Модифицированный фактор vii

Модифицированный фактор vii

Реферат

 

Изобретение относится к медицине, в частности к гематологии и к белкам, используемым в качестве антикоагулянтов, в частности к модифицированным формам Фактора VII, ингибирующим свертывание крови и фактор ткани. В изобретении заявляются способы для различного использования, в частности для подавления отложений тромбоцитов у пациента и лечения острой закупорки коронарной артерии, и состава, состоящего из Фактора VII, имеющего, по крайней мере, одну модификацию в своем активном центре, модификация которого существенно подавляет способность модифицированного Фактора VII активировать плазматический Фактор Х или IX. Изобретение позволяет получить препарат без нежелательных побочных эффектов, который может быть легко получен рекомбинантным путем. 4 с. и 19 з.п .ф-лы, 5 ил., 18 табл.

Изобретение является частичным продолжением заявки No 08/327690, зарегистрированной 24 октября 1994 года, которая является частичным продолжением PCT/US 94/05779, зарегистрированной 23 мая 1994 года и частичным продолжением заявки No 08/065725, зарегистрированной 21 мая 1993 года, которая является частичным продолжением PCT/US92/01636 и заявки No 07/662920, зарегистрированной 28 февраля 1991 года с передачей прав заявки No 08/164666, каждая из которых специально включена здесь во всей своей полноте в виде ссылок.

Область изобретения Настоящее изобретение относится к белкам, используемым в качестве антикоагулянтов. Более подробно, настоящее изобретение относится к модифицированным формам Фактора VII, ингибирующим свертывание крови и фактор ткани.

Предпосылки к созданию изобретения Свертывание крови представляет собой процесс, включающий сложное взаимодействие различных компонентов крови или факторов, который в конечном счете приводит к образованию фибринового сгустка. Обычно компоненты крови, которые участвуют в том, что определяется как коагуляционный "каскад", являются проэнзимами или зимогенами - энзиматически неактивными белками, которые превращаются в протеолитические ферменты при действии активатора, активированного фактора свертывающей системы крови. Факторы свертывания, которые подвергаются такому превращению, обычно относятся к "активным факторам" и обозначаются добавлением прописного индекса "а" (например, Фактор VIIa).

Активированный Фактор Х ("Ха") необходим для превращения протромбина в тромбин, который затем на заключительной стадии образования фибринового сгустка превращает фибриноген в фибрин. Существуют две системы или два метаболических пути, способствующих активации Фактора X. "Внутренний метаболический путь" охватывает те реакции, которые приводят к образованию тромбина посредством утилизации факторов, присутствующих только в плазме. Серия опосредованных протеазой реакций в итоге генерирует Фактор IXa, который в сочетании с Фактором VIIIa расщепляет Фактор Х в Ха. Идентичный протеолиз во "внешнем метаболическом пути" осуществляется Фактором VIIa и его кофактором, фактором ткани. Фактор ткани представляет собой связанный с мембраной белок и обычно не циркулирует в плазме. Однако при разрыве сосуда он может образовывать комплекс с Фактором VIIa для катализа активации Фактора Х или Фактора IX в присутствии иона Са++ и фосфолипида (Nemerson and Gentry, Biochem. 25: 4020-4033 (1986)). Несмотря на то, что относительное значение двух метаболических путей коагуляции в гемостазе остается неясным, в последние годы было найдено, что Фактор VII и фактор ткани играют основную роль в регуляции свертывания крови.

Фактор VII является маркерным гликопротеином плазмы, который циркулирует в крови в виде одноцепочечного зимогена. Зимоген каталитически неактивен (Williams et al. , J. Biol. Chem. 264:7536-7543 (1989); Rao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85:6687-6691 (1988)). Одноцепочечный Фактор VII может быть превращен in vitro в двухцепочечный Фактор VIIa Фактором Ха, Фактором ХIIа, Фактором IXa или тромбином. Фактор Ха считается основным физиологическим активатором Фактора VII. Подобно некоторым другим белкам плазмы, включенным в гемостаз, Фактору VII для активности, связанной с гамма-карбоксилированием многочисленных остатков глутаминовой кислоты, сосредоточенных на амино-конце белка, необходим витамин К. Эти гамма-карбоксилированные глутаминовые кислоты необходимы для взаимодействия Фактора VII с фосфолипидами в присутствии ионов металла.

