Рекомбинантный полиовирусный вектор (варианты), способ его получения (варианты), способ индукции иммунного ответа у индивидуума (варианты), способ получения белка (варианты), вакцинная композиция для терапии или профилактики инфекционных заболеваний (варианты)

Рекомбинантный полиовирусный вектор (варианты), способ его получения (варианты), способ индукции иммунного ответа у индивидуума (варианты), способ получения белка (варианты), вакцинная композиция для терапии или профилактики инфекционных заболеваний (варианты)

Реферат

 

Изобретение относится к генетической инженерии. Репликационно-компетентные рекомбинантные вирусы, особенно репликационно-компетентные рекомбинантные полиовирусы, включают последовательности экзогенных нуклеиновых кислот, которые кодируют экзогенный полипептид, и последовательность нуклеиновых кислот, которая кодирует искусственный сайт протеолитического расщепления для вирусной или клеточной протеазы, которая протеолитически процессирует (расщепляет) предшественник протеина, продуцируемый вирусом, и использует его. Рекомбинантный предшественник расщепляется на обычный ряд составляющих протеинов, высвобождая экзогенный полипептид. Репликационно-компетентные рекомбинантные вирусы используют в качестве вакцин против холеры, гастроэнтерита, гриппа, гепатита В, коклюша и простого герпеса, а также для индукции иммунного ответа. Способ получения рекомбинантного полиовируса устанавливает порядок расположения экзогенной нуклеотидной последовательности и нуклеотидной последовательности, кодирующей искусственный сайт протеолитического расщепления. Рекомбинантный полиовирус, продуцированный с помощью рекомбинантного полиовирусного вектора, включают в клетку-хозяина. Из клетки-хозяина выделяют белок. В качестве клеток-хозяев используют человеческие клетки. Изобретение позволяет разработать вакцины, альтернативные существующим в настоящее время вакцинам, и создать новые вакцины, что позволит снизить заболеваемость и смертность от многих заболеваний. 12 с. и 25 з. п. ф-лы, 6 ил., 3 табл.

Предпосылки изобретения В настоящее время существует множество типов вакцин, используемых для иммунизации индивидуумов против заболеваний. Хотя те из них, которые доступны, обычно безопасны и, по крайней мере, до некоторой степени эффективны в создании иммунной реакции, все они имеют ограничения. Кроме того, против некоторых заболеваний не существует эффективных вакцин. Разработка альтернатив существующим в настоящее время вакцинам и создание новых вакцин для защиты от заболеваний, вакцины против которых в настоящее время не существует, были бы важным шагом в снижении заболеваемости и смертности многими заболеваниями.

Краткое содержание изобретения Настоящее изобретение относится к репликационно-компетентным рекомбинантным вирусам, которые содержат экзогенные последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют экзогенный полипептид или протеин, который экспрессируется как компонент рекомбинантного полипротеинового предшественника, который затем протеолитически расщепляется вирусными и/или клеточными энзимами. В результате, происходит высвобождение закодированного экзогенного полипептида. Репликационно-компетентными вирусами могут быть вирусы животных (не человека) (например, вирусы позвоночных и млекопитающих), вирусы человека или вирусы растений. Изобретение относится к репликационно-компетентным рекомбинантным вирусам, особенно, к полиовирусам, в которых рекомбинантный геном включает экзогенную последовательность нуклеиновых кислот (или последовательности), кодирующую экзогенный полипептид или полипептиды, которые подлежат экспрессии, и одну или более из последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих соответственное число искусственных сайтов протеолитического расщепления, и которая экспрессирует закодированный полипептид (полипептиды) и индуцирует продуцирование антител, специфичных для этого полипептида (полипептидов) у млекопитающего, которому они введены. Соответствующим образом выбранные репликационно-компетентные вирусы подходят для поставки экзогенного протеина индивидууму, например, позвоночному, особенно млекопитающему, и еще более конкретно, человеку, которому они вводятся. В случае растительных вирусов, например, репликационно-компетентный растительный вирус можно включить в семена или в растение на другой стадии развития, таким образом, что закодированный экзогенный полипептид экспрессируется и процессируется. Такой экзогенный полипептид можно использовать, например, для защиты растений от заболеваний или от нападения насекомых. Растения можно использовать для введения вакцины за счет орального приема.

