Способы и компоненты индукции опухоль-специфической цитотоксичности

Способы и компоненты индукции опухоль-специфической цитотоксичности

Реферат

 

Изобретение относится к области медицинской генетики. Сущность изобретения: способ экспрессии гетерологичной последовательности в опухолевой клетке путем внедрения в нее гена, подвергаемого импринтингу. Ген содержит регуляторную последовательность, например H19 с промотором Р3 или Р4 IGF-2 и др. , способную управлять экспрессией цитотоксических продуктов. Гены могут использоваться для лечения различных раковых, вирусных и аутоиммунных заболеваний. Описание изобретения содержит сведения о соответствующих векторах экспрессии и методах лечения. Технический результат - расширение арсенала средств генной терапии. 5 с. и 35 з.п.ф-лы, 10 ил., 1 табл.

Настоящая заявка является частично продолжающей заявкой одновременно рассматриваемой заявки серийный номер 08/943608, поданной 3 октября 1997 года, которая полностью включена сюда в качестве ссылки.

1. Область изобретения Изобретение относится к области клеточной биологии опухолей и лечения злокачественных опухолей. Более конкретно изобретение относится к специфической экспрессии гетерологичных генов, в частности генов, кодирующих цитотоксические продукты, в опухолевых клетках.

2. Предпосылки изобретения 2.1 Ген Н19 Ген H19 является одним из немногих генов, для которых известно, что они подвергаются импритингу у людей ("Hurst et al., 1996, Nature Genetics 12: 234-237). На самых ранних стадиях эмбриогенеза ген H19 экспрессируется обоими аллелями хромосом (DeGroot et al., 1994, Trofoblast 8:285-302). Чуть позже происходит подавление отцовского аллеля, и транскрибируется только унаследованный от матери аллель. Ген H19 является избыточно экспрессирующимся в ходе эмбриогенеза и впервые был идентифицирован как ген, который соответственно регулируется альфа-фетопротеином в печени с помощью трансвзаимодействия с локусом raf (Pachnis et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5523-5527). Кроме того, ген Н19 был независимо клонирован рядом лабораторий, применяющих скрининг с целью выделения генов, экспрессируемых в ходе тканевой дифференцировки. Например, Davis et al. (1987, Cell 51:987-1000) идентифицировали гомолог гена Н19 у мыши при скрининге генов, активных на ранних этапах дифференцировки клеток С3Н10Т1/2. Pourier et al. (1991, Development 113:1105-1114) обнаружили, что ген Н19 мышей экспрессируется в ходе дифференцировки стволовых клеток и в период имплантации. Транскрипция человеческого гена Н19 также была обнаружена при дифференцировке цитотрофобластов плаценты человека (Rachmilewitz et al., 1992, Molec. Reprod. Dev.32: 196-202).

Несмотря на то что транскрипция РНК гена H19 происходит в ряде различных эмбриональных тканей в течение всего эмбрионального периода и развития плаценты, после рождения наблюдается даун-регуляция экспрессии гена Н19. Однако имеются данные об относительно низких уровнях транскрипции гена H19 в мышечной ткани и печени взрослых мышей (Brannan et al., 1990, Molec. Cell. Biol. 10: 28-36). Ген Н19 также постнатально активен в малигнизированных клетках. Ariel et al. (1997, Molec. Pathol. 50:34-44) показали экспрессию гена H19 в ряде опухолей, происходящих из тканей, в которых ген H19 экспрессирует пренатально. Кроме того, данные авторы обнаружили РНК гена H19 в опухолях, происходящих из нервных тканей, в частности в астроцитоме и ганглионейробластоме, связь которых с экспрессией гена H19 неизвестна. Получив данные по широкому кругу злокачественных опухолей, экспрессирующих РНК гена H19, эти авторы сделали предположение, что ген H19 экспрессирует онкофетальную РНК, и предложили исследование гена H19 как опухолевого маркера новообразований человека.

Как человеческий, так и мышиный гены H19 были клонированы и секвенированы (Brannan et al., 1990, Molec. Cell. Biol. 10:28-36). Сравнение генов Н19 человека и мыши позволило выявить в общей сложности 77%-ную идентичность нуклеотидных последовательностей. Несмотря на данную консервативность межвидовой гомологичности нуклеотидных последовательностей, могла быть предсказана очень низкая идентичность аминокислотных последовательностей с открытых рамок считывания двух данных генов (Id). Далее хотя РНК гена H19 транскрибируется с помощью РНК-полимеразы II, сплайсируется и полиаденилируется, она не подвергается трансляции. Вместо этого была найдена взаимосвязь РНК гена H19 с цитоплазматической 28S РНК, что позволило предположить, что РНК гена H19 может иметь функцию РНК-компонента рибонуклеопротеина (Id).

