Варианты стимулируемой солями желчи липазы, кодирующие их молекулы днк и трансгенные млекопитающие, не принадлежащие к человеку

Варианты стимулируемой солями желчи липазы, кодирующие их молекулы днк и трансгенные млекопитающие, не принадлежащие к человеку

Реферат

 

Изобретение относится к области биотехнологии. Полипептид - вариант BSSL включает аминокислотную последовательность 1-535 SEQID NO:3 и фрагмент из 536-722 SEQ ID NO:3, или аминокислотную последовательность, которая, по крайней мере, на 90% гомологична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, или аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, в которой аминокислотные остатки -23-0 и 536-711 делетированы (SEQ ID NO:5); или аминокислотные остатки -23-0, 536-568 и 591-711 делетированы (SEQ ID NO:6); или аминокислотные остатки -23-0 делетированы и аминокислота Asn в положении 187 заменена на Gln (SEQ ID NO:7); или аминокислотные остатки 632-708 делетированы (SEQ ID NO:9). Предложена также молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая упомянутые полипептиды, гибридный ген, способный опосредовать экспрессию указанной молекулы нуклеиновой кислоты в клетке млекопитающих, плазмида, в которую встроен гибридный ген, клеточная линия, несущая гибридный ген. Предложен способ продуцирования варианта BSSL, варианты способа продуцирования трансгенного млекопитающего и фармацевтическая композиция для лечения заболеваний поджелудочной железы. Изобретение позволяет увеличить выход стимулируемой солями желчи липазы (BSSL) и повысить эффективность лечения патологических состояний, связанных с нарушением деятельности поджелудочной железы. 12 с. и 8 з.п.ф-лы, 19 ил., 3 табл.

Область техники, к которой относится изобретение Изобретение относится к новым полипептидам, которые представляют собой варианты стимулируемой солями желчи липазы (BSSL; EC 3.1.1.1.). Оно также относится к молекулам ДНК, кодирующим упомянутые полипептиды, и к субпродуктам, содержащим упомянутые молекулы ДНК. Изобретение также относится к способам продуцирования упомянутых вариантов BSSL и к продуцированию трансгенных млекопитающих, не принадлежащих к человеку, способных экспрессировать варианты BSSL. Кроме того, изобретение относится к таким трансгенным животным, а также к детскому питанию (infant formula), содержащему таких трансгенных животных. Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим упомянутые полипептиды и к применению упомянутых полипептидов и молекул ДНК в производстве лекарственных препаратов.

Предпосылки создания изобретения Гидролиз пищевых липидов Пищевые липиды являются важным источником энергии. Богатые энергией триацилглицеролы составляют более 95% таких липидов. Некоторые из липидов, например некоторые жирные кислоты и жирорастворимые витамины, являются существенными составляющими пищи. До желудочно-кишечной абсорбции триацилглицеролы, так же, как и минорные компоненты, т.е. эстерифицированные жирорастворимые витамины и холестерол и диацилфосфатидилглицеролы, требуют гидролиза сложноэфирных связей, чтобы дать начало менее гидрофобным абсорбируемым продуктам. Эти реакции катализируются специфической группой ферментов, называемых липазами.

Полагают, что существенными для человека липазами являются желудочная липаза, панкреатическая зависящая от колипазы липаза (гидролиз три- и диацилглицеролов), панкреатическая фосфолипаза А2 (гидролиз диацилфосфатидилглицеролов) и карбоксилэстеразы (СЕН) (гидролиз холестерилэфиров и эфиров жирорастворимых витаминов, но также три-, ди- и моноацилглицеролов). При грудном вскармливании новорожденных стимулируемая солями желчи липаза (BSSL) играет важную роль в гидролизе некоторых из вышеупомянутых липидов. Вместе с солями желчи продукты переваривания липидов образуют смешанные мицеллы или однослойные везикулы (Hernell et al., 1990), из которых происходит абсорбция.

Стимулируемая солями желчи липаза Стимулируемая солями желчи липаза (BSSL) является составной частью молока ряда видов, например человека, гориллы, кошек и собак (Hernell et al., 1989, Hamosh et al., 1986). При смешении с желчью в содержимом верхнего отдела тонкого кишечника BSSL специфически активируется первичными солями желчи (Hernell, 1975). BSSL, которая отвечает приблизительно за 1% всего белка молока 1981), не разрушается во время прохождения через желудок, и в дуоденальном содержимом защищается солями желчи от инактивации панкреатическими протеазами, такими как трипсин и химотрипсин.