Репликационно-компетентные рекомбинантные вирусы настоящего изобретения включают широкий круг типов вирусов, таких как пикорнавирусы (например, энтеровирусы, полиовирусы, вирус ящера (FM DV), риновирусы, эковирусы, вирусы гепатита А), Тогавирусы (например, вирусы Синобис и краснухи) и Флавивирусы (например, вирус желтой лихорадки). Тип используемого вируса определяется частично целевым экзогенным антигеном (антигенами), подлежащим экспрессии, способом введения полученных рекомбинантных вирусов и характером желательной иммунной реакции.

В частности, настоящее изобретение относится к репликационно-компетентным рекомбинантным полиовирусам, которые отличаются от родительских полиовирусов тем, что они были модифицированы таким образом, чтобы они не были патогенными и содержали бы экзогенные последовательности нуклеиновых кислот и один или более из искусственных сайтов протеолитического расщепления, с тем, чтобы во время вирусной инфекции они стабильно экспрессировали закодированный продукт как компонент рекомбинантного полипротеинового предшественника. Предшественник протеолитически расщепляют, высвобождая нормальные полиовирусные протеины и закодированный экзогенный протеин. Кроме того, репликационно-компетентные рекомбинантные вирусы могут содержать полилинкерную последовательность (EcoR1, Not1, BssH2 и Xho1) для облегчения встраивания целевых чужеродных нуклеотидных последовательностей. Они также включают поли-аминокислотный участок, например, поли-глициновый участок, который обычно соседствует со встроенной последовательностью, так, что повышается структурная гибкость участка и потенциально повышается эффективность протеолитического расщепления.

Настоящее изобретение относится к новому способу получения рекомбинантных вирусов, в котором экзогенные последовательности нуклеиновых кислот встраивают в вирусный геном. В способе настоящего изобретения используют основные аспекты жизненного цикла вируса, в результате чего рекомбинантный вирус продуцирует свои нормальные компоненты, и реплицируется, причем аминокислотная последовательность, закодированная экзогенной последовательностью (последовательностями) нуклеиновых кислот (экзогенный протеин), продуцируется в значительных количествах в инфицированных клетках. В рассматриваемом способе исходный вирус, геном которого кодирует полипротеиновый предшественник, который протеолитически расщепляется вирусными или клеточными энзимами с образованием одного или более из зрелых протеинов, модифицируют следующим образом: Экзогенную последовательность нуклеиновых кислот, которая кодирует подлежащий продуцированию полипептид, и последовательность или последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют (кодирует) искусственный сайт или сайты протеолитического расщепления для вирусной или клеточной протеазы, которая протеолитически расщепляет предшественник полипротеина, продуцируемый во время жизненного цикла исходным вирусом, вводят в вирусный геном, продуцирующий рекомбинантный вирус. Последовательности можно встраивать в вирусный геном в любом месте, при условии, что их наличие не нарушает вирусную последовательность, необходимую для вирусной репликации. Так, например, две последовательности можно строить по нативному сайту, по которому полипротеин расщепляется, для получения двух нативных протеинов (то есть, по любому сайту, по которому обычно протеолитически расщепляется нативный полипротеин). В тех случаях, когда экзогенные последовательности нуклеиновых кислот встраивают по концу вирусной последовательности, кодирующей протеин, необходима только одна протеолитически расщепляемая последовательность. Если в вирусный геном встраивают более чем одну экзогенную последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую нужный полипептид, могут понадобиться дополнительные последовательности нуклеотидов, кодирующие протеолитический сайт расщепления. Так, например, если две или более полипептид-кодирующие последовательности нуклеиновых кислот встраивают в вирусный геном (внутрь генома) и нужно, чтобы закодированные протеины были расщеплены с образованием двух или более отдельных протеинов, тогда следует также встроить достаточное количество последовательностей нуклеотидов, кодирующих сайты расщепления. Так, например, если в вирусный геном встраивают две экзогенные нуклеотидные последовательности, каждая из которых кодирует протеин, который нужно получить, и два отдельных (индивидуальных) протеина необходимо получить, необходимы три или четыре последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие сайты протеолитического расщепления (то есть, три, если два протеина кодируются двумя последовательностями нуклеиновых кислот, присутствующими в вирусном геноме, без прерывания последовательностей аминокислот, и четыре - если две последовательности нуклеиновых кислот разделены прерывающей последовательностью нуклеиновых кислот, причем продукт, который она кодирует, должен быть удален для "разделения" двух закодированных протеинов). В таких случаях, когда последовательности встроены внутрь (а не по концам) вирусного генома, необходимы две последовательности протеолитического расщепления для того, чтобы дать возможность освободить оба конца экзогенной последовательности нуклеиновых кислот; причем эти последовательности могут быть одинаковыми или различными.