Превращение зимогенного Фактора VII в активированную двухцепочечную молекулу происходит при расщеплении внутренней пептидной связи, расположенной примерно в середине молекулы. В человеческом Факторе VII сайт активационного расщепления находится при Arg₁₅₂-lle₁₅₃ (Hagen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83:24122416 (1986); Thim et al., Biochem. 27:7785-7793 (1988), обе работы включены здесь в виде ссылок). Бычий Фактор VII активируется расщеплением по аналогичной связи Arg₁₅₂-Ile₁₅₃ (Takeya et аl., J. Biol. Chem. 263: 14868-14877 (1988)). В присутствии фактора ткани, фосфолипидов и ионов кальция двухцепочечный Фактор VIIa ограниченным протеолизом быстро активирует Фактор Х или Фактор IX.

Часто бывает необходимым селективно блокировать коагуляционный каскад у пациента. Антикоагулянты, такие как гепарин, кумарин, производные кумарина, индандиона или другие агенты, могут быть использованы, например, при почечном диализе или в лечении тромбоза глубоких вен, коагулопатии потребления (DIC) и множества других медицинских нарушений. Например, обработка гепарином или экстракорпоральная обработка цитрат-ионом (US Patent 4500309) могут быть использованы при диализе, чтобы предотвратить коагуляцию в ходе лечения. Гепарин используется также для предотвращения тромбозов глубоких вен у пациентов, подвергающихся хирургической операции.

Однако лечение гепарином и другими антикоагулянтами может иметь нежелательные побочные эффекты. Все известные антикоагулянты, как правило, действуют по всему организму, а не специфично на сгусток. Например, гепарин может вызвать тяжелое кровотечение. Более того, имея время полувыведения примерно 80 минут, гепарин быстро исчезает из крови, тем самым вызывая необходимость частого введения. Из-за того что гепарин действует как кофактор антитромбина III (ATIII), а АТIII быстро убывает при лечении DIC, бывает очень трудно поддерживать надлежащую дозировку гепарина, что вызывает необходимость продолжительного мониторинга ATIII и уровней гепарина. Гепарин также неэффективен, если снижение ATIII экстремально. Кроме того, продолжительное использование гепарина может усилить агрегацию тромбоцитов и понизить их количество и явиться одной из причин развития остеопороза. Производные индандиона также могут иметь побочные токсические эффекты.

Было найдено, что, кроме антикоагулянтов, кратко описанных выше, некоторые природные белки обладают антикоагулянтной активностью. Например, Reutelingsperger (US Patent No 4736018) выделил антикоагулянтные белки из бычьей аорты и сосудов человеческой пупочной вены. Maki и др. (US Patent No 4732891) открыли антикоагулянтные белки в человеческой плаценте. Кроме того, в качестве терапевтического антикоагулянта был предложен ATIII (Schipper et al. , Lancet 1 (8069):854-856 (1978); Jordan, US Patent No 4386025; Bock et al., US Patent No 4517294).

Пролиферация клеток гладкой мышцы (SMCs) сосудистой стенки является важным событием при возникновении сосудистых поражений при атеросклерозе, после восстановления сосудов или в ответ на другие сосудистые повреждения. Например, лечение атеросклероза часто включает в себя очищение закупоренных сосудов ангиопластикой, эндартерэктомией или редукционной атерэктомией, или имплантацией шунтов - хирургические процедуры, при которых атеросклеротические бляшки спрессовываются или удаляются посредством катетеризации (ангиопластика), удаляются с артериальной стенки посредством рассечения (эндартерэктомия) или шунтируются природными или синтетическими имплантатами. Эти процедуры удаляют сосудистый эндотелий, нарушают находящуюся под ним внутреннюю оболочку (интиму) и приводят к гибели медиальных SMCs. Повреждение сопровождается пролиферацией медиальных SMCs и миграцией их во внутреннюю оболочку, что характерным образом проявляется в первые недели и вплоть до шести месяцев после повреждения и прекращается, когда происходит восстановление поверхностного эндотелиального слоя. У людей эти повреждения составляют примерно 20% клеток и 80% внеклеточного матрикса.

Примерно у 30% пациентов и более, подвергшихся ангиопластике, эндартерэктомии или шунтированию, тромбоз и/или пролиферация SMCs во внутреннюю оболочку вызывает повторное слипание сосуда и в результате этого несостоятельность восстановительной хирургии. Такое закрытие сосуда после хирургического вмешательства известно как рестеноз.

Все еще существует необходимость в создании улучшенных составов с антикоагулянтной активностью, которые могут быть введены в сравнительно низких дозах и не дают нежелательных побочных эффектов, присущих традиционным антикоагулянтам. Настоящее изобретение реализует эту необходимость, обеспечивая антикоагулянты, которые действуют специфически в сайтах повреждения и дополнительно обеспечивают другие родственные преимущества.