Настоящая физиологическая роль гена H19 понятна не до конца. Ген H19 может действовать как доминантный летальный ген; высокая эктопическая экспрессия гена Н19 у трансгенных мышей является причиной летальности незадолго перед рождением (Brunkow et al., supra). Данный летальный период совпадает со временем подавления транскрипции гена H19. С другой стороны, не было обнаружено повреждения ни у гетерозиготных, ни у гомозиготных нокаут-мышей по H19 аллелю (Leighton et al., 1995, Nature 375:34-39). Выбивание материнского наследственного аллеля мешает проведению импритинга генетически связанного и противоположно подверженного импритингу гена IGF-2; получившиеся мыши рождаются крупнее, чем остальное потомство, вследствие увеличения пренатальной экспрессии гена IGF-2 (Id). Поскольку данные два противоположно подверженных импритингу гена разделены цис-взаимодействующими регуляторными последовательностями, Leighton и коллеги сделали предположение, что ген H19 может быть вовлечен в импритинг гена IGF-2.

Другой предполагаемой функцией продукта гена H19 является РНК-супрессия опухоли. Нао et al. (1993, Nature 365:764-767) сообщили, что трансфекция в две эмбриональные опухолевые клеточные линии RD и G401 экспрессирующей конструкции гена H19 приводит к задержке клеточного роста, морфологическим изменениям и уменьшению туморогенности у мышей nude. Подобная опухолесупрессорная активность была замечена в случаях, согласующихся с наблюдаемой летальностью при эктопической экспрессии у мышей (Нао et al., supra) и также увеличением размера мышей с выключенным материнским аллелем Н19 (Leighton et al. , supra). Однако предположение о том, что ген H19 имеет функцию опухолевого супрессора является спорным. Некоторые из опубликованных результатов не подтвердились и возможно существование другого кандидата гена опухолевого супрессора, тесно связанного с геном H19 (Ariel et al., supra). Предположительная роль гена H19 как опухолевого супрессора также не согласуется с экспериментальными данными о том, что ген H19 активируется во множестве опухолевых клеток (смотри, например, Listig-Yariv et al., 1997, Oncogene 23: 169-177).

2.2 Гены инсулиноподобного фактора роста (IGF) IGF-2 является другим подверженным импритингу геном, экспрессия которого зависит от его родительского источника происхождения. Однако, в отличие от гена Н19, ген IGF-2 является подверженным материнскому импритингу как у мышей, так и у человека, и поэтому экспрессируется с унаследованного от отца аллеля (Rainer et al., 1993, Nature 363:747-749). Ген IGF-2 человека проявляет сложный транскрипционный профиль. Существуют четыре промотора для гена IGF-2, активирующиеся в ткани на определенной стадии развития. Только три промотора Р2, Р3 и Р4 подвержены импритингу и активны в течение периода развития плода и в злокачественных опухолевых тканях. Четвертый промотор Р1 не подвержен импритингу и активируется только во взрослом состоянии в печени и сосудистом сплетении (смотри Holthuizen et al., 1993, Mol. Reprod. Dev. 35: 391-393). Промотор Р3 гена IGF-2 вовлекается при развитии цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы (Kim and Park, 1998, J.Korean Med. sci. 13: 171-178).

Потеря импритинга гена IGF-2 наблюдается при нефробластоме (Ogawa et al. , 1993, Nature 363:749-751). Данное наблюдение привело многих исследователей к предположению, что потеря импритинга и экспрессия подверженных импритингу генов с двух аллелей может приводить к нарушениям роста и развитию злокачественных опухолей (смотри также Rainer et al., 1993, Nature 362:747-749 и Glassman et al., 1996. Cancer Genet. Cytogenet. 89:69-73).

2.3 Опухоль-специфическая генная терапия Регуляторные последовательности опухольассоциированных генов применяли с целью селективной прицельной экспресии суицидного гена в клетках опухоли. Например, в гепатоцеллюлярной карциноме индуцируют экспрессию альфа-фетопротеина. Huber и др. (1991, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 88:8039-8043) использовали регуляторные последовательности как гена альбумина, так и гена альфа-фетопротеина для прицельной экспрессии гена тимидинкиназы возбудителя ветряной оспы (VZV ТК), кодирующего последовательности в клетках гепатомы. Клетки гепатомы, инфицированные in vitro ретровирусным вектором, содержащим одну из данных конструкций, экспрессировали VZV TK и становились чувствительными к обычно нетоксичному пролекарственному препарату 6-метоксипуринарабинонуклеозиду (агаМ). Kaneko et al. (1995, Cancer Res. 55:5283-5287) создали аденовирусный вектор, экспрессирующий HSV ТК под контролем регуляторных последовательностей альфа-фетопротеина. Рекомбинантные аденовирусные частицы, содержащие данный вектор, непосредственно вводили в опухоли, возникшие из гепатоцеллюлярной карциномы, развившиеся у бестимусных мышей nude. Последовательные интраперитонеальные инъекции ганцикловира приводят к регрессии опухолей, развившихся из гепатоцеллюлярной карциномы.