Тепловая обработка человеческого молока (пастеризация при 62,5^oС 30 мин), которая инактивирует BSSL полностью (Bjorksten et al., 1980), снижает коэффициент поглощения жиров у недоношенных новорожденных приблизительно на 1/3 (Williamson et al., 1978, Atkinson et al., 1981). Следовательно, лучшее усвоение триацилглицерола свежего человеческого молока по сравнению с усвоением детского питания с подобным жировым составом происходит благодаря BSSL (Hernel et al., 1991, Chapell et al., 1986).

BSSL является неспецифической липазой (ЕС 3.1.1.1.), поскольку она гидролизует не только триглицерол, но также и ди- и моноглицерол, сложные холестерилэфиры и сложные эфиры жирорастворимых витаминов 1983). Так, после активации BSSL имеет возможность гидролизовать большинство липидов человеческого молока сама по себе, хотя наиболее эффективное усвоение триглицерола человеческого молока требует синергичного действия желудочной липазы (ЕС 3.1.1.3.), зависящей от колипазы панкреатической липазы (EC 3.1.1.3) и BSSL 1990).

Последние исследования говорят о том, что молочный фермент является особенно важным для усвоения новорожденными длинноцепных полиненасыщенных жирных кислот (1993). Такие жирные кислоты являются важными предшественниками эйкозаноидов и важны для развития нервной системы. Новорожденные, особенно родившиеся преждевременно, имеют ограниченную способность синтеза таких жирных кислот и их предшественников. Следовательно, они считаются важными в течение пока еще не установленного периода после рождения.

В последних исследованиях ряда лабораторий охарактеризованы структуры кДНК как молочной липазы, так и карбоксиэстеразы поджелудочной железы (СЕН) (Е. С. 3.1.1.1.) (Baba et al., 1991, Hui et al., 1991, Nilsson et al., 1990, Reue et al. , 1991), и делается вывод, что молочный фермент и фермент поджелудочной железы являются продуктами одного и того же гена. Последовательность кДНК и выведения аминокислотная последовательность гена BSSL (СЕН) SEQ ID NO:1) раскрываются также в ВОИС 91/15234 (Oklahoma Medical Research Foundation) и в ВОИС 91/18923 (Aktiebolaget Astra).

BSSL является гликопротеином с одной цепью. Выведенный белок (SEQ ID NO: 3) содержит 722 аминокислотных остатка и является высоко гликозилированным (Abouakil et al., 1989). N-концевая половина белка показывает удивительную гомологию с ацетилхолинэстеразой и некоторыми другими эстеразами (Nilsson et al., 1990).

Предполагаемый остаток серина с активным сайтом располагается в серине-194; последовательность вблизи этого серина согласуется с консенсусной последовательностью активного сайта серингидролаз. Единственный предполагаемый сайт N-гликозилирования определяется только семью N-концевыми остатками серина активного сайта (Nilsson et al., 1990).

Последовательность BSSL содержит в своей С-концевой части 16 богатых пролином повторов из 11 аминокислотных остатков каждый. Оказывается, что изменение в числе повторов является главным объяснением различий в размере молекул и аминокислотном составе между соответствующими ферментами различных видов (Han et al., 1987, Fontaine et al., 1991, Kyder et al., 1989). Эти повторы несут большую часть 15-20% углевода белка (Baba et al., 1991, Abouakil et al., 1989).

Уникальное структурное различие между BSSL и типичными эстеразами кроется в С-концевой части полипептидной цепи, т.е. в 16 богатых пролином повторных из 11 аминокислотных остатков. Соответствующие ферменты поджелудочной железы коровы и крысы имеют только 3 и 4 повтора соответственно (Han et al., 1987, Kyder et al., 1989). Следовательно, возможно предположение, что С-концевая часть, или по крайней мере часть ее, обязательны для липазной активности, т.е. для действия против эмульгированного длинноцепного тирацилглицерола.

Липидная малабсорбция Обычными причинами малабсорбции и, следовательно, недостаточного питания являются пониженные внутрипросветные (intraluminal) уровни панкреатической, зависящей от колипазы, липазы и/или солей желчи. Типичными примерами случаев такой липазной недостаточности являются пацианты, страдающие муковисцидозом - обычным генетическим нарушением, приводящим к недостаточности в течение всей жизни у 80% пациентов, и страдающие хроническим панкреатитом, часто вследствие хронического алкоголизма.