В одном из вариантов настоящего изобретения две последовательности вводят в геном родительского вируса между первым или уникальным стартовым кодоном и вторым кодоном у 5' конца вирусной последовательности, кодирующей вирусный протеин таким образом, что порядок рекомбинантного генома становится: 5' нетранслируемый участок исходного вируса - уникальный стартовый кодон исходного вируса - экзогенная последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая подлежащий экспрессии продукт - последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая искусственный сайт протеолитического расщепления - второй кодон исходного вируса - остальная часть последовательности нуклеиновых кислот исходного вируса. В другом варианте, в котором экзогенная последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая экзогенный полипептид, встроена в вирусный геном, порядок последовательностей в получаемом рекомбинантном вирусном геноме будет следующим: 5' нетранслируемый участок исходного вируса - уникальный стартовый кодон исходного вируса - начальный кодон (кодоны) транслируемого участка исходного вируса - последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая искусственный сайт протеолитического расщепления - экзогенная последовательность нуклеиновых кислот - последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая искусственный сайт протеолитического расщепления - остальная часть генома исходного вируса. Кодируемые сайты протеолитического расщепления могут быть одинаковы или различны.

В одном варианте настоящего изобретения, в котором получают рекомбинантный полиовирус (который экспрессирует экзогенную нуклеотидную последовательность или последовательности), последовательность нуклеотидов, кодирующую протеин (например, антиген), который необходимо экспрессировать, и нуклеотидная последовательность (последовательности), кодирующую искусственную распознающую последовательность (или последовательности) для полиовирусной 3С протеазы, встраивают в геном исходного полиовируса. В другом варианте последовательность (или последовательности) нуклеотидов, кодирующую искусственную распознающую последовательность (последовательности) для полиовирусной 2А протеазы, встраивают в вирусный геном наряду с одной или более из последовательностей нуклеотидов, кодирующих подлежащий экспрессии протеин (протеины). В случае ДНК - вирусов с геномом манипулируют в его ДНК форме. В случае РНК вирусов, с геномом манипулируют в его кДНК форме. Обе они обозначаются как геном исходного вируса. В том варианте, когда экзогенная последовательность нуклеотидов, кодирующая экзогенный полипептид, встраивается в конец полиовирусного генома, получают рекомбинантный полиовирусный геном следующей структуры: 5' нетранслируемый участок исходного полиовируса - полиовирусный уникальный стартовый кодон - экзогенная нуклеотидная последовательность - искусственный полиовирусный сайт распознавания 3С или 2А протеазы - второй кодон полиовирусного генома - остальная часть полиовирусного генома. В том варианте, когда экзогенная последовательность нуклеотидов, кодирующая экзогенный полипептид, встроена по сайту внутри исходного полиовирусного генома (то есть, по внутреннему сайту), получающийся рекомбинантный полиовирусный геном имеет вид: 5 нетранслируемый участок исходных полиовирусов - полиовирусный уникальный стартовый кодон - полиопротеиновый кодирующий участок (участки) - последовательность нуклеотидов, кодирующая искусственный сайт распознавания 3С протеазы или 2А протеазы - экзогенная нуклеотидная последовательность (последовательности) - последовательность нуклеотидов, кодирующая искусственный сайт распознавания 3С протеазы или 2А протеазы - остальная часть полиовируса. В тех случаях, когда более чем один протеин или полипептид подлежат экспрессированию, более чем одна экзогенная последовательность нуклеиновых кислот встроена в рекомбинантный репликационно-компетентный полиовирус (то есть, последовательность нуклеотидов, кодирующая каждый из протеинов или полипептидов, подлежащих экспрессии), вместе с соответствующим количеством искусственных сайтов протеолитического расщепления, как было указано ранее.

