Усовершенствованные вакцины

Усовершенствованные вакцины

Реферат

 

Изобретение относится к медицине и представляет вакцинные конъюгаты, иммуногенные полипептиды, кодирующие иммуногенные полипептиды молекулы нуклеиновых кислот, клетки-хозяева, содержащие кодирующие иммуногенные полипептиды молекулы нуклеиновых кислот, и методы получения вакцинных конъюгатов и иммуногенных полипептидов так же, как и кодирующих иммуногенные полипептиды молекул нуклеиновых кислот. Кроме того, изобретение представляет IgE-вакцину, которая вызывает ответ на "свой" IgE у млекопитающих. Изобретение обеспечивает уменьшение эффектов IgE антител у млекопитающего путем уменьшения общего и связанного с рецептором количества IgE антител у млекопитающего. 6 с. и 20 з.п.ф-лы, 7 ил.

Изобретение относится к методам и материалам, используемым в лечении различных заболеваний, таких как инфекции и IgE-зависимые заболевания. Более конкретно, изобретение относится к методам и материалам, которые могут быть использованы для вакцинации млекопитающего от "своих" антигенов и "чужих" антигенов. Например, описанные здесь методы и материалы могут быть использованы для уменьшения эффекттов IgE антител у млекопитающего.

Уровень техники Млекопитающие являются восприимчивыми ко многим заболеваниям и расстройствам, включающим бактериальные инфекции, вирусные инфекции и IgE-зависимые заболевания, такие как аллергии. В общем, инфекции характеризуются внедрением и размножением микроорганизмов (например, бактерий, грибков и вирусов) внутри тканей тела. Многие типы инфекций можно лечить и предупреждать с использованием вакцин. Например, вакцина против полиомиелита может предупреждать полиовирусные инфекции. Обычно вакциной является суспензия ослабленных и убитых микроорганизмов.

IgE-зависимые заболевания опосредуются классом иммуноглобулинов, обозначаемых как иммуноглобулин Е (IgE). В действительности, IgE антитела являются основной причиной реакций гиперчувствительности, обнаруживаемых у популяции человека, в отличие от их очень низких концентраций в плазме крови человека (10-400 нг/мл) в норме. Эффекты являются следствием взаимодействия IgE антител с высокоаффинным рецептором к IgE на стволовых клетках и базофильных лейкоцитах. Перекрестное сшивание IgE рецепторов на поверхности этих типов клеток, например, при связывании аллергена инициирует высвобождение некоторого числа физиологически активных субстанций, таких как гистамин, PAF (фактор активации тромбоцитов), гепарин, лейкотриены, простагландины, тромбоксаны и хемотаксические факторы к эозинофильным и нейтрофильным гранулоцитам. По-видимому, эти медиаторы являются причиной прямых симптомов IgE-зависимых аллергических реакций (гиперчувствительность типа I). Болезненные состояния, принадлежащие к этой группе, могут включать астму, аллергии на пух, пыльцевые аллергии, пищевые аллергии и экзему.

Высокоаффинный рецептор к IgE был охарактеризован. Показано, что этот рецептор присутствует на стволовых клетках, базофильных лейкоцитах, эозинофилах, моноцитах и клетках Лангерганса. В дополнение, рецептор является комплексом трех различных субъединиц (, и -цепей). -Цепь локализована главным образом внеклеточно и предполагается, что она взаимодействует с молекулой IgE. Предыдущие исследования эпсилон-цепи молекулы IgE навели на мысль, что участок из 76 аминокислот на границе между СН2 и СН3 доменами (СН используется применительно к константным доменам в тяжелых цепях) является важным для взаимодействия между молекулой IgE и ее высокоаффинным рецептором. В дополнение было показано, что соответствующий этому участку пептид ингибирует взаимодействие между нативным IgE и его высокоаффинным рецептором in vitro в молярной пропорции приблизительно 1:1 по сравнению с целым участком СН2-СН3-СН4 (Helm et al., Nature 331, 180-183 (1988)). Также было показано, что этот пептид ингибирует IgE-опосредованную flare реакцию при стимуляции аллергеном. В этом случае, тем не менее, концентрация была примерно в 10 раз больше концентрации, необходимой для проявления такого же ингибирующего эффекта с нативным IgE (Helm et al., Proc. Natl. Acad. Set. USA 86, 9465-9469 (1989)).