В настоящее время лечение пациентов, страдающих от дефицита панкреатической липазы, состоит в пероральном введении весьма больших доз сырого препарата панкреатических ферментов. Однако зависящая от колипазы панкреатическая липаза инактивируется при низком рН, преобладающем в желудке. Этот эффект не может быть полностью преодолен применением больших доз фермента. Таким образом, большие вводимые дозы являются неадекватными для большинства пациентов, и, сверх того, препараты являются неочищенными и неприятными.

Сформулированы некоторые таблетки, которые проходят через кислотные отделы желудка и выделяют фермент только в относительно щелочной среде тощей кишки. Однако многие пациенты, страдающие панкреатическими нарушениями, имеют патологически кислую среду в тощей кишке, и в таких случаях фермент из таблеток может не выделиться.

Более того, так как препараты, имеющиеся в настоящее время на рынке, происходят из нечеловеческого источника, существует опасность иммунореакций, которые могут вызвать опасные для пациента эффекты или привести к снижению эффективности лечения. Другим недостатком имеющихся препаратов является то, что не установлено содержание в них других липолитических активностей, кроме зависящей от колипазы липазы. В действительности, большинство из них имеет очень низкий уровень активности BSSL/СЕН. Это может быть одной из причин, почему многие пациенты, страдающие от муковисцидоза, вопреки дополнительному лечению, страдают от недостатка жирорастворимых витаминов и основных жирных кислот.

Таким образом, существует большая потребность в продуктах со свойствами и структурой, происходящими от липаз человека, и с широкой субстратной специфичностью, которые могут быть введены перорально пациентам, страдающим от нехватки одного или нескольких липолитических ферментов. Продукты, которые могут быть получены при применении настоящего изобретения, удовлетворяют этой потребности сами по себе или в сочетании с препаратами, содержащими другие липазы.

Краткое изложение сущности изобретения Варианты рекомбинатной BSSL по настоящему изобретению сохраняют каталитическую активность, но содержат меньше сайтов гликозилирования, чем полная BSSL, и получаются, таким образом, с потенциально пониженной степенью углеводной гетерогенности. Это уменьшенное разнообразие облегчает очистку и исследование рекомбинатного белка, что будет приводить к более эффективному, по стоимости, производству полипептидов, обладающих активностью BSSL.

С другой стороны, пониженная степень гликозилирования менее требовательна к хозяину и допускает более высокое продуцирование в некоторых клетках-хозяевах. И еще, уменьшенное число сайтов гликозилирования в варианте BSSL допускает эффективное продуцирование в низших эукариотах и ограничивает потенциальный риск гликозилирования с отклонениями от нормы, которые могут вызвать иммунологические реакции. Уменьшенный размер и меньшая сложность гликозилирования также предполагает, что круг хозяев шире, чем для белка, имеющего очень сложные и тяжелые углеводные составляющие.

Терапевтическое применение варианта BSSL, который меньше по размеру, но равен по активности, означает, что уменьшается масса вещества, необходимая для добавления. Другим возможным преимуществом варианта рекомбинатной BSSL, лишенного большинства или всех О-гликозилированных повторов, является уменьшенный риск иммунологической реакции у отдельного реципиента. Это происходит благодаря тому, что О-связанный сахар может очень гетерогенно зависеть от клетки, в которой он продуцируется.

В научной литературе имеются указания, что нативная BSSL связывается с и поглощается слизистой оболочкой кишечника. Вариант BSSL, который выбирают для уменьшения поглощения, будет активным на субстратах пищевых липидов в течение более продолжительного периода времени, что ведет к более эффективному внутрипросветному перевариванию. Примерами таких вариантов являются молекулы с пониженным гликозилированием.

Как упоминалось выше, предполагается, что BSSL имеет особую важность для усвоения длинноцепных полиненасыщенных жирных кислот (Нernell et al., 1993), которые имеют большое значение для развития нервной системы у новорожденных и для усвоения витамина А. Вариант BSSL по изобретению, который является в этом отношении более эффективным, может быть выбран известными способами. Усеченный, или укороченный, фермент должен, вероятно, отличаться в отношении конформации, которая может влиять на специфичность против различных липидных субстратов.

Раскрытие сущности изобретения С одной стороны, изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который представляет собой вариант BSSL короче 722 аминокислот, причем упомянутый вариант BSSL содержит часть аминокислотной последовательности, представляемой как остатки 536-722 в SEQ ID NO:3.

