Гибридный белок для ингибирования дегрануляции мастоцитов и его применение

Гибридный белок для ингибирования дегрануляции мастоцитов и его применение

Реферат

 

Изобретение относится к гибридному белку, содержащему (I) известный белок, который связывается с мастоцитами и/или базофилами известным образом или абсорбируется таким образом, и (II) протеазу, которая расщепляет один или более чем один белок аппарата секреции мастоцитов и/или базофилов, или состоящему из них. Гибридный белок по изобретению обладает высокой ингибирующей активностью по отношению к грануляции мастоцитов. 3 с. и 2 з.п. ф-лы.

Аллергические реакции немедленного типа характеризуются тем, что пациенты, к которым это относится, вырабатывают антитела IgE-типа против аллергенов (например, цветочной пыльцы, домашней пыли, клещей, шерсти животных). Эти антитела циркулируют не только в крови, но также связаны с присутствующими в ткани клетками, экспонирующими в плазматической мембране специфичный рецептор к участку молекулы IgE, Fc-фрагменту (Fishman & Lorberboum-Galski 1997; Hamawy 1997). Клетками с рецепторами IgE являются исключительно мастоциты и базофилы. Эти клетки представляют собой клетки, осуществляющие аллергическую реакцию немедленного типа. Они содержат пузырьки, содержащие вазоактивные амины, а также простагландины и лейкотриены (производные арахидоновой кислоты). Высвобождение этих веществ, приводящее к дегрануляции мастоцитов, происходит посредством специфического и неспецифического механизма. Как только клетки механически разрушаются, например путем царапины на коже, неспецифически высвобождается гистамин. Кожа около раны становится красной. Образуется крапивница (отеки) и чешется кожа (тройной ответ). Вещества, специфически высвобождающие гистамин, эффективны в относительно низких концентрациях и запускают следующий каскад реакций (сигнальный каскад): активация фосфолипазы С - образование вторичных мессенджеров "диацилглицерина" и "IP3" - мобилизация кальция из клеточных депо - слияние гранул с клеточной мембраной - экзоцитоз гранул без цитолиза - обмен натрия на положительно заряженный гистамин комплекса с гепарином и основным белком - высвобождение гистамина из матрикса гранул. Если имеет место контакт между мастоцитами субъекта, имеющего аллергию, и аллергеном, молекулы IgE на клеточной поверхности связывают этот аллерген. Как только молекулы аллергена связаны в достаточных количествах, происходит агрегация рецепторов в плазматической мембране. Агрегация является специфическим стимулом для индукции вышеописанного сигнального каскада внутри клетки. Высвободившиеся вещества вызывают аллергические симптомы (конъюнктивит, ринит, астму, отек гортани, крапивницу, кровяное давление снижается до резко выраженного анафилактического шока). Пептиды, содержащиеся в токсине пчелы, такие как мастоцит-дегранулирующий пептид (MCD), также влияют на дегрануляцию мастоцитов. Кроме того, некоторые фармацевтические препараты вызывают специфическое высвобождение гистамина как нежелательный эффект. Высвобождение гистамина у людей описано для миорелаксантов, декстранов, ацетилсалициловой кислоты (аспирина), морфина, антибиотиков, контрастных веществ в рентгенографии, чужеродных сывороток и тому подобного.

Если слияние пузырьков с плазматической мембраной успешно ингибируется, тогда не происходит высвобождения аминов и производных арахидоновой кислоты. В результате не индуцируются аллергические реакции. Несколько белков (белков слияния) вовлечены в процесс секреции и высвобождение, эти белки, соответственно, могут быть связаны с мембранами секреторных пузырьков и/или с плазматической мембраной. Подобным образом они могут находиться в цитозоле. Представителями этих белков являются SNAP 25, синаптобревин (VAMP), синтаксин и его изоформы, соответственно. Эти белки образуют комплекс (комплекс слияния), фиксирующий секреторные пузырьки на внутренней стороне плазматической мембраны. Такая фиксация предшествует слиянию пузырьков с плазматической мембраной, причем указанное слияние индуцируется притоком Са⁺⁺, вызванным IgЕ. Образование комплекса ингибируется путем инактивации одного из этих белков, например путем протеолитического расщепления.

