Определение трансформирующей способности агентов

Определение трансформирующей способности агентов

Реферат

 

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии, в частности активации апоптин-индуцированного апоптоза различными агентами, вызывающими трансформацию клетки в нормальных и/или склонных к раковым заболеваниям клетках. Сущность изобретения состоит в следующем. Апоптин, или так называемый VP3, является вирусным белком, выделенным из вируса анемии цыплят. Также изобретение относится к профилактической противоопухолевой терапии нормальных и/или склонных к раковым заболеваниям клеток. Обработка нормальных и/или склонных к раковым заболеваниям клеток агентами, индуцирующими развитие опухоли, будет активировать апоптин-индуцированный апоптоз, приводя к уничтожению потенциальных опухолевых клеток. Также изобретение относится к диагностике агентов, вызывающих раковые заболевания. Агенты, обладающие опухолеродной активностью, могут быть исследованы путем их экспрессии в нормальных клетках и анализа их способности вызывать апоптин-индуцированный апоптоз. Технический результат - расширение арсенала средств для диагностики и терапии опухолей. 6 с. и 6 з.п. ф-лы, 10 ил.

Настоящее изобретение относится к области диагностики и лечения раковых заболеваний, а также к области определения трансформирующей способности потенциальных опухолеродных или способствующих возникновению опухолей агентов (эти два термина будут в дальнейшем использоваться как взаимозаменяемые).

Общей доминантой настоящего изобретения является то, что во всех отмеченных выше областях в соответствии с настоящим изобретением может быть использован апоптин или его производные и/или их фрагменты (в дальнейшем все рассматривается как апоптиновая или апоптиноподобная активность). Апоптин представляет собой белок, впервые обнаруженный в вирусе анемии цыплят (Noteborn, M. H.M., De Boer, G.P., Van Roozelaar, D., Karreman, C., Kranenburg, 0. , Vos, J., Jeurissen, S., Zantema, A., Hoeben, R., Koch, G., Van Ormondt, H., and Van der Eb, A.J. (1991). Характеристика клонированного ДНК вируса анемии цыплят, который содержит все элементы инфекции репликационного цикла. Journal of Virology 65, 3131-3139) и который впервые был назван как VP3. Апоптическая активность этого белка была раскрыта группой настоящих изобретателей (Noteborn, M.H.M., Todd, D., Verschueren, С.A.J., De Gauw, H. W. P. M. , Curran, W.L., Veldkamp, S., Douglas, A.J., McNulty, M.S., Van der Eb, A. J., and Koch, G. (1994). Один из белков вируса анемии цыплят индуцирует апоптоз. Journal of Virology 68, 346-351).

Как было отмечено выше, в настоящем изобретении используют действие апоптина, индуцирующее апоптоз.

Апоптоз - это активный и программируемый физиологический процесс уничтожения чрезмерно, сильно поврежденных или злокачественных клеток (Earnshaw, W. C., 1995. Ядерные изменения при апоптозе. Current Opinion in Cell Biology 7, 337-343; Duke, R.C., Ocjius, D.M., Young, J, D-E. (1996). Суицид клетки в здоровье и заболеваниях. Scientific American December 1996, 48-55). Апоптоз характеризуется сокращением клеток, ядерной сегментацией и фрагментацией цитоплазмы, конденсацией и расщеплением ДНК на фрагменты по размеру доменов, в большинстве случаев за этим следует межнуклеосомное разрушение. Апоптические клетки распадаются на фрагменты, представляющие собой заключенные внутри мембран апоптические тела. И наконец, соседние клетки и/или макрофаги будут быстро фагоцитировать эти умирающие клетки (Wyllie, A.H., Kerr, J.P.R., Currie, A.R. (1980). Смерть клетки: Значение апоптолиза. International Review of Cytology 68, 251-306, White, E. (1996). Жизнь, смерть и погоня за апоптозом. Genes and development 10, 1-15). Клетки, выросшие в условиях тканевой культуры, и клетки тканей могут быть проанализированы на наличие признаков апоптоза с помощью агентов, окрашивающих хромосомную ДНК, таких как, например, DAPI или пропидий иодид, который окрашивает обычную ДНК (из хроматина) сильно и равномерно, а апоптический хроматин - слабо и/или неравномерно (Noteborn, M.H.M., Todd, D., Verschueren, C.A.J., De Gauw, H.W.P.M. , Curran, W.L., Veldkamp, S., Douglas, A.J., McNulty, M.S., Van der Eb, A.J. , and Koch, G. (1994). Один из белков вируса анемии цыплят индуцирует апоптоз. Journal of Virology 68, 346-351, Telford, W.G., King, L.E., Fraker, P. J. (1992). Сравнительная оценка некоторых связывающихся ДНК красителей в определении апоптоз-ассоциированной деградации хроматина методом проточной цитометрии. Cytometry 13, 137-143).