Osaki et al. (1994, Cancer Res. 54;5258-5261) трансфицировали клетки легочной карциномы А549 экспрессирующей конструкцией, содержащей регуляторные последовательности гена легочного карциномоэмбрионального антигена, связанного с кодирующей последовательностью тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV ТК). Трансфицированные клетки были чувствительны к ганцикловиру. Кроме того, рост опухоли у мышей nude из подкожно введенных трансфицированных клеток ингибировали повторными интраперитониальными инъекциями ганцикловира. Однако ген карциномоэмбрионального антигена недавно был описан как экспрессирующийся в нормальной слизистой оболочке толстого кишечника, таким образом ограничивая пригодность данных регуляторных последовательностей в качестве специфических регуляторных областей (Osaki et al., supra). Таким образом, сохраняется потребность в разработке векторов для генной терапии, которые специфически экспрессируют генные продукты в опухолевых клетках.

3. Сущность изобретения Изобретение относится к способам и композициям для индукции селективной экспрессии гетерологичных генов в опухолевых клетках. В частности, изобретение относится к полинуклеотидам, содержащим регуляторную транскрипционную последовательность, оперативно связанную с гетерологичными генами, что приводит к опухоль-специфической экспрессии гетерологичных генов. Более подробно, регуляторная транскрипционная последовательность состоит из подверженного геномному импритингу гена, который специфически экспрессируется в малигнизированных клетках, такого как ген Н19, и промоторов Р3 и Р4 гена IGF-2, и гетерологичного гена, кодирующего цитотоксический белок или цитостатический генный продукт. Другая реализация изобретения относится к промотору IGF-1, оперативно связанному с гетерологичным геном, что приводит к опухоль-специфической экспрессии гена. Регуляторные последовательности будут управлять экспрессией гена в ряде различных типов клеток злокачественных опухолей. Подобные способы и композиции применимы для лечения широкого спектра злокачественных опухолей и гиперпролиферативных состояний.

Одним аспектом изобретения являются экспрессирующие векторы, содержащие полинуклеотиды, такие как регуляторные области, оперативно связанные с гетерологичными генами. Особенно предпочтительными регуляторными областями являются участки, формирующие регуляторные области гена H19, такие как промоторная и энхансерная последовательности, промоторы Р3 и Р4 гена IGF-2 или промотор гена IGF-1. В связи с этим энхансер гена H19 и его активные участки могут быть использованы в любой комбинации с промотором гена H19, промотором гена IGF-1, промотором Р3 гена IGF-2 или промотором Р4 гена IGF-2. Также изобретение охватывает и клетки-хозяева, содержащие подобные векторы. В связи с этим экспрессирующая конструкция, содержащая гетерологичный ген, контролируемый промотором гена H19 в присутствии или в отсутствии энхансера гена H19, может быть введена в клетку совместно со второй конструкцией, включающей гетерологичный ген, контролируемый промотором гена IGF-1, промотором Р3 или промотором Р4 гена IGF-2 в сочетании с энхансером гена Н19. В другом аспекте изобретение обеспечивает способы применения подобных векторов для экспрессии гетерологичных генов в опухолевых клетках. Еще одним аспектом изобретения явления лечение злокачественных опухолей с применением векторов по настоящему изобретению методами генной терапии.

4. Краткое описание чертежей Фиг.1А-1С - нуклеотидная последовательность промоторной области гена H19 человека. Промоторная область от -837 нуклеотидного положения до -7 (относительно точки начала транскрипции).

Фиг. 2 - схематическая диаграмма векторов, применяемых для экспрессии гетерологичного гена под контролем регуляторных последовательностей гена H19.

Фиг. 3А-3Е - регуляторные последовательности гена Н19 управляют экспрессией гетерологичного гена (CAT) в клеточных линиях злокачественной опухоли мочевого пузыря. Для пяти различных указанных клеточных линий CAT специфическая активность (импульс в минуту/мкг белка) изображена как функция используемого для трансфекции вектора. Фиг.3А: клетки НТ-1376. Фиг.3В: клетки EJ28. Фиг.3С: клетки Т24Р. Фиг.3Д: клетки 1197. Фиг.3Е: клетки UM-UC-3. Следующие векторы более подробно описаны ниже в части 6: (1) pCAT-Basic; (2) pCAT-Control; (3) рН19Е; (4)pHl9EH19D; (5) pH19EH19R.

