количества родственного Zot иммунорегулятора в сочетании со специфическим(-и) родственным (-и) антигеном(-ами).

Еще одной целью изобретения является создание способа терапии животного с отторжением, связанным с иммунными нарушениями после трансплантации ткани или органа, введением эффективного количества Zot-связанного иммунорегулятора. В альтернативном варианте изобретения лечение животного с вызванным иммунными нарушениями отторжением после трансплантации ткани или органа, может включать введение эффективного количества Zot-связанного иммунорегулятора в сочетании со специфическим(-и) трансплантационным(-и) антигеном (-ами).

Следующей целью данного изобретения является создание способа лечения животного, пораженного воспалительным или аллергическим заболеванием или состоянием, таким как астма, псориаз, экзематозный дерматит, саркома Капоши, рессеянный склероз, кишечное заболевание, нарушение пролиферации клеток гладких мышц, и воспалительным состоянием, связанным с микотическими, вирусными, паразитарными или бактериальными инфекциями, введением терапевтически эффективного количества Zot-связанного иммунорегулятора. В альтернативном варианте изобретения лечение животного, пораженного воспалительным или аллергическим заболеванием или расстройством, может включать введение эффективного количества Zot-связанного иммунорегулятора в сочетании со специфическим(-и) родственным(-и) воспалительному антигеном(-ами) или аллергеном(-ами).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР На фиг. 1 даны кривые насыщения Zot-FITC для лимфоцитов и макрофагов. Данные показывают, что Zot связывается предпочтительно с моноцитами/макрофагами человека.

Фиг. 2 иллюстрирует блокаду Zot-FITC-связывания немеченым Zot. Предварительное термостатирование РВМС с немеченым Zot понижает связывание Zot-FITC как с моноцитами/макрофагами, так и с Т-лимфоцитами, примерно на 33%, что говорит, что Zot-связывание с этими клетками опосредуется рецептором. Предварительное термостатирование (преинкубация) клеток с очищенным МВР не оказывает влияния на блокаду Zot-FITC-связывания, показывая, что блокада меченым Zot есть специфический феномен.

На фиг. 3 иллюстрировано влияние Zot на пролиферацию РВМС человека, индуцированную РНА и столбнячным токсином. Данные показывают, что Zot заметно подавляет стимуляцию столбнячным токсином пролиферацию в зависимости от дозы, не оказывая влияния на пролиферацию, стимулированную РНА.

На фиг. 4 показано действие антисыворотки к анти-Zot на Zot-индуцированную супрессию пролиферации РВМС человека, вызванной столбнячным токсином. Добавление анти-Zot "реверсирует" Zot-опосредуемую супрессию индуцированной столбнячным токсином пролиферацию более чем на 50%.

На фиг. 5A-5D проиллюстрировано действие Zot на поглощение FITC-декстрана нормальными CD14+HLA-DR+ макрофагами человека. На фиг. 5А изображено поглощение FITC-декстрана в средах при 0^oС (2,9%) и представлена температурная зависимость поглощения антигена. На фиг. 5В изображено поглощение FITC-декстрана в средах при 37^oС (46,0%) и представлен контроль за поглощением антигена. На фиг. 5С изображено поглощение FITC-декстрана в BSA при 37^oС (39,0%) и представлен негативный контроль поглощения антигена. На фиг. 5D изображено поглощение FIТС-декстрана в Zot при 37^oС (19,3%). Данные указывают, что Zot понижает поглощение антигена.

На фиг. 6 показано число FITC-Zot сайтов связывания/в клетке в макрофагах и лимфоцитах человека. РВМС термостатировали (инкубировали) при увеличивающихся концентрациях Zot-FITC и анализировали проточной цитометрией. Среднюю интенсивность флуоресценции каждой популяции переводили в число Zot-связывающих сайтов/в клетке с помощью стандартной кривой, построенной с использованием набора Quantum 26-MESF. Эти данные показывают, что связывание Zot является насыщаемым феноменом, причем насыщение достигается примерно, при 0,5 пМ, и что среднее число Zot-связывающих сайтов/в клетке, примерно, в 10 раз выше в макрофагах (~106000), чем в лимфоцитах (~9000).

На фиг. 7А-7С показана кинетика связывания Zot с макрофагами и лимфоцитами человека. Исследование кинетики связывания Zot с клетками человека проводили проточной цитометрией, используя конъюгаты Zot-FITC. РВМС, меченые анти-CDS-ECD и анти-СD-14-РЕ mAb, выдерживали при 37^oС во время эксперимента (12 мин), тогда как данные получали, используя устройство для сортировки жизнеспособных образцов (кинетический модуль), соединенный с проточным цитометром. Уровни фоновой FITC-флуоресценции регистрировали в течение 90-150 с (указанные стрелками) и регистрацию данных прекращали на 10-15 с для инъекции Zot-FITC (фиг. 7А и 7В). На фиг. 7С показана кинетика связывания aнти-CD-14-FITC с немечеными моноцитами/макрофагами человека. Данные представлены в виде изометрического изображения интенсивности Zot-FITC (ось у) во времени (ось х) относительно числа клеток (ось z) для клеток (пропускаемых), селектируемых по CD3 (лимфоциты) или CD14 (макрофаги). Результаты показывают, что связывание Zot с макрофагами (фиг. 7А) и лимфоцитами (фиг. 7В) человека происходит очень быстро, достигая равновесия в пределах 2 мин после добавления Zot-FITC.