Если транслируется модифицированный полиовирусный геном, получается более крупная структура, но она соответствующим образом расщепляется на обычные участки, составляющие полиовирусные протеины за счет 3С и/или 2А протеазы (протеаз), присутствующие в исходном полиовирусе. 3С и/или 2А протеаза (протеазы) также точно распознает (распознают) и расщепляет (расщепляют) искусственный сайт распознавания (протеолитического расщепления), освобождая экзогенный полипептид, закодированный экозогенной последовательностью нуклеотидов. Как было указано, рекомбинантные полиовирусы настоящего изобретения экспрессируют закодированный экзогенный протеин (протеины) в детектируемых количествах. Исходные вирусы продолжают реплицироваться и нативные протеины образуются точно также.

Репликационно-компетентные рекомбинантные вирусы настоящего изобретения, которые представлены рекомбинантными полиовирусами, можно использовать в качестве вакцин против бактериальных, вирусных, грибковых (например, дрожжевых) инфекций, паразитарных заболеваний, рака или аллергий. Их можно также использовать для введения контрацептивов (например, антигена спермы). Вакцинные и контрацептивные композиции, которые являются или включают репликационно-компетентные рекомбинантные вирусы, как здесь указано, также составляют объект настоящего изобретения.

Рекомбинантные полиовирусные вакцины настоящего изобретения особенно выгодны, если для предотвращения инфекции необходимо создать иммунитет слизистой оболочки. Так, например, эффективное создание иммунитета слизистой оболочки было бы выгодно для предотвращения или уменьшения инфекции HIV, ротавирусами, респираторным синцитиальным вирусом (RSV), вирусом гепатита А, полиовирусом, вирусом папиломы, вирусом кори и вирусами гриппа. Рекомбинантные вирусы также пригодны для создания иммунитета против бактериальных заболеваний, таких, которые вызываются Vibrio Cholerae и энеротоксигенными Е. Coli. Кроме того, рекомбинатные полиовирусы можно использовать для создания защиты от инфицирования более чем одним организмом за счет введения более чем одной экзогенной нуклеотидной последовательности (например, двух или более из последовательностей нуклеотидов, каждая из которых кодирует различные антигены) в геном исходного полиовируса. В другом варианте, смесь или коктейль из двух или более рекомбинантных вирусов, каждый из которых экспрессирует отличный антиген, можно использовать для иммунизации индивидуума против более чем одного организма или инфицирующего агента. За счет использования появившихся подходов молекулярной биологии для разработки усовершенствованных или новых вакцин, определение "идеальная вакцина", приведенное Task Force on Child Survivae (организация по детскому выживанию), как вакцина, при которой "однократное введение при рождении обеспечивает защиту от множества болезней", может быть многообещающе реализовано.

Рекомбинантные вирусы можно также использовать для получения экзогенных полипептидов в тканевой культуре, которые можно выделить или отделить из клеток и вирусов, в которых они вырабатываются. Их можно использовать для получения экзогенного полипептида в клетках позвоночных, в клетках млекопитающих, включая человеческие клетки, и в растительных клетках.

Краткое описание чертежей На фиг. 1 схематически представлен рекомбинантный полиовирус настоящего изобретения, в котором полиовирусный геном (SEQ ID 24 и 25) модифицирован, и эти модификации позволяют встраивать экзогенные последовательности нуклеиновых кислот в конце полиовирусного генома, и показана экспрессия экзогенных полипептидов. Представлен также ход протеолитического процессинга вирусной 3C протеазы, когда она расщепляет как нативный полиовирусный полипротеиновый (РО) предшественник, так и экзогенную протеиновую вставку.

На фиг.2 схематически представлены рекомбинантные полиовирусы настоящего изобретения, со вставкой экзогенных последовательностей нуклеотидов на конце и внутри полиовирусного генома, что приводит к экспрессии экзогенных полипептидов. Представлен также поли-глициновый участок, соседний со встроенной последовательностью, который повышает структурную гибкость этого участка.