Сущность изобретения Изобретение относится к методам и материалам, используемым в лечении различных заболеваний, таких как инфекции и IgE-зависимые заболевания. Более конкретно, изобретение относится к методам и материалам, которые могут быть использованы для вакцинации млекопитающего от "своих" антигенов и "чужих" антигенов. Например, описанные здесь методы и материалы могут быть использованы для уменьшения эффектов IgE антител у млекопитающего путем уменьшения общего и связанного с рецептором количества IgE антител у млекопитающего. Такие методы и материалы могут быть использованы для лечения атопических аллергий у млекопитающих, таких как люди, собаки и свиньи.

Изобретение основано на открытии, что вакцинный конъюгат может быть сконструирован с содержанием по крайней мере двух полипептидов, причем каждый полипептид имеет по крайней мере два сходных аминокислотных участка, таким образом, что введение конъюгата млекопитающему может индуцировать иммунный ответ на по крайней мере часть одного из полипептидов. Такие иммунные ответы могут быть более сильными, чем ответы, индуцированные любыми полипептидами в неконъюгированной форме или любым конъюгатом полипептидов, не содержащих по крайней мере двух похожих аминокислотных участков. Поэтому описанные здесь вакцинные конъюгаты могут быть использованы для предоставления млекопитающим надежной защиты от широкого круга или "своих" антигенов (например, молекул IgE) или "чужих" антигенов (например, вирусных полипептидов).

Изобретение также основано на открытии, что вакцинный конъюгат может быть сконструирован с содержанием полипептида, обладающего такой цитокиновой активностью, что против другого полипептида внутри конъюгата индуцируется мощный иммунный ответ. Такие иммунные ответы могут быть более сильными, чем ответы, индуцированные конъюгатом, не содержащим обладающего цитокиновой активностью полипептида. Не будучи ограниченным каким-либо конкретным механизмом действия, конъюгат, содержащий обладающий цитокиновой активностью полипептид, так же как и иммуногенный полипептид, предположительно сосредотачивает цитокиновую активность в ограниченном участке, содержащем иммуногенный полипептид. Поэтому обладающий цитокиновой активностью полипептид может стимулировать клетки, участвующие в генерации специфического иммунного ответа на иммуногенный полипептид.

В дополнение, изобретение основывается на открытии, что полипептиды, содержащие часть "своих" IgE и часть "чужих" IgE, являются иммуногенными и вызывают ответ на "свои" IgE у млекопитающих. Такие иммуногенные полипептиды могут быть использованы в качестве вакцины для индукции ответа на "свои" IgE, который противодействует гиперчувствительности, индуцированной "своими" IgE антителами. Не будучи ограниченными каким-либо конкретным механизмом действия, описанные здесь иммуногенные полипептиды индуцируют образование "чужих" IgE антител, которые предположительно обладают специфичностью к части той молекулы IgE, которая взаимодействует с высокоаффинным IgE рецептором. После образования "чужие" IgE антитела могут взаимодействовать со "своими" IgE антителами таким образом, что "свои" IgE антитела становятся неспособными к связыванию с высокоаффинным IgE рецептором. Это ингибирование связывания с рецептором предположительно уменьшает гиперчувствительность, индуцированную "своими" IgE антителами. Поэтому степень IgE-индуцированных эффектов может быть уменьшена, если будет образовываться больше "чужих" IgE антител.