Известно, что упомянутые белки слияния являются молекулами-мишенями (субстратами) легких цепей нейротоксинов, продуцируемых бациллой Clostridium botulinum в нервных клетках (Ahnert-Hilger & Bigalke, 1995; Bigalke 1999 в печати). В настоящее время известны семь различных типов ботулинических токсинов (А, В, С1, D, Е, F и G). Упомянутый синаптобревин, кроме того, является молекулой-мишенью для TeNT (Link et al., 1993), продуцируемого Clostridium tetani, а также для протеазы из Neisseria gonorrhoeae (Binscheck et al. , 1995). Токсины, за исключением последнего, состоят из по меньшей мере двух функциональных доменов. С-концевой участок белка (тяжелая цепь) ответственен за связывание его с нервной клеткой, в то время как N-конец (легкая цепь) характеризуется описанной выше высокоспецифической протеолитической активностью. Токсины связываются с нервными клетками посредством своей тяжелой цепи и достигают цитозоля посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза и последующего перемещения, где они расщепляют один или более чем один из упомянутых белков слияния, которые, в свою очередь, являются конститутивными для комплекса слияния. После расщепления соответствующего белка ингибируется секреция ацетилхолина и других медиаторов, соответственно, из нервных клеток (Binscheck and Wellhoner, 1997).

Ингибирование высвобождения медиаторов терапевтически использовалось в прошлом для лечения дистонических двигательных расстройств и для подавления избыточной парасимпатической активности (Benecke and Kessler, 1995). Для клостридиальных нейротоксинов иные биологические субстраты, нежели белки слияния, неизвестны. Тяжелые цепи обладают высокой аффинностью к периферическим нервным клеткам, так что легкие цепи, соединенные с ними, достигают только этих клеток и становятся эффективными только в этих клетках - хотя другие типы клеток, такие как мастоциты и базофилы, в которых происходят процессы секреции, обладают вышеупомянутыми субстратами, однако они не обладают механизмом для поглощения протеазы (Marxen et al., 1989).

Описание изобретения Одно воплощение настоящего изобретения относится к гибридному белку, содержащему: (I) белок, по существу известный, связывающийся с мастоцитами и/или базофилами и/или поглощаемый этими клетками по существу известным образом, (II) протеазу, по существу известную, расщепляющую один или несколько белков аппарата секреции мастоцитов и/или базофилов, или состоящему из них.

Дополнительное воплощение настоящего изобретения относится к гибридному белку, содержащему: (I) белок, связывающийся с мастоцитами и/или базофилами и/или поглощаемый этими клетками, причем этот белок (I) выбран из группы, состоящей из: IgЕ, фрагмента IgЕ, в частности Fc-фрагмента IgЕ, антитела против IgE-рецептора мастоцитов и/или базофилов, фрагмента антитела против IgE-рецептора мастоцитов и/или базофилов, в частности Fab фрагмента, антитела против мастоцит-специфического калиевого канала и неактивного, но связывающего MCD пептида, и (II) протеазу, в частности протеазу, по существу известную, расщепляющую один или несколько белков аппарата секреции мастоцитов и/или базофилов, или состоящего из них.

Еще одно воплощение настоящего изобретения относится к гибридному белку, содержащему: (I) белок, в частности белок, по существу известный, связывающийся с мастоцитами и/или базофилами и/или поглощаемый этими клетками, в частности по существу известным образом, и (II) протеазу, расщепляющую один или несколько белков аппарата секреции мастоцитов и/или базофилов, причем эта протеаза (II) выбрана из группы, состоящей из: легкой цепи токсина Clostridium botulinum, в частности токсинов типа А, В, С1, D, Е, F и G, каталитически активного фрагмента легкой цепи токсина Clostridium botulinum, в частности токсина типа А, В, С1, D, Е, F и G, легкой цепи столбнячного токсина (TeNT), каталитически активного фрагмента легкой цепи столбнячного токсина, протеазы IgA Neisseria gonorrhoeae и каталитического домена протеазы IgA Neisseria gonorrhoeae; или состоящему из них.

Гибридный белок по настоящему изобретению может отличаться тем, что белок (I) и протеаза (II) выбраны соответственно из предыдущих групп белков и протеаз.