Фиг. 4А-4Е - промоторы Р3 и Р4 гена IGF-2 управляют экспрессией гетерологичного гена (люциферазы) в клеточных линиях злокачественной опухоли мочевого пузыря. Для пяти различных клеточных линий показана специфическая люцеферазная активность (импульсов мкг белка) представлена как функция промотора гена IGF-2, применяемого в трансфекционной конструкции для управления экспрессией люциферазы Фиг.4А: клетки Т24Р. Фиг.4В: клетки 1376. Фиг.4С: клетки UM-UC3. Фиг. 4D: клетки 1197. Фиг.4Е: клетки EJ28. Более подробно векторы описаны в части 10.

Фиг. 5 - нуклеотидная последовательность промоторного фрагмента гена H19 человека (SEQ ID NO:2).

Фиг. 6 - нуклеотидная последовательность энхансерного фрагмента гена H19 длиной 0,9 т.п.н. (SEQ ID NO:3).

Фиг. 7А и 7В - нуклеотидная последовательность энхансерного фрагмента гена Н19 длиной 2 т.п.н. (SEQ ID NO:4).

Фиг. 8А-8С - нуклеотидная последовательность энхансерного фрагмента гена H19 длиной 4 т.п.н. (SEQ ID NO:5).

Фиг. 9А-9С - трансфекция векторами, содержащими различные комбинации регуляторной области гена H19 с промотором Р4, позволяет управлять экспрессией люциферазы в опухолевых клетках. Фиг.9А: клетки 5637. Фиг.9В: клетки Huh7. Фиг.9с: клетки 293Т.

Фиг. 10А-10Е - трансфекция векторами, содержащими регуляторную область гена Н19, позволяет управлять экспрессией в опухолевых клетках. Фиг.10А: клетки 293Т. Фиг. 10В: клетки Т24Р. Фиг.10С: клетки Huh7. Фиг.10D: клетки 5637. Фиг.10Е: клетки RT112.

5. Подробное описание изобретения Изобретение частично основывается на открытии того, что регуляторные области подверженных геномному импритингу генов, экспрессирующихся в малигнизированных клетках, могут быть использованы для прицельной экспрессии кодирующих последовательностей в интересующих малигнизированных клетках. В частности, было установлено, что экспрессия гена H19 активируется в целом ряде карцином, включая, но не ограничиваясь, карциному мочевого пузыря, гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому, рабдомиосаркому, карциному яичника, карциному шейки матки, карциному легких, карциному молочной железы, плоскоклеточную карциному головы и шеи, карциному пищевода, карциному щитовидной железы, астроцитому, ганглиобластому и нейробластому. Далее было обнаружено, что конструкции, содержащие промоторные области гена H19, оперативно связанные с гетерологичным геном, или промоторы Р3 или Р4 гена IGF-2, оперативно связанные с гетерологичным геном, или конструкции, содержащие подобный промотор в комбинации с ниже расположенным энхансером гена H19, специфически активируются в опухолевых клетках. В другом аспекте изобретения для управления экспрессией гетерологичного гена применяют промотор IGF-1.

Соответственно в одном из своих аспектов изобретение обеспечивает способы и композиции для изменения фенотипа или селективного уничтожения малигнизированных клеток. Данная цель выполняется с помощью внесения в клетки полинуклеотида, содержащего регуляторные области из подверженных геномному импритингу генов, которые экспрессируются в малигнизированных клетках, будучи оперативно связаны с гетерологичным геном. Гетерологичный ген, например, способен кодировать цитостатический или цитотоксический агент (например, токсин, антисмысловую РНК или рибозим).

Регуляторные области подверженных геномному импритингу гена, который экспрессируется в малигнизированных клетках, включают, не ограничиваясь, промотор и энхансер гена Н19 и промоторы Р3 и Р4 гена IGF-2.

В контексте настоящего изобретения, описанного здесь, термин "оперативно связанный" означает, что нуклеотидная последовательность связана с регуляторной последовательностью таким образом, что позволяет регуляторной последовательности управлять экспрессией нуклеотидной последовательности.

В контексте настоящей заявки термин "последовательность гетерологичного гена" относится к последовательности гена, которая обычно оперативно не связанна с регуляторными последовательностями гена H19. Как правило, последовательности гетерологичного гена включают последовательности, кодирующие цитостатические или цитотоксические генные продукты.

Термин "экспрессия", употребляемый здесь, относится к транскрипции интересующей ДНК, сплайсингу, процессингу, стабилизации и необязательно трансляции соответствующего мРНК-транскрипта. В зависимости от структуры доставляемой молекулы ДНК экспрессия может быть кратковременной или длительной.