Выражение "часть аминокислотной последовательности" следует понимать как одну единственную аминокислоту, а также и как последовательность нескольких аминокислот или несколько таких соединенных последовательностей.

Термин "вариант BSSL" следует понимать как полипептид, имеющий активность BSSL и содержащий часть аминокислотной последовательности человеческой BSSL, представленной в списке последовательностей как SEQ ID NO:3.

Термин "полипептид, имеющий активность BSSL" следует понимать, как полипептид, обладающий по крайней мере свойствами (а) подходить для перорального введения, (b) активироваться специфическими солями желчи, (с) активирования, как неспецифической липазы, в содержимом тонких кишок, т. е. , способность гидролизовать липиды, относительно независимые по своей химической структуре и физическому состоянию (эмульгированные, мицеллы, растворенные), и, не обязательно, обладающие одним или несколькими из следующих свойств, (d) способность гидролизовать триацилглицеролы с жирными кислотами с различной длиной цепи и различной степенью ненасыщенности, (е) способность гидролизовать также диацилглицерол, моноацилглицерол, сложные холестерилэфиры, лизофосфатилилацилглицерол и ретинил и другие сложные эфиры жирорастворимых витаминов, (f) способность гидролизовать в триацилглицероле не только сложноэфирные связи sn-1 (3), но также и сложноэфирные связи sn-2, (g) способность взаимодействовать не только с первичными, но так же и со вторичными солями желчи, (h) зависимость оптимальной активности от солей желчи, (i) устойчивость в том смысле, что содержимое желудка не будет влиять на каталитическую эффективность в сколько-нибудь заметной степени, (j) устойчивость к инактивации панкреатической протеазой, например трипсином, при условии, что присутствуют соли желчи, (k) способность связываться с гепарином или производными гепарина, например с гепаринсульфатом, (l) способность связываться с интерфазами липид-вода, (m) достаточная устойчивость, которая допускает линофилизацию, (n) устойчивость при смешении с составляющими пищи, такими как человеческое молоко или молочная смесь.

С другой стороны, изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты в соответствии с вышесказанным, при этом упомянутый вариант BSSL имеет остаток фенилаланина в своем С-концевом положении или содержит в С-концевой части последовательность Gln-Met-Pro, альтернативно содержит аминокислотную последовательность, представляемую как остатки 712-722 в SEQ ID NO:3 в своей С-концевой части.

В контексте настоящего описания термин "С-концевое положение" означает положение заключительного С-концевого остатка, в то время как термин "С-концевая часть" следует понимать, как приблизительно 50 аминокислотных остатков, которые составляют С-концевое окончание варианта BSSL.

Изобретение также относится к молекуле нуклеиновой кислоты в соответствии с вышесказанными, при этом упомянутый вариант BSSL содержит менее 16 повторяющихся единиц. В контексте настоящего описания термин "повторяющаяся единица" означает одну из повторяющихся единиц из 33 нуклеотидов каждая, которые указываются в списке последовательностей в SEQ ID NO: 1.

В других аспектах изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты в соответствии с вышесказанным, которая кодирует полипептид, аминокислотная последовательность которого по крайней мере на 90% гомологична с аминокислотой последовательностью, показанной как SEQ ID NO:5, 6 или 9 в списке последовательностей, так же, как и к молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, аминокислотная последовательность которого по крайней мере на 90% гомологична аминокислотной последовательности, показанной как SEQ ID NO: 7 в списке последовательностей, за исключением тех молекул нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептиды, которые имеют остаток аспарагина в положении 187.

Изобретение также относится к полипептиду, выявленному как SEQ ID NO:5, 6, 7 или 9 в списке последовательностей, так же как и к полипептиду, кодируемому аминокислотной последовательностью, как упоминается выше.

Изобретение также относится к гибридному гену, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты, в соответствии с вышеупомянутым, к вектору воспроизводимой экспрессии, содержащему такой гибридный ген, и к клетке, несущей такой гибридный ген. Эта клетка может быть прокариотной клеткой, одноклеточным эукариотным организмом или клеткой, происходящей от многоклеточного организма, например от млекопитающего.