Процесс апоптоза может быть инициирован с помощью разнообразных регулирующих стимуляторов (Wyllie, A.H. (1995). Генетическая регуляция апоптоза. Current Opinion in Genetics and Development 5, 97-104, White, E. (1996). Жизнь, смерть и погоня за апоптозом. Genes and development 10, 1-15, Levine, A. J. (1997). Р53, клеточный сторож, хранитель развития и роста. Cell 88, 323-331). Изменения в степени выживания клеток играют важную роль в человеческом патогенезе, например, при развитии раковых заболеваний, которые вызывает усиление пролиферации и/или уменьшение числа смертей клеток (Kerr, J.F. R. , Winterford, С.М., and Harmon, B.V. (1994). Апоптоз: Значение в раковых заболеваниях и раковой терапии. Cancer 73, 2013-2026, Paulovich, A.G., Toczyski, D., Hartwell, H. (1997). Когда точка инициации не действует. Cell 88, 315-321). Было продемонстрировано, что разнообразные хемотерапевтические агенты и облучение индуцируют апоптоз раковых клеток, который во многих случаях осуществляется при участии белка-супрессора опухоли р53 (Thompson, С. В. (1995). Апоптоз в патогенезе и лечении заболеваний. Science 267, 1456-1462, Bellamy, С.ОС., Malcomson, R.D.G., Harrison, D.J., and Wyllie. H. 1995. Смерть и заболевания клетки: Биология и регуляция апоптоза. Seminars on Cancer Biology 6, 3-12, Steller, H. (1995). Механизмы и гены клеточного суицида. Science 267, 1445-1449, McDonell T. J., Meyn, R.E., Robertson, L.E (1995). Использование апоптической регуляции смерти клеток в терапии рака. Seminars in Cancer Biology 6, 53-60). Однако многие опухоли подвергаются мутации в р53 в процессе своего развития, что часто связано со снижением воздействия на них противораковой терапии. Вызывающие трансформацию белки ДНК опухолевых вирусов инактивируют р53 путем косвенного или прямого связывания с ним (Teodoro, J.G. and Branton, P.E. (1997). Регуляция апоптоза посредством вирусных генных продуктов. Journal of Virology 71, 1739-1746). Примером такого агента является большой Т-антиген ДНК опухолевого вируса SV40. В определенных гемопоэтических опухолях высокий уровень экспрессии Bcl-2-онкогена сочетается с сильной устойчивостью к различным апоптоз-индуцирующим хемотерапевтическим агентам (Hockenberry, D.M. (1994). Bcl-2 в раковых клетках, развитие и апоптоз. Journal of Cell Science, Supplement 18, 51-55, Sachs, L. and Lotem, J. (1993). Контроль программированной смерти клеток для нормальных клеток и клеток лейкоза: Новые применения в терапии. Blood 82, 15-21). В отношении таких раковых заболеваний, которые устойчивы ко многим цитотоксическим агентам, развивается альтернативная противоопухолевая терапия, основанная на индукции апоптоза (Thompson, С.В. (1995). Апоптоз в патогенезе и лечении заболеваний. Science 267, 1456-1462 и Paulovich, A.G., Toczyski, D., Hartwell, H. (1997). Когда точка инициации не действует. Cell 88, 315-321).

Апоптин представляет собой небольшой белок, полученный из вируса анемии цыплят (CAV; Noteborn and De Boer, G.F. (1996). Patent USA/no. 030, 335, Noteborn, M.H.M., De Boer, G.P., Van Roozelaar, D., Karreman, C., Kranenburg, О., Vos, J., Jeurissen, S., Zantema, A., Hoeben, R., Koch, G., Van Ormondt, H., and Van der Eb, A.J. (1991). Характеристика клонированного ДНК вируса анемии цыплят, который содержит все элементы инфекции репликационного цикла. Journal of Virology 65, 3131-3139, Noteborn, M.H.M., Todd, D., Verschueren, C.A.J., De Gauw, H.W.P.M., Curran, W.L., Veldkamp, S., Douglas, A. J. , McNulty, M.S., Van der Eb, A.J., and Koch, G. (1994). Один из белков вируса анемии цыплят индуцирует апоптоз. Journal of Virology 68, 346-351), который может индуцировать апоптоз в злокачественных и трансформированных клеточных линиях человека, но не в нетрансформированных диплоидных клетках человека. In vitro апоптин не может индуцировать программируемую смерть клеток в нормальных лимфоидных, кожных фибробластных, эпидермальных, эндотелиальных клетках и клетках гладкой мускулатуры. Однако, когда нормальные клетки трансформируются, например, под воздействием вызывающих трансформацию генов SV40, они становятся восприимчивыми к апоптозу, индуцированному апоптином. (Danen-van Oorschot, A.A.A.M., Den Hollander, A., Tak-ayama, S., Reed, J. , Van der Eb, A.J., and Noteborn, M.H.M. (1997). BAG-1 ингибирует р53-индуцированный, но не апоптин-индуцированный апоптоз. Apoptosis, In Press и Noteborn, M.H.M. (1996). PCT application WO 96/41191. Апоптин индуцирует апоптоз в человеческих трансформированных и злокачественных клетках, но не в нормальных клетках, что является существенной характеристикой для развития антираковой терапии). Длительная экспрессия апоптина в нормальных человеческих фибробластах показала, что апоптин не проявляет токсической или трансформирующей активности в этих клетках. Было обнаружено, что в нормальных клетках апоптин преимущественно локализован в цитоплазме, в то время как в трансформированных или злокачественных клетках он был локализован в ядрах, что предполагает, что локализация апоптина связана с его активностью в отношении индукции клеточной смерти (Danen-van Oorschot, A.A.A.M., Den Hollander, A., Tak-ayama, S., Reed, J., Van der Eb, A.J., and Noteborn, M.H. M. (1997). BAG-1 ингибирует р53-индуцированный, но не апоптин-индуцированный апоптоз. Apoptosis, In Press).

