Цитомодулирующие липофильные пептиды для модуляции активности иммунной системы и подавления воспаления

Цитомодулирующие липофильные пептиды для модуляции активности иммунной системы и подавления воспаления

Реферат

 

Изобретение относится к олигопептиднам, включающим аминокислотную последовательность B-X-X-X-B-X-X-X-J-Tyr, в которой В - Lys или Arg; X представляет собой любую аминокислоту, иную, чем заряженная алифатическая аминокислота, или ее D-изомер; J - Gly, Lys или Arg; указанные аминокислоты представляют собой существующие в природе L-изомеры, их D-изомеры и норлейцин, и где указанный олигопептид включает иные, чем (а) встречающаяся в природе последовательность -домена антигена-В лейкоцита человека (HLA-B) 75-84, (б) встречающаяся в природе последовательность трансмембранной последовательности -цепи Т-клеточного рецептора человека и (в) последовательность, являющаяся мутантной по отношению либо к (а), либо к (б), имеющая не более двух мутаций в качестве активной части указанного олигопептида; способу подавления активации лимфоцитных клеток, способу трансплантации донорных органов или клеток млекопитающих, способу ингибирования синтеза белка воспалительного цитокина клетками, способными продуцировать указанный белок воспалительного цитокина, способу подавления воспалительной реакции у млекопитающих, способу модуляции активности гемсодержащего фермента и способу задержки наступления аутоиммунной болезни у млекопитающего. 7 с. и 29 з.п. ф-лы, 3 табл., 2 ил.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ Данное изобретение относится к области химии и медицины, более конкретно к новым пептидам, полезным для модуляции активности клеток иммунной системы и для подавления воспаления.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ Иммунная система представляет собой чрезвычайно сложную комбинацию клеток и композиций, которая защищает хозяина, представляющего собой млекопитающего, от широкого разнообразия патогенов, и в то же время осуществляет контроль в его теле за вредными аберрациями, такими, как новообразования. Одна ветвь иммунной системы включает клетки, которые осуществляют функции иммунной системы, (а) лимфоциты, такие, как происходящие из костного мозга В-лимфоциты и происходящие из вилочковой железы клетки Т-лимфоциты и клетки, являющиеся естественными киллерами (NK), и (б) одноядерные фагоциты, включающие как моноциты, так и макрофаги. В то время, как лимфоциты в первую очередь связаны со специфическими иммунными реакциями, благодаря их способности специфически распознавать и отличать антигенные детерминанты, одноядерные фагоциты чаще всего осуществляют общее удаление чужеродных микроорганизмов посредством фагоцитоза, а также синтез и выделение цитокинов, что индуцируется либо непосредственно самим микроорганизмом, либо в ответ на стимулированные антигеном Т-лимфоциты. Функции лимфоцитных клеток и одноядерных фагоцитов тесно связаны и имеют важное значение для правильного функционирования иммунной системы.

Одной из важных субпопуляций лимфоцитных клеток являются Т-лимфоциты, которые получили свое название из-за того факта, что они вырабатываются тимусом (вилочковой железой). Т-лимфоциты представляют собой группу клеток, включающую комплекс различных клеток, которые могут быть цитотоксическими, обладающими многочисленными механизмами, вызывающими гибель клеток, или активирующими, путем синтеза различных цитокинов, функция которых заключается в активировании других клеток. Цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ) действуют, будучи ограниченными конкретным антигеном главного комплекса гистосовместимости (ГКГ), и экспрессируют Т-клеточный рецептор клеточной поверхности, который включает как -, так и -цепь, и который имеет специфическое сродство к конкретному комплексу ГКГ, связанное с пептидом в желобке этого ГКГ. ЦТЛ "подогнаны" таким образом, что в норме они не действуют против тех клеток, у которых находящийся в желобке пептид является эндогенным для хозяина. Однако в том случае, когда ГКГ является чужеродным или находящийся в желобке пептид является чужеродным для хозяина, то ЦТЛ атакуют такие клетки и уничтожают их. Другие лимфоцитные клетки, которые играют важную роль в иммунной реакции, включают В-лимфоциты и NK-клетки (естественные киллеры), причем на активность обоих этих типов клеток могут влиять другие клетки иммунной системы и различные полипептиды цитокинов.