Сущность Приготовлены новые составы, включающие модифицированный Фактор VII, обладающие антикоагулянтными свойствами. Составы с модифицированным Фактором VII ингибируют также фактор ткани. Последовательность Фактора VII имеет, по крайней мере, одну аминокислотную модификацию, которая выбрана таким образом, что существенно снижает способность активированного Фактора VII катализировать активацию плазматических Факторов Х или XI и вследствие этого возможность ингибировать свертывающую активность. Новый Фактор VII имеет активный центр, модифицированный заменой, по крайней мере, одной аминокислоты и в своей модифицированной форме способен связывать фактор ткани. Для составов модифицированного Фактора VII типичной является в значительной степени чистая форма.

Составы изобретения особенно полезны для лечения больных, когда превращены в фармацевтические составы, которые могут быть даны пациентам, страдающим от различных болезней, чтобы лечить связанные с коагуляцией состояния. Такие молекулы модифицированного Фактора VII, способные связывать фактор ткани, но имеющие значительно сниженную способность катализировать активацию других факторов в свертывающем каскаде, могут обладать более длительным периодом полувыведения из плазмы и вследствие этого соответственно большей продолжительностью периода противосвертывающей активности по сравнению с другими анти коагулянтами.

Среди медицинских показаний для составов изобретения есть те, которые обычно лечат антикоагулянтами, такие как, например, тромбоз глубоких вен, легочная эмболия, удар, коагулопатия потребления (DIC), отложения фибрина в легких и почках, связанные с грам-отрицательной эндотоксемией, и инфаркт миокарда. Составы могут быть использованы для подавления сосудистого рестеноза, возникающего после механического повреждения сосуда, такого как повреждение, вызванное баллонной ангиопластикой, эндартерэктомией, редукционной атерэктомией, установкой стента, лазерной терапией или иссечением распадающейся ткани, или возникающего дополнительно к сосудистым имплантатам, стентам, шунтам или трансплантатам органов. Составы могут быть использованы для подавления отложения тромбоцитов и связанных с этим нарушений. Метод подавления коагуляции, сосудистого рестеноза или отложения тромбоцитов состоит во введении пациенту состава, включающего в себя модифицированный Фактор VII, имеющий, по крайней мере, одну замененную аминокислоту в каталитической триаде Ser₃₄₄, Asp₂₄₂ и His₁₉₃ в количестве, достаточном для эффективного подавления коагуляции, сосудистого рестеноза или отложения тромбоцитов. Метод также находит применение в лечении острой закупорки коронарной артерии у больного и состоит во введении модифицированного Фактора VII, который включает в себя DEGR-Фактор VII в сочетании с активатором тканевого плазминогена (tРА) или стрептокиназой и может ускорять tPA-индуцированный тромболиз.

Характерно, что фармацевтические составы для введения людям будут состоять из белка модифицированного Фактора VII и фармацевтически приемлемых носителей и буферов.

В приведенных воплощениях человеческого и бычьего Фактора VII остаток Ser₃₄₄ в активном центре модифицирован, заменен на Gly, Met, Thr или, предпочтительнее, на А1а. Такая замена может быть сделана отдельно или в комбинации с заменой(нами) в других сайтах каталитической триады, которая включает Asp₂₄₂ и His₁₉₃.

В другом аспекте изобретение связано с полинуклеотидной молекулой, состоящей из двух оперативно связанных областей кодирующих последовательностей, которые кодируют соответственно пре-пропептид и gla-домен витамин К-зависимого плазматического белка и лишенный gla-домена белок Фактора VII, при экспрессии упомянутый полинуклеотид кодирует молекулу Фактора VII, которая не активирует в достаточной степени плазматические Факторы Х или IX, но способна связывать фактор ткани. Молекула модифицированного Фактора VII, экспрессированная этим полинуклеотидом, является биологически активным антикоагулянтом, т. е. способна подавлять коагуляционный каскад и, следовательно, образование отложения фибрина или сгустка. С целью экспрессии модифицированного Фактора VII молекула полинуклеотида трансфицируется в линии клеток млекопитающих, такие как, например, ВНК, ВНК 570 или ВНК 293.

Краткое описание чертежей.

Фиг. 1 иллюстрирует конструкцию экспрессионного вектора с последовательностью ДНК для Фактора VII с модификацией Ser₃₄₄, на Ala. Использованы символы 0-1, последовательность единицы картирования 0-1 аденовируса 5; Е, ген-энхансер (усилитель) вируса SV40; MLP, основной поздний промотор; SS, набор сайтов сплайсинга; и рА, сигнал полиаденилирования от SV40 в поздней ориентации.