Далее, было установлено, что апоптин может индуцировать апоптоз при отсутствии функционального р53 (Zhuang, S.-M., Landegent, J.E., Verschueren, С. A. J., Falkenburg, J.H.F., Van Ormondt, H., Van der Eb, A.J., Noteborn, M.H. M. (1995). Апоптин, белок закодированный вирусом анемии цыплят, индуцирует смерть клетки в различных гематологических злокачественных клетках in vitro. Leukemia 9 SI, 118-120) и его не могут ингибировать Bcl-2-, Bcr-abl (Zhuang, S. -M. , Shvarts, A., Van Ormondt, H., Jochemsen, A.-G., Van der Eb, A.J., Noteborn, M.H.M. (1995). Апоптин, белок выделенный из вируса анемии цыплят, индуцирует р53-независимый апоптоз в человеческих остеосаркомных клетках. Cancer Research 55, 486-489), Bcl-2-ассоциированный белок BAG-1 и белок caspase -ингибитор вакцины коровьей оспы CrmA (Danen-van Oorschot, A.A.A.M., Den Hollander, A., Tak-ayama, S., Reed, J., Van der Eb, A.J., and Noteborn, M. H. M. (1997). BAG-1 ингибирует р53-индуцированный, но не апоптин-индуцированный апоптоз. Apoptosis, In Press, Noteborn, M.H.M. (1996). PCT application WO 96/41191. Апоптин индуцирует апоптоз в человеческих трансформированных и злокачественных клетках, но не в нормальных клетках, что является существенной характеристикой для развития анти-раковой терапии). И наконец, оказывается, что клетки, которые только иммортализованы и таким образом минимально трансформированы, также могут быть убиты апоптином.

Таким образом, апоптин является потенциальным противоопухолевым агентом, также и в отношении опухолей, которые являются не восприимчивыми к действию или в меньшей степени восприимчивы к действию хемотерапевтических агентов из-за отсутствия функционального р53, (сверх) экспрессии Всl-2 или других апоптоз-ингибирующих генов. Тот факт, что апоптин не индуцирует апоптоз в нормальных клетках человека, дает возможность предположить, что токсический эффект при лечении апоптином in vivo будет очень низким. В дополнение, оказалось, что даже предраковые, минимально трансформированные клетки, могут быть восприимчивыми к воздействию апоптина, вызывающему клеточную смерть.

Зная, что апоптин совершенно безопасен в нормальных клетках, но как только клетка становится трансформированной и/или иммортализованной (эти термины могут использоваться как взаимозаменяемые), настоящие изобретатели разработали некоторые пути его использования, основываясь на этом открытии.

Таким образом, изобретение относится к способу определения трансформирующей способности агента, который предположительно может вызывать трансформацию, включающий обеспечение не трансформированной клетке индуцируемой активности на подобие активности апоптина, воздействие на клетку указанного вызывающего трансформацию агента и определение локализации указанной апоптической активности внутри этой клетки или определение индукции апоптоза в указанной клетке.

Должно быть понятно, что под указанной выше апоптической активностью подразумеваются и вещества, имеющие указанную активность.

Предпочтительно обеспечивать указанную клетку указанной апоптической активностью путем трансдукции указанной клетки с помощью молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную активность. Апоптин-подобную активность в данном случае определяют как любое (предпочтительно белковое) вещество, имеющее такую же активность, как и VP 3 или апоптин вируса анемии цыпленка. В особенности под это определение подходят аллельные варианты, производные и/или фрагменты апоптина, где производные определяют как содержащие замены аминокислот, не приводящие к полной потере апоптической активности. Должно быть понятным, что такая же активность означает, что тип активности тот же, но количество может быть другим. Способы в соответствии с изобретением особенно пригодны в случае применений, в которых указанный предположительно вызывающий трансформацию агент является белковым веществом. Это позволяет указанному белковому веществу одновременно экспессироваться в указанной не трансформированной клетке с указанной апоптической активностью. Примером белкового вещества, является большой Т-антиген SV40 или его функциональный эквивалент.

Изобретение также относится к модификации гена апоптина, приводящей к изменениям апоптинового белка, что дает возможность апоптину проникать внутрь ядра не трансформированных и трансформированных/опухолеродных клеток, что в результате приводит к индукции апоптоза. Белок апоптин увеличивают за счет присоединения сигнального пептида, определяющего ядерную локализацию, SV 40. В особенности в указанное определение апоптина включаются алелльные варианты, производные и/или фрагменты апоптина, в которых производные определены как имеющие замены аминокислот, которые не приводят к полной потере апоптиновой активности. Это позволяет апоптиновому белку экспрессироваться в нетрансформированных клетках с указанной апоптической активностью. Фрагменты апоптина с указанной апоптической активностью, которые не способны проникать внутрь ядра не трансформированных или трансформированных клеток с помощью своих собственных последовательностей, способны проникать в ядро за счет модификаций и индуцировать апоптоз.