Гибридный белок по настоящему изобретению может дополнительно отличаться тем, что N-концевой участок тяжелой цепи соответствующего токсина (Н_N-фрагмент) или его фрагмент, может представлять собой часть гибридного белка, в дополнение к легкой цепи токсина Clostridium botulinum или столбнячного токсина.

Если бы мастоциты были убиты, то существовала бы опасность, что будет индуцирован аллергический шок, как только погибающие мастоциты высвободят содержащиеся в них эндогенные амины. Кроме того, снижение числа мастоцитов стимулировало бы синтез de novo этих клеток, которые, в свою очередь, были бы снова пригодны для аллергических реакций. Гибридный белок по настоящему изобретению, таким образом, фундаментально отличается от конъюгата IgE-Fc/экзотоксин псевдомонад, ингибирующего синтез белков путем его АДФ(аденозиндифосфат)-рибозилирующей активности, и, таким образом, осуществляющего гибель клетки (Fishman & Lorberboum-Galski, 1997). Как раз наоборот, гибридный белок по настоящему изобретению не служит для того, чтобы убивать мастоциты. Клетка, вернее, остается живой после того, как она была подвергнута воздействию гибридного белка по настоящему изобретению, и теряет не более чем свою способность высвобождать сосудосуживающие амины.

Стимуляции синтеза de novo не происходит. При терапевтическом применении устраняются возможные токсичные побочные действия, которые ожидаются при использовании конъюгата, основанного на целом цитотоксичном псевдомонадном токсине или сопоставимом цитотоксине.

Таким образом, объектом изобретения может быть конъюгат (гибридный белок), состоящий из (I) белка или пептида (транспортного белка/пептида), проявляющего высокую аффинность к мастоцитам/базофилам и (II) специфической протеазы, причем этот конъюгат блокирует дегрануляцию и механизм секреции, соответственно, этих клеток. Этот конъюгат полезен для терапии/профилактики аллергических реакций немедленного типа.

(I) Предпочтительные высокоаффинные мастоцит-связывающие компоненты конъюгатов представляют собой иммуноглобулины типа Е (IgЕ) и их фрагменты (например, Fc-фрагмент), соответственно. Дополнительно, используют антитела против специфических поверхностных молекул мастоцитов/базофилов, причем эти антитела селективно связываются с плазматической мембраной этих клеток. Главным образом, этой цели отвечают антитела против IgE-рецептора. Более того, неактивные, но связывающие мутанты мастоцит-дегранулирующего пептида должны быть использованы в качестве транспортных пептидов/белков в гибридном белке. Эти транспортные пептиды/белки полезны для пропускания протеазы в клетки. Эта протеаза расщепляет белки в комплексе слияния мастоцитов высокоспецифичным образом, каковые белки инициируют механизм дегрануляции этих клеток.

(II) В качестве высокоспецифичной протеазы полезна металлопротеаза, например легкая цепь ботулинического токсина типа А, В, С1, D, Е, F или G (BoNT/X) и столбнячного токсина (TeNT) или протеаза IgA Neisseria gonorrhoeae. Эти протеазы расщепляют синаптосомальный связанный белок (относительная молекулярная масса 25000) (SNAP 25), синаптобревин или синтаксин. Если только один из этих белков/пептидов расщеплен, дегрануляция мастоцитов ингибирована. Как результат, секреции гистамина, простагландинов и лейкотриенов не будет происходить, и аллергические симптомы больше не смогут появиться.

В настоящем изобретении нетоксичные легкие цепи токсинов могут быть присоединены к транспортным белкам, связывающимся исключительно с мастоцитами и базофилами, соответственно, и могут быть, таким образом, поглощены только этими клетками, причем легкие цепи достигают клеток, как если бы они переносились в качестве пассажира. Они не могут вторгаться в нервные клетки и клетки организма другого типа, так что действие ограничено мастоцитами и базофилами. Если один из субстратов протеолитически разрушен, то отсутствуют любые аллергические симптомы, следующие за контактом этих IgE-нагруженных клеток с аллергеном или с одним из вышеупомянутых фармацевтических препаратов.