Фиг. 3 представляет собой фотографию результатов анализа бляшкообразования, который представляет фенотип исходного полиовируса и рекомбинантного полиовируса. В представленном анализе бляшкообразования HeLa клетки были инфицированы исходным полиовирусом (А) или рекомбинантными полиовирусами, содержащими: антигенные эпитопы, полученные из ротавирусного VP4 протеина (В, С и Д), или полную кодирующую последовательность субфрагмента В (СТВ) зрелого токсина холеры (Е).

Фиг. 4 представляет результаты анализов, которые показывают экспрессию и процессинг рекомбинантных полиовирусов, содержащих субъединицу токсина последовательности Vibrio cholerae В или последовательности ротавируса VP4.

На фиг. 4А представлена фотография Вестерн - блота, полученного с использованием экстрактов клеток HeLa, инфицированных либо исходным полиовирусом (линия 1), либо рекомбинантным вирусом полиовируса и токсина В холеры, описанным в примере 2 (полоса 2). Полученные результаты показывают, что В субъединица экспрессируется и соответствующим образом процессируется в контексте рекомбинантного полиовируса (указано стрелкой).

Фиг. 4В представляет фотографию экстрактов из тех же клеток HeLa, инфицированных либо исходным полиовирусом (линия 1), либо рекомбинантным полиовирусом токсин В холеры (СТВ) (линия 5) (пример 2) и зондированных кроличьими антителами, распознающими структурные протеины полиовируса. Полученные результаты показывают, что получается больше, чем нормальный РI полипротеиновый предшественник в полиовирусном рекомбинанте, но происходит соответствующее протеолитическое расщепление, в результате чего образуется нормальный комплемент полиовирусных протеиновых продуктов, а также высвобождается экзогенный СТВ протеин, получаемый из СТВ нуклеотидных последовательностей. Линии 2-4 содержат рекомбинантные полиовирусы, содержащие антигенные эпитопы (21-104 аминокислоты в длину), полученные из ротавирусного VP4 протеина.

На фиг.5 представлены результаты SDS-PAGE анализа, проведенного для определения структуры и состава рекомбинантных вариантов. Характер миграции двух вирусов (исходного и рекомбинантного) совершенно неразличим, что дает возможность предположить, что рекомбинантные вирусы имеют нормальную структуру и композицию протеинов. Показана идентичность полиовирусных капсидных протеинов.

На фиг.6 представлены результаты Вестерн-блот анализа, проведенного для определения способности рекомбинантных полиовирусов вызывать иммунную реакцию у вакцинированного хозяина, в сравнении с контрольными значениями и ложными инъекциями.

Подробное описание изобретения Настоящее изобретение относится к рекомбинантным репликационно-компетентным вирусам, которые включают экзогенную последовательность нуклеотидов, которая кодирует экзогенный полипротеин, который получают во время жизненного цикла вируса, и нуклеотидную последовательность, которая кодирует искусственный сайт протеолитического расщепления для вирусной или клеточной протеаз, которые расщепляют полипротеин предшественника, продуцируемый исходным вирусом. Два типа последовательностей могут присутствовать в любом месте исходного вирусного генома, при условии, что их присутствие не нарушает вирусную последовательность, необходимую для вирусной репликации.