В общем, изобретение обрисовывает иммуногенный полипептид, имеющий часть "своих" IgE и часть "чужих" IgE. Иммуногенный полипептид является способным индукцировать ответ на "свои" IgE у млекопитающего (например, человека). "Своя" часть по крайней мере может содержать часть СН3 домена IgE. Полипептид может быть способным димеризоваться с образованием растворимого иммуногенного димера, способного индуцировать ответ на "свои" IgE у млекопитающего. Часть "чужих" IgE может содержать первый участок и второй участок частью "своих" IgE, расположенных между первым и вторым участками части "чужих" IgE. Первый участок может содержать по крайней мере часть СН2 домена IgE, и второй участок может содержать по крайней мере часть СН4 домена IgE. Часть "чужих" IgE может содержать последовательность IgE, присутствующую у неплацентарных млекопитающих (например, опоссума, утконоса, коалы, кенгуру, валлаби или вомбата). В части "своих" IgE может недоставать СН2 домена IgE антител. Иммуногенный полипептид может содержать эукариотическую посттрансляционную модификацию. В дополнение, иммуногенный полипептид может содержать полигистидиновую последовательность. Ответ на "чужие" IgE может быть поликлональным.

В соответствии с другим осуществлением изобретение обрисовывает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность, которая кодирует иммуногенный полипептид. Иммуногенный полипептид содержит часть "своих" IgE так же, как и часть "чужих" IgE, и является способным индуцировать ответ на "чужие" IgE у млекопитающего. Молекула нуклеиновой кислоты может содержать добавочную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая способствует секреции иммуногенного полипептида в эукариотических клетках.

В соответствии с другим осуществлением изобретение обрисовывает клетку-хозяина (например, эукариотическую клетку), содержащую молекулу нуклеиновой кислоты с последовательностью, которая кодирует иммуногенный полипептид. Иммуногенный полипептид содержит часть "своих" IgE так же, как и часть "чужих" IgE, и является способным индуцировать ответ на "чужие" IgE у млекопитающего.

В соответствии с другим осуществлением изобретение обрисовывает растворимый иммуногенный димер, содержащий два иммуногенных полипептида, способных димеризоваться с образованием растворимого иммуногенного димера. Каждый из двух иммуногенных полипептидов содержит часть "своих" IgE так же, как и часть "чужих" IgE, и растворимый иммуногенный димер является способным индуцировать ответ на "чужие" IgE у млекопитающего.

В соответствии с другим осуществлением изобретение обрисовывает вакцину, содержащую иммуногенный полипептид, имеющий часть "своих" IgE и часть "чужих" IgE. Иммуногенный полипептид является способным индуцировать ответ на "чужие" IgE у млекопитающего. Вакцина может содержать фармацевтически приемлимый носитель.

В соответствии с другим осуществлением изобретение обрисовывает метод получения молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует иммуногенный полипептид, который является способным индуцировать ответ на "чужие" IgE у млекопитающего. Метод включает комбинирование первой и второй последовательностей нуклеиновой кислоты с образованием молекулы нуклеиновой кислоты, где первая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует по крайней мере часть молекулы IgE, представленной у млекопитающего, и где вторая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует по крайней мере часть молекулы IgE, не представленной у млекопитающего.

В соответствии с другим осуществлением изобретение обрисовывает метод получения молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует иммуногенный полипептид, который является способным индуцировать ответ на "чужие" IgE у млекопитающего. Метод включает (а) подбор первой последовательности нуклеиновой кислоты, где первая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует по крайней мере часть молекулы IgE, представленной у млекопитающего, (b) подбор второй последовательности нуклеиновой кислоты, где вторая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует по крайней мере часть молекулы IgE, не представленной у млекопитающего, и (с) комбинирование первой и второй последовательностей нуклеиновой кислоты с образованием молекулы нуклеиновой кислоты.

В другом аспекте, изобретение обрисовывает вакцинный комплекс для вакцинации млекопитающего (например, человека). Комплекс содержит первый и второй полипептиды. Каждый из полипептидов содержит по крайней мере две сходные аминокислотные последовательности с по крайней мере пятью аминокислотными остатками в длину. В дополнение, первый и второй полипептиды соединены с образованием комплекса и введение комплекса млекопитающему вызывает иммунный ответ на на по крайней мере часть первого или второго полипептидов. Первый и/или второй полипептиды может содержать аминокислотную последовательность, экспрессируемую млекопитающим. Первый и второй полипептиды могут быть идентичными и могут образовывать димер. Соединение первого и второго полипептидов может включать дисульфидную связь. Соединение первого и второго полипептидов может включать нековалентное взаимодействие. Первый и/или второй полипептид может содержать линкерный сайт (например, полигистидиновую последовательность). Амино- и карбоксильные концы первого и/или второго полипептида могут содержать линкерный сайт. Комплекс может включать связывающую молекулу (например, антитело, такое как антиполигистидиновое антитело). Связывающая молекула может связывать первый и второй полипептиды. Комплекс может содержать третий полипептид, причем третий полипептид обладает цитокиновой активностью. Цитокиновой активностью может быть активность цитокина, такого как интерферон-, интерферон-, интерферон-, TNF-, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-15, IL-18, и колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов. Связывающая молекула может связывать третий полипептид с первым и вторым полипептидами. Сходные аминокислотные последовательности могут быть более чем около двадцати аминокислотных остатка в длину. Комплекс может содержать блокирующую молекулу Fc-гамма рецептора II (например, анти-CD32 антитело).