Одноядерные фагоциты составляют другую основную популяцию клеток иммунной системы и состоят из клеток, имеющих общую линию дифференцировки, главной функцией которых является фагоцитоз. Одноядерные фагоциты происходят из клеток-предшественников ствола костного мозга, и после созревания и последующей активации они могут приобретать различные морфологические формы, включая неполностью дифференцированные моноцитные клетки и макрофаги. Должное функционирование одноядерных фагоцитов зависит от способности как продуцировать различные цитокиновые белки, так и реагировать на них.

Цитокины, такие, как различные интерфероны, интерлейкины, факторы некроза опухолей, хемокины, гематопоэтические факторы роста и факторы торможения миграции клеток представляют собой группу различных белков, синтезируемых широким разнообразием различных типов клеток иммунной системы. Наиболее важным является то, что цитокины продуцируются различными лимфоцитами и одноядерными фагоцитами и/или на них реагируют в ответ на различные воздействия. В основном цитокины продуцируются во время эффекторной фазы как естественного, так специфического иммунитета и служат посредниками и регуляторами как иммунной, так и воспалительной реакций. Цитокины, как и другие полипептидные гормоны, начинают свое действие со связывания специфических рецепторов на поверхности клеток-мишеней, причем их активация часто приводит к воспалительной реакции.

Хотя активация иммунного ответа и индуцированные цитокином воспалительные реакции чрезвычайно важны для здоровья хозяина и для правильного функционирования иммунной системы, существует ряд ситуаций, в которых такая активация является нежелательной. Одна из таких конкретных ситуаций связана с трансплантацией, при которой очень редко бывает идентичная совместимость между антигенами ГКГ донора и реципиента. Вторая ситуация связана с тем, что в результате "сбоя" в части ЦТЛ они атакуют клетки, у которых как ГКГ, так и связанный с ним пептид являются эндогенными, что имеет место при аутоиммунных болезнях, таких, как инсулинзависимый сахарный диабет (ИЗСД). Кроме того, бывают случаи, когда опосредованные цитокинами функции воспалительной реакции отрицательно влияют на здоровье хозяина, например, воспалительные реакции, связанные с такими заболеваниями, как септический шок, ревматоидный артрит, болезнь Крона, колит и тому подобными. Главным подходом для разрешения ситуаций, когда активация ЦТЛ нежелательна, стала иммуносупрессия. Однако иммуносупрессанты, такие, как циклоспорин A, FK-506 и им подобные, имеют многочисленные нежелательные побочные действия. Кроме того, применялись различные подходы, направленные на контролирование или подавление воспалительных реакций, однако многие из этих подходов также имеют один или несколько нежелательных эффектов. Поэтому существует значительный интерес к идентификации новых агентов, которые могут подавлять активацию лимфоцитных клеток, в частности ЦТЛ, и в то же время обладают менее универсальным иммуноподавляющим действием на иммунную систему и имеют меньше побочных действий, чтобы оставить хозяина с существенной частью его иммунной системы для защиты от случайных инфекций. Существует также значительный интерес к идентификации новых агентов, функция которых заключается в контролировании или подавлении воспалительных реакций.

В последние несколько лет появились сообщения о том, что олигопептиды эффективны для модуляции активности иммунной системы и увеличения продолжительности жизни аллогенных трансплантатов. Эти олигопептиды основаны на ₁-домене антигена-В лейкоцита человека (HLA-B) и имеют консервативную аминокислотную последовательность Аrg-Х-Х-Х-Аrg-Х-Х-Х-Х-Тyr, в которой различные аминокислоты, обозначенные как X, варьируют в пределах относительно небольшого числа аминокислот, чтобы сохранить активность (например, см. WO 95/13288). Механизм, с помощью которого эти олигопептиды воздействуют на активность иммунной системы, неясен, в частности неясно, как они взаимодействуют с субтерапевтическими дозами циклоспорина, увеличивая при этом срок жизни аллогенных трансплантатов.

Сообщается также (Manolios, NOVEL PEPTID, заявка на патент РСТ, поданная на основе Австралийских заявок PN 0589 и PN 0590 16 января 1995) о действии на опосредованное Т-клетками воспаление, оказываемое олигасахаридами формулы A-B-C-D-E, в которой А отсутствует или представляет собой 1 или 2 гидрофобных остатка; В представляет собой положительно заряженную аминокислоту; С представляет собой пептид, состоящий из 3 - 5 гидрофобных аминокислот; D представляет собой положительно заряженную аминокислоту и Е отсутствует или представляет собой до 8 гидрофобных аминокислот. Пептиды, которые были синтезированы, представляют собой Gly-Leu-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val; Met-Gly-Leu-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu; Leu-Gly-Ile-Leu-Leu-Leu-Gly-Val; Leu-Asp-Ile-Leu-Leu-Leu-Gly-Val; Leu-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Ile-Leu-Val и Leu-Arg-Leu-Leu-Leu-Lys-Val. Эти последовательности предсказаны по последовательности трансмембранной последовательности TCR-. В этой заявке нет доказательств того, что эти пептиды оказывают благоприятное действие на увеличение продолжительности жизни трансплантатов.