На фиг. 8 изображено связывание FITC-Zot с Т- и В-лимфоцитами. РВМС термостатировали с Zot-FITC и mAb к молекулам, присутствующим в Т-(СВ3⁺) и B-(CD19⁺) лимфоцитах, и анализировали прточной цитометрией. Меченое изотопным FITC контрольное mAb (антитело) (mIg), соответствующее клеткам, пропускаемым (селектируемым) как рассеяние вперед по сравнению с боковым рассеянием лимфоцитов, также показано как индикатор неспецифического связывания. Результаты показывают, что Zot связывается как с Т-, так и с В-лимфоцитами.

На фиг. 9 показана неспособность антагонистов Zot блокировать связывание Zot-FITC. РВМС, окрашенные CD14-PE и CD3-ECD, отмывали и термостатировали в течение 15 мин при 4^oС в среде AIM-V, либо одной, либо со 100-кратным избытком FZI/0 (SEQ ID N0:7), FZI/1 (SEQ ID N0:8), BSA (негативный контроль) или 4-кратным избытком немеченого Zot (позитивный контроль). Затем клетки термостатировали с Zot-FITC и анализировали проточной цитометрией. Результаты выражены в % супрессии средней интенсивности флуоресценции клеток, термостатированных с Zot-FITC в присутствии антагонистов Zot, немеченого Zot или BSA, относительно средней интенсивности флуоресценции клеток, термостатированных только в средах (произвольно взятой за 100%). Результаты показывают, что добавление антагонистов Zot FZI/0 или FZI/1 незначительно блокирует связывание Zot-FITC с CD14⁺ отобранными (пропущенными) макрофагами. Напротив, преинкубация (предварительное термостатирование) с немеченым Zot блокировала связывание Zot-FITC на 24-43%.

На фиг.х 10А-10В проиллюстрирована супрессия экспрессии CD14 на моноцитах/макрофагах человека. РВМС термостатировали в течение 18 ч в отсутствие или в присутствии ТТ без или с очищенным Zot или BSA, окрашивали CD14-FITC и анализировали проточной цитометрией. Результаты приведены в виде единых цветных гистограмм на клетках, пропущенных в "области моноцитов", определяемой как рассеяние вперед по сравнению с боковым рассеянием макрофагов человека. Добавление Zot вызвало заметную супрессию экспрессии CD14 в отсутствие ТТ (фиг. 10А) или в присутствии ТТ (фиг. 10В).

На фиг. 11 показано действие Zot на жизнеспособность моноцитов/макрофагов и лимфоцитов. РВМС термостатировали в течение различного времени в отсутствие или в присутствии очищенного Zot или BSA. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью исключения пропидийиодида и проточной цитометрии. Результаты представлены как% жизнеспособных клеток, зарегистрированных в "области моноцитов" ("моноцитарной области") или в "области лимфоцитов" ("лимфоцитарной области"), определяемой как рассеяние вперед по сравнению с боковым рассеянием этих клеточных популяций. Результаты показывают, что добавление Zot влияет на жизнеспособность макрофага в относительно ранний период, тогда как действие на лимфоциты незаметно в течение, по меньшей мере, 4 дней в культуре.

На фиг. 12А-12С показана Zot-опосредованная индукция продуцирования цитокинов моноцитами/макрофагами человека. РВМС термостатировали от 6 ч до 4 дней в отсутствие или в присутствии очищенного Zot или BSA. Супернатанты собирали в указанные промежутки времени и измеряли уровни цитокинов с помощью хемилюминесцентного ELISA. Добавление Zot привело к продуцированию на высоком уровне TNF-a (фиг. 12А) и IL-10 (фиг. 12С) уже через 6 ч, пик уровней достигается через 24 ч. Наблюдалась также слабая индукция продуцирования IL-1b (фиг. 12В).

На фиг. 13А-13В проиллюстрирована Zot-опосредованная индукция продуцирования цитокинов лимфоцитами человека. РВМС термостатировали в течение 3 дней без или с ТТ в отсутствие или в присутствии очищенного Zot или BSA и измеряли уровни цитокинов с помощью хемилюминесцентного ELISA. Добавление Zot вызывало супрессию продуцирования IL-2, стимулируемую термостатированием с ТТ, тогда как в отсутствие ТТ Zot не индуцировал IL-2 на поддающемся измерению уровне (фиг. 13А). Напротив, добавление Zot последовательно индуцировало продуцирование IFN-g в отсутствие ТТ, на уровнях, аналогичных уровням, индуцируемым ТТ, и заметно увеличивал уровни IFN-g, индуцированные ТТ (фиг. 13В).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Предыдущие исследования были сосредоточены на способности Zot и зонулина физиологически модулировать открытие зон плотных контактов (zonula occludens) эпителия различных тканей млекопитающих; такая модуляция особенно применима для облегчения доставки лекарственных средств через эти мембраны. В ходе этого исследования рецепторы Zot и зонулина