В качестве белков, специфически связывающихся с мастоцитами, полезны: 1) иммуноглобулины типа Е и их фрагменты типа Fc, 2) антитела против IgE-рецептора, 3) мастоцит-дегранулирующий пептид, и 4) антитело против мастоцит-специфического калиевого канала.

В отношении перечисленных белков делается ссылка на следующие публикации: - IgE: Helman (1995); - IgE-Fc-фрагмент: Helman (1995); - антитело против IgE-рецептора мастоцитов/базофилов, антитела против мастоцит-специфического калиевого канала, Fab-фрагмент антитела: это стандартные процедуры, описанные в: Liddel & Weeks (1995); - MCD-пептиды: Gmachel & Krell (1995); - неактивный, но связывающий мутант Мутантный пептид получают в соответствии со стандартными способами: Nichol D.S.T. (1995); - легкие цепи различных ботулинических токсинов типа A-G: Binz et al. (1990); - легкая цепь столбнячного токсина: Eisel et al. (1989); - протеаза IgA: Bruscheck et al. (1995).

Соединение обоих компонентов (транспортного белка и протеазы) происходит различными путями. Сначала легкую цепь токсина хроматографически очищают. Легкая цепь совершенно не токсична, поскольку после ее отделения от тяжелой цепи, нейротропного транспортного белка, она не может достичь нервных клеток, а внеклеточного субстрата не существует. Легкую цепь затем химически связывают с одним из четырех мастоцит-связывающих белков с образованием конъюгата, который, в свою очередь, поглощается цитозолем мастоцитов. Легкая цепь расщепляет здесь свой субстрат, причем это расщепление ингибирует секрецию гистамина и других веществ. Второй способ получения конъюгата заключается в слиянии гена легкой цепи и гена одного из четырех мастоцит-связывающих белков, так чтобы гибридный белок экспрессировался в подходящих клетках-хозяевах. Этот гибридный белок, получаемый биотехнологическим путем, должен блокировать процесс секреции из мастоцитов по аналогии с конъюгатом, получаемым из двух белковых компонентов. Получение гибридных белков представляет собой процедуру, по существу известную, в частности, в области терапии опухолей (Vogel, 1987; Magerstadt, 1991). В этой терапевтической концепции антитело против поверхностных белков опухолевых клеток прикреплено к цитотоксическому белку, например рицину, дифтерийному токсину, чтобы убивать раковые клетки. Новый аспект в способе по настоящему изобретению заключается в применении специфических протеаз и протеолитических доменов, соответственно, в гибридных белках для ингибирования дегрануляции мастоцитов и, таким образом, для противоаллергической терапии. Эти гибридные белки были полезны не только для того, чтобы избежать сильно ухудшающихся аллергических симптомов (сенной лихорадки, астмы и нейродермита). Их также можно вводить профилактически для того, чтобы избежать аллергических реакций во время терапии с помощью спасающих жизнь фармацевтических препаратов. Более того, с их помощью можно было бы избежать аллергических симптомов, имеющих место в курсе десенсибилизации.

Пример 1. Синтез гибридного белка из IgE и легкой цепи ВоNТ/А Очищенный ботулинический токсин (5,0 мг) типа А был нанесен, после уравновешивания в 15 мМ тетраборате натрия и 30 мМ фосфате, рН 8.4, на колонку QAE Sephadex (1,03,0 см), уравновешенную тем же самым буфером. Колонку последовательно промывали 10 мл 120 мМ дитиоэритрола, 2 М мочевины и 1 мМ ЭДТА (этилендиаминтетраацетат) и инкубировали в течение ночи. После этого легкую цепь элюировали из колонки с помощью 10 мМ боратного буфера и диализировали против 20 мМ фосфата, рН 7,0.

Иммуноглобулин Е (крыса) был куплен. 10 мг иммуноглобулина расщепляли 50 мкг папаина в 1 мл фосфатного буфера (4^oС в течение ночи). Fc-фрагмент очистили через гель-фильтрационную колонку (Sephacryl S200). 3,0 мг очищенного Fc-фрагмента инкубировали с 3,0 мг очищенной легкой цепи ботулинического токсина с 10 мМ дитиобиссукцинимидилпропионатом (бифункциональный агент) в 2 мл Na-фосфата, рН 7,0, в течение периода, составляющего 16 часов. Синтезированный таким образом гибридный белок был очищен с помощью гель-фильтрации (Sephacryl S200) и проанализирован на чистоту посредством гель-электрофореза сДСН (додецилсульфат натрия).