В контексте настоящего описания термин "гибридный ген" означает последовательность нуклеиновых кислот, содержащую, с одной стороны, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант BSSL, как определяется выше, и с другой стороны последовательность нуклеиновой кислоты гена, который способен посредничать в экспрессии продукта гибридного гена. Термин "ген" обозначает полный ген, как и его субпоследовательность, которые способны посредничать и нацеливать экспрессию гибридного гена в ткани, представляющей интерес. Обычно упомянутая субпоследовательность представляет собой субпоследовательность, которая включает один или несколько промоторных участков, сайт инициации транскрипции, 3' и 5'-некодирующие участки и структурные последовательности.

Гибридный ген образуется, предпочтительно, вставкой in vitro последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант BSSL, в ген, способный посредничать в экспрессии, с применением технических приемов, известных в технике. С другой стороны, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вариант BSSL, может быть вставлена in vivo путем гомологической рекомбинации.

В контексте настоящего описания термин "воспроизводимый" означает, что вектор способен реплицироваться в данном типе клетки-хозяина, в которую он введен. Непосредственно в обратном направлении последовательности нуклеиновой кислоты может быть получена последовательность, кодирующая сигнальный пептид, присутствие которого обеспечивает секрецию варианта BSSL, экспрессированного клетками-хозяевами, несущими вектор. Сигнальная последовательность может представлять собой последовательность, естественно ассоциируемую с последовательностью нуклеиновой кислоты или другого происхождения.

Вектор может представлять собой любой вектор, который можно удобно подвергнуть технологии рекомбинатных ДНК, и выбор вектора часто будет зависеть от клетки-хозяина, в которую он должен быть введен. Таким образом, вектор может представлять собой автономно реплицирующийся вектор, т.е. вектор, который существует как внехромосомный объект, репликация которого не зависит от хромосомной репликации, примерами такого вектора являются плазмида, фаг, космида, минихромосома или вирус. С другой стороны, вектор может представлять собой вектор, который, когда вводится в клетку-хозяина, интегрируется с геном клетки-хозяина и реплицируется вместе с хромосомой (хромосомами), с которой он объединен. Примерами подходящих векторов являются вектор бактериальной экспрессии и вектор экспрессии дрожжей. Вектор настоящего изобретения может нести любую из последовательностей нуклеиновых кислот по изобретению, о которых упоминалось выше.

С другой стороны, изобретение относится к способу продуцирования рекомбинатного полипептида, причем упомянутый способ включает (i) вставку молекулы нуклеиновой кислоты, упоминающейся выше, в гибридный ген, который способен реплицироваться в специфической клетке-хозяине или организме; (ii) введение получающегося в результате рекомбинатного гибридного гена в клетку-хозяина или организм; (iii) выращивание образующейся в результате клетки в или на культуральной среде, или идентифицирование и репродуцирование организма для экспрессии полипептида; и (iv) извлечение полипептида.

Среда, используемая для выращивания клеток, может быть любой обычной средой, подходящей для этой цели. Подходящим вектором может быть любой вектор из описанных выше, и соответствующая клетка-хозяин может быть любой из типа клеток, описанных выше. Способы, используемые для конструирования вектора и осуществления введения его в клетку-хозяина, могут быть любыми из известных методов, применяемых для этих целей в технологии рекомбинатных ДНК. Вариант рекомбинатной человеческой BSSL, экспрессированный клетками, может быть секретирован, т. е. транспортирован через клеточную мембрану, способом, зависящим от типа клетки и состава вектора.

Если вариант BSSL продуцируется внутриклеточно рекомбинатным хозяином, т. е. он клеткой не секретируется, он может быть извлечен стандартными процедурами, включающими разрушение клетки механическими способами, например ультразвуком или гомогенизацией, или ферментами или химическими способами с последующей очисткой.

В целях секреции последовательности ДНК, кодирующей вариант BSSL, должна предшествовать последовательность, кодирующая сигнальный пептид, присутствие которого обеспечивает секрецию варианта BSSL из клеток таким образом, что по крайней мере значительная часть экспрессированного варианта BSSL секретируется в культуральную среду и извлекается.

Изобретение также относится к системе экспрессии, содержащей гибридный ген, который экспрессируется в клетке-хозяине или организме-хозяине, несущих упомянутый гибридный ген, так что рекомбинатный полипептид продуцируется, когда экспрессируется гибридный ген, причем упомянутый гибридный ген продуцируется посредством вставки последовательности нуклеиновой кислоты, упомянутой выше, в ген, способный посредничать в экспрессии упомянутого гибридного гена.