ОТНОСЯЩАЯСЯ К НАСТОЯЩЕЙ ЗАЯВКЕ ЛИТЕРАТУРА Buelow et al., Transplantation 59:649-654 (1995) и ссылки на литературу, цитированную в этой публикации. Manolios et al., Nature Medicine 3:84-88 (1997) описывает полученные на основе логической схемы полипептиды, которые модулируют активность Т-клеток. Публикация WO 95/13288, Clayberger et al., в которой описываются пептиды, способные модулировать активность Т-клеток. Ссылки, описывающие способы конструирования соединений с помощью компьютера с использованием взаимосвязи структуры с активностью, включая Grassy et al., J. оf Molecular Graphics 13:356-367 (1995); Haiech et al., J. оf Molecular Graphics 13: 46-48 (1995); Yasri et al., Protein Engineering 11:959-976 (1996) и Ashton et al., Drug Discovery Today 1:71-78 (1996).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ Предлагаются цитомодулирующие пептиды, которые способны (1) модулировать активность различных клеток иммунной системы, в частности лимфоцитных клеток, более конкретно ЦТЛ, (2) подавлять синтез "воспалительных" цитокинов клетками, способными продуцировать такие цитокины, являясь поэтому эффективными для лечения состояний, связанных с неблагоприятными воспалительными реакциями, (3) модулировать активность гемсодержащих ферментов и/или (4) задерживать наступление инсулинзависимого сахарного диабета (ИЗСД) у хозяина, восприимчивого к ИЗСД или имеющего ИЗСД, причем пептиды основаны на схеме, полученной в результате компьютерного программирования. Примерами этих соединений являются олигопептиды, включающие последовательность В-Х-Х-Х-В-Х-Х-X-J-Tyr, в которой В представляет собой основную аминокислоту, J представляет собой Gly, В или алифатическую гидрофобную аминокислоту, содержащую от 5 до 6 атомов углерода, и Х представляет собой любую аминокислоту, иную, чем алифатическая полярная аминокислота, в которой по меньшей мере три Х представляют собой одну и ту же алифатическую неполярную аминокислоту, ее димеры и ее D-стереоизомеры, и при этом аминокислотная последовательность может представлять собой часть кольца. Эти пептиды находят применение для подавления активации лимфоцитов иммунной системы, в частности цитотоксических лимфоцитов, либо отдельно, либо совместно с другими иммуносупрессантами, в частности, для увеличения продолжительности жизни трансплантатов. Описываемые здесь пептиды также находят применение для подавления синтеза воспалительных цитокинов (например, -интерферона, IL-1, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-16, MIPl и т.п.), тем самым являясь полезными для подавления воспалительных реакций, связанных с различными заболеваниями, такими, как ревматоидный артрит, септический шок, болезнь Крона, колит, аллергические реакции, аутоиммунные заболевания и тому подобные, для подавления активности гемсодержащих ферментов, таких, как гемоксигеназа, синтаза окиси азота и др. , и задержки наступления ИЗСД у пациентов, подверженных риску ИЗСД, как in vitro, так и in vivo. Введение пептидов может осуществляться ех vivo для подлежащего пересадке органа или in vivo, любыми удобными способами, включая прямое применение или введение пептида или нуклеиновой кислоты, кодирующей желаемый пептид, в количестве, достаточном для существенного подавления активации лимфоцитов, подавления синтеза воспалительных цитокинов и связанного с ними воспалительного процесса, подавления активности основанных на геме ферментов, активности, которая была предварительно связана с воспалительными реакциями и/или для задержки наступления ИЗСД.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ Фиг. 1 изображает конформационное пространственное образование кластеров пептида bcl-nL. Представленные конформации получены из анализа кластеров траектории пептида bcl-nL.

Фиг. 2 изображает проекции траекторий пептида в главный план эталонной траектории пептида D2.