Настоящее изобретение основано на демонстрации заявителями того факта, что экзогенную последовательность нуклеотидов, кодирующую экзогенный полипептид, можно строить в геном вируса в конце вирусного генома, или по месту внутри вирусного генома (то есть, по внутреннему сайту) и она может быть получена во время жизненного цикла вируса как полипротеиновый предшественник, который расщепляется вирусной или клеточной протеазами, которые расщепляют протеиновый предшественник, обычно продуцируемый исходным вирусом (то есть, вирусом, в который встраивают экзогенную последовательность нуклеиновых кислот). В одном варианте, в котором экзогенную нуклеотидную последовательность, кодирующую экзогенный полипептид, встраивают в конце вирусного генома, порядок последовательности в получаемом рекомбинантном вирусном геноме следующий: 5' нетранслируемый участок исходного вируса - уникальный стартовый кодон исходного вируса - экзогенная последовательность нуклеотидов - последовательность нуклеотидов, кодирующая искусственный сайт протеолитического расщепления - второй кодон исходного вируса - остальная часть вирусного генома. Участок рекомбинантного генома, который является 5' нетранслируемым участком вирусного генома, может представлять весь, или часть 5' нетранслируемого участка в том виде, как он встречается в исходном вирусе. В другом варианте, где экзогенная нуклеотидная последовательность, кодирующая экзогенный полипептид, встроена в вирусный геном, порядок последовательности в получаемом рекомбинантном вирусном геноме следующий: 5' нетранслируемый участок исходного вируса - уникальный стартовый кодон (кодоны) исходного вируса - исходный кодон (кодоны) транслируемого участка исходного вируса - последовательность нуклеотидов, кодирующая искусственный сайт протеолитического расщепления - экзогенная нуклеотидная последовательность - последовательность нуклеотидов, кодирующая искусственный сайт протеолитического расщепления - остальная часть исходного вирусного генома.

Кодируемый экзогенный полипептид экспрессируется в контексте трансляции нормального вирусного протеина, как компонент рекомбинантного или слитого полипептида предшественника (который включает экзогенный полипептид, искусственный сайт или сайты протеолитического расщепления и вирусный полипротеин). Рекомбинантный полипептидный предшественник протеолитически расщепляется под действием вирусной или клеточной протеазы (протеаз), которая расщепляет исходный вирусный полипротеин предшественника, что приводит к высвобождению свободного экзогенного протеина из вирусных протеинов. Вирус, модифицируемый таким образом, чтобы он включал экзогенные последовательности, вызывают исходным вирусом, который может быть нативным вирусом (либо патогенным, либо, предпочтительно, непатогенным), ослабленным вирусом, штаммом вакцины или рекомбинантным вирусом. В том смысле, как здесь использован, термин полипептид включает протеины или их части (пептиды), слияния двух или более из протеинов или пептидов и слияния протеина и пептида.

В конкретном варианте заявители получили репликационно-компетентный рекомбинантный полиовирус, который включает экзогенную последовательность нуклеотидов, кодирующую экзогенный протеин, подлежащий экспрессии, и нуклеотидную последовательность, кодирующую искусственный сайт протеолитического расщепления для протеазы полиовируса 3С и/или протеазы 2А, встроенные в конце полиовирусного генома, или по сайту внутри полиовирусного генома. Они продемонстрировали, что экзогенный протеин экспрессируется и высвобождается из полиовирусных протеинов за счет протеолитического расщепления. Получаемые репликационно-компетентные рекомбинантные полиовирусы отличаются от исходных вирусов тем, что они включают экзогенную нуклеотидную последовательность (последовательности), кодирующую экзогенный полипептид или полипептиды, и один или более из искусственных сайтов протеолитического расщепления, и экспрессируют эндогенный продукт во время вирусной инфекции. Исходные полиовирусы могут быть нативными или дикого типа полиовирусами, или рекомбинантными или генетически сконструированными полиовирусами (в этом случае измененные или мутированные последовательности не кодируют экзогенный протеин, пригодный для описанных здесь целей для полиовирусов, которые составляют настоящее изобретение).

В одном из вариантов настоящего изобретения, экзогенная последовательность нуклеотидов, кодирующая экзогенный полипептид, и нуклеотидная последовательность, кодирующая искусственные сайты протеолитического расщепления, расположены в конце полиовирусного генома, между уникальным стартовым кодоном и вторым кодоном полиовирусного генома, так что порядок последовательностей в рекомбинантном геноме следующий: 5' нетранслируемый участок полиовирусного генома - полиовирусный уникальный стартовый (первый) кодон - экзогенная последовательность нуклеиновых кислот - искусственный протеазный сайт распознавания - второй кодон полиовирусного генома - остальная часть полиовирусного генома. В результате экспрессии рекомибнантного полиовирусного генома продуцируется рекомбинантный полипротеиновый предшественник или полипротеин слияния, который включает экзогенный протеин, искусственный сайт протеолитического расщепления и полиовирусный полипротеин. Заявители показали, что протеолитическое расщепление рекомбинантного полипротеинового предшественника протеазой, для которой встроен искусственный сайт расщепления, приводит к продуцированию компонентов нормального полиовирусного протеина и высвобождению экзогенного протеина. Существует также вирусная репликация, но экзогенный протеин не включен в полиовирусный вирион.