В соответствии с другим осуществлением изобретение обрисовывает вакцинный комплекс для вакцинации млекопитающего (например, человека). Комплекс содержит первый полипептид, связанный со вторым полипептидом, причем первый полипептид содержит по крайней мере две сходные аминокислотные последовательности с по крайней мере пятью аминокислотными остатками в длину. В дополнение, второй полипептид обладает цитокиновой активностью и введение комплекса млекопитающему вызывает иммунный ответ на по крайней мере часть первого полипептида. Первый полипептид может содержать аминокислотную последовательность, экспрессируемую млекопитающим. Соединение первого и второго полипептидов может включать нековалентное взаимодействие. Первый и/или второй полипептид может содержать линкерный сайт (например, полигистидиновую последовательность). Например, амино- и карбоксильные концы первого полипептида могут содержать линкерный сайт. Комплекс может содержать связывающую молекулу (например, антитело, такое как антиполигистидиновое антитело). Цитокиновой активностью может быть активность цитокина, такого как интерферон-, интерферон-, интерферон-, TNF-, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-15, IL-18, и колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов. Комплекс может содержать третий полипептид. Первый и третий полипептиды могут быть идентичными и могут образовывать димер. Соединение первого и третьего полипептидов может включать дисульфидную связь. Сходные аминокислотные последовательности могут быть более чем около двадцати аминокислотных остатка в длину. Комплекс может содержать блокирующую молекулу Fc-гамма рецептора II (например, анти-СD32 антитело).

В соответствии с другим осуществлением изобретение обрисовывает вакцинный комплекс для вакцинации млекопитающего (например, человека). Комплекс содержит первый, второй и третий полипептиды, где первый, второй и третий полипептиды соединены с образованием комплекса. Первый полипептид обладает первой цитокиновой активностью. Второй полипептид обладает второй цитокиновой активностью. Введение комплекса млекопитающему вызывает иммунный ответ на по крайней мере часть третьего полипептида. Третий полипептид может содержать аминокислотную последовательность, экспрессируемую млекопитающим. Соединения первого, второго и третьего полипептидов могут включать нековалентные взаимодействия. Первый, второй и третий полипептиды могут содержать линкерный сайт. Комплекс может содержать связывающую молекулу. Третий полипептид содержит по крайней мере две сходные аминокислотные последовательности с по крайней мере пятью аминокислотными остатками в длину. Комплекс может содержать блокирующую молекулу Fc-гамма рецептора II (например, анти-СD32 антитело).

В соответствии с другим осуществлением изобретение обрисовывает вакцинный комплекс для вакцинации млекопитающего (например, человека). Комплекс содержит первый полипептид, связанный со вторым полипептидом, где первый полипептид является полипептидом, обладающим активностью интерферона- или интерферона-, и введение комплекса млекопитающему вызывает иммунный ответ на по крайней мере часть второго полипептида. Второй полипептид может содержать аминокислотную последовательность, экспрессируемую млекопитающим. Соединения первого и второго полипептидов могут включать нековалентные взаимодействия. Первый и/или второй полипептид может содержать линкерный сайт. Комплекс может содержать связывающую молекулу. Второй полипептид содержит по крайней мере две сходные аминокислотные последовательности с по крайней мере пятью аминокислотными остатками в длину. Комплекс может содержать блокирующую молекулу Fc-гамма рецептора II (например, анти-CD32 антитело).