Кроме того, изобретение относится к способу определения предрасположенности клетки к превращению в опухолевую клетку путем обеспечения указанной клетке индуцируемой апоптин-подобной апоптической активности и сообщение указанной клетке относительно мягкой опухолеродной активности и определение апоптоза в указанной клетке и/или определение локализации указанной апоптической активности в указанной клетке. В этом случае предположительно вызывающий трансформацию агент, как обсуждалось ранее, уже присутствует в указанной клетке в виде мутации, приводящей к канцерогенной или опухолеродной активности. В этом случае факт, что апоптин индуцирует апоптоз только в клетках, которые уже были трансформированы, ведет к возможности проверить, имеют ли клетки мутацию, которая приведет к имммортализации или трансформации в условиях мягкого воздействия трансформирующей активности, такой как обработки UV-излучением и рентгеновским излучением.

Таким образом может быть определена вероятность предрасположенности ряда клеток к раковым заболеваниям. Это, конечно, приводит к применению в области диагностики у людей, подверженных наследственному риску возникновения раковых заболеваний, и дает возможность проведения профилактики, что является еще одним объектом настоящего изобретения. Такого рода диагностика может быть также применена для консультации людей, дети которых имеют предрасположенность к раковым заболеваниям.

Таким образом, изобретение относится к способу определения предрасположенности пациента к наследственным формам раковых заболеваний, включающему обработку образца релевантной подгруппы клеток этого пациента с помощью способа, раскрытого здесь ранее. И, кроме того, изобретение касается способа определения генной мутации, имеющей канцерогенную и/или трансформирующую активность в клетке, включающего обработку указанной клетки способом согласно изобретению.

Как утверждалось ранее, другим объектом настоящего изобретения являются средства для профилактической обработки подгруппы клеток у пациента, когда эта подгруппа клеток имеет склонность к раковым заболеваниям. Эти средства включают нуклеиновую кислоту, кодирующую апоптин-подобную активность, предпочтительно существующую в форме инструмента доставки гена, который может иметь вирусное или другое происхождение. В уровне техники описаны многие такие инструменты, и они хорошо известны специалистам в этой области. Они включают, но не ограничиваются ими: аденовирусные векторы, предпочтительно в форме аденовирусных частиц; ретровирусные векторы, предпочтительно в форме рекомбинантных ретровирусов; этот же тип векторов, но полученных из других вирусов; липосомы или другие молекулы переносчики, и т.д.

Изобретение также относится к диагностическому тестовому набору для осуществления способа по изобретению для определения опухолеродной способности агента, включающему нетрансформированную клетку, подвергнутую трансдукции нуклеиновой кислотой, кодирующей апоптин, или его функциональное производное, или его фрагмент и, необязательно, другие материалы, необходимые для проведения теста и определения результата.

Изобретение также касается диагностического тестового набора для осуществления способа по изобретению для определения склонности клеток к раковым заболеваниям, включающего нуклеиновую кислоту, кодирующую апоптин, или его функциональное производное, или его фрагмент, способные к трансдукции эукариотической клетки и способные экспрессироваться в такой клетке, и, необязательно, все другие материалы, необходимые для проведения теста и определения результата. Предпочтительно также обеспечивается средство, с помощью которого клетку подвергают воздействию мягкой опухолеродной активности, представляющей собой UV-излучение и рентгеновское излучение.

Изобретение также относится к способу изучения индукции апоптин-индуцированного апоптоза, которая приводит к ингибированию образования опухоли, с помощью вызывающих трансформацию агентов, таких как химические соединения, вирусы, UV- и рентгеновское излучение, на модели трансгенной мыши. Апоптин-трансгенные мыши могут быть использованы для изучения противоопухолевого эффекта апоптина в трансгенных химерах, несущих наследственные типы раковых заболеваний и способных к экспрессии апоптина. Более того, воздействие экспрессии апоптина на модели in vivo может изучаться с помощью описанных апоптин-трансгенных мышей.

Подробное описание изобретения.

Ранее было показано, что вирусный белок апоптин индуцирует апоптоз в культурах трансформированных клеток как человека, так и грызунов, но не в нормальных клетках человека. Также обнаружилось, что апоптин не может индуцировать апоптоз в культуре мышиных (или крысиных) эмбриональных фибробластов (культуры клеток были получены от 16-18-дневных мышиных (крысиных) эмбрионов). Это показывает, что апоптин также может экспрессироваться в здоровом эмбрионе, не проявляя токсических свойств, по крайней мере на не слишком ранней стадии развития эмбриона.

В настоящее время имеется возможность продуцировать жизнеспособных апоптин-трансгенных мышей. Мы сделали вывод о том, что нерегулируемая экспрессия апоптина в трансгенной мыши не приводит к летальному исходу или другим угрожающим жизни, сокращающим жизнь воздействиям. Также было обнаружено, что одновременная трансфекция культивируемых нормальных фибробластов человека геном апоптина и вызывающими трансформацию генами SV40 будет активировать процесс апоптоза, который сопровождается перемещением белка апоптина из цитоплазмы, где он вначале накапливается, внутрь ядра.