Фиг. 2 показывает влияние струйного введения DEGR-Фактора VIIa на образование тромба (отложение тромбоцитов) на эндартерэктомизированной аорте бабуина по сравнению с обработанными физиологическим раствором контролями. Артерии измеряли через 60 минут. На данной модели острого сосудистого повреждения примата DEGR-Фактор VIIa заметно подавлял развитие обогащенных тромбоцитами тромбов.

Фиг.3 показывает результаты, полученные при инкубации клеток гладкой мышцы бабуина с возрастающими концентрациями или FVIIa (незакрашенные квадраты), или DEGR-FVIIa в присутствии постоянного количества FVIIa (5 нМ) (закрашенные квадраты). Уровень активации FX был затем определен с использованием хромогенного субстрата S-2222. Данные представлены в виде амидолитической активности, а именно как процент от активности, генерированной в присутствии только 5 нМ FVIIa.

Фиг.4 изображает размер площади внутренней оболочки после эндартерэктомии сонной артерии бабуина и обработки с DEGR-Фактором VIIa в течение 7 или 30 дней по сравнению с контрольными животными.

Фиг. 5 показывает отношение площади внутренней оболочки к сумме площадей внутренней и медиальной оболочки бедренной артерии бабуина после баллонного повреждения и обработки DEGR-Фактором VIIa, контрольная группа включала 5 сосудов, при 7-дневной обработке обследованы 11 сосудов, при 30-дневной обработке обследованы 2 сосуда (n - число обследованных сосудов).

Описание специфических воплощений.

Новый модифицированный Фактор VII, имеющий антикоагулянтную активность, обеспечивается настоящим изобретением. Модифицированный Фактор VII может быть в форме зимогена (т.е. одноцепочечной молекулы) или может быть расщеплен в активационном сайте. Таким образом, понятие "модифицированный Фактор VII" включает в себя модифицированный Фактор VII и молекулы модифицированного Фактора VIIa, которые связывают фактор ткани и подавляют активацию Фактора IX в IXa и Фактора Х в Ха. Составы модифицированного Фактора VII пригодны для введения различным млекопитающим, особенно человеку, с целью ингибирования коагуляционного каскада. Модифицированный Фактор VII может быть введен пациенту в сочетании с другими антикоагулянтами или вместо них.

Фактор VII играет важную роль в коагуляционном каскаде, особенно важным является включение его во внешний метаболический путь. Присутствуя в циркулирующей плазме в виде неактивного одноцепочечного проферментного белка и подвергнувшись активации, Фактор VIIa в сочетании с фактором ткани и ионами кальция активирует Фактор Х в Ха и Фактор IX в IХа с возможным образованием фибринового сгустка.

Натсоящее изобретение обеспечивает возможность подавлять эту последовательность событий в коагуляционном каскаде, предотвращая или иным образом ингибируя активацию Факторов Х и IX с помощью Фактора VIIa. Белок Фактора VII этого изобретения имеет каталитический центр, который модифицирован таким образом, чтобы снизить каталитическую активность Фактора VIIa, но сохранить способность связывать фактор ткани. Молекула модифицированного Фактора VII конкурирует с нативным Фактором VII и/или VIIa за связвание с фактором ткани. В результате подавляется активация Факторов Х и IX, В одном аспекте настоящего изобретения каталитическая активность Фактора VIIa подавляется химической дериватизацией каталитического центра, или триады. Дериватизация может быть осуществлена взаимодействием Фактора VII с необратимым ингибитором, таким как фосфорорганическое соединение, сульфонилхлорид, пептидсодержащий галометилкетон или азапептид, или, например, ацилированием. Предпочтительные пептидсодержащие галометилкетоны включают РРАСК (D-Phe-Pro-Arg-хлорметилкетон; см. US Patent No 4318904, включенный здесь в виде ссылки), D-Phe-Phe-Arg- и Phe-Phe-Arg-хлорметилкетон; и DEGRck (Dansyl-Glu-Gly-Arg-хлорметилкетон).

В другом аспекте каталитическая активность Фактора VIIa может быть также подавлена замещением, введением или удалением аминокислот. В представленных воплощениях замены аминокислот производятся в аминокислотной последовательности каталитической триады Фактора VII, определяемой здесь как область, содержащая аминокислоты, которые способствуют активности каталитического сайта Фактора VIIa. Замещения, введения или удаления в каталитической триаде обычно производят по аминокислоте, которая входит в каталитически и сайт или находится по соседству с ней. В белках человеческого и бычьего Фактора VII аминокислотами, образующими каталитическую "триаду", являются Ser₃₄₄, Asp₂₄₂ и His₁₉₃ (нижний цифровой индекс указывает положение в аминокислотной последовательности). Каталитические сайты Фактора VII других видов млекопитающих могут быть определены с использованием доступной техники, включая помимо других выделение белка и анализ аминокислотной последовательности. Каталитические сайты могут быть также определены удлинением последовательности в присутствии других серинпротеаз, особенно химотрипсина, активный центр которого расшифрован ранее (Sigler et al., J. Mol. Biol. 35:143-164 (1968), включено здесь в виде ссылки), устанавливая с помощью упомянутого удлинения аналогичные аминокислотные остатки активного центра.