Возможным способом получения варианта рекомбинатной BSSL по изобретению является способ с использованием трансгенных, не принадлежащих к человеку, млекопитающих, способных выделять вариант BSSL в свое молоко. Использование трансгенных, не относящихся к человеку, млекопитающих имеет то преимущество, что можно получать большой выход варианта рекомбинатной BSSL при разумной стоимости, и особенно то, что, когда не относящимся к человеку млекопитающим является корова, вариант рекомбинатной BSSL продуцируется в молоке, которое является естественной составляющей, например, детского питания, так что не требуется дорогостоящей очистки, когда вариант рекомбинатной BSSL должен использоваться в качестве питательной добавки к продуктам на основе молока.

Кроме того, продуцирование в высшем организме, таком как не принадлежащее к человеку млекопитающее, естественно, ведет к правильному процессингу белка млекопитающего, например, в отношении посттрансляционного процессинга, как обсуждается выше, и к надлежащей складчатости. Также можно получить большое количество, по существу, чистого варианта BSSL.

Соответственно система экспрессии, отнесенная к вышеупомянутой, может представлять собой систему экспрессии у млекопитающего, содержащую последовательность ДНК, кодирующую вариант BSSL, вставленную в ген, кодирующий белок молока не принадлежащего к человеку млекопитающего, с тем, чтобы образовать гибридный ген, который экспрессируется в молочной железе взрослой самки млекопитающего, несущей упомянутый гибридный ген.

Молочная железа, как ткань экспрессии, и гены, кодирующие белки молока, вообще, рассматриваются как особенно подходящие для использования при производстве гетерологичных белков в трансгенных, не принадлежащих к человеку, млекопитающих, так как белки молока продуцируются естественно при высоком уровне экспрессии в молочной железе. Кроме того, молоко легко собирается и доступно в больших количествах. В связи с этим использование генов белка молока при продуцировании варианта рекомбинатной BSSL, имеет еще то преимущество, что он продуцируется в условиях, подобных условиям его естественного производства в смысле регуляции экспрессии и места продуцирования (молочная железа).

Когда гибридный ген, упомянутый выше, используется в трансгенном млекопитающем, он, предпочтительно, содержит последовательность, кодирующую сигнальный пептид, с тем, чтобы создать возможность правильного секретирования гибридного генного продукта в молочной железе. Сигнальный пептид будет, как правило, представлять собой пептид, который обычно обнаруживается в гене молочного белка, о котором идет речь, или пептид, ассоциированный с последовательностью ДНК, кодирующей вариант BSSL. Однако другие сигнальные последовательности, способные посредничать в секреции продукта гибридного гена в молочную железу, также являются уместными. Конечно, различные элементы гибридного гена должны сливаться таким образом, чтобы создать возможность для правильной экспрессии и процессинга генного продукта. Таким образом, последовательность ДНК, кодирующая сигнальный пептид отбора, должна быть точно слита с N-концевой частью последовательности ДНК, кодирующей вариант BSSL. В гибридном гене последовательность ДНК, кодирующая вариант BSSL, будет обычно содержать его стоп-кодон, но не расщепление своей собственной информации и сайт полиаденилирования. В прямом направлении последовательности ДНК, кодирующей вариант BSSL, процессинговые последовательности мРНК гена белка молока будут обычно сохраняться.

Предполагается, что ряд факторов является ответственным за фактический уровень экспрессии определенного гибридного гена. Способность промотора, как и других регуляторных последовательностей, как упоминается выше, интеграция сайта системы экспрессии с геномом млекопитающего, интеграция сайта последовательности ДНК, кодирующей вариант BSSL, с геном, кодирующим белок молока, элементы, сообщающие посттранскрипциональную регуляцию, и другие подобные факторы могут представлять существенное значение для получаемого уровня экспрессии. На основе знаний о различных факторах, влияющих на уровень экспрессии гибридного гена, специалисту будет известно, как сконструировать систему экспрессии, подходящую для данной цели.

Ген белка молока, который используется, может быть получен из того же вида, в котором должна размещаться система экспрессии, или он может быть получен от другого вида. В этой связи показано, что регуляторные элементы, которые нацеливают экспрессию гена в молочную железу, являются границами функционально перекрестных видов, что может происходить благодаря возможному общему предшественнику (Hennighausen et. al., 1990).