Описываемое изобретение обеспечивает основу для добавления аминокислот к апоптиновому белку или его фрагментам, давая им возможность проникать в клеточное ядро и/или накапливаться там, что в результате приводит к индукции апоптоза.

Изобретение обеспечивает основу для диагностического теста для определения потенциально вызывающих трансформацию генов. В этом тесте используются нормальные диплоидные клетки млекопитающих, такие как клетки человека и/или клетки грызунов. Для этого нормальные диплоидные клетки подвергают одновременной трансфекции плазмидой, содержащей ген(ы), которые должны быть изучены, и плазмидой, кодирующей апоптин, или подвергают трансфекции геном(ами), которые должны быть изучены, и инфицируют вирусным вектором, экспрессирующим апоптин. Индукция апоптин-индуцированного апоптоза и/или присутствие апоптина в ядре показывает, что изучаемый ген обладает трансформирующей/опухолеродной способностью.

Кроме того, было обнаружено, что диплоидные клетки человека, полученные от людей, которые несут мутацию гена-супрессора опухоли в зародышевой линии, и как результат предрасположены к развитию определенного спектра раковых заболеваний (это также относится к склонности к раковым заболеваниям), устойчивы к воздействию апоптина, индуцирующему апоптоз, так же как диплоидные клетки от здоровых индивидуумов, однако они становятся чувствительными к нему, если культуры клеток облучают ультрафиолетовым светом.

Это позволило нам разработать диагностическое исследование для определения склонности к раковым заболеваниям. В семьях с наследственной предрасположенностью к раковым заболеваниям из-за мутации зародышевой линии в гене-супрессоре опухоли часто бывает невозможным без обширного анализа хромосомной ДНК, предсказать, поражен ли член семьи или несет ген заболевания. Наши результаты показали, что это может быть определено простым способом, с использованием гена апоптина. Для этого диплоидные фибробласты кожи или лимфоциты отбирают у человека для тестирования и культивируемые клетки подвергают трансфекции геном апоптина, с последующим облучением с помощью UV-света (266 нм). Если подвергшиеся трансфекции клетки становятся апоптическими после UV-облучения, но не подвергаются апоптозу без UV-экспозиции, тогда это является серьезным подтверждением того, что человек имеет склонность к раковым заболеваниям. Предрасположенность еще не ко всем типам раковых заболеваний, которые появляются из-за мутации гена-супрессора опухоли, была протестирована с помощью апоптин/UV анализа. Тем не менее нет причины предполагать, что то же самое явление не будет наблюдаться в других склонных к раковым заболеваниям клетках. Аналогичный диагностический тест для предсказания склонности к раковым заболеваниям может быть выполнен с использованием обработки рентгеновскими лучами вместо UV-облучения.

Изобретение также позволяет получить много информации о молекулярных основах склонности к раковым заболеваниям и его взаимосвязи с определенными ответными реакциями на стресс, такими как Усиленная Реактивация (Enhanced Reactivation, ER) (Abrahams, P.J., Houweling, A., Cornelissen-Steijger, P.D. M., Arwert, F., Menko, F.H., Pinedo, H.M., Terleth, C., and Van der Eb, A.J. (1996). Наследование ненормальной экспрессии SOS-подобных реакций в Xeroderma Pigmentosum и наследственные синдромы склонности к раковым заболеваниям. Cancer Research, 56, 2621-2625). Усиленная Реактивация - это одна из реакций нормальных клеток (человека) на действие определенных ДНК-повреждающих агентов, которая, по-видимому, отражает клеточную восприимчивость к онкогенной трансформации.

Изобретение будет представлено в деталях в следующей экспериментальной части. Эта часть служит только для иллюстрации и не должна интерпретироваться как ограничивающая область изобретения.

Экспериментальная часть Клетки и условия культивирования клеток Эмбриональные фибробласты крысы (REF) были получены из 14-дневных эмбрионов. Клетки оттаивали из жидкого азота, культивировали в DMEM, с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки и подвергали трансфекции ДНК плазмидой при клеточном пассаже 2.

Эмбриональные фибробласты мыши (MEF) были получены из р53+/+ мышей или из р53-/- мышей, подвергнутых нокауту (Jacks, Т. (1994). Спектральный анализ опухолей у р53-мутантных мышей. Current Biology 4, 1-7 и Jacks, T. (1996) Уроки, полученные из р53 мутированных мышей. Journal of Cancer Research and Clininal Oncology 122, 19-27; Tyler Jacks et al., 1994). Клетки выращивали на Corning чашках в среде F15 с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки.

Р19 клетки получены из эмбриональной мышиной карциномы/тератокарциномы (McBurney, M. W. et al. (1982) Выделение мужских мышиных эмбриональных клеток карциномы и пути репликации их хромосом. Developments in Biology 89, 503-508). Клетки выращивали на желатинированных чашках Петри в DMEM с добавлением 8% фетальной телячьей сыворотки.