Замещения, введения или удаления аминокислот производятся таким образом, чтобы предотвратить или иным способом подавить активацию Факторов Х и/или Х Фактором VIIa. Модифицированный таким способом Фактор VII должен, однако, сохранять способность конкурировать с аутентичным Фактором VII и/или Фактором VIIa за связывание с фактором ткани в коагуляционном каскаде. Такая конкуренция легко определяется посредством, например, анализа свертываемости крови, как здесь описано, или анализом конкурентного связывания с использованием, например, клеточной линии, имеющей поверхностно-связанный фактор ткани, такой как клетки человеческой карциномы мочевого пузыря линии J82 (Sakai et al., J. Biol. Chem. 264:9980-9988 (1989), включено здесь в виде ссылки).

Аминокислоты, которые образуют каталитический сайт Фактора VII, такие как Ser₃₄₄, Asp₂₄₂ и His₁₉₃, человеческого и бычьего Фактора VII, могут быть или заменены, или удалены. В рамках настоящего изобретения предпочтительнее изменить только одну аминокислоту, сводя таким образом к минимуму вероятность усиления антигенности молекулы или подавления ее способности связывать фактор ткани, однако могут быть сделаны изменения двух или более аминокислот (замены, добавления или удаления), а также могут проводиться сочетания замены(н), добавления(ий) и удаления(ий). В избранном воплощении для человеческого и бычьего Фактора VII предпочтительнее замена Ser₃₄₄ на Ala, но могут быть заменены Gly, Met, Thr или другие аминокислоты. Предпочтительно заменить Asp на Glu и His на Lys или Arg. В общем замена подбирается таким образом, чтобы как можно меньше разрушать третичную структуру белка. Модель Дайхоффа и др. (в Атласе структуры белка 1978. Natl. Biomed. Res. Found., Вашингтон, Колумбия), включенная здесь в виде ссылки, может быть использована в качестве руководства по выбору других аминокислотных заместителей. Можно внести изменение, как описано выше, в каталитический сайт соответствующей последовательности Фактора VII человека, быка или другого вида и тестировать полученный белок на подавление каталитической активности и возникающую антикоагулянтную активность, как здесь описано. Для модифицированного Фактора VII каталитическая активность будет существенно снижена, обычно она составляет менее 5% от каталитической активности соответствующих образцов Фактора VII дикого типа, преимущественно менее 1%.

Белки настоящего изобретения могут быть получены с использованием техники рекомбинантной ДНК. В общем клонированная последовательность ДНК Фактора VII дикого типа модифицируется, чтобы кодировать желаемый белок. Эта модифицированная последовательность затем встраивается в экспрессионный вектор, который в свою очередь трансформируется или вносится в клетки хозяина. Клетки высших эукариот, особенно культивированные клетки млекопитающих, являются предпочтительными в качестве клеток хозяина. Для человеческого Фактора VII известны полные нуклеотидная и аминокислотная последовательности. См. US Patent No 4784950 (который включен здесь в виде ссылки), где описаны клонирование и экспрессия человеческого рекомбинантного Фактора VII. Последовательность бычьего Фактора VII описана в работе Takeya et al., J. Biol. Chem. 263:14868-14872 (1988), которая включена в виде ссылки.

Изменения аминокислотной последовательности могут быть осуществлены различными методами. Для модификации последовательности ДНК используют сайт-специфичный мутагенез. Методы сайт-специфичного мутагенеза хорошо известны и описаны, например, Золлером и Смитом (ДНК 3:479-488 (1984)). Таким образом, используя нуклеотидные и аминокислотные последовательности Фактора VII, можно осуществить изменения по выбору.

Фактор VII, модифицированный в соответствии с настоящим изобретением, включает в себя те белки, у которых амино-концевая область (gla-домен) заменена gla-доменом одного из витамин К-зависимых плазматических белков Фактора IX, Фактора X, протромбина, белка С, белка S или белка Z. gla-Домены витамин К-зависимых плазматических белков характеризуются наличием остатков гамма-карбоксиглутаминовой кислоты и обычно имеют протяженность от примерно 30 до 40 аминокислот с С-концами, подобными положениям на границах экзон-интрон соответствующих генов. Методы получения Фактора VII с гетерологичным gla-доменом раскрыты в US Patent No 4784950, включенном здесь в виде ссылки.