5.1 Регуляторные последовательности гена Н19, пзомоторы Р3 и Р4 гена IGF-2 и промотор гена IGF-1 Описанные здесь регуляторные последовательности гена H19 могут быть использованы для управления специфической экспрессией в опухолевой клетке гетерологичной кодирующей последовательности. Данные регуляторные последовательности гена Н19 включают выше расположенную промоторную область гена H19 и/или ниже расположенную энхансерную область гена H19. Нуклеотидная последовательность одной промоторной области гена Н19 показана на фигуре 1А-1С (SEQ ID NO: 1). Данная 830-нуклеотидная последовательность располагается от -837 до -7 нуклеотида от сар-сайта (как описано Brannan et al., supra). Консенсусная ТАТА последовательность наблюдается в положении от -27 до -35 нуклеотида. Два консенсусных АР2 связывающих сайта (8/9 совпадений) располагаются приблизительно на -500 и -40 нуклеотидов выше сайта инициации транскрипции. Будучи расположены выше кодирующей области гетерологичного гена, что обсуждается более подробно ниже, приблизительно 830 пар нуклеотидов регуляторной области достаточны для управления экспрессией оперативно связанного гетерологичного гена в малигнизированных клетках, которые также экспрессируют эндогенный ген Н19. Кроме того, другая промоторная область гена H19 между нуклеотидами -819 до +14 (фигура 5, SEQ ID NO:2) также достаточна для управления экспрессией оперативно связанного гетерологичного гена в малигнизированных клетках.

Ниже расположенная энхансерная область гена H19 человека может быть необязательно встроена в конструкцию промотор гена Н19/гетерологичный ген для того, чтобы обеспечить повышение уровня опухоль-специфической клеточной экспрессии. Согласно более подробному описанию, приведенному ниже, и иллюстрации на примере в части 6 ниже расположенная энхансерная область входит в состав SacI-рестрикционного фрагмента, располагающегося от +6 т.п.н. до +11 т.п.н. относительно сайта начала транскрипции. Исходя из свойств энхансерной последовательности, ниже расположенный энхансер способен оказывать влияние в случае расположения как в обратном, так и в прямом направлении (относительно ориентации энхансера H19 в эндогенном гене H19) ниже кодирующей области гетерологичного гена под контролем промотора гена Н19. Кроме того, фрагменты данного энхансера, содержащие последовательности, изображенные на фигурах 6, 7А, 7В и 8А-8С (SEQ ID NOS:3-5), также могут быть использованы для облегчения экспрессии гена. Экспрессия гена IGF-1 взаимосвязана со злокачественными опухолями легких и молочной железы. Промотор гена IGF-1 является нуклеотидной последовательностью, расположенной между и 1630 нуклеотидами в последовательности гена IGF-1 человека (номер доступа в Genbank M12659 М77496, включенный здесь в качестве ссылки; Rotwein et al., 1986, J.Biol. Chem. 261:4828-4832).

Продукт гена IGF-2 экспрессируется с помощью одной из четырех различных промоторных областей. Три из четырех данных промоторов подвержены импринтингу и экспрессируются в эмбриональных тканях; однако промотор Р1 активируется только в тканях взрослого организма (Sussenbach et al., 1992, Growth Reg. 2: 1-9). Промотор Р3 является вовлеченным в развитие карциномы печени. Также установлено, что подверженные импритингу промотор Р4 (последовательность от -546 до +102 нуклеотидов гена IGF-2) и промотор Р3 (последовательность от -1229 до +140 нуклеотидов гена IGF-2) активируются у человека в клетках злокачественной опухоли мочевого пузыря и могут быть использованы для управления экспрессией оперативно связанного гетерологичного гена опухолевых клеток. Промоторы Р3 и Р4 гена IGF-2 могут применяться в комбинации с энхансером гена H19 или его активными фрагментами.

Данные регуляторные последовательности подверженных и неподверженных геномному импринтингу генов, которые экспрессируются в малигнизированных клетках, могут далее для определения быть изображены в виде минимальных регуляторных последовательностей, необходимых для достижения желаемой опухоль-специфической экспрессии. Например, промоторная область может быть изменена с помощью добавлений, замен и делеций и проанализирована на предмет снижения функции опухоль-специфической экспрессии. Различные части ниже расположенного энхансера гена H19 могут быть протестированы индивидуально на предмет способности усиливать транскрипцию с промотора гена H19.

Изменения в регуляторных последовательностях могут быть произведены с помощью химических и ферментативных способов, хорошо известных специалистам в данной области. Например, могут быть удалены области последовательностей, ограниченные сайгами рестрикции. Олигонуклеотидный направленный мутагенез может быть применен для изменения последовательности определенным образом и/или для введения сайтов рестрикции в определенные области последовательности. Кроме того, могут быть получены мутанты с делецией с помощью ДНК-нуклеаз, таких как Ваl31 или ЕхоIII и S1-нуклеаза. Более обширные делеции в регуляторных последовательностях создают инкубированием ДНК с нуклеазами в течение более продолжительных периодов времени (смотри Ausubel et al., 1989 Current protocols for Molecular biology, для обзора методик мутагенеза).