В соответствии с другим осуществлением изобретение обрисовывает вакцинный комплекс для вакцинации млекопитающего (например, человека). Вакцина содержит блокирующую молекулу Fc-гамма рецептора II (например, анти-CD32 антитело) и полипетид, причем введение вакцины млекопитающему вызывает иммунный ответ на по крайней мере часть полипептида. Полипептид может содержать аминокислотную последовательность, экспрессируемую млекопитающим. Блокирующая молекула Fc-гамма рецептора II и полипептид могут быть связаны и соединение может включать нековалентное взаимодействие.

Если не оговорено иначе, все используемые здесь технические и научные термины имеют те же значения, что и однозначно понимается средним специалистом в данной области, к которой относится это изобретение. Хотя методы и материалы, сходные или равноценные описанным здесь, могут быть использованы в практике или тестировании данного изобретения, подходящие методы и материалы описаны ниже. Все публикации, заявки на патент, патенты и другие указанные здесь ссылки включены в качестве ссылки во всей полноте. В случае конфликта настоящее описание, включая определения, будет рассматриваться дополнительно. В дополнение, материалы, методы и примеры служат исключительно для иллюстративных целей и не предназначены для ограничения объема притязаний настоящего изобретения.

Другие детали и преимущества изобретения будут выявлены из последующего детального описания и формулы изобретения.

Описание рисунков Фиг. 1 является диаграммой, сравнивающей аминокислотные последовательности СН2-СН3-СН4 доменов IgE человека, крысы и опоссума в верхнем, среднем и нижнем уровнях соответственно. Последовательность опоссума также содержит N-концевую сигнальную последовательность с последующими шестью гистидиновыми остатками.

Фиг. 2А-В содержат диаграммы, сравнивающие аминокислотные последовательности различных полипептидов, содержащих следующие компоненты: CH2 опоссума - СН3 крысы - СН4 опоссума (ORO); СН2 опоссума - N-конец СН3 крысы - С-конец СН3 опоссума - СН4 опоссума (ORO-trunc); CH2 опоссума - СН3 мыши - СН4 опоссума (ОМО); СН2-СН3-СН4 опоссума (OOO); СН2-СН3-СН4 утконоса (РРР); CH2 опоссума - СН3 человека - СН4 опоссума (ОНО); CH2 опоссума - СН3 свиньи - СН4 опоссума (ОРО) и CH2 опоссума - СН3 собаки - СН4 опоссума (ODO). Стрелки показывают края доменов.

Фиг. 3А-С содержат диаграммы, отображающие анализ иммунных ответов на иммуногенный полипептид ORO in a panel of трех различных линий крыс. Уровень IgG анти-IgE антител крысы, нацеленных против нативных IgE крысы, измеряли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Нативные IgE крысы использовали в концентрации 5 г/мл для покрытия ELISA чашек. Последовательные пятикратные разведения сыворотки крови от каждой из особей крысы тестировали цветной реакцией с помощью ELISA. Из каждой линии шесть вакцинированных крыс анализировали вместе четырьмя контрольными крысами.

Фиг. 4 является диаграммой, отображающей анализ иммунных ответов на иммуногенный полипептид ORO, так же как и на контрольные полипептиды OOO и РРР.

Подробное описание Изобретение представляет методы и материалы для лечения различных заболеваний, таких как инфекции и IgE-зависимые заболевания. Более конкретно, изобретение представляет методы и материалы, которые могут быть использованы для вакцинации млекопитающего от "своих" антигенов и "чужих" антигенов. Например, описанные здесь методы и материалы могут быть использованы для уменьшения эффектов IgE антител у млекопитающего путем уменьшения общего и связанного с рецептором количества IgE антител у млекопитающего.