ОПИСАНИЕ КОНКРЕТНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ Предлагаются способы и композиции для модуляции активности клеток иммунной системы, в частности Т- и В-клеток и одноядерных фагоцитов, более конкретно активности клеток ЦТЛ и NK, in vitro и in vivo. Предлагаются также способы и композиции, эффективные для подавления синтеза воспалительного цитокина (цитокинов), вследствие этого находящие применение в терапевтическом лечении заболеваний, связанных с вредными воспалительными реакциями, для подавления активности различных гемсодержащих ферментов и/или для задержки наступления аутоимунных заболеваний, таких, как ИЗСД. Пептиды, обладающие специфическим действием в качестве пептидов, цитомодулирующих клетки ЦТЛ и NK, получены в соответствии с компьютерной программой, как описано в относящейся к данной заявке литературе. Следуя методике, описанной в указанной выше публикации Grassy et al., определили параметры, основанные на известных олигопептидах, для которых ранее была установлена способность подавлять активность Т-клеток. См. , например, Buelow et al., выше. Конформационное пространство, необходимое для иммуносупрессивной активности, было рассчитано так, как описано в указанной выше публикации Yasri et al.

Используя эти параметры, показали, что соединения, обладающие известной ингибиторной активностью по отношению к Т-клеткам, находятся в пределах этих параметров, и стало возможным разработать и испытать ряд новых пептидных соединений. Новые пептидные соединения оказались обладающими активностью от равной до превосходящей показатели известных соединений. Известные активные соединения включают -домен HLA-B (антигена-В лейкоцита человека), в частности аминокислоты от 75 до 84 и вариации этой последовательности, в которых заменены не более двух аминокислот, при этом эти аминокислоты не включают R и Y, поскольку настоящее изобретение не охватывает такие известные соединения (см. , например, WO 95/13288 и цитированную выше публикацию Buelow et al). Известны также последовательности, основанные на трансмембранной области TCR- человека, состоящей из этой последовательности и последовательностей, имеющих не более 2 мутаций в этой последовательности. Эти последовательности включают 2 основные аминокислоты, причем эти 2 основные аминокислоты отделены друг от друга четырьмя алифатическими гидрофобными аминокислотами, хотя в заявке указывается, что могут присутствовать от 3 до 5 гидрофобных аминокислот. Под мутацией подразумевается любое замещение одной аминокислоты другой аминокислотой или вставка, или делеция, каждая из которых считается за одну мутацию.

Желательно, чтобы в кор-последовательности описываемых здесь новых пептидных соединений имелись две или три основные аминокислоты, отделенные друг от друга гидрофобными аминокислотами в количестве от трех до четырех, в частности тремя гидрофобными аминокислотами, в частности, где N-конец представляет собой основную аминокислоту. Более желательно, чтобы С-концевая аминокислота представляла собой ароматическую аминокислоту, в частности тирозин. Особенно желательно, чтобы по меньшей мере одна из концевых аминокислот кор-олигопептида представляла собой аминокислоту окончания олигопептида, которая может иметь форму мономерного или олигомерного соединения.

Разработали новые выделенные пептидные соединения, включающие последовательность B-X-X-X-B-X-X-X-J-Tyr, в которой В представляет собой основную аминокислоту, а именно Lys или Аrg, в частности Аrg, по меньшей мере в одном положении, предпочтительно в обоих положениях, J представляет собой Gly, В или алифатическую гидрофобную кислоту, содержащую от 5 до 6 атомов углерода, в частности Gly или В, и Х представляет собой любую аминокислоту, иную, чем алифатическая заряженная аминокислота, предпочтительно любую аминокислоту, иную, чем полярная аминокислота, в которой по меньшей мере три Х представляют собой одну и ту же алифатическую неполярную аминокислоту, предпочтительно по меньшей мере четыре, Х представляют собой одну и ту же алифатическую неполярную аминокислоту и более предпочтительно - по меньшей мере все, кроме одного X, представляют собой одну и ту же алифатическую неполярную аминокислоту, олигомеры, в частности ее димеры и ее D-стереоизомеры, и при этом аминокислотная последовательность может представлять собой часть кольца.