Последовательности ДНК для использования в рамках настоящего изобретения будут типично кодировать препропептид на аминоконце белка Фактора VII для установления надлежащего посттрансляционного процессинга (например, гамма-карбоксилирование остатков глутаминовой кислоты) и секреции из клетки-хозяина. Препропептид может быть таким, как в Факторе VII, или другим витамин К-зависимым плазматическим белком, таким, как Фактор IX, Фактор X, протромбин, белок С или белок S. Как признают специалисты, могут быть осуществлены дополнительные модификации аминокислотной последовательности модифицированного Фактора VII, которые не ослабляют существенно способность белка действовать в качестве антикоагулянта. Например, Фактор VII, модифицированный по каталитической триаде, может быть также модифицирован и по сайту активационного расщепления с целью ингибировать превращение зимогенного Фактора VII в его активированную двухцепочечную форму, как описано в US Patent 5288629, включенном здесь в виде ссылки.

Экспрессионные векторы для использования в осуществлении настоящего изобретения будут включать в себя промотор, способный направлять транскрипцию клонированного гена или кДНК. Предпочтительными промоторами для использования в культуре клеток млекопитающих являются вирусные и клеточные промоторы. Вирусные включают промотор от SV40 (Subramani et al., Mol. Cell Bio). 1:854-864 (1981)) и промотор от CMV (цитомегаловируса) (Boshart et al. , Cell 41:521-530 (1985)). Особо предпочтительным вирусным промотором является основной поздний промотор аденовируса 2 (Kaufman and Sharp. Mol. Cell Biol. 2: 1304-1319 (1982)). Клеточные промоторы включают мышиный каппа-промотор (Bergman et al. , Proc. Natl. Acad. Scl. USA 81:7041-7045 (1983)) и мышиный V_H промотор (Loh et al., Cell 33:85-93 (1983)). Особо предпочтительным клеточным промотором является мышиный металлотионеиновый промотор I (Palmiter et al., Science 222:809-814 (1983)). Экспрессионные векторы могут также содержать набор сайтов сплайсинга РНК, расположенных по ходу транскрипции от промотора и против хода транскрипции от сайта включения для последовательности Фактора VII. Предпочтительные сайты сплайсинга РНК могут быть получены из аденовирусов и/или генов иммуноглобуллина. В экспрессионном векторе содержится также сигнал полиаденилирования, расположенный по ходу транскрипции от сайта включения. Особо предпочтительные сигналы полиаденилирования включают ранний или поздний сигнал от SV40 (Kaufman and Sharp, там же), сигнал полиаденилирования из области Е1Ь аденовируса 5, терминатор гена человеческого гормона роста (De Noto er al. Nucl. Acids Res. 9:3719-3730 (1981)), сигнал полиаденилирования гена человеческого Фактора VII или гена бычьего Фактора VII. Экспрессионные векторы могут также включать некодирующую вирусную лидерную последовательность, такую как у аденовируса 2, расположенную между промотором и сайтами сплайсинга РНК; энхансерные последовательности, такие как энхансер от SV40.

Клонированные последовательности ДНК вводятся в культуру клеток млекопитающих, например, опосредованной фосфатом кальция трансфекцией (Wigler et al. , Cell 14:725-732 (1978); Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603-616, 1981; Graham and Van der Eb, Virology 52d:456-467 (1973)) или электропорацией (Neumann et al., EMBO J. 1:841-845 (1982)). Для идентификации и отбора клеток, экспрессирующих экзогенную ДНК, в клетки наряду с основным геном или кДНК обычно вводится ген, который определяет селектируемый фенотип (селектируемый маркер). Предпочтительные селектируемые маркеры включают гены, которые определяют устойчивость к таким препаратам, как неомицин, гигромицин и метотрексат. Селектируемый маркер может быть амплифицируемым селектируемым маркером. Предпочтительным амплифицируемым селективным маркером является последовательность дигидрофолатредуктазы (DHFR). Селектируемые маркеры рассмотрены Тилли (Технология клетки млекопитающих. Butterworth Publishers, Стонхем, Массачусетс; включено здесь в виде ссылки). Выбор селектируемого маркера доступен для обычного специалиста.