Ингибирование дегрануляции мастоцитов оценивали с использованием двух экспериментальных методов. В первом методе выделенные мастоциты крысы инкубировали с гибридной молекулой. После этого стимулировали высвобождение гистамина. Стимуляция происходила с помощью специфических гистамин-освобождающих агентов, таких как пептид MCD и конканавалин А (последний был экспериментально используемым веществом), и путем непосредственного увеличения внутриклеточной концентрации кальция, соответственно. Последнее достигается путем введения кальция в отдельные мастоциты. Таким образом, непосредственно достигается вышеописанный сигнальный каскад, поскольку увеличение концентрации кальция представляет собой стадию во время процесса секреции, за которой следует слияние пузырьков. За дегрануляцией мастоцита, отражающей высвобождение гистамина, следят в фазово-контрастный микроскоп. Затем можно количественно подсчитать высвободившийся гистамин с помощью измерения флуоресценции. Наконец, увеличение мастоцита, вызванное включением мембран пузырьков в плазматическую мембрану в процессе дегрануляции, можно определить электрофизиологически. В клетках, обработанных гибридным белком, в отличие от контрольных клеток не будет происходить (1) никакого морфологического изменения, (2) никакого увеличения флуоресценции в супернатанте клетки, и (3) никакого увеличения клетки. Таким образом можно доказать, что высвобождение гистамина блокируется гибридным белком.

Во втором экспериментальном методе гибридный белок вводят живым крысам. Крыс убивают через несколько дней и их мастоциты выделяют традиционным способом. Дегрануляцию и высвобождение гистамина, соответственно, определяют как описано выше. В этом методе оценивают, способен ли конъюгат достичь компартмента, в котором локализованы мастоциты, также в живом животном, и инактивирует ли конъюгат мастоцит в живом животном.

Пример 2. Продуцирование рекомбинантного гибридного белка путем связывания работоспособным образом гена, кодирующего легкую цепь типа А Clostridium botulinum, с геном, кодирующим иммуноглобулин Е и один из его фрагментов (Fc-фрагмент), соответственно.

Ген, кодирующий легкую цепь ботулинического токсина типа А, выделяют с помощью подходящих праймеров посредством ПЦР (полимеразная цепная реакция). Получают культуру Clostridium botulinum типа А, из которой получают ДНК. Из опубликованной последовательности гена токсина (Binz et al.) получают пару праймеров и ген легкой субъединицы, амплифицированный посредством ПЦР. После этого этот ген клонируют в имеющемся в продаже векторе экспрессии pQE в соответствии с инструкцией производителя.

Ген, кодирующий Fc-фрагмент человеческого иммуноглобулина Е (Helman L), был выделен посредством ПЦР из имеющейся в продаже библиотеки кДНК и слит в векторную конструкцию с геном легкой цепи ботулинического токсина типа А.

Этой конструкцией трансформировали компетентные клетки М15 (Е. соli). Поскольку в этой системе экспрессии встроенные гены снабжены "his-меткой", рекомбинантный белок очищают через колонку с иммобилизованным Ni. За процессом тщательной очистки белка следует гель-фильтрация через Sephacryl S300.

Измерение биологической активности осуществляли снова на выделенных мастоцитах in vitro.

Пример 3. Получение рекомбинантного гибридного белка путем связывания работоспособным образом гена, кодирующего легкую субъединицу столбнячного токсина, с мутантным геном, кодирующим мастоцит-дегранулирующий пептид (MCD).

"Последовательность для "мастоцит-дегранулирующего пептида", 22 мер, известна (Gmachl and Kreil). На ее основе синтезируют олигонуклеотид.

Для того чтобы выделить последовательность легкой субъединицы столбнячного токсина получали культуру С. tetani и из нее доставали ДНК. От известной последовательности нуклеиновой кислоты столбнячного токсина получали праймер для ПЦР и, в результате, ген легкой субъединицы токсина.