BRK/xho клетки были получены из почечных клеток детенышей крысы путем трансформации с использованием 5 El участка аденовирусного типа (Schrier, P. I. , Bernards, R., Vaessen, R. Т. M. J., Houweling, A. and Van der Eb, A. J. (1983). Экспрессия класс 1 главных антиген гистосовместимости прекращается при наличии онкогенного аденовируса 12 в трансформированных клетках крысы. Nature, 305, 771-775). Клетки культивировали в среде DMEM с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки.

Диплоидные фибробласты крайней плоти человека VH10 и VH25 (Klein, В., Pasting, A. , Odijk, H. , Westerveld, A. , and Van der Eb, A.J. (1990). Трансформация и иммортализация диплоидных Xeroderma pigmentosum фибробластов. Experimental Cellular Research 191, 256-262) выращивали в модифицированной Dulbecco, Eagle среде (DMEM) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки.

Первоначально культуры эпидермальных кератиноцитов человека (FSK-1) начинали выращивать в полной среде, как это описано (Reinwald, J.G. and Green, H. (1975). Cell 6, 331-343) с незначительными модификациями согласно Ропес, М. , Kempenaar, J. A., and De Kloet, E.R. (1981). Кортикоиды и культивированные человеческие эпидермальные кератиноциты: специфическое внутриклеточное связывание и клиническая эффективность. Journal Investmental Dermatology 76, 211-214, и после этого культивировали в кератиноцитной среде, свободной от сыворотки (KSFM). Для описанных здесь экспериментов использовали число пассажей, равное 3.

F9605 клетки представляют собой диплоидные фибробласты, р16-/-, полученные от пациентов с синдромом диспластичного невуса (DNS), для которого установлено, что он является предшественником семейного атипичного множественного синдрома меланомы невуса (FAMMM) (Gruis, N.A. et al. (1995). Гомозиготы для CDKN2(P16) мутации зародышевой линии в семейной Голландской обычной меланоме. Nature Genetics, 10: 351-353, 1995). Клетки выращивали в DMEM с 10% фетальной телячьей сыворотки.

GM1492 клетки представляют собой диплоидные фибробласты человека, которые не экспрессируют р53, и получены от пациентов с синдромом Блума (Bloom's), аутосомальным рецессивным расстройством с высокой частотой раковых заболеваний (Van Laar Т. , Steegenga wt et al. (1994). В Bloom's Syndrome клетках GM1492 нет заметного количества белка р53, но в них происходит нормальная остановка G1 клеточного цикла после UV облучения. Oncogene. 9: 981-983). Клетки выращивали в DMEM, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки.

LF2675T представляют собой диплоидные фибробласты кожи от пациентов, с синдромом Ли-Фраумени (Li-Fraumeni) (LFS). Это заболевание характеризуется мутацией зародышевой линии в одном аллеле гена р53 и ранним началом различных типов раковых заболеваний (Srivastava, S. , Zou. Z., et al. (1990). Трансмиссия зародышевой линии мутированного гена р53 в семьях, имеющих склонность к раковым заболеваниям с синдромом Li-Fraumeni. Nature 348, 747-749; Abrahams, P. J., Houweling, A., Cornelissen-Steijger, P.D.M., Arwert, F. , Menko, F. H. , Pinedo, H.M., Terleth, C., and Van der Eb, A.J. (1996). Наследование ненормальной экспрессии SOS-подобных реакций в Xeroderma Pigmentosum и наследственные синдромы склонности к раковым заболеваниям. Cancer Research, 56, 2621-2625). Клетки выращивали в DMEM с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки.

Клетки представляют собой диплоидные фибробласты кожи от людей с семейством синдромов Линча (Lynch) типа 2 с высокой частотой различных типов раковых заболеваний. Клетки были получены от людей, умерших от рака грудной железы (Abrahams, P.J., Houweling, A., Cornelissen-Steijger, P.D.M., Arwert, F., Menko, F.H., Pinedo, H.M., Terleth, C., and Van der Eb, A.J. (1996). Наследование ненормальной экспрессии SOS-подобных реакций в Xeroderma Pigmentosum и наследственные синдромы склонности к раковым заболеваниям. Cancer Research, 56, 2621-2625). Клетки выращивали в DMEM с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки.

Все культуральные среды были получены от GIBCO/BRL и содержали антибиотики пенициллин и стрептомицин.

Облучение культур клеток Кондиционированную среду удаляли из культур, и клетки дважды промывали PBS. После удаления PBS культуры облучали с помощью UV-света, как описано выше (Abrahams, P.J., Huitema, В.A., and Van der Eb, A.J. (1984) Усиленная реактивация и усиленный мутагенез герпес симплекс вируса в нормальных человеческих клетках и Xeroderma Pigmentosum клетках. Molecular Cellular Biology 4, 2341-2346), или обрабатывали рентгеновскими лучами (5 gray) с использованием Andrex 225 SMART (Andrex St, Copenhagen) при 200 KV, 4 mA с 1-мм А1 фильтром. Дозу и мощность дозы регулировали с помощью PTW дозиметра. После обработки UV-излучением кондиционированную среду возвращали назад и культуры инкубировали при 37^oС.

Плазмиды Экспрессирующая плазмида pCMV-VP3 содержит CAV ДНК последовательность, кодирующую только белок апоптин (nt 427-868; Noteborn, M.H.M., De Boer, G.P. , Van Roozelaar, D., Karreman, C., Kranenburg, 0., Vos, J., Jeurissen, S., Zantema, A. , Hoeben, R., Koch, G., Van Ormondt, H., and Van der Eb, A.J. (1991). Характеристика клонированного ДНК вируса анемии цыплят, которой содержит все элементы инфекции репликационного цикла. Journal of Virology 65, 3131-3139, Noteborn and De Boer, G.F. (1996). Patent USA/no. 030, 335), а плазмида pCMV-des кодирует десмин, структурный белок мышечных клеток (Menke, A. L, Shvarts, A., Riteco, N, Van Наm, R.C.A., Van der Eb, A J., and Jochemsen, A.G. (1997). Wilms' Tumor 1 (WT1) слипшиеся варианты без КТС индуцируют апоптоз в р53-негативных и р53-позитивных HepG2 клетках. Cancer Research 57, 1353-1363). Плазмида pCMV-neo используется как "пустой" негативный контроль для плазмид, кодирующих генные продукты с потенциальным воздействием на апоптин-индуцированный апоптоз. Все экспрессированые гены регулируются (ранним) усиленным промотором цитомегаловируса.

Плазмида SV40 содержит клон первоначально дефектного (ori) раннего (early-) участка SV40, включающий участки, кодирующие и большой Т-антиген и малый Т-антиген SV40, регулируемые их собственным промотором (Dinsart, С., Cornelis, J. J. , Klein, В., van der Eb, A. J., and Rommelaere, J. (1984). Трансфекция с внеклеточной UV-поврежденной ДНК стимулируют крысиные и человеческие клетки к экспрессии мутированого фенотипа к парвовирусу Н-1. Molecular Cellular Biology, 4, 324-). Плазмида pR-s884 экспрессирует полный большой Т-антиген SV40 и усеченный малый Т-антиген под транскрипциным контролем длинного концевого повтора (LTR) вируса саркомы Роуса (Rous) (RSV; De Ronde, A. , et al. (1989). Малый Т-антиген вируса SV40 необходим для морфологической трансформации человеческих фиробластов. Virology 171, 260-263; Smits, P. H. M. et al. (1992). Модуляция трансформации и транскрипции вируса папиломы человека типа 16 при делении положения короткой ветви человеческой хромосомы 11 может быть имитирована малым антигеном t SV40. Virology 190, 40-44). Плазмида PR-SVt содержит последовательности кДНК, кодирующие малый Т-ген SV40, который был объединен с RSV LTR (Philips, В., and Rundell, К. (1988). Неудача малого t антигена вируса SV40 в попытке дезорганизовать актиновые структуры в не пермисивных клеточных линиях. Journal of Virology 62, 768-775).

Экспрессирующая плазмида 21ЕсоА, которая состоит из участков гена/промотора мышиного Н-2КЬ антигена гистосовместимости (Mellor, A.L., Golden, L. , Weiss, E. , Bullman, H., Hurst, Simpson, E., James, R. F., Townsend, A. R., Taylor, P.M., Schmldt, W., Ferluga, J., Leben, L., Santamaria, M., Atfield, G. Festenstein, H., Flavell, R.A. (1982)) и рВг327 последовательностей, подарена Prof Dr Frank Grosveld, Erasmus Университет, Ротердам. Нидерланды. Плазмида 21ЕсоА содержит Notl внутри первого экзона Н-2КЬ гена, который делает возможной интеграцию чужеродного гена, который становится регулируемым промотором Н-2Кb. Фрагмент BamHl, содержащий последовательности, кодирующие апоптин, был выделен из pCMV-VP3 и клонирован в Notl сайте плазмиды 21ЕСоА с использованием линкеров Notl-BamHl. Финальная плазмида, содержащая ген апоптина, регулируемый Н-2Кb промотором, была названа p21EcoA-VP3. Впоследствии EcoRl сайт, следующий за геном апоптина, был делегирован путем линеаризации плазмиды p21EcoA-VP3 по этому специфичному EcoRl сайту и обработки полимеразой Кленова. Плазмида названа p21EcoA-Vp3-Eco.

Фрагмент ДНК, содержащий Н-2Кb экспрессирующую единицу с геном апоптина, был отделен от последовательностей прокариотической ДНК посредством гидролиза EcoRl и электрофореза на агарозном геле.

ДНК плазмиду очищали при помощи центрифугирования в градиенте CsCl и колоночной хроматографии на Сефакриле (Sephacryl) S500 (Pharmacia, Швеция).

Транзитная Трансфекция.

Клетки были подвергнуты трансфекции в монослойных культурах агентом трансфекции DOTAP (Boehringer, Mannheim, FRG) по существу так же, как описано у Fischer, D.F., Gibbs, S., Van de Putte, P., and Backendorf, C. (1996). Внутризависимые элементы контроля транскрипции регулируют экспрессию гена SPRR2A в процессе терминальной дифференциации кератиноцитов (Molecular and Cellular Biology 16, 5365-5374) или их подвергали трансфекции с помощью ДНК плазмиды осаждением фосфата кальция, как описано у Graham, F.L. and Van der Eb, A.J. (1973). Новая методика анализа инфекционности человеческого аденовируса 5 DNA. Virology 52, 456-467.

Непрямая иммунофлуоресценция Все клетки были выращены на предметных стеклах для микроскопа. Предметные стекла были либо без покрытия (VH10, VH25), либо с покрытием из 3-аминопропилтриэтоксисилана (TESPA; FSK-1). Клетки фиксировали 80% ацетоном в течение 10 мин при комнатной температуре и использовали для непрямой иммунофлуоресценции, как описано ранее (Van den Heuvel, S.J.L., Van Laar, Т., Kast, W.M., Melief, C.J., Zantema, A., and Van der Eb, a.]. (1990). Ассоциация между клеточным р53 и аденовирусным 5 Е1В-55 кд белками снижает онкогенность Ad-трансформированных клеток. EMBO Journal 9, 2621-2629). Для демонстрации присутствия и/или клеточной локализации апоптина в клетках, подвергнутых трансфекции, использовали мышиное моноклональное антитело (Mab) CV1-CAV-85.1 (85.1; Noteborn, M. H. M., De Boer, G.P., Van Roozelaar, D., Karreman, C., Kranenburg, О. , Vos, J., Jeurissen, S., Zantema, A., Hoeben, R., Koch, G., Van Ormondt, H., and Van der Eb, A.J. (1991). Характеристика клонированного ДНК вируса анемии цыплят, которой содержит все элементы инфекции репликационного цикла. Journal of Virology 65, 3131-3139); для человеческого десмина мышиное Mab 33 (Monosan, Uden, Нидерланды); для Т-антигенов SV40 - Pab 419, любезно предоставленное Dr A.-G Joshemsen из университета Лейдена, Нидерланды. В качестве второго антитела было использовано меченое изотиоцианатом флуоресцеина козлиное анти-мьшиное антитело (Jackson Immunoresearch Laboratories Inc., West grov PA, USA). Ядерную ДНК окрашивали 2,4-диамино-2-фенилиндолом (DAPI).

Генерация апоптин-трансгенных мышей Для генерации апоптин-трансгенных мышей были использованы оплодотворенные ооциты из FVB линии мышей и мыши из мышиных линий в качестве fosters. Микроинъекции в мужские пронуклеусы осуществляли согласно Brinster, R.L., Chen, H. Y. , and Trumbauer, M.E. (1981). Мышиные ооциты транскрибируют инъецированный Xenopus 5S RNA ген. Science 211, 396-398. На одну микроинъекцию вводили 500 копий фрагмента ДНК EcoRl, полученного из плазмиды p21EcoA-Vp3-Есо, содержащего требуемую Н-2Кb транскрипционную единицу и полный ген апоптина.

Результаты и обсуждение.

Апоптин индуцирует апоптоз в трансформированных клетках грызунов, но не индуцирует его в нормальных эмбриональных клетках.

Чтобы исследовать, будет ли апоптин индуцировать апоптоз в нормальных эмбриональных клетках грызунов, культуры клеток зародышей мышей и клеток зародышей крыс были подвергнуты транзитной трансфекции плазмидой, кодирующей апоптин. В качестве отрицательного контроля клетки были подвергнуты трансфекции плазмидой, кодирующей десмин, который не обладает апоптической активностью. Клетки, экспрессирующие апоптин, были отобраны путем непрямой иммунофлуоресценции с использованием Маb 85.1, а клетки, экспрессирующие десмин, - с использованием мышиного Маb 33. Индукцию апоптоза в апоптин- или десмин-позитивных клетках анализировали при помощи DAPI, который вызывает равномерное окрашивание неповрежденных ядер и неравномерное и/или слабое окрашивание апоптических ядер.

Через пять дней после трансфекции примерно 10-20% десмин-позитивных клеток стали апоптическими, что является базовым уровнем, скорее всего обусловленным результатом трансфекции (данные не показаны, Menke, A.L., Shvarts, A. , Riteco, N. , Van Ham, R.C.A., Van der Eb, A. J., and Jochemsen, A.G. (1997). Wilms' Tumor 1 (WT1) слипшиеся варианты без КТС индуцируют апоптоз в р53-негативных и р53-позитивных HepG2 клетках. Cancer Research 57, 1353-1363, Danen-van Oorschot, A.A.A.M., Fischer, D., Grimbergen, J.M., Klein, В. , Zhuang, S.-M., Falkenburg, J.H.F., Backendorf, C., Quax, P.H.A., Van der Eb, A. J. , and Noteborn, M.H.M. (1997). Апоптин индуцирует апоптоз в человеческих трансформированных или злокачественных клетках, но не в нормальных клетках. Proceedings National Academy Sciences, USA: 94, 5843-5847). Через 2, 3, 4 или 5 дней после трансфекции процентное содержание апоптических апоптин-позитивных клеток не превышало в значительной степени процентное содержание апоптических клеток, наблюдавшееся в десмин-позитивных культурах, что указывает на то, что апоптин не индуцирует апоптоз в культурах нормальных эмбриональных клеток. Транзитная трансфекция трансформированных эмбриональных клеток мышей/крыс или почечных клеток детенышей крыс плазмидой, кодирующей апоптин, подтвердила, что апоптин способен индуцировать апоптоз в этих клетках