Любой из N- и С-концов или оба эти конца часто могут быть увеличены, но не более чем (в сумме) на около 100, обычно не более чем на около 30, более обычно не более чем на около 20 аминокислот, часто не более чем на 9 аминокислот, причем аминокислоты имеют менее 25%, более обычно менее 20% полярных аминокислот, более конкретно менее 20% аминокислот, являющихся заряженными аминокислотами. Кроме того, концевая аминогруппа или карбоксильная группа олигопептида может быть модифицирована путем алкилирования или ацилирования с образованием эфиров, амидов или замещенных аминогрупп, причем алкильная или ацильная группа может иметь около от 1 до 30, обычно от 1 до 24, предпочтительно либо от 1 до 3, либо от 8 до 24, в частности от 12 до 18 атомов углерода.

Сюда также входят олигомеры, в частности димеры олигопептидов, которые могут быть типов "от головы к голове", "от хвоста к хвосту" или "от хвоста к голове", причем в них имеется не более шести повторов пептида. Кроме того, 1 или более аминокислот, вплоть до всего количества аминокислот, могут представлять собой D-стереоизомеры.

Кроме того, могут использоваться также структурно-ограниченные олигопептиды, такие, как циклические пептиды, содержащие примерно от 9 до 50, обычно от 12 до 36 аминокислот, причем аминокислоты, иные, чем указанные аминокислоты, могут присутствовать в качестве мостика. В некоторых случаях можно использовать мостики, представленные не аминокислотами. Имея концевые цистеины, можно сформировать дисульфидный мостик, замыкающий кольцо. Альтернативные способы образования кольца можно найти в публикациях Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:5872-5876 (1992) и Wu et al., Protein Engineering 6:471-478 (1993).

Для целей настоящего изобретения аминокислоты (для большей части природных аминокислот или их D-стереоизомеров) разбиты на следующие категории.

1. Алифатические (а) неполярные алифатические: Gly, Ala, Val, nL, Ile, Leu, (б) полярные алифатические: (1) незаряженные Cys, Met, Ser, Thr, Asn, Gln, (2) заряженные: Asp, Glu, Lys, Arg, 2. Ароматические Phe, His, Trp, Tyr в которых Pro может быть включен в неполярные алифатические аминокислоты, но обычно не включен в них. nL означает норлейцин, в котором неполярные алифатические аминокислоты могут быть замещены другими изомерами.

Предпочтительно, чтобы по меньшей мере 3 из шести аминокислот, обозначенных как Х в пептидной последовательности B-X-X-X-B-X-X-X-J-Tyr, представляли собой алифатические аминокислоты, содержащие от 5 до 6 атомов углерода, более предпочтительно, чтобы по меньшей мере 4 аминокислоты представляли собой алифатические аминокислоты, содержащие от 5 до 6 атомов углерода, более конкретно 6 атомов углерода. Другие аминокислоты могут представлять собой другие незаряженные алифатические аминокислоты, в частности неполярные алифатические аминокислоты или ароматические аминокислоты.

Кор-последовательность может быть увеличена в любом направлении с помощью аминокислот, которые в большинстве случаев являются липофильными, а именно алифатическими незаряженными аминокислотами, и ароматическими аминокислотами. Кроме того, как указано ранее, один или оба, а обычно один конец олигопептида может быть замещен липофильной группой, обычно алифатической или аралкильной, имеющей от 8 до 36, обычно от 8 до 24 атомов углерода и менее двух гетероатомов в алифатической цепи, причем гетероатомы обычно представляют собой, кислород, азот и серу. Цепь может быть насыщенной или ненасыщенной, желательно имеющей не более 3 сайтов, обычно не более 2 сайтов, алифатической ненасыщенности. Удобно, что можно использовать коммерчески доступные алифатические жирные кислоты, спирты и амины, такие, как лауриновая кислота, миристиловый спирт, стеариловый амин и т.п. Может быть проведена реакция липофильных групп с соответствующей функциональной группой олигопептида в соответствии с обычными способами, часто во время синтеза на носителе, в зависимости от сайта прикрепления олигопептида к носителю.

Композиции, представляющие особый интерес, имеют следующую формулу: Arg-U-X-X-Arg-X-X-X-J-Tyr, в которой все символы были определены выше, за исключением U, и U представляет собой незаряженную алифатическую аминокислоту или ароматическую аминокислоту, в частности неполярную алифатическую аминокислоту или ароматическую аминокислоту.