Примеры подходящих генов, кодирующих белок молока или эффективные последовательности, которые используются при конструировании системы экспрессии настоящего изобретения, обычно находят среди белков молочной сыворотки, полученной от различных млекопитающих, например ген кислого белка молочной сыворотки (WAP), предпочтительно от мыши, и ген -лактоглубулина, предпочтительно происходящего от овцы. Найдено, что также гены казеина различного происхождения могут быть подходящими для трансгенного получения варианта BSSL, например коровий S1-казеин и кроличий -казеин. Предпочтительным, в данном случае, геном является ген мышиного WAP, так как обнаружено, что он способен обеспечивать высокий уровень экспрессии ряда чужеродных человеческих белков в молоке различных трансгенных животных (Hennighausen et al., 1990).

Другой последовательностью, предпочтительно взаимодействующей с системой экспрессии настоящего изобретения, является так называемая стабилизирующая экспрессию последовательность, способная посредничать в экспрессии высокого уровня. Существуют твердые указания, что такие стабилизирующие последовательности обнаруживаются около и в обратном направлении генов белков молока.

В изобретение также включается способ продуцирования трансгенного, не принадлежащего к человеку, млекопитающего, способного экспрессировать вариант BSSL, включающий (а) введение вышеупомянутой системы экспрессии в оплодотворенную яйцеклетку или клетку эмбриона не принадлежащего к человеку млекопитающего с тем, чтобы включить систему экспрессии в зародыш млекопитающего, и (b) развитие получающихся в результате интродуцированных оплодотворенной яйцеклетки или эмбриона во взрослую самку млекопитающего, не принадлежащего к человеку.

Включение системы экспрессии в зародыш млекопитающего может быть осуществлено с использованием подходящих технических приемов, описанных, например, в "Manipulating the Mouse Embryo", A laboratory Manual Cold Harbor Laboratory Press, 1986. Например, несколько сот молекул системы экспрессии могут быть введены непосредственно в оплодотворенную яйцеклетку, например в оплодотворенную одноклеточную яйцеклетку или в ее пронуклеус или в эмбрион отобранного млекопитающего, и микроинъецированные яйцеклетки затем переносят в яйцеводы псевдобеременных приемных матерей и оставляют развиваться.

Способ продуцирования трансгенного, не принадлежащего к человеку млекопитающего, способного экспрессировать вариант BSSL, может также включать метод, при котором упомянутое млекопитающее, по существу, не способно экспрессировать BSSL из самого млекопитающего. Такой способ включает (а) разрушение способности экспрессирования BSSL млекопитающего таким образом, что BSSL млекопитающего, по существу, не экспрессируется, и введение вышеупомянутой системы экспрессии в зародыш млекопитающего так, что в млекопитающем экспрессируется вариант BSSL, и/или (b) замещение гена BSSL млекопитающего или его части на вышеупомянутую систему экспрессии.

Способность экспрессирования BSSL млекопитающего может быть подходящим образом разрушена путем введения мутаций в последовательность ДНК, ответственную за экспрессию BSSL. Такие мутации могут включать мутации, которые выставляют последовательность ДНК из рамки, вводят стоп-кодон или осуществляют делецию одного или нескольких нуклеотидов из последовательности ДНК.

Ген BSSL млекопитающего или его часть могут быть замещены системой экспрессии, определенной выше, или последовательностью ДНК, кодирующей вариант BSSL, путем использования хорошо известных принципов гомологичной рекомбинации.

Важным аспектом изобретения является также трансгенное, не относящееся к человеку, млекопитающее, несущее в своем геноме последовательность ДНК, упомянутую выше. Упомянутая последовательность ДНК может присутствовать, предпочтительно, в зародыше млекопитающего и в гене белка молока млекопитающего. Трансгенное, не принадлежащее к человеку, млекопитающее может быть выбрано, предпочтительно, из группы, состоящий из мышей, крыс, кроликов, овец, свиней и крупного рогатого скота.

В изобретение также включаются потомство упомянутого, не принадлежащего к человеку, млекопитающего, а также молоко, полученное от такого трансгенного, не принадлежащего к человеку, млекопитающего.

Изобретение также относится к детской формуле (детскому питанию), содержащей вышеупомянутое молоко, и к детской формуле, содержащей вышеупомянутый вариант BSSL. Детская формула может быть получена с использованием обычных технических приемов и содержать любые необходимые добавки, такие как минеральные соли, витамины и т.п.

Изобретение относится также к фармацевтической композиции, содержащей вышеупомянутый вариант BSSL, а также к применению такого варианта BSSL при лечении.