Как описано в Примере 1, обе последовательности нуклеиновых кислот были слиты в векторе экспрессии pQU и затем экспрессированы в Е. соli. Гибридный белок, который, в свою очередь, был снабжен his-меткой, очищали с помощью аффинной хроматографии и последующей гель-фильтрации. Очищенный ген, кодирующий мастоцит-дегранулирующий пептид, химически синтезируют, включая точковую мутацию в активном домене пептида. Ген работоспособным образом связывают с геном, кодирующим легкую цепь столбнячного токсина. Гибридный белок экспрессируют в Е.соli и очищают. Полученный таким образом гибридный белок тестируют in vitro в анализе дегрануляции мастоцитов.

Пример 4: Получение рекомбинантного гибридного белка путем связывания гена, кодирующего Fc-фрагмент IgЕ, с геном, кодирующим протеазу IgА.

Ген, кодирующий Fc-фрагмент IgЕ, выделяли как описано в Примере 1.

Ген, кодирующий протеазу IgA из N. gonorrhoeae, известен. Из него были получены праймеры, и ген, кодирующий специфическую протеазу, был выделен посредством ПЦР из препарата нуклеиновой кислоты, полученного из N. gonorrhoeae.

Обе нуклеиновые кислоты были встроены в имеющийся в продаже вектор, следуя инструкции, данной производителем, и гибридный белок очищали с помощью аффинной хроматографии (см. Пример 2).

Ингибиторная активность снова доказана in vitro на выделенных мастоцитах (см. выше).

Пример 5. Получение гибридного белка, состоящего из Fab-фрагмента антитела против IgE-рецептора и легкой цепи ботулинического токсина типа В.

Моноклональное антитело против IgE-рецептора на мастоцитах было куплено и повторно очищено с помощью хроматографии. 0,5 мг антитела конъюгировали с 0,4 г очищенной легкой цепи ботулинического токсина F. Легкую субъединицу выделили путем расщепления нейротоксина и последующей очистки посредством ионобменной хроматографии, как только осуществили получение нейротоксина в соответствии с процедурой Примера 1.

Оба белка (легкая субъединица токсина типа F и моноклональное антитело) связали друг с другом с помощью бифункционального агента. Для этой цели выделенные белки инкубировали с 10 мМ малеимидобензоил-N-гидрокси-сукцинимидэфиром. Гибридный белок затем очищали от неконъюгированных белков с помощью гель-фильтрации через Sephacryl S300.

Выделенные мастоциты снова использовали для демонстрации того, что синтезированный гибридный белок ингибирует секрецию гистамина. Ссылка на следующие патенты: Патент 4902495 Системы направленной доставки IgE- Fc Новый агент, контролирующий клеточную активность Заявка РСТ WO 94/21300 Ссылки (см. в конце описания).

Дополнительные примеры Исследование биологической активности Пример 6. Ингибирование секреции гистамина из мастоцитов человека гибридным белком из Примера 1.

Мастоциты человека выделили из биоптатов кишечника согласно Bischoff et аl. (Bischoff S.C. Schwengberg S., Raab R. & Manns M. P. (1997). Functional Properties of Human Intestinal Mast Cells Cultured in a New Culture System Enhancement of IgE. - Receptor-Dependent Mediator Release and Response to Stem Cell Factor Journal of Immun 159, p. 560-5567). Слизистую оболочку механически отделяли от подслизистой основы и слизь отбирали в 1 мг/мл ацетилцистеина. После отделения эпителиальных клеток (5 мМ EDTA) изолят инкубировали в течение 30 минут последовательно инкубировали со следующими ферментами: 3 мг/мл проназы, химопапаина, коллагеназы D и эластазы. Освобожденные клетки отфильтровывали (полиамидный фильтр Nicolt) и затем очищали центрифугированием в градиенте Перкола (500 г 15 мин).

10⁶ клеток культивировали при 5% СO₂ в пластиковых планшетах в течение 14 суток. 10⁵ клеток затем инкубировали с 10 нМ гибридного белка, полученного в Примере 1, или без этого белка в течение ночи при 37^oС и 5% СO₂. После промывки клеток секрецию гистамина стимулировали иономицином и РМА. Общее содержание гистамина определяли после лизиса клеток, применяя радиоиммунный анализ (Dianova). Содержание гистамина (секретированный гистамин) в супернатанте обработанных и необработанных клеток анализировали радиоиммунным анализом после центрифугирования (400 г 10 мл). В необработанных клетках секретировалось 45% клеточного гистамина. В клетках, обработанных указанным гибридным белком, секретировалось только 5% клеточного гистамина.