Последовательности по настоящему изобретению находят различное применение. В исследовательских целях их можно использовать для анализа физиологических путей, связанных с активацией и деактивацией ЦТЛ. Можно комбинировать ЦТЛ, в частности клеточные линии ЦТЛ, имеющие известные пептидные мишени, с пептидами по настоящему изобретению, в частности помеченными радиоактивной меткой, в присутствии или в отсутствие антигенпредставляющих клеток, по отношению к которым узко применимы эти ЦТЛ. После лизиса, осуществленного с помощью ЦТЛ, можно отделить активированные клетки ЦТЛ от покоящихся клеток ЦТЛ, с помощью маркера CD69, который отрегулирован in vitro на активацию. Разделение можно выполнить с помощью FACS (клеточного сортера с возбуждением флуоресценции) и анти-CD69, помеченного флуоресцентной меткой.

Выделив наиболее флуоресцентные клетки, например, с наиболее высоким показателем в 25%, затем лизируют эти клетки и выделяют белки, связанные с используемыми маркерами, например, с помощью хроматографии, неденатурирующего электрофореза или тому подобного. В качестве альтернативы белки разделяют с помощью электрофореза, а затем используют вестерн-блоттинг или другие методики с мечеными пептидами, чтобы идентифицировать белки, с которыми связаны пептиды по настоящему изобретению. Вместо радиоактивной метки можно использовать любой другой тип метки, обычно небольшую молекулу органического вещества, такого, как биотин, флюоресцентное вещество и т.п. Если используют биотин, то после разделения можно добавить авидин, причем авидин помечен с помощью метки, описанной выше.

Можно также сравнить Т-клетки, которые были объединены с антигенпредставляющими клетками в присутствии и в отсутствие пептидов по настоящему изобретению. В каждом случае можно получить библиотеки кДНК и использовать репрезентативный дифференциальный анализ, вычленение или тому подобные методы, чтобы обнаружить различия в экспрессии между клетками, которые были активированы в присутствии и в отсутствие пептидов по настоящему изобретению. Можно также определить, отличается ли реакция определенных субпопуляций ЦТЛ от реакции других субпопуляций на пептиды по настоящему изобретению, на основе их экспрессии или отсутствия экспрессии одного или более белков, в частности белков поверхности мембран. Таким образом можно идентифицировать ЦТЛ, которые можно удалить с помощью лейкофореза и подобных методов, чтобы свести к минимуму нежелательную атаку ткани клетками ЦТЛ.

Сообщается, что пептиды -домена антигена-В лейкоцита человека (HLA-B) связываются с hsc70, который, как известно, служит шапероном ("спутником") и связывается с рядом последовательностей в своей роли шаперона.

В зависимости от их предполагаемого использования, в частности для введения относящимся к млекопитающим хозяевам, пептиды по настоящему изобретению можно модифицировать в широких пределах, чтобы заменить их распределение в кровотоке, уменьшить или увеличить связывание с компонентами крови, увеличить продолжительность жизни пептида в кровотоке и т.п. Пептиды по настоящему изобретению могут быть связаны с этими другими компонентами с помощью линкеров, которые являются расщепляющимися или нерасщепляющимися в физиологической среде крови. Эти пептиды могут быть присоединены в любой точке пептида, в которой присутствует функциональная группа, такая, как гидроксильная, тиольная, карбоксильная, аминогруппа или тому подобные. Желательно, чтобы связывание происходило либо в N-конце, либо в С-конце.

Пептид может быть присоединен к широкому разнообразию других олигопептидов или белков для разных целей. Например, пептиды по настоящему изобретению могут быть ковалентно связаны с иммуногеном для выработки антител по отношению к пептидам по настоящему изобретению, причем антитела могут служить для идентификации других пептидов, имеющих сравнимую конформацию. Кроме того, антитела можно использовать для получения антиидиотипических антител, которые могут конкурировать с пептидами по настоящему изобретению за связывание с сайтом-мишенью. Эти антиидиотипические антитела затем можно использовать для идентификации белков, с которыми связываются пептиды по настоящему изобретению.

В качестве альтернативы пептиды по настоящему изобретению могут экспрессироваться в соединении с другими пептидами или белками, составляя при этом часть цепи, либо внутреннюю, либо N- или С-конец. Путем обеспечения экспрессии пептидов по настоящему изобретению, можно добиться различных послеэкспрессионных модификаций. Например, посредством использования соответствующих кодирующих последовательностей можно добиться липидизации, например пренилирования или миристоилирования. В этой ситуации пептид по настоящему изобретению должен быть связан с липидной группой в конце, чтобы он был способен связываться с липидной мембраной, такой, как липосома. Для введения лекарственного средства можно использовать липосомы, в которых лекарство может быть введено в люмен липосомы, для того чтобы оно взаимодействовало с пептидами по настоящему изобретению в уменьшении активации ЦТЛ. Таким образом, иммуносупрессанты можно включить в люмен, для того чтобы иммуносупрессант и пептид по настоящему изобретению могли действовать локализованно.