1. Вакцинные конъюгаты Изобретение представляет вакцинные конъюгаты, которые содержат по крайней мере два полипептида, каждый из которых имеет по крайней мере два сходных аминокислотных участка. Используемый здесь термин "конъюгат" используется применительно к любой композиции, содержащей по крайней мере два полипептида, которые прямо или опосредованно соединены через одну или более ковалентную или нековалентную связи. Например, конъюгат может содержать десять последовательно связанных полипептидов (например, номер один связан с номером два, номер два связан с номером три, номер три связан с номером четыре и т.д.). Используемый здесь по отношению к полипептидам термин "связанный" используется применительно к любому типу ковалентной или нековалентной связи, включая, без ограничения, одинарные связи, двойные связи, тройные связи, дисульфидные связи, водородные связи, гидрофобные взаимодействия, Вандер-Ваальсовы взаимодействия и их любые комбинации. Например, дисульфидная связь может соединять полипептид номер один с полипептидом номер два. Альтернативно, антитело может соединять полипептиды номер один и два. В этом случае каждый из полипептидов один и два может содержать эпитоп, распознающийся антителом таким образом, что получающийся конъюгат содержит полипептид номер один, нековалентно связанный с антителом, которое нековалентно связано с полипептидом номер два. Отмечено, что полипептид номер один или два в этом примере может иметь идентичную аминокислотную последовательность.

Используемый здесь термин "аминокислотные участки" используется применительно к смежным участкам аминокислотной последовательности полипептида. Например, аминокислотная последовательность от 30 до 40 остатков внутри содержащего 100 аминокислот полипептида может считаться аминокислотным участком. Для целей данного изобретения аминокислотный участок может быть любой длины, большей чем пять аминокислотных остатков (например, более чем шесть, семь, восемь, девять, десять, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 150 или 200 аминокислотных остатков). Поэтому аминокислотный участок может быть целым СН3 доменом IgE антитела.

Используемый здесь по отношению к по крайней мере двум аминокислотным участкам термин "сходный" означает, что участки являются по крайней мере на 50 процентов идентичными в аминокислотной последовательности. Например, сходные аминокислотные участки могут быть на 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 или 100 процентов идентичными. Для целей данного изобретения процент идентичности аминокислотной последовательности между одним аминокислотным участком и другим расчитывался следующим образом. Во-первых, аминокислотные последовательности двух аминокислотных участков выравнивали с использованием програмного обеспечения по выравниванию последовательности MEGALIGN (DNASTAR, Madison, WI, 1997), следующего алгоритму Jotun Heim с опциями по умолчанию. Во-вторых, определяется число совпадающих позиций между двумя выравненными аминокислотными последовательностями. Совпадающая позиция используется применительно к позиции, в которой идентичные остатки появляются в тех же самых позициях, что и выравненные с использованием программного обеспечения по выравниванию последовательности MEGALIGN. В-третьих, число совпадающих позиций делили на общее число позиций и полученное значение умножали на 100 с получением процента идентичности.

Итак, вакцинный конъюгат содержит по крайней мере два полипептида, каждый из которых имеет по крайней мере два сходных аминокислотных участка. Поэтому вакцинный конъюгат может содержать два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, 15, 20, 25 или 30 полипептидов, каждый из которых имеет по крайней мере два сходных аминокислотных участка. Отмечено, что полипептид, содержащий по крайней мере два сходных аминокислотных участка, может содержать два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или более сходных аминокислотных участков. В дополнение к полипептидам, содержащим по крайней мере два сходных аминокислотных участка, вакцинный конъюгат изобретения может содержать любое число полипептидов, неимеющих по крайней мере два сходных аминокислотных участка. Например, вакцинный конъюгат может содержать четыре полипептида, каждый из которых имеет участок в 30 аминокислотных остатков, повторяющийся три раза так же, как и два полипептида, в каждом из которых недостает сходных аминокислотных участков.