Два рекомбинантных полиовируса настоящего изобретения, в которых экзогенная нуклеотидная последовательность и последовательность нуклеотидов, кодирующая искусственный сайт протеолитического расщепления, встроены в конце полиовирусного генома, представлены на фиг.1 и 2 (рМОV 1.3). Рекомбинантный полиовирусный геном включает последовательности нуклеиновых кислот (сразу после 3' уникального стартового кодона), которые кодируют пять аминокислотных остатков, присутствующих на аминоконце полипротеина штамма полиовируса Mohoney, типа 1. Наличие этих последовательностей не является необходимым, но их присутствие может повлиять на эффективность экспрессии. Как видно на фиг. 2, рекомбинантный полиовирусный геном может также включать полиглициновый участок рядом со встроенными (экзогенными) последовательностями.

Экзогенные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие подлежащий экспрессии протеин или полипептид, можно встраивать в вирусный геном: например, в поливирусный геном. Как видно на фиг.2, существует ряд дополнительных участков внутри полиовирусного генома, по которым экзогенную последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую экзогенный полипептид, и последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие искусственные сайты протеолитического расщепления, можно расположить для продуцирования репликационно-компетентных рекомбинантных полиовирусов, которые экспрессируют закодированный продукт. Эти сайты внутри генома полиовируса включают соединения между Vp1 кодирующим участком и 2А кодирующим участком, соединение между 2А кодирующим участком и 2В кодирующим участком и соединение между 2С кодирующим участком и 3А кодирующим участком. Полилинкерные/протеолитические фрагменты были встроены по этим сайтам, и полученные рекомбинантные полиовирусы, как было показано, оказались репликационно-компетентны. Используя описанные здесь способы и известные способы, по этим сайтам можно встроить экзогенную последовательность или последовательности нуклеиновых кислот. Встраивание полилинкерных/протеолитических фрагментов по соединению Vpg кодирующего участка и 3С кодирующего участка прекращает вирусную репликацию.

Для облегчения процессинга экзогенных последовательностей внутри вирусного полипротеина необходимо включить соответствующие сигналы протеолитического расщепления по обоим концам вставки. Поэтому порядок последовательностей в полиовирусном геноме, в котором экзогенная последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая экзогенный полипептид, и последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая искусственные сайты протеолитического расщепления, встроены, например, между Vp1 кодирующим участком и 2А кодирующим участком, следующая: 5' нетранслируемый участок полиовирусного генома - полиовирусный уникальный стартовый кодон - Vp0 кодирующий участок - Vp3 кодирующий участок - Vp1 кодирующий участок - последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая искусственный сайт распознавания 3С протеазы или сайт распознавания 2А протеазы - экзогенная последовательность нуклеиновых кислот - последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая искусственный сайт распознавания 3С протеазы или сайт распознавания 2А протеазы - остальная часть полиовирусного генома.

Определение, что существует множество сайтов полиовирусного генома, по которым можно осуществить встраивание последовательностей экзогенных нуклеиновых кислот для продуцирования репликационно-компетентных рекомбинантных полиовирусов, означает, в широком смысле, что существует значительная гибкость и возможность вариаций при конструировании и продуцировании рекомбинантных вирусов, пригодных, например, в качестве вакцин и получения протеинов. Один или более из экзогенных последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих экзогенный протеин или полипептид, подлежащие экспрессии и протеолитическому расщеплению, можно строить по одному или более из сайтов (на конце или внутри) описанного здесь вирусного генома. Помимо этого, другие сайты, по которым могут быть осуществлены вставки без нарушения репликационной способности вируса, можно идентифицировать. Возможно, что некоторые экзогенные последовательности нуклеиновых кислот будут более устойчивы, или будут более эффективно экспрессироваться и/или протеолитически расщепляться, если они будут встроены в определенный сайт вирусного генома. Насколько это верно (если вообще справедливо) можно оценить, используя описанные здесь способы и, соответственно, полученные рекомбинантные вирусы, например, как это проделано на примере полиовирусов.