Пептиды по настоящему изобретению можно ПЭГилировать, при этом полиэтиленоксигруппа обеспечивает увеличение продолжительности жизни в кровотоке. Пептиды по настоящему изобретению можно также соединять с другими белками, такими, как Fc или изотип IgG, которые могут комплементарно связываться или не связываться комплементарно, или с токсином, таким, как рицин, абрин, токсин дифтерии или тому подобными, в частности с А-цепью.

Можно получить эти композиции посредством получения гена, кодирующего определенный пептид или белок, соединенного с последовательностью ДНК, кодирующей пептид по настоящему изобретению. Этот ген можно ввести в соответствующий вектор экспрессии, множество которых коммерчески доступны, в результате чего ген затем экспрессируется в соответствующем хозяине. См. Sambrook et al., Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring. Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Пептиды по настоящему изобретению можно получить посредством химического синтеза или с помощью рекомбинантных технологий, как указано выше. В продаже имеются различные аппараты для синтеза, например автоматические синтезаторы компании Applied Biosystems Inc., Foster City, Beckman, CA, и др. При использовании синтезаторов натуральные аминокислоты можно заменить аминокислотами искусственного происхождения, в частности D-стереоизомерами, боковыми цепями, имеющими различную длину или функциональность, и тому подобным. Что касается рекомбинантных методов, можно получить последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую множество пептидов по настоящему изобретению в тандеме, с помощью вставочной аминокислоты или последовательности, что позволяет осуществить расщепление до отдельного пептида или димера "от головы до хвоста". В случае, если отсутствует метионин, можно использовать вставочный метионин, который позволяет осуществить расщепление отдельной аминокислоты. В качестве альтернативы, можно ввести консенсусные последовательности, которые распознаются особыми протеазами для ферментативного расщепления. Конкретная последовательность и способ получения определяются имеющимися возможностями, экономическими соображениями, требуемой степенью чистоты и тому подобным.

Химическое связывание можно осуществить с различными пептидами или белками, включающими подходящие для образования химических связей функциональные группы, такие, как аминогруппы для образования амидов или замещенных аминов, например, для восстановительного аминирования, тиольные группы для образования тиоэфира или дисульфида, карбоксильные группы для образования амидов и тому подобное. Особый интерес представляют пептиды, имеющие по меньшей мере 2, более обычно 3 и не более чем около 60 лизиновых групп, в частности полилизины, имеющие примерно от 4 до 20, обычно от 6 до 18 лизиновых единиц, называемые MAP, в которых пептиды по настоящему изобретению связаны с лизиновыми аминогруппами, как правило, составляющими по меньшей мере около 20%, более обычно по меньшей мере около 50% от имеющихся аминогрупп, что обеспечивает получение мультипептидного продукта. Таким образом, можно получить молекулы, имеющие множество пептидов по настоящему изобретению, в которых ориентация пептидов по настоящему изобретению осуществляется в одном и том же направлении, и в результате получают связывающую группу, обеспечивающую ди- или олигомеризацию "от хвоста до хвоста". В качестве альтернативы можно использовать другие природные или синтетические пептиды и белки, чтобы получить скелет для прикрепления к нему пептидов по настоящему изобретению в С-конце.

В большинстве случаев используемые композиции включают по меньшей мере 20% по массе желаемого продукта, более обычно по меньшей мере 75% по массе, предпочтительно по меньшей мере около 95% по массе, а для терапевтических целей - обычно по меньшей мере около 99,5% по массе по отношению к примесям, связанным со способом получения продукта и его очистки. Обычно эти проценты основаны на общем количестве белка.

При желании в пептид можно ввести различные группы во время синтеза или во время экспрессии, что позволит осуществить связывание с другими молекулами или с поверхностью. Так, цистеины можно использовать для получения тиоэфиров, гистидины - для связывания с комплексом ионов металла, карбоксильные группы - для образования амидов или сложных эфиров, аминогруппы - для образования амидов и т.п. В качестве альтернативы можно использовать большое разнообразие меток, как описано выше, включая лиганды для связывания с антителами или естественными рецепторами, причем пептиды могут быть присоединены к носителю или, в качестве альтернативы, к другой молекуле. Как уже указывалось, пептиды по настоящему изобретению могут связываться с hsc70, что позволяет произвести выделение и очистку hsc70 от других белков, находящихся в клетке.