Обычно вакцинный конъюгат содержит действующий в качестве антигена полипептид, на который вызывается иммунный ответ. Поэтому вакцинный конъюгат в рамках изобретения может содержать любой тип полипептида, включая, без ограничения, бактериальные полипептиды, грибковые полипептиды, вирусные полипептиды и полипептиды млекопитающих. Например, вакцинный конъюгат может содержать пять вирусных полипептидов гепатита С. Отмечено, что каждый полипептид конъюгата может иметь идентичные аминокислотные последовательности. В дополнение, полипептид вакцинного конъюгата обычно содержит сходные аминокислотные участки, каждый из которых может действовать в качестве определенной антигенной единицы, на которую вызывается иммунный ответ. Поэтому полипептид вакцинного конъюгата может содержать сходные аминокислотные участки, которые соответствуют любому участку полипептида, включая, без ограничения, участки связывания рецептора, участки связывания лиганда, активные участки ферментов, участки высвобождения полипептидных субстратов ферментов, участки связывания антигена антител и эпитопы, распознающиеся антителами. Например, полипептид вакцинного конъюгата может содержать три сходных аминокислотных участка, каждый из которых соответствует активному участку фермента X. Отмечено, что сходные аминокислотные участки могут быть расположены друг за другом или рассеяны по всему протяжению полипептида. Обычно введение вакцинного конъюгата вызывает образование антител, имеющих специфичность по отношению к эпитопу, образованному по крайней мере частью сходных аминокислотных участков внутри одного из полипептидов вакцинного конъюгата.

Любой метод может быть использован для получения полипептидов вакцинного конъюгата, включая, без ограничения, прокариотические системы экспрессии, эукариотические системы экспрессии и методы химического синтеза. В дополнение, полипептид вакцинного конъюгата может быть получен из естественных источников тканей. Например, гликополипептид головного мозга может быть получен из ткани головного мозга. Обычно каждый отдельный полипептид конъюгата делают независимо или выделяют независимо и затем используют для образования конъюгата. Отмечено, что полипептиды могут быть очищены перед тем, как будут использованы для образования конъюгата. Любой метод может быть использован для очистки полипептидов, включая, без ограничений, фракционирование, центрифугирование и хроматографию. Например, содержащие полигистидиновую последовательность полипептиды могут быть очищены с использованием аффинной хроматографии. Будучи полученными, полипептиды могут быть соединены с использованием любого метода. Например, образец полипептида может быть инкубирован со связывающей молекулой таким образом, что отдельные полипептиды формируют конъюгаты. Связывающая молекула является любой молекулой, которая соединяет два полипептида. Обычно связывающей молекулой является молекула с двумя реактивными группами или сайтами, с которыми способны взаимодействовать с образованием связи между аминокислотными остатками два полипептида. Связывающей молекулой может быть специфическая связывающая молекула, такая как антитело, или неспецифическая связывающая молекула, такая как химический реагент (например, глутаральдегид или формальдегид).

Любое антитело может быть использовано в качестве связывающей молекулы. Например, антиполигистидиновое антитело или антитело против эпитопной метки, такое как антитело против FLAG-эпитопа или антитело против гемагглютининовой (НА) метки, могут быть использованы для соединения полипептидов. FLAG-эпитопы описаны в Патентах США 4,703,004 и 4,782,137. Отмечено, что для связывания со специфической связывающей молекулой полипептиды должны содержать специфический участок, распозноваемый связывающей молекулой. Например, для связывания двух полипептидов с антиполигистидиновым антителом каждый полипептид должен содержать полигистидиновый эпитоп, распозноваемый этим антителом. Для целей данного изобретения специфический участок, распознаваемый специфической связывающей молекулой, такой как антитело, называется линкерным участком. Любой метод может быть использован для получения содержащего линкерный участок полипептида таким образом, что указанное антитело может быть использовано в качестве связывающей молекулы. Например, традиционные методы молекулярного клонирования могут быть использованы для введения нуклеиновой кислоты, которая кодирует FLAG-эпитопную метку, в нуклеиновую кислоту, которая кодирует специфический полипептид. Отмечено, что линкерный участок может быть локализован в любой позиции. Например, полигистидиновая последовательность может быть в N-концевом участке, С-концевом участке или во внутренней части полипептида. В дополнение, полипептид может содержать более чем один линкерный участок. Например, полипептид может иметь полигистидиновую последовательность во внутренней части так же, как и в С-концевом участке. Более того, полипептид может содержать различные линкерные участки. Например, полипептид может иметь полигистидиновую последовательность во внутренней части FLAG-эпитопной метки в С-концевом участке.