Пример 7. Ингибирование секреции гистамина из мастоцитов человека гибридным белком из примера 3 Эксперимент осуществляли как описано выше для гибридного белка из Примера 1 (см. Пример 6), за исключением того, что использовали гибридный белок из Примера 3.

Получили следующие результаты: в необработанных клетках секретировалось 40% клеточного гистамина, тогда как в клетках, которые были обработаны гибридным белком, секретировалось только 4% гистамина.

Пример 8. Ингибирование секреции гистамина из мастоцитов человека гибридным белком из Примера 4 Эксперимент осуществляли как описано выше для гибридного белка из Примера 1 (см. Пример 6), за исключением того, что использовали гибридный белок из Примера 4.

Получили следующие результаты: в необработанных клетках секретировалось 42% клеточного гистамина, тогда как в клетках, которые были обработаны гибридным белком, секретировалось только 7% гистамина.

Пример 9. Ингибирование секреции гистамина из мастоцитов человека гибридным белком из Примера 5 Эксперимент осуществляли как описано выше для гибридного белка из Примера 1 (см. Пример 6), за исключением того, что использовали гибридный белок из Примера 5.

Получили следующие результаты: в необработанных клетках секретировалось 46% клеточного гистамина, тогда как в клетках, которые были обработаны гибридным белком, секретировалось только 8% гистамина.

Формула изобретения

1. Гибридный белок, содержащий (I) белок, по существу, известный, связывающийся с мастоцитами и/или базофилами и/или поглощаемый этими клетками, по существу, известным образом, (II) протеазу, по существу, известную, расщепляющую один или несколько белков аппарата секреции мастоцитов и/или базофилов, или состоящий из них.

2. Гибридный белок, содержащий (I) белок, связывающийся с мастоцитами и/или базофилами и/или поглощаемый этими клетками, причем этот белок (I) выбран из группы, состоящей из иммуноглобулина Е (IgE), фрагмента IgE, в частности Fc-фрагмента IgE, антитела против IgE-рецептора мастоцитов и/или базофилов, фрагмента антитела против IgE-рецептора мастоцитов и/или базофилов, в частности Fab-фрагмента, антитела против мастоцит-специфического калиевого канала и неактивного, но связывающего мастоцит-дегранулирующего (MCD) пептида, и (II) протеазу, в частности протеазу, по существу, известную, расщепляющую один или несколько белков аппарата секреции мастоцитов и/или базофилов, или состоящий из них.

3. Гибридный белок, содержащий (I) белок, в частности белок, по существу, известный, связывающийся с мастоцитами и/или базофилами и/или поглощаемый этими клетками, в частности, по существу, известным образом, и (II) протеазу, расщепляющую один или несколько белков аппарата секреции мастоцитов и/или базофилов, причем эта протеаза (II) выбрана из группы, состоящей из легкой цепи токсина Clostridium botulinum, в частности токсинов типа А, В, С1, D, Е, F и G, каталитически активного фрагмента легкой цепи токсина Clostridium botulinum, в частности токсина типа А, В, Сl, D, Е, F и G, легкой цепи столбнячного токсина (ТеNТ), каталитически активного фрагмента легкой цепи столбнячного токсина, протеазы иммуноглобулина A (IgA) Neisseria gonorrhoeae и каталитического домена протеазы IgA Neisseria gonorrhoeae, или состоящий из них.

4. Гибридный белок по п.2 или 3, отличающийся тем, что белок (I) выбран из группы в соответствии с п.2, а протеаза (II) выбрана из группы в соответствии с п.3.

5. Гибридный белок по п. 4, отличающийся тем, что N-концевой участок тяжелой цепи соответствующего токсина (Hn-фрагмент) или его фрагмент может представлять собой часть гибридного белка в дополнение к легкой цепи токсина Clostridium botulinum или столбнячного токсина.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2