Селектируемые маркеры могут быть введены в клетку в отдельной плазмиде в одно и то же время с основным геном или могут быть введены в одной с ним плазмиде. При расположении в одной и той же плазмиде селектируемый маркер и основной ген могут контролироваться различными промоторами или одним и тем же промотором, последняя схема дает дицистронную единицу генетического кода. Конструкции этого типа известны специалистам (например, Levinson and Simonsen, US Patent 4713339). Полезным может быть также прибавление дополнительной ДНК, известной как "носитель ДНК", к смеси, которая вводится в клетку.

После введения ДНК в клетки они растут в подходящей ростовой среде, обычно Т-2 дня, до начала экспрессии целевого гена. Использованный здесь термин "подходящая ростовая среда" обозначает среду, содержащую питательные и др. компоненты, необходимые для роста клеток и экспрессии гена модифицированного Фактора VII. Среда обычно включает источники углерода, азота, незаменимые аминокислоты, углеводы, витамины, соли, фосфолипиды, белок и факторы роста. Для продукции гамма-карбоксилированного модифицированного Фактора VII среда будет содержать витамин К, желательно в концентрации 0,1-5 мкг/мл. Затем проводится подбор препаратов для селекции клеток, которые устойчиво экспрессируют селектируемый маркер. Для клеток, которые были трансфицированы амплифицируемым селектируемым маркером, концентрация препарата может быть повышена, чтобы отобрать большее число копий клонированных последовательностей, тем самым повышая уровни экспрессии. Затем клоны устойчивых трансфицированных клеток скринируются на экспрессию модифицированного Фактора VII.

Предпочтительные линии клеток млекопитающих для использования в настоящем изобретении включают клетки COS-1 (ATCC CRL 1650), клетки почек новорожденного хомяка (ВНК) и 293 (ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Clin. Virol. 36: 59-72 (1977)). Предпочтительной линией клеток ВНК является штамм tk^-ts13 (Waechter and Baserge, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106-1110 (1982), включено здесь в виде ссылки), в дальнейшем отнесенный к ВНК 570. Линия клеток ВНК 570 зарегистрирована в Американской коллекции типов культур (ATCC), 12301 Parklawn Dr., Роквилль, Мэриленд 20852, под номером CRL 10314. Линия клеток ВНК tk^-ts13 также известна в ATCC под номером CRL 1632. Кроме того, в рамках настоящего изобретения могут быть использованы и другие клеточные линии, включая клетки Rat Hep I (гепатома крысы; ATCC CRL 1600), клетки Rat Hep II (гепатома крысы; ATCC CRL 1548), клетки ТСМК (ATCC CCL 139), клетки легких человека (ATCC НВ 8065), клетки NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1), клетки СНО (АТСС CCL 61) и клетки DUKX (Urtaub and Chasin, Proc. Natl. Soc. Sci. USA 77:4216-4220 (1980).

В рамках настоящего изобретения для получения модифицированного Фактора VII может быть использована технология трансгенных животных. Предпочтительнее продуцировать белки в молочных железах самок млекопитающих. Экспрессия в молочной железе и последующая секреция целевого белка в молоко преодолевают многие трудности, связанные с выделением белков из других источников. Молоко легко собирается, доступно в больших количествах и хорошо охарактеризовано биохимически. Более того, основные белки молока присутствуют в нем в высоких концентрациях (обычно 1-15 г/л). С коммерческой точки зрения очевидно, что предпочтительнее использовать в качестве хозяина виды, которые дают большое количество молока. В то время как могут использоваться мелкие животные, такие как мыши и крысы (которые являются предпочтительными при подтверждении принципиального этапа), в рамках настоящего изобретения предпочтительнее использовать домашних млекопитающих, включая (но не только) свиней, коз, овец и крупный рогатый скот. Овцы являются особо предпочтительными благодаря таким факторам, как предшествующая история трансгенеза у этого вида, выход молока, стоимость и высокая доступность оборудования для сбора овечьего молока. Для сравнения факторов, влияющих на выбор вида хозяина, см. WIPO Publication WO 88/00239. Обычно желательно выбирать ту породу животного-хозяина, которая разводится для получения молока, такую как овца породы East Friesland, или интродуцировать молочную породу размножением трансгенной линии на более позднем этапе. В любом случае должно использоваться известное животное и в хорошем состоянии.

Для получения экспрессии в молочной железе используют промотор гена молочного белка. Группу генов молочного белка составляют гены, кодирующие казеин (см. US Patent No 5304489, включенный здесь в виде ссылки), бета-лактоглобулин, альфа- лактоглобулин и кислый белок сыворотки. Предпочтительным является промотор бета-лактоглобулина. В случае гена овечьего бета-лактоглобулина, как правило, будет использована проксимальная 5'-фланкирующая последовательность из 406 нуклеотидов, хотя предпочтительными являются более значительные фрагменты 5'-фланкирующей последовательности, примерно до 5 тыс. нуклеотидов, такие как сегмент ДНК в 4,25 тыс. нуклеотидов, окружающий 5'-фланкирующий промотор и некодирующую часть гена бета-лактоглобулина. См. Whitelaw et al. , Biochem. J. 286:31-39 (1992). Применимы также и подобные фрагменты промоторной ДНК других видов.