Измененные последовательности оценивают на предмет их способности управлять опухоль-специфической экспрессией гетерологичных кодирующих последовательностей в подходящих клетках-хозяевах, в частности в экспрессирующих ген H19 клетках карциномы (например, в клетках карциномы мочевого пузыря, приводимые). В объеме настоящего изобретения любые измененные регуляторные последовательности, которые сохраняют свою способность управлять опухоль-специфической экспрессией, встраиваются в рекомбинантные экспрессирующие векторы для дальнейшего применения.

Большое разнообразие гетерологичных генов способно экспрессироваться под контролем данных регуляторных последовательностей, таких как гены, кодирующие токсические генные продукты, потенциально токсические генные продукты и антипролиферативные или цитостатические генные продукты. Также способны экспрессироваться маркерные гены, включающие гены ферментов (например CAT, бета-галактозидазы, люциферазы), флюоресцентных белков, таких как зеленый флюоресцентный белок, или антигенные маркеры.

Цитотоксические генные продукты широко определяют токсины и индуцирующие апоптоз агенты. Кроме того, в контексте настоящего изобретения цитотоксические генные продукты включают ферменты, метаболизирующие лекарства, которые превращают пролекарство в цитотокоический продукт. Примеры цитотоксических генных продуктов, которые могут использоваться в методах данного изобретения, включают в себя дифтерийный токсин, токсин Pseudomonas, рицин, холерный токсин, РЕ40 и гены опухолевых супрессоров, такие как ген ретинобластомы и р53. Кроме того, могут применяться последовательности, кодирующие апоптотические белки, которые индуцируют клеточный апоптоз. Подобные апоптотические белки включают бета-пептид А Альцгеймера (смотри LaFerla et al., 1995, Nat. Genet. 9:21-30), предсердный натрийуретический фактор (смотри Wu et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:14860-14866), пептид, связанный с геном кальцитонина (смотри Sacuta et al., 1996, J. Neuroiminunol. 67:103-109), так же, как и другие апоптотические белки, уже известные или которые будут открыты в будущем.

Ферменты, метаболизирующие лекарства, которые превращают пролекарство в цитотоксический продукт, включают в себя тимидинкиназу (вирусов простого герпеса или ветряной оспы), цитозиндезаминазу, нитроредуктазу, цитохром Р-450 2В1, тимидинфосфорилазу, пуриннуклеозидфосфорилазу, щелочную фосфатазу, карбоксипептидазы А и G2, линамаразу, лактамазу и ксантиноксидазу (смотри Rigg Sikora, August 1997, Mol. Med. Today, pp. 359-366 для ознакомления).

Кроме того, антисмысловые, антигенные или аптамерные олигонуклеотиды могут доставляться в малигнизированные клетки с помощью описанных здесь экспрессирующих конструкций. Рибозимы или одноцепочечные РНК также могут экспрессироваться в малигнизированных клетках для ингибирования экспрессии отдельного интересующего гена. Генами-мишенями для данных антисмысловых или рибозимных молекул должны являться гены, кодирующие продукты, которые существенны для поддержания функций клетки или для поддержания фенотипа малигнизированной клетки. Подобные гены-мишени включают гены cdk2, cdk8, cdk21, cdk25A, циклин D1, циклин Е, циклин А и cdk4, не ограничиваясь данным.

Например, экспрессирующие векторы под контролем регуляторных последовательностей подверженных импринтингу генов или промотора IGF-1, которые экспрессируются в малигнизированных клетках, антисмысловые РНК или рибозимы, специфичные по отношению к транскриптам онкогенных образований Р53, c-fos, c-jun, kr-ras и/или Her2/neu, вводятся в клетки для того, чтобы обеспечить даун-регуляцию экспрессии эндогенных генов. Опухолевые клетки, которые экспрессируют ген H19, и способны активировать регуляторные последовательности гена H19 (или которые специфически активируют промотор IGF-1, промоторы Р3 и Р4 IGF-2), могут являться специфической мишенью для экспрессии антисмысловой РНК или рибозимной РНК.