В других аспектах, изобретение относится к применению вышеупомянутого варианта BSSL для производства лекарственных препаратов для лечения патологического состояния, относящегося к экзокринной недостаточности поджелудочной железы, муковисцидозу, хроническому панкреатиту, жировой малабсорбции, малабсорбции жирорастворимых витаминов, жировой малабсорбции вследствие физиологических причин. Изобретение также относится к применению варианта BSSL для производства лекарственных препаратов для улучшения усвоения пищевых липидов, в особенности, недоношенными детьми.

Примеры 1. Экспрессия рекомбинатной BSSL в эукариотных и прокариотных клетках 1.1. Методики экспериментов 1.1.1. Рекомбинатные плазмиды Плазмиду рS 146, содержащую кДНК человеческой BSSL с 2,3 т.п.о., клонированную в рUC 19, переваривают с Hind III и Sal I, и кДНК BSSL вводят в вектор экспрессии вируса папилломы коровы (BPV) pS 147 (фиг.1). Этот вектор содержит кДНК человеческой BSSL под контролем энхансера - мышиного металлотионеина 1 (mМТ-1) и промоторного элемента (Povlakis & Hamer, 1983). Сигналы процессинга мРНК обеспечиваются геномным фрагментом, содержащим часть экзона II, интрона II, экзона III, и в прямом направлении элементы гена кроличьего -глобина. Эту единицу транскрипции клонируют в вектор, содержащий полный геном BPV. Транскрипция является однонаправленной для BPV и для единицы транскрипции BSSL. Для размножения вектора в Е.coli вектор содержит рМL 2d производное рВR 322 (Salver et. al, 1982).

Вектор экспрессии рS котрансфецируют вектором, кодирующим ген устойчивости к неомицину, произведенному 5'-длинным концевым повтором вируса саркомы Харвея и сигналами полиаденилирования обезьяньего вируса 40 (Lusky & Botchan? 1984).

Для экспрессии BSSL в Е.coli кДНК субклонируют как фрагмент Ndel I-Bam HI из плазмиды рT7-7 (Ausubel et.al., 1992) в плазмиду рGEMEX-1 (Promega, Madison, WI, USA (Studier & Moffat, 1986).

Этой процедурой клонирования кодирующую последовательность гена 10 Т7 замещают геном BSSL, кодирующим зрелый белок, предшествующий иницирующему кодону. Окончательный вектор экспрессии, рGEMEX/BSSL, подтверждается расшифровкой последовательности ДНК с использованием внутренних праймеров специфичной BSSL.

1.1.2. Мутагенез Нуклеотидный номер 1 присваивается А в инициирующем кодоне ATG. Для нумерации аминокислот первый метионин в сигнальном пептиде является 23, и первый аминокислотный остаток зрелого белка - аланин - снабжается номером 1.

Для конструирования варианта делеции А (SEQ ID NO:4) синтезируется два праймера PCR-PCR-1 и PCR-2 (табл.1). Для клонирования в различных плазмидах создают сайты Нind III, Sal I и Bam HI. Сайт Bcl I генерируют в последовательности BSSL без изменения аминокислотной последовательности. Это делается для облегчения добавления синтетической ДНК для получения других вариантов. Праймер PCR-2 содержит два синтетических стоп-кодона. Получающиеся в результате фрагменты PCR переваривают Bam HI и Hind III и клоинируют в рUС18 для анализа последовательности. Эту плазмиду обозначают рS157. Правильный фрагмент РСR вставляют в вектор экспрессии ВРV путем слияния с последовательностью в уникальном сайте АSр700 (положение 1405 в кДНК BSSL), и в сайте Sal I перед фрагментом гена -глобина, получая в результате рS257.

Конструкцию В-варината (SEQ ID NO:5) создают, используя олигонуклеотиды с номерами 3, 4, 7 и 8 (табл. 1). Гибридизованные олигонуклеотиды кодируют самую С-концевую аминокислотную последовательность, представляющую в белке полной длины часть с лизина 712 по фенилаланин 722. Этот фрагмент сливают с глутаминов 535. Конец трансляции вставляют прямо после последнего фенилаланина. Фрагмент содержит сайт Bcl I в 5'-окончании и сайт Sal I в 3'-окончании, допуская интропродукцию в рS157. Получающую в результате плазмиду переваривают с Asp700 и Sal I, и фрагмент 313 т.п.о. вставляют в вектор экспрессии, как описано выше. Получающуюся в результате плазм