Другие области бета-глобулинового гена могут также включаться в конструкцию, т.к. могут экспрессироваться геномные области гена. Принято считать, что, например, конструкции, лишенные интронов, экспрессируют плохо по сравнению с теми, которые содержат такие последовательности ДНК (см. Brinster et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:836-840 (1988); Palmiter et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA 88:478-482 (1991); Whitelaw et al., Transgenic Res. 1: 3-13 (1991); WO 89/01343; и WO 91/02318, каждый включен здесь в виде ссылки). В этом отношении обычно предпочтительно использовать, где возможно, геномные последовательности, содержащие все или некоторые нативные интроны гена, кодирующего целевой белок или полипептид, следовательно, дополнительное включение, по крайней мере, некоторых интронов, например, из бета-лактоглобулинового гена, является предпочтительным. Одной из таких областей служит сегмент ДНК, который обеспечивает сплайсинг интрона и полиаденилирование РНК от 3'-некодирующего участка гена овечьего бета-лактоглобулина. При замене на природные 3'-некодирующие последовательности гена этот овечий бета-лактоглобулиновый сегмент может как усилить, так и стабилизировать уровни экспрессии целевого белка или протеина. В рамках других воплощений область, окружающая ATG инициации модифицированного Фактора VII, заменяется соответствующими последовательностями гена специфического белка молока. Такая замена обеспечивает предполагаемое ткане-специфическое инициационное окружение для того, чтобы усилить экспрессию. Удобно заменить полностью пре- про- и 5'-некодирующие последовательности модифицированного Фактора VII последовательностями, например, гена BLG, хотя можно заменять и меньшие области.

Для экспрессии модифицированного Фактора VII у трансгенных животных сегмент ДНК, кодирующий модифицированный Фактор VII, оперативно связывается с дополнительными сегментами ДНК, необходимыми для его экспрессии, чтобы образовать экспрессионные единицы. Такие дополнительные сегменты включают вышеупомянутый промотор, а также последовательности, которые обеспечивают терминацию транскрипции и полиаденилирование мРНК. Экспрессионные единицы затем будут включать сегмент ДНК, кодирующий секреторную сигнальную последовательность, оперативно связанную с сегментом, кодирующим модифицированный Фактор VII. Секреторная сигнальная последовательность может быть последовательностью нативного Фактора VII или какого-либо другого белка, такого как белок молока. См. , например, von Heinje, Nucl. Acids Res. 14:4683-4690 (1986); Meade et al., US Patent No 4873316, которые включены здесь в виде ссылок.

Конструирование экспрессионных единиц у трансгенных животных удобно осуществлять включением последовательности модифицированного Фактора VII в плазмиду или фаговый вектор, содержащий дополнительные сегменты ДНК, хотя экспрессионная единица может быть сконструирована с помощью других последовательностей лигирования. Особенно удобно создать вектор, содержащий сегмент ДНК, кодирующий белок молока, и заменить кодирующую последовательность молока последовательностью полипептида модифицированного Фактора VII, тем самым создавая смешение генов, которое включает экспрессионные контрольные последовательности гена белка молока. В любом случае клонирование экспрессионных единиц в плазмидах или других векторах благоприятствует амплификации последовательности модифицированного Фактора VII. Амплификацию удобно проводить в бактериальной клетке-хозяине (например, Е. coli), таким образом, векторы будут включать источник репликации и селектируемый маркер в хозяйские бактериальные клетки.

Экспрессионную единицу затем вводят в оплодотворенные яйцеклетки (включая эмбрионы на ранней стадии развития) выбранного вида-хозяина. Введение гетерологичной ДНК может быть выполнено одним из нескольких способов, включая микроинъекцию (например, US Patent No 4873191), ретровирусную инфекцию (Jaenisch, Science 240:1468-1474 (1988)) или направленную интеграцию с использованием стволовых клеток эмбриона (ES) (рассмотрено Bradley et al., Bio/Technology 10: 534-539 (1992)). Яйцеклеткам, имплантированным в фаллопиевы трубы или матки псевдобеременных самок, дают развиваться до срока. Потомок, несущий введенную ДНК в зачаточном состоянии, может передавать ДНК своему потомству нормальным способом, по Менделю, с образованием трансгенного ста