Антисмысловые подходы включают в себя создание олигонуклеотидов (в данном случае мРНК), которые комплементарны мРНК-мишени. Антисмысловые олигонуклеотиды будут связываться с комплементарными транскриптами мРНК-мишени и препятствовать трансляции. Абсолютная комплемент арность, хотя и предпочтительна, но не требуется. В данном случае последовательность, "комплементарная" части РНК, означает последовательность, обладающую достаточной комплементарностью для гибридизации с РНК, образуя стабильный дуплекс. Способность гибридизоваться будет зависеть как от степени комплементарности, так и от длины антисмысловой нуклеиновой кислоты. Как правило, чем длиннее гибридизующаяся нуклеиновая кислота, тем больше несовпадений нуклеотидов с РНК, она может содержать и все же формировать стабильный дуплекс (или триплекс в некоторых случаях). Специалисты в данной области могут установить допустимую степень несовпадения с помощью стандартных способов определения точки плавления гибридного комплекса.

Олигонуклеотиды, которые комплементарны 5'-концу последовательности-мишени, например 5'-нетранслируемая последовательность вплоть до и включая инициирующий кодон AUG, должны быть наиболее эффективны в ингибировании трансляции. Однако недавно было показано, что последовательности, комплементарные 3'-нетранслируемым последовательностям мРНК, также эффективны в ингибировании трансляции (смотри Wagner, R., 1994, Nature 372:333-335). Таким образом, олигонуклеотиды, комплементарные как 5'-, так и 3'-нетранслируемым, некодирующим областям транскриптов гена-мишени, могут использоваться в антисмысловом подходе для ингибирования трансляции эндогенных генов. Олигонукдеотиды, комплементарные 5'-нетранслируемой области мРНК, будут включать комплемент стартовому кодону AUG. Антисмысловые олигонуклеотиды, комплементарные кодирующим областям мРНК, являются менее эффективными ингибиторами трансляции, но могут быть использованы согласно данному изобретению. Чтобы создаваемая конструкция была способна к гибридизации с 5'-, 3'- или кодирующей областью мРНК-мишени, антисмысловая нуклеиновая кислота должна иметь по крайней мере длину в шесть нуклеотидов, и предпочтительными являются олигонуклеотиды длиной в пределах от 6 до приблизительно 50 нуклеотидов. В определенных случаях требуются олигонуклеотиды длиной по крайней мере 10 нуклеотидов, по крайней мере 17 нуклеотидов, по крайней мере 25 нуклеотидов или по крайней мере 50 нуклеотидов.

Невзирая на выбор последовательности мишени, предпочтительно, чтобы сначала проводились исследования in vitro для количественной оценки способности антисмысловых нуклеотидов ингибировать экспрессию гена. Данные исследования должны использовать контроль, чтобы разграничить антисенсорное ингибирование гена и неспецифические биологические эффекты олигонуклеотидов. Также предпочтительно, чтобы в данных исследованиях сравнивалось содержание РНК- или белка-мишени с РНК или белком внутреннего контроля.

Молекулы рибозима, предназначенные для каталитического расщепления исходного гена мишени, также могут применяться для предотвращения трансляции мРНК-мишени (смотри, например, РСТ International Publication WO 90/11364, published October 4, 1990; Sarver et al., 1990, Science 247:1222-1225). Когда рибозим специфичен для транскрипции гена, кодирующего белок, необходимый для роста малигнизированной клетки, подобные рибозимы могут приводить к изменению фенотипа малигнизированной клетки. Хотя рибозимы, расщепляющие мРНК в сайте специфического узнавания последовательностей, могут применяться для разрушения мРНК-мишеней, предпочтительным является применение молоткообразных рибозимов. Молоткообразные рибозимы расщепляют мРНК в положениях, определяемых фланкирующими областями, что создает комплементарные пары оснований с мРНК-мишенью. Единственным требованием является наличие в мРНК-мишени следующей последовательности из двух оснований: 5'-UG-3'. Создание и получение молоткообразных рибозимов технически хорошо известно и более подробно описано в Haseloff Gerlach, 1988, Nature, 334:585-591. Рибозим предпочтительно конструируют таким образом, чтобы сайт узнавания расщепления располагался вблизи 5'-конца мРНК мишени; т.е. для повышения эффективности и минимизации и внутриклеточного накопления нефункциональных транскриптов мРНК.

Применяемые в настоящем изобретении рибозимы также включают РНК-эндорибонуклеазы (здесь и далее называемые "рибозимы Сесh-типа"), подобно рибозиму естественно встречающемуся Tetrahymena thermophila (известные как IVS, L-19 IVS РНК), который подробно описан Thomas Cech и коллегами (Zaug et al. , 1984, Science, 224:574-578; Zaug and Cech, 1986, Science, 231:470-475; Zaug et al., 1986, Nature, 324-129-433; International Patent Application No. WO 88/04300 by University Patents Inc.; Been and Cech, 1986, Cell, 47:207-216). Рибозимы Cech типа содержат активный сайт, состоящий из восьми пар оснований, который гибридизуется с последовательностью РНК-мишени, после чего происходит расщепление РНК-мишени. Изобретение рассматривает применение данных рибозимов Cech типа, в которых мишенью для активного сайта, состоящего из восьми пар оснований, являются последовательности, присутствующие в генах-мишенях.