В некоторых случаях два или более полипептидов могут быть получены таким образом, что они соединены через ковалентную связь. Например, два полипептида могут быть получены в качестве слитого белка таким образом, что они соединены пептидной связью. Альтернативно, полипептид может быть получен в клеточной линии, которая способствует образованию дисульфидных связей между, например, двумя идентичными полипептидами. В этом случае конъюгат является гомодимером. Отмечено, что любой полипептид может быть получен с содержанием одного или более цистеиновых остатков таким образом, что полипептиды формируют конъюгаты через цистеиновые мостики. Например, полипептид может быть получен с содержанием N-концевых и С-концевых цистеиновых остатков таким образом, что конъюгаты различной величины образуются внутриклеточно.

В дополнение, взаимодействие между биотином и авидином может быть использовано для образования конъюгатов. Например, полипептиды могут быть сконструированы или химически обработаны с получением молекул биотина в С-концевых и N-концевых участках. Эти биотинсодержащие полипептиды могут быть инкубированы с молекулами авидина, которые способны одновременно взаимодействовать с двумя или более молекулами биотина. В этом случае одна молекула авидина может связывать два биотинсодержащих полипептида с образованием конъюгата. Затем хелатирующие молекулы, которые могут одновременно связывать два или более ионов (например, Ni++, Cu++, Co++ и Zn++), могут быть использованы для формирования конъюгатов. Например, хелатирующая медь молекула, которая может взаимодействовать с двумя ионами меди, может быть использована для связывания двух полипептидов, содержащих полигистидиновую последовательность. В этом случае один ион меди может взаимодействовать с каждой полигистидиновой последовательностью, в то время как одна хелатирующая медь молекула связывает два полипептида с формированием конъюгата. Отмечено, что иммунностимулирующие комплексы (iscoms) могут быть использованы для формирования конъюгатов. Например, iscom может быть сконструирован с содержанием ионов меди таким образом, что содержащие полигистидиновую последовательность полипептиды могут быть конъюгированы.

Обычно молекула нуклеиновой кислоты сконструирована таким образом, что специфический полипептид является экспрессированным. Например, молекула нуклеиновой кислоты может быть сконструирована для кодирования полипептида, имеющего три сходных аминокислотных участка, так же как и полигистидиновую последовательность в его С-конце. Будучи сконструированной, молекула нуклеиновой кислоты может быть интродуцирована в клетку-хозяина таким образом, что вырабатывается полипептид. Может быть использована любая клетка-хозяин, включая, без ограничений, прокариотические клетки (например, бактерии) и эукариотические клетки (например, клетки человека). Будучи произведенным, полипептид может быть очищен и использован для получения требуемого вакцинного конъюгата.

Используемый здесь термин "нуклеиновая кислота" заключает в себе РНК и ДНК, включая кДНК, геномную ДНК и синтетическую (например, химически синтезированную) ДНК. Нуклеиновая кислота может быть двухцепочечная или одноцепочечная. Одноцепочечная нуклеиновая кислота может быть смысловой цепью или антисмысловой цепью. В дополнение, нуклеиновая кислота может быть кольцевой или линейной.

Нуклеиновая кислота может быть получена с использованием традиционных процедур и методов молекулярного клонирования и химического синтеза нуклеиновых кислот, включая PCR. PCR используется применительно к процедуре или методу, в котором нуклеиновая кислота-мишень амплифицируется способом, сходным с описанным в Патенте США 4,683,195 и описанными в нем последующими модификациями процедуры. В общем, информация конца последовательности интересующего участка или beyond используется для конструирования олигонуклеотидной затравки, которая является идентичной или сходной с последовательностью противоположных цепей потенциальной матрицы, которую амплифицируют. Используя PCR, последовательность нуклеиновой кислоты может быть амплифицирована с РНК или ДНК. Например, последовательность нуклеиновой кислоты может быть изолирована путем PCR-амплификации с общей клеточной РНК, общей геномной ДНК и кДНК так же, как и с последовательностями бактериофага, плазмидными последовательностями, вирусными последовательностями и подобными. Когда в качестве источника матрицы используется РНК, для синтеза комплеметарных цепей ДНК может быть использована обратная транскриптаза.

Для интродукции нуклеиновой кислоты в клетку может быть использован любой метод. Фактически,