В конструкцию репликационно-компетентных рекомбинантных вирусов могут быть включены дополнительные характеристики, такие, как полилинкерные последовательности (например, EcoR1, Not1, BssH2 и Xho1) для облегчения встраивания целевой чужеродной последовательности в рекомбинантный вектор. Далее, такие варианты, как полиглициновый фрагмент, можно встроить рядом со встроенной последовательностью таким образом, чтобы повысить структурную гибкость участка и потенциально повысить эффективность протеолитического расщепления.

Более одной последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих экзогенный протеин или полипептид, подлежащие продуцированию, можно встроить в рекомбинантные репликационно-компетентные вирусы, которые в результате продуцируют соответствующее число протеинов или полипептидов. Две или более из аминокислотных последовательностей, каждая из которых может кодировать другой продукт, или может кодировать тот же самый продукт (например, если желательно повышенное продуцирование протеина или полипептида). Далее, для полиовируса сайт (сайты) протеолитического расщепления может быть сайтом 3С расщепления, сайтом 2А расщепления, или ими обоими.

Хотя настоящее изобретение проиллюстрировано на примере получения рекомбинантного полиовируса, любой вирус, в котором происходит протеолитическое расщепление протеина вирусного предшественника, может быть модифицирован с тем, чтобы он продуцировал рекомбинантный вирус, который экспрессирует экзогенный протеин и процессирует его соответствующим образом. Так, например, рекомбинантные пикорнавирусы (например, энтеровирусы, полиовирусы, FMDV, риновирусы, эковирусы, вирус гепатита А) и рекомбинантные флавивирусы (например, вирус желтой лихорадки) могут быть получены и использованы таким же способом, который описан для рекомбинантных полиовирусов.

Рассматриваемый способ получения репликационно-компетентного рекомбинантного вируса, который экспрессирует и протеолитически расщепляет экзогенный протеин, представляет собой следующее: Вирус, который в своем природном жизненном цикле (именуемый исходным вирусом) продуцирует протеиновый предшественник, который протеолитически расщепляется вирусной или клеточной протеазой (протеазами), модифицируют, используя известные методы генной инженерии (Sambrook. J. et. al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual /2d, ed/, Cold Spring Harbor Laboratory Precc (1989)) для встраивания, по крайней мере, двух типов последовательностей нуклеиновых кислот в вирусный геном: экзогенной последовательности нуклеиновых кислот (последовательности нуклеиновых кислот, полученной из источника, отличного от типа вируса, в который ее встраивают), кодирующей экзогенный протеин или полипептид, подлежащий экспрессии и процессингу рекомбинантным вирусом, и последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую искусственный сайт распознавания для вирусной и/или клеточной протеазы (протеаз), которая процессирует экспрессированный рекомбинантный протеин с выделением вирусных и экзогенных протеинов. Дополнительный тип последовательности нуклеиновых кислот, например, поли-глициновый фрагмент, может быть встроен рядом с экзогенной последовательностью нуклеиновых кислот для повышения структурной гибкости участка и потенциального повышения эффективности.

Конструирование клона кДНК полиовирусного вектора, иллюстрирующее настоящее изобретение, описано в примере 1. Один или более из "фрагментов", каждый из которых включает экзогенные последовательности нуклеиновых кислот или последовательности, кодирующие экзогенный продукт (продукты), один или более из искусственных протеолитических сайтов распознавания и, необязательно, дополнительные последовательности нуклеиновых кислот, такие, как поли-глициновый фрагмент, могут быть встроены таким образом. Так, например, один "фрагмент", который включает последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую экзогенный протеиновый антиген, против которого нужно выработать иммунную реакцию, и искусственный сайт распознавания для протеолитического расщепления, можно встроить по 5' концу вирусного генома. В другом варианте, два или более таких "фрагмента" или один "фрагмент", которые включают последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие более одного протеина или полипептида, и соответствующее количество сайтов протеолитического расщепления (например, для достижения экспрессии и высвобожден