5.2 Активация генов в опухолевых клетках Клетки, в которых восстанавливается экспрессия подверженного импринтингу гена, будут также способны к специфической активации экспрессии конструкций, содержащих подобные регуляторные области подверженного импритингу гена, оперативно связанного с гетерологичным геном. Подобные клетки, в частности опухолевые клетки, являются подходящими мишенями для способов генной терапии данного изобретения. Специфическая экспрессия гена Н19 и промоторов Р3 и Р4 гена IGF-2 как в опухолях, так и клеточных линиях может быть определена с помощью способов анализов РНК, гибридизации in situ и репортерных генных конструкций. Кроме того, опухолевые клетки с активированной экспрессией гена IGF-1 могут быть сходным образом определены и являться мишенью для генной терапии с помощью промотора гена IGF-1, управляющего экспрессией гетерологичного гена.

Для большинства применений анализа РНК меченый зонд, который специфически гибридизуется с интересующим генным транскриптом, создают любым из многочисленных хорошо известных в данной области методов. Меченый зонд может содержать по крайней мере 15-30 нуклеотидов, комплементарых нуклеотидной последовательности гена H19, и, как правило, содержит по крайней мере от 50 до 150 нуклеотидов, комплементарных транскрипту гена H19. Обычно предпочитаемым гибридизационным зондом для экспрессии гена H19 является полинуклеотид, комплементарный 3' - концу транскрипту гена H19 от приблизительно 800 пар нуклеотидов выше сайта полиаденилирования до сайта полиаденилирования.

Специфическим осуществлением изобретения, что проиллюстрировано ниже на рабочем примере, является создание меченой антисмысловой РНК с помощью Т7 или Т3 экспрессирующей плазмиды. Зонды для гена H19 также могут быть меченными с помощью случайного прайминга присутствующих меченых нуклеотидов, например, используя Prime-It kit (Stratagene, La Jolla, CA; Catalog NO. 300392). Альтеративно меченные зонды могут быть созданы в реакции ПЦР, применяя клон кДНК кодирующей области гена H19 и праймеры, предназначенные для амплификации региона кодирующей области, или с помощью стандартной реакции ник-трансляции.

Подходящими метками для полинуклеотидных зондов являются нуклеотиды, включающие радиоактивные изотопы (такие как ³⁵S и ³²P), флуоресцентные, люминисцентные, цветные метки и ферментативные структуры.

Меченый зонд гибридизуют in situ в клетке или образце ткани с помощью стандартных технологий, подобных описанным далее в рабочем примере, и в совместно рассматриваемой патентной заявке США серийный номер 08/704,786, включенной сюда в качестве ссылки. Альтернативно, если может быть получено достаточное количество подходящих клеток, можно провести стандартные анализы РНК (такие как Нозерн-анализ, рибонуклеазная защита или удлинение праймера) для определения уровня экспрессии интересующего гена.

Кроме того, возможно провести подобный анализ экспрессии гена in situ, например непосредственно в срезах ткани (фиксированных и/или замороженных) из тканей плаценты, полученной биопсией или резекцией, таким образом не нуждаясь в проведении выделения нуклеиновой кислоты. Реагенты нуклеиновой кислоты, аналогичные описанным выше, смогут использоваться в качестве зондов и/или праймеров для подобных процедур in situ (смотри, например, Nuovo, G.J. , 1992, PCR In Situ Hybridization: Protocols And Applications, Raven Press, NY).

Альтернативным способом определения в случае, если опухоль или клетка будут способны специфически активировать экспрессирующие конструкции, содержащие частичные регуляторные области, оперативно связанные с гетерологичным геном, действительно является трансфекция подобных экспрессирующих конструкций в клетку. Для данных целей гетерологичный ген предпочтительно является продуктом маркерного гена. Положительным результатом при оценке продукта маркерного гена является то, что клетка или клеточная линия оказывается способной активировать экспрессию регуляторных областей.

Используя данные технологии, образцами типов опухолей, с активацией экспрессии гена H19 являются следующие типы: А. Солидные опухоли у детей 1. Нефробластома 2. Гепатобластома 3. Эмбриональная рабдомиосаркома В. Зародышевоклеточные опухоли и трофобластные опухоли 1. Тестикулярная зародышевая опухоль 2. Незрелая тератома яичника 3. Сакрококцигеальная опухоль 4. Хориокарцинома 5. Плацентарно-расположенная трофобластная опухоль.

С. Эпителиальные опухоли у взрослых 1. Карцинома мочевого пузыря 2. Гепатоцеллюлярная карцинома 3. Карцинома яичника 4. Карцинома шейки матки 5. Карцинома легки