Пептиды по настоящему изобретению можно использовать для модуляции пролиферации и/или активации клеток ЦТЛ и/или NK. Путем соединения пептидов по настоящему изобретению с лимфоцитами модулируют пролиферацию и/или активацию ЦТЛ с помощью антигенпредставляющих клеток, как правило, по меньшей мере примерно на 20%, более обычно - по меньшей мере на 40% и предпочтительно - по меньшей мере примерно на 60%, на основе процента лизиса, как описано в экспериментальном разделе. Ингибирующая концентрация ИК₅₀ для лизиса в основном составляет менее чем около 500 мкг/мл, как правило, менее чем около 200 мкг/мл и более чем около 0,1 мкг/мл, обычно более чем около 1 мкг/мл.

Композиции по настоящему изобретению можно использовать in vitro для подавления лизиса антигенпредставляющих клеток Т-клетками (первые являются мишенью вторых). Таким образом, в тех исследованиях, в которых желательно поддерживать смеси клеток, в которых клетки ЦТЛ были бы активированными и уничтожали антигенпредставляющие клетки, такие, как макрофаги или В-лимфоциты, или другие клетки, которые могли бы служить клетками-мишенями, например клетки новообразований, инфицированные вирусом клетки или тому подобные, лизис можно подавлять, что позволит поддерживать клеточную популяцию в течение эксперимента.

Композиции по настоящему изобретению можно также использовать ex vivo. В случае трансплантации органов, в частности твердых органов или определенных клеток, ксеногенных или аллогенных, донорный орган может быть погружен в ванну со средой, включающей пептиды по настоящему изобретению. В результате этого не допускается участие присутствующих в имплантате ЦТЛ в реакции "трансплантат против хозяина". Кроме того, в течение того периода, когда пептиды по настоящему изобретению остаются связанными с имплантатом, подавляется активация ЦТЛ реципиента. Как правило, концентрация пептида в среде варьирует в зависимости от активности пептида, уровня желаемого подавления, присутствия других соединений, отрицательно влияющих на активацию ЦТЛ и т.п. Как правило, концентрация находится в интервале примерно от 0,1 до 100 мкг/мл, более обычно - в интервале примерно от 1 до 10 мкг/мл. Другие иммуносупрессанты, которые также могут присутствовать, включают циклоспорин A, FK506, антитела для белков плазменной мембраны, связанные с отторжением трансплантата, такие, как антитела к CD4, CD8, CD2, LFA-1, ICAM-1, CD28 и тому подобные. Применяют субтерапевтические дозировки, как правило, если они присутствуют, в количестве не менее чем около 5% от обычной дозировки и не более чем около 75%, обычно в интервале примерно от 10 до 60%. Другие компоненты среды для ванны, в которую погружают трансплантаты, обычно представляют собой компоненты, обычно используемые в растворах для сохранения органов, например HBSS. Время, в течение которого орган поддерживается в среде, обычно находится в интервале от 2 до 72 часов.

Композиции по настоящему изобретению также можно применять in vivo, путем введения композиций пептидов по настоящему изобретению любым удобным способом. Композиции по настоящему изобретению можно вводить перед имплантацией, при этом введение обычно начинают не ранее чем примерно за 14 суток до имплантации и предпочтительно по меньшей мере одну дозу вводят в течение трех суток введения. Композиции по настоящему изобретению можно вводить в период времени, начинающийся примерно за 6 часов до имплантации, и можно продолжать введение в течение предусмотренного схемой введения времени после имплантации, обычно не более 30 суток после имплантации, более обычно не более 20 суток после имплантации. Однако после имплантации композиции пептидов по настоящему изобретению можно вводить по мере необходимости, в зависимости от реакции реципиента на орган или клетки. В некоторых ситуациях композиции по настоящему изобретению можно водить хронически, в течение всего времени, пока имплантат присутствует в организме хозяина.

Как правило, в случае, если пептидную композицию вводят непосредственно хозяину, то вводимый болюс с композицией по настоящему изобретению содержит в интервале примерно от около 0,1 до 50, более обычно - от около 1 до 25 мг/кг, в расчете на